Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
35
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk menguji aktivitas
antibakteri dengan kombinasi ekstrak etanol daun Annona squamosa (EDAS) dan
daun Jatropha gossypifolia (EDJG) terhadap pertumbuhan bakteri Staphylococcus
aureus dan Escherichia coli.
4.2 Lokasi Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi
Universitas Negeri Malang.
4.3 Alat Penelitian
1. Inkubator
2. Autoclave
3. Laminar Air Flow
4. Penjepit
5. Mikroskop
6. Kertas Cakram
7. Jarum ose steril
8. Oven
9. Lemari Pendingin
10. Erlenmeyer
11. Tabung Reaksi
12. Ephendrop
13. Labu Ukur
14. Batang Pengaduk
15. Beaker glass
16. Cawan Penguap
17. Kassa Steril
18. Mikropipet
19. Blue tip dan yellow tip
36
4.4 Bahan Penelitian
4.4.1 Bahan Uji
Pada penelitian ini bahan uji yang digunakan yaitu ekstrak etanol daun
Annona squamosayang didapatkan dari penelitian sebelumnya oleh Ibu Siti
Rofida (2015), kegiatan pengujian Aktivitas Antihiperlipidemia Ekstrak Etanol
Daun Annona squamosa dan ekstrak etanol daunJatropha gossypifolia yang
didapatkan dari penelitian sebelumnya oleh Dilla Novita (2015), kegiatan
pengujian Perbandingan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Daun
JatrophagossypifoliaLinn dari Berbagai Metode Ekstraksi Remaserasi. Daun
Jatrophagossypifolia didapatkan dari kecamatan Grati, Kabupaten Pasuruan dan
telah diidentifikasi oleh Balai Materia Medika, Dinas Kesehatan, Jawa Timur.
Adapun mikroba uji yang digunakan yaitu Escherichia coli dan
Staphylococcus aureus yang didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi
Universitas Muhamadiyah Malang.
4.4.2 Sampel Bakteri
Bakteri Staphyococcus aureus dan Escherichia coli diisolasi pada media
media Mueller Hinton Agar (MHA) diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam.
4.4.3 Pengujian Difusi Cakram
1. Mueller Hinton Agar (MHA)
2. Mueller Hinton Broth(MHB)
3. Kloramfenikol 30 μg sebagai kontrol positif
4. Aquades steril
5. DMSO 10%
4.5 Sterilisasi Bahan dan Alat
Semua bahan yang akan digunakan dalam penelitian, di sterilisasikan
terlebih dahulu dengan cara sterilisasi pemanasankering dan sterilisasi pemanasan
basah.
4.5.1 Sterilisasi Pemanasan Kering
Sterilisasi pemanasan dibagi menjadi 2 cara yaitu sterilisasi dengan api
langsung dan dengan oven pemanas.
37
1. Sterilisasi dengan api langsung
Cara sterilisasi ini dilakukan untuk alat-alat seperti jarum ose, pinset, spatel,
mulut tabung dan batang pengaduk.
2. Sterilisasi dengan oven pemanas
Sterilisasi dengan oven pemanas digunakan untuk sterilisasi alat seperti gelas
yang tidak berskala, seperti cawan petri, tabung reaksi, dan penjepit. Setelah
mencapai suhu 160ºC, alat-alat yang akan disterilkan dimasukkan ke dalam
oven selama 1-2 jam. (Entjang,2003)
4.5.2 Sterilisasi Pemanasan Basah
Sterilisasi pemanasan basah dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Alat
yang di sterilkan menggunakan metode ini yaitu gelas ukur, erlenmeyer, dan pipet
tetes. Proses sterilisasi ini dilakukan pada suhu 121ºC selama 15-20 menit.
4.6 Media Uji Bakteri
Pada uji ini, digunakan Mueller Hinton Agar (MHA) sebagai media uji. MHA
adalah salah satu media untuk pemeriksaan sensibilitas tes (dengan metode Kirby-
bauer). Komposisi yang terkandung pada MHA yaitu Beef Extract 2 gram, Acid
Hydrolysate of Casein 17,5 gram, Starch 1,5 gram, Agar 17 gram dan Aquadest 1
liter, pH akhir Mueller Hinton Agar 7,3 ± 0,1 pada suhu 25 ºC.
