Upload
duongbao
View
234
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
28
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis penelitian
Jenis penelitian yang digunakan adalah true experimental dengan
rancangan post test only control group design. Metode yang digunakan
adalah uji dilusi tabung (tube dilution test) untuk mengetahui efek ekstrak
kulit pisang kepok (Musa paradisiaca L.) sebagai antibakteri dengan berbagai
konsentrasi terhadap pertumbuhan bakteri P.aeruginosa secara in vitro.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas
Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu
selama 1 bulan.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri P. aeruginosa yang
diperoleh dari Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Sampel
1 Sampel dalam penelitian ini adalah bakteri P. aeruginosa yang
diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling.
28
26
29
4.3.2.1 Estimasi dan Jumlah Pengulangan
2 Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit
pisang kepok, satu kelompok kontrol negatif dan satu kelompok kontrol
negatif, sehingga ada 10 kelompok. Jumlah sampel dari setiap kelompok
perlakuan dihitung dengan menggunakan rumus Federer, dengan p adalah
jumlah perlakuan dan n adalah jumlah pengulangan (Candrasari dkk, 2012).
3 ( p-1 ) ( n-1 ) ≥ 15
4
5 ( 10-1 ) ( n-1 ) ≥ 15
6 9 ( n-1) ≥ 15
7
8 9n – 9 ≥ 15
9
10 n ≥ 2,67 ≈ 3
11 Ket : p = jumlah perlakuan
12 n = jumlah ulangan yang diperlukan
13
Dari hasil perhitungan diatas, maka diperlukan tiga kali pengulangan
untuk sampel.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit pisang kepok
dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39%
dan 2 kontrol yaitu kontrol negatif dan kontrol positif .
30
4.4.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah jumlah koloni bakteri
P. aeruginosa dengan mengukur tingkat kekeruhan yang dihasilkan pada
media nutrient broth (KHM) dan jumlah koloni bakteri P. aeruginosa pada
Nutrient agar plate (KBM).
4.5 Definisi Operasional
1. Ekstrak kulit pisang kepok adalah kulit pisang kepok matang yang
diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut metanol
kemudian dilakukan penyaringan untuk memisahkan filtrat dari ampas
selanjutnya diuapkan dengan rotatory evaporator sehingga dihasilkan
ektrak kulit pisang kepok yang bebas dari pelarut. Konsentrasi ekstrak
kulit pisang kepok yang digunakan pada penelitian ini yaitu 100%, 50%,
25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%. Skala variabel ini
adalah ordinal.
2. Pertumbuhan bakteri P. aeruginosa yaitu pertumbuhan bakteri yang
dilihat dengan menghitung jumlah koloni pada Nutrient Agar Plate
(NAP). Skala variabel ini adalah rasio.
3. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah ekstrak kulit
pisang kepok yang dapat membunuh bakteri P. aeruginosa, ditandai
dengan tidak terdapatnya pertumbuhan koloni P. aeruginosa pada NAP
atau pertumbuhan koloninya kurang dari 0,1% dari jumlah koloni
inokulum awal (original inoculum). Skala variabel untuk KBM adalah
rasio.
31
4. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah kadar atau konsentrasi minimal
ekstrak kulit pisang kepok yang mampu menghambat pertumbuhan
bakteri P. aeruginosa, ditentukan dengan cara membandingkan dengan
kontrol negatif sehingga bisa ditentukan ekstrak kulit pisang kepok yang
paling mendekati kontrol bahan. Skala variabel KHM adalah ordinal.
4.6 Instrumen Penelitian
4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)
1. Alat
o Erlenmeyer (gelas berskala)
o Hot plate
o Stirrer
2. Bahan
o Nutrient broth
o Aquades
4.6.2 Alat dan Bahan Pembuatan Nutrient Agar Plate (NAP)
1. Alat
o Cawan Petri
o Erlenmeyer (gelas berskala)
o Hot plate
o Stirrer
2. Bahan
o Nutrient Agar
o Aquades
32
4.6.3 Alat dan Bahan Identifikasi P. aeruginosa
1. Alat
o Ose
o Kertas penghisap
o Minyak imersi
o Mikroskop
o Gelas obyek
o Cotton bud
o Pipet
o Lampu spiritus
2. Bahan
o Aquades
o Isolat bakteri P. aeruginosa
o Pewarna gram (kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin)
o Medium pembenihan Nutrient Agar Plate (NAP)
o Bahan uji katalase (H2O2.)
4.6.4 Alat dan Bahan Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Pisang Kepok (Musa
paradisiaca L.)