4.7 Metode Penelitian
4.7.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental yang bertujuan untuk mengetahui
zona hambat aktivitas antibakteri S.aureus dan E.coli dari kombinasi ekstrak daun
Annona squamosa dan Jatropha gossypiifolia secara in vitro dengan metode difusi
cakram. Pada penelitian ini, dilakukan dengan menggunakan dua perlakuan yaitu
kelompok uji dan kelompok kontrol. Penelitian ini melalui beberapa tahapan,
yaitu persiapan konsentrasi kombinasi ekstrak dan pengujian antibakteri dengan
metode difusi cakram.
38
4.7.2 Kerangka Operasional
4.8 Variabel Penelitian
4.8.1 Variabel Terikat
Pada penelitian ini yang termasuk variabel terikat adalah diameter zona
hambat yag dihasilkan oleh senyawa uji yang ditandai dengan adanya warna
bening di sekitar senyawa uji yang terdapat pada media agar sebagai parameter
untuk menentukan hambat minimum senyawa ekstrak etanol.
4.8.2 Variabel Bebas
Pada penelitian ini yang termasuk variabel bebas yaitu komponen senyawa
kimia pada kombinasi EDAS dan EDJG dengan perbandingan konsentrasi
EDAS;EDJG untuk bakteri S.aureusdan E.coli, yaitu 62,5 mg/mL : 50 mg/mL;
62,5 mg/mL : 25mg/mL; dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.
4.9 Prosedur Kerja
4.9.1 Preparasi Sampel
4.9.1.1 Persiapan Ekstrak Etanol 96% Daun Jarak Merah
Sampel yang diteliti adalah daun jarak merah (Jatropha gossypifolia Linn).
Jarak merah dicuci dengan air hingga bersih dan dipisahkan dari rantingnya,
kemudian diangin-anginkan pada suhu kamar selama 30 menit. Pengeringan
simplisia dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu 40-50ºC. Bagian daun
Persiapan Bahan Uji
Persiapan Konsentrasi Kombinasi Ekstrak
Preparasi Media dan Bakteri
Pengujian Difusi Cakram
Analisis Data
Kelompok Kontrol : -Kontrol Postif (Kloramfenikol 30 μg)
-Kontrol Negatif (DMSO 10%)
Kelompok Uji : Ekstrak etanol kombinasi daun srikaya
(Annona squamosa) dan srikaya
(Jatropha gossypifolia)
Gambar 3. 1Kerangka operasional
Gambar 4. 1Kerangka operasional
39
jarak merah yang telah kering kemudian dihaluskan dengan mesin penggilingan,
sehingga diperoleh serbuk halus. Selanjutnya diayak menggunakan Shieve shaker
dengan derajat kehalusan tertentu dan selanjutnya disimpan pada suhu ruangan
(Farmakope Herbal Indonesia, 2009).
Proses ekstraksi menggunakan metode remaserasi non kinetik selama 24
jam menggunakan pelarut etanol 96%. Cara pembuatannya adalah sebagai berikut
(BPOM, 2010; Fauzana, 2010: Farmakope Herbal Indonesia, 2008: Handa, 2008):
1. Timbang serbuk halus daun Jatropha gossypifolia sebanyak 100 gram
masukkan ke dalam beaker glass.
2. Maserasi dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL, diamkan selama 24 jam,
saring, dan ditampung filtratnya
3. Residu dimaserasi kembali dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL dan
diamkan selama 24 jam, saring, dan ditampung filtratnya.
4. Residu dimaserasi kembali dengan etanol 96% sebanyak 1000,0 mL dan
diamkan selama 24 jam, saring dan ditampung filtratnya.
5. Filtrat dikumpulkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator vacum sampai
diperoleh larutan ekstrak kental, kemudian dipindahkan ke cawan porselen.
6. Ekstrak kental dikeringkan di oven pada suhu 40ºC.
4.9.1.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Annona squamosa
Daun Annona squamosa Linn dikeringkan pada suhu ruangan selama satu
minggu. Daun Annona squamosa L., kering kemudian dihancurkan dengan
menggunkan alat penggiling. Serbuk yang sudah ditimbang kemudian diekstraksi
menggunakan etanol sebagai pelarut. Larutan kemudian dievaporasi sampai
memperoleh ekstrak kental. Ekstrak disimpan pada suhu 2-8ºC sampai akan
digunakan.
4.10.1 Tahap Persiapan
4.10.1.1 Persiapan Dosis Larutan Uji
Daripenelitian sebelumnyatelah diketahui konsentrasi tiap tanaman
sebagai antibakteri, sehingga pada pengujian digunakan perbandingan konsentrasi
larutan uji kombinasi EDAS dan EDJG sebagai berikut :
40
1) Perbandingan konsentrasi untuk bakteri S.aureus
a) Konsentrasi 1 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 50 mg/mL
b) Konsentrasi 2 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL
c) Konsentrasi 3 = srikaya (Annona squamosa) 125 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL
2) Perbandingan konsentrasi untuk bakteri E.coli
a) Konsentrasi 1 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 50 mg/mL
b) Konsentrasi 2 = srikaya (Annona squamosa) 62,5 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL
c) Konsentrasi 3 = srikaya (Annona squamosa) 125 mg/mL dan jarak merah
(Jatropha gossypifolia) 25 mg/mL
4.10.1.2 Pembuatan Larutan Uji
Langkah-langkah pembuatan konsentrasi larutan uji, sebagai berikut :
1) Konsentrasi larutan uji untuk bakteri S.aureus
a) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 50 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga
diperoleh larutan uji konsentrasi 1 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 50
mg/mL.
b) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga
diperoleh larutan uji konsentrasi 2 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 25
mg/mL.
c) Ditimbang EDAS 125 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1 mL pada masing-masing ekstrak sehingga
diperoleh larutan uji konsentrasi 3 dari EDAS 125 mg/mL dan EDJG 25
mg/mL.
2) Konsentrasi larutan uji untuk bakteri E.coli :
a) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga
41
diperoleh larutan uji konsentrasi 1 dari EDAS 62,5 mg/ml dan EDJG 25
mg/mL.
b) Ditimbang EDAS 62,5 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga
diperoleh larutan uji konsentrasi 2 dari EDAS 62,5 mg/mL dan EDJG 25
mg/mL.
c) Ditimbang EDAS 125 mg dan EDJG 25 mg, kemudian ditambahkan
DMSO 10% sebanyak 1mL pada masing-masing ekstrak sehingga
diperoleh larutan uji konsentrasi 3 dari EDAS 125 mg/mL dan EDJG 25
mg/mL.
4.10.1.3 Preparasi MediaMueller Hinton Agar
Pada penelitian ini digunakan media yaitu Mueller Hinton Agar (MHA)
dalam pembuatan suspensi bakteri menggunakan aquadest steril dengan
meremajakan bakteri sehari sebelum preparasi. Pembuatan media Mueller Hinton
Agar (MHA) dengan melarutkan bahan sebanyak 38 gram (dengan komposisi :
Beef dehydrate infusion 300 g, Casein hydrolysate 17.5 g, Starch 1.5 g dan Agar
15 g) ke dalam 1 L aquadest pada erlenmeyer dengan kapasitas 1 L. Erlenmeyer
diletakkan diatas hot plate kemudian masukkan magnetic stirer untuk
mempercepat pelarutan sampai didapatkan larutan media menjadi berwarna
kuning jernih. Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil kemudian
disterilisasi dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Dituang media
steril ke cawan petri steril secara aseptis di dalam LAF.
4.10.1.4 Preparasi MediaMueller Hinton Broth
Pada proses peremajaan bakteri, pada penelitian ini digunakan media yaitu
Mueller Hinton Broth (MHB). Pembuatan media Mueller Hinton Broth dengan
melarutkan bahan sebanyak 21 gram (dengan komposisi Acid casein pepton (H)
17,50 g, Beef infusion 2 g, dan Corn Starch 1,5 g) ke dalam 1 L aquadest pada
erlenmeyer dengan kapasitas 1 L. Erlenmeyer diletakkan diatas hot plate sampai
media terlarut sempurna. Setelah itu erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil
kemudian disterilisasidengan auoklaf selama 15 menit pada suhu 121ºC. Simpan
media pada suhu 2-8 ºC
42
4.10.1.5 Pembuatan Standar Mc Farland
Diambil aquadest kira-kira setengah dari tabung reaksi. Kemudian
tambahkan H2SO4 1% sebanyak 9950 μL dan BaCl2 1% sebanyak 50μL. Campur
kedua larutan dalam tabung tersebut, dikocok sampai homogen dan terbentuk
larutan keruh. Larutan tersebut ini dipakai sebagai pembanding suspensi bakteri
dengan tingkat kekeruhan 108 CFU/mL (Eucast, 2015).