1. Alat
o Tabung reaksi steril
o Ose
o Mikropipet 1 ml
o Inkubator
33
o Lampu spirtus
o Label
o Vortex
o Colony counter
2. Bahan
o Perbenihan cair bakteri P. aeruginosa
o Ekstrak kulit pisang kepok
o Nutrient broth
o Nutrient Agar Plate (NAP)
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Sterelisasi Alat
Sterelisasi alat dilakukan dengan cara:
1. Mencuci semua peralatan dengan sabun hingga bersih dan
membiarkannya hingga kering.
2. Alat-alat yang dapat disterilkan dalam autoklaf dibungkus dengan kertas
dan dimasukan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 atm
selama 15 menit. Sedang alat yang tidak dapat disterilkan dengan
autoklaf disterilkan dengan alkohol 70%.
4.7.2 Pembuatan Medium Nutrient Agar Plate
Nutrient agar plate dibuat dengan cara :
1. Nutrient agar sebanyak 20 gram, dilarutkan dengan 1000mL aquadest
pada Erlenmeyer.
2. Media dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan
34
pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer.
3. Campuran media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan
tekanan 1 atm selama 15 menit
4. Media dituangkan ke dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL
dan dibiarkan hingga memadat.
4.7.3 Pembuatan Medium Nutrient Broth
Nutrient Broth dibuat dengan cara:
a) Nutrient broth sebanyak 8 gram, dilarutkan dengan 1000 mL
aquadest pada Erlenmeyer.
b) Media dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan
pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer.
c) Campuran media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C
dengan tekanan 1 atm selama 15 menit
d) Larutan nutrient broth yang telah disterilisasi disimpan ke dalam
kulkas.
4.7.4 Identifikasi Bakteri P. aeruginosa
a) Pewarnaan Gram
1. Menyiapkan gelas objek dan dibersihkan dengan kapas,kemudian
dilewatkan diatas api untuk menghilangkan lemak atau minyak dan
biarkan dingin.
2. Satu ose aquades steril diteteskan pada gelas objek, kemudian diambil
sedikit bakteri untuk disuspensikan dengan aquades yang telah
diletakkan diatas gelas objek. Kemudian dibiarkan kering.
35
3. Setelah kering suspensi bakteri difiksasi dengan cara melewatkannya
di atas api bunsen dua sampai tiga kali dan sediaan siap diwarnai.
4. Sediaan ditetesi dengan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit.
Kemudian sisa kristal violet dibuang dan dibilas dengan air perlahan-
lahan.
5. Meneteskan larutan lugol pada sediaan dan diamkan selama 1 menit,
buang sisa lugol dan bilas dengan air.
6. Kemudian dilakukan dekolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan
alkohol 96% dan tunggu selama 5-10 detik.
7. Sediaan ditetesi dengan larutan safranin dan ditunggu selama 30 detik,
kemudian sisa safranin dibuang dan dibilas dengan air.
8. Mengeringkan sediaan dengan kertas penghisap kemudian siap untuk
dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100x
menggunakan minyak immersi.
b) Uji Katalase
1. Meneteskan larutan H2O2 pada gelas objek dengan pipet
2. Mengambil kultur bakteri P.aeruginosa dengan ose dan meletakkan
ose pada gelas objek yang sudah ditetesi oleh larutan H2O2
3. Mengamati adanya gelembung-gelembung gas
4. Tes positif apabila terdapat gelembung gas, yang berarti bakteri yang
diamati merupakan bakteri gram negatif.
c) Penanaman pada Media Nutrient Agar Plate
36
Dilakukan inokulasi bakteri pada media Nutrient Agar Plate
yang kemudian diinkubasikan di dalam inkubator pada suhu 37℃ , selama
18-24 jam. Penanaman ini untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri P.
aeruginosa dengan gambaran koloni besar dan low-convex, kasar, dan
biasanya berbentuk oval dengan tumbuh segaris dengan garis streaking.
Kultur berbau khas, terkadang mengeluarkan bau manis menyerupai bau
buah anggur atau seperti jagung. Koloni juga memberikan warna
fluoresensi hijau ketika mendapatkan cahaya.
4.7.5 Pembuatan Pembenihan Cair Bakteri 106 CFU/ml
Pembuatan pembenihan cair bakteri dengan kepadatan 106
CFU/ml
dibuat pada nutrient broth. Kemudian perbenihan bakteri P.aeruginosa ini akan
distandarisasi dengan spektrofotometer (pada panjang gelombang 600 nm
sampai mencapai optical density (OD) 0.1 yang setara dengan 108
CFU/ml)
dan diencerkan 100 kali sehingga didapatkan jumlah bakteri 106
CFU/ml.