4.10.1.6 Preparasi Bakteri
Proses peremajaan bakteri diperoleh dari biakan murni digoreskan dengan
3-4 ose secara horizontal pada tabung reaksi yang berisi media Mueller Hinton
Broth (MHB). Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37ºC, jika perlu
di shaker dengan kecepatan 120 rpm. Setelah diinkubasi selama 24 jam,
bandingkan sediaan dengan standar McFarland dengan tingkat kekeruhan 108
CFU/mL.
Setelah dilakukan perbandingan dengan standar McFarland maka
dilakukan penggoresan pada media MHA yang diambil menggunakan kapas lidi
steril dan digoreskan dengan 3-4 bagian secara horizontal, lalu putar cawan 90º.
Lanjutkan goresan sampai merata dan masukkan cakram uji ke dalam cawan.
Setelah itu, bakteri diinkubasi pada suhu 37ºC selama 24 jam. Setelah diinkubasi
selama 24 jam, ukur diameter hambat pada cakram.
4.10.1.7 Pewarnaan Bakteri Uji
Perwarnaan bakteri uji yang dilakukan adalah pewarnaan Gram.
Perwarnaan bakteri dilakukan untuk identifikasi dan memastikan tidak ada
kontaminan pada kultur kerja. Pewarnaan bakteri uji dilaksanakan pada tahap
peremajaan bakteri dan pada tahap akhir saat bakteri telah dioleskan pada cawan
yang berisi MHA. Objek kaca yang digunakan dibersihkan dengan alkohol 96%
dan dikeringkan. Kemudian tambahkan aquadest 1 tetes di atas objek kaca, dan
ambil biakan bakteri yang akan dilakukan pewarnaan dengan ose steril (biakan
bakteri yang diambil 1 koloni), kemudian ratakan biakan bakteri di permukaan
objek kaca yang telah berisi aquadest. Kemudian difiksasi dengan api bunsen
(lewatkan di atas api 2-3 kali). Setelah kering, pertama ditetesi dengan pewarna
Crystal Violet kemudian tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest. Kedua,
ditetesi dengan Lugol dan tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest. Ketiga, bilas
43
dengan alkohol 96% lalu bilas dengan aquadest. Keempat, ditetesi pewarna
Safranin dan tunggu 1 menit lalu bilas dengan aquadest kemudian keringkan
dengan tisu. Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10), bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan kedalam bakteri Gram positif. Sedangkan bakteri
Gram negatif juga berwarna ungu tetapi penggunaan Safranin akan mewarnai sel
Gram negatif menjadi berwarna merah, sedangkan Gram positif tidak terpengaruh
(Hafsan et al., 2015; Back, 2001).
4.10.2 Tahap Pengujian
4.10.2.3 Pengujian Penghambatan Pertumbuhan Bakteri Dengan Difusi
Cakram
1. Prosedur pengujian bakteri Staphylococcus aureus secara difusi cakram
dilakukan sebagai berikut:
a) Disiapkan larutan uji masing-masing yang telah dimasukkan ke dalam
eppendorf dengan perbandingan EDAS : EDJG yaitu 62,5 mg/mL : 50
mg/mL; 62,5 mg/mL : 25 mg/mL dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.
b) Dilakukan peremajaan bakteri. Dilakukan preparasi media.
c) Disiapkan larutan uji EDAS : EDJG dengan konsentrasi yang telah
ditentukan (konsentrasi 1,2, dan 3) kemudian kertas cakram kosong
diletakkan diatas kaca arloji yang telah berisi kombinasi larutan uji
kemudian ditetesi larutan uji 20 µL dengan pengulangan 5x dan tunggu
sampai meresap.
d) Bakteri yang telah dipreparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi
steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi
steriil tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak,
lalu dioleskan pada permukaan Mueller Hinton Agar (MHA) di cawan petri
kemudian diratakan.
e) Kertas cakram yang telah berisi larutan uji diletakkan diatas
permukaanMueller Hinton Agar (MHA) secara aseptis di dalam Laminar
Air Flow (LAF) yang menyala. Untuk diperoleh kontak yang baik, kertas
cakram dapat ditekan dengan lembut menggunakan pinset pada
permukaannya. Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu cakram dengan
cakram yang lainnya berjauhan. Antibiotik kloramfenikol digunakan
sebagai kontrol positif.
44
f) Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
g) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang
dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona hambat atau area
bening disekitar kertas cakram. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan
jangka sorong dalam satuan militer (mm).
h) Dilakukan repikasi sebanyak 3 kali.
2. Prosedur pengujian bakteri Escherichia coli secara difusi cakram dilakukan
sebagai berikut :
a) Disiapkan larutan uji masing-masing yang telah dimasukkan ke dalam
ephendrop dengan perbandingan dosis EDAS : EDJG yaitu 62,5 mg/mL : 50
mg/mL;62,5 mg/mL : 25 dan 125 mg/mL : 25 mg/mL.
b) Dilakukan peremajaan bakteri. Dilakukan preparasi media.
c) Disiapkan larutan uji EDAS dan EDJG dengan konsentrasi yang telah
ditentukan (konsentrasi 1,2, dan 3) kemudian kertas cakram kosong
diletakkan di atas kaca arloji yang telah berisi kombinasi larutan uji
kemudian ditetesi larutan uji sebanyak 20 µL dengan pengulangan 5x dan
tunggu sampai meresap.
d) Bakteri yang telah di preparasi diambil dengan cara mencelupkan kapas lidi
steril satu kali, lalu diletakkan pada tepi tabung reaksi, kemudian kapas lidi
steril tersebut diputar agar bakteri yang akan dioleskan tidak terlalu banyak,
Lalu dioleskan pada permukaan Mueller Hinton Agar (MHA) di cawan petri
kemudian diratakan.
e) Kertas cakram yang telah berisi larutan uji diletakkan diatas permukaan
Mueller Hinton Agar (MHA) secara aseptis di dalam Laminar Air Flow
(LAF) yang menyala. Untuk diperoleh kontak yang baik, kertas cakram
dapat ditekan dengan lembut menggunakan pinset pada permukaannya.
Jarak diatur sedemikian rupa sehingga satu cakram dengan cakram yang
lainnya berjauhan. Antibiotik kloramfenikol digunakan sebagai kontrol
positif.
f) Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam.
g) Pengujian senyawa antibakteri dilakukan dengan pengamatan yang
dilakukan setiap 24 jam dengan melihat adanya zona hambat atau area
45
bening disekitar kertas cakram. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan
penggaris dalam satuan militer (mm).
h) Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali
4.11 Analisis Data
Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan pengamatan
terhadap pengukuran diameter zona hambat daerah berwarna bening dari masing-
nmasing konsentrasi pada kombinasi EDAS dan EDJG terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli dengan menggunakan jangka sorong.
Daerah berwarna bening disekitar kertas cakram diukur menggunakan jangka
sorong dengan mengukur diameter. Hasil pengukuran tersebut merupakan
diameter zona hambat dari kombinasi EDAS dan EDJG terhadap bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli.
Gambar 4. 2 Bagan Prosedur Pengujian Antibakteri dengan Metode
Difusi Cakram
Konsentrasi 1
Konsentrasi 3
Kontrol negatif Aqua +
DMSO 10%
Konsentrasi 2
Kontrol positif
kloramfenikol 30µg
Jarak cakram dengan tepi
plate tidak kurang dari 1,5
cm dan jarak antar cakram
tidakkurang dari 2,5 cm
Cawan petri yang berisi bakteri S. Aureus, E. coli dan media
Diinkubasi selama 18-24 jam, kemudian diukur zona hambat
Dilakukan replikasi sebanyak tiga kali
pada masing-masing konsentrasi ekstrak
yang diuji