4.7.6 Uji Efek Antibakteri Larutan Ekstrak Kulit Pisang Kepok terhadap P.
aeruginosa
Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi. Pada penelitian
ini diperlukan kadar beberapa macam konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok
untuk dicampurkan atau diinokulasi dengan perbenihan cair kuman P.
aeruginosa. Proses selanjutnya ialah mengeramkan selama 24 jam pada suhu
37°C.
37
Dengan cara sebagai berikut:
1. Sediakan 10 tabung reaksi steril: tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4,
tabung 5, tabung 6, tabung 7, tabung 8, tabung 9, tabung10. Masing-masing
di beri perlakuan 8 konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok dan 2 dari 10
tabung tersebut untuk kontrol negatif dan poasitif.
2. Masukkan 1 ml nutrient broth pada tabung 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 2 ml ekstrak
kulit pisang kepok pada tabung 1 serta 2 ml bakteri pada tabung 10.
Kontrol negatif Nutrient broth Kontrol positif
3. Masukkan masing-masing 1 ml ekstrak kulit pisang kepok ke dalam tabung
2 dan 3.
1 m
l
Konsentrasi ekstrak kulit
pisang kepok
Tabung 2 1 ml (100%)
Tabung 3 2 ml (50%)
1 m
l
38
4. Campurlah hingga rata larutan Nutrient broth dan ekstrak kulit pisang kepok
pada tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 4.
1ml
5. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9.
6. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml.
7. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antibakteri dari masing-
masing tabung adalah :
8. Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair bakteri 1 ml
9. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga
konsentrasi akhir antibakteri berubah seperti berikut :
Konsentrasi ekstrak kulit
pisang kepok
Tabung 3 1 ml (50%)
Tabung 4 2 ml (25%)
39
10. Kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 18-24 jam.
11. Pada hari ke 2 tabung dikeluarkan dari inkubator, akan di dapatkan KHM
dengan cara melihat kejernihan tabung. Kemudian dari masing-masing
tabung diambil 1 ose dan diinokulasikan pada NAP. Lalu diinkubasikan lagi
18-24 jam pada suhu 37˚C
12. Pada hari ke 3 NAP dikeluarkan dari inkubator, koloni yang timbul diamati
dan dihitung dengan metode colony counter untuk menententukan KBM
dari ekstrak kulit pisang kepok dengan cara membandingkan jumlah koloni
dengan original inoculum.
40
4.8 Skema Alur Penelitian
Penentuan KHM dan KBM:
Pembuatan pembenihan cair
Pseudomonas aeruginosa dengan
konsentrasi 106 CFU/ml
Identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa
Pewarnaan Gram
Uji Katalase
Penanaman pada media NAP
Uji antibakteri dengan Tube Dilution Test
Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC
Tingkat kekeruhan yang terjadi diamati dan
dibandingkan dengan kontrol bahan. KHM
Streaking pada media NAP
Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC
Jumlah koloni yang tumbuh dihitung
dengan colony counter KBM
Analisis Data
Konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok
50% 25% 12,5% 6,25% 3, 25% 1,56% 0,78% 0,39%
0,39
Kontrol
kuman (+)
0%
Kontrol
bahan (-)
100%
41
4.9 Analisis Data
Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni P.
aeruginosa yang tumbuh pada NAP berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak kulit
pisang kepok (Musa paradisiaca L.). Analisis yang digunakan adalah uji one way
ANOVA (Analysis Of Variance). Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya
perbedaan yang bermakna antara kelompok perlakuan.
Syarat yang harus dipenuhi dalam melakukan uji one way ANOVA
(untuk > 2 kelompok) adalah:
1. Distribusi data harus normal (p > 0,05), pada penelitian ini dilakukan uji
normalitas menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui apakah
kelompok data penelitian berasal dari populasi berdistribusi normal atau
tidak normal. Jika distribusi data tidak normal, maka diupayakan untuk
melakukan transformasi data supaya distribusi data menjadi normal.
2. Varian data harus sama atau homogen (p > 0,05), yang dapat diketahui dari
uji homogenitas Levene. Jika varian data tidak sama atau homogen, maka
diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya ragam data menjadi
sama atau homogen.
Apabila data berdistribusi normal dan varian sama maka dilanjutkan dengan
uji Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat
perbedaan yang bermakna. Jika distribusi normal dan varian berbeda, maka
digunakan uji Post Hoc Tamhane’s
Jika data hasil transformasi tidak terdistribusi normal atau ragam data tetap
tidak sama, maka dipilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai
42
alternatifnya dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney untuk
menentukan pada konsentrasi mana yang memiliki hasil kebermaknaan.