BAB VPEMBAHASAN

Antibiotika adalah zat–zat kimia yang diperoleh dari atau dibentuk dan

dihasilkan oleh mikroorganisme. Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan

oleh organisme hidup yang dalam konsentrasi rendah dapat menghambat atau

membunuh organisme lain. Berdasarkan mekanisme aksinya antibiotik dibedakan

menjadi lima, yaitu antibiotik yang menghambat dinding sel, antibiotik yang

merusak membran plasma, antibiotik yang menghambat sintesis protein, antibiotik

yang menghambat asam nukleat (DNA/RNA) dan antibiotik yang menghambat

metabolit essensial.

Kloramfenikol merupakan antibiotik dengan spektrum luas dan aktif

terhadap bakteri gram positif dan gram negatif kecuali Pseudomonas.

Kloramfenikol bersifat bakteriostatik dengan jalan penghambatan sintesis protein

bakteri yaitu memberikan efek dengan cara bereaksi pada bagian ribosom 50s,

tempat suatu antibiotika tersebut menghalangi enzim peptidil transferase. Enzim

inilah yang melaksanakan langkah ketiga pada sintesis protein dengan membentuk

ikatan peptida antara asam amino baru, yang masih melekat pada t –RNAnya dan

asam amino terakhir peptida yang sedang berkembang sehingga semua sintesis

protein terhenti.

Percobaan ini dilakukan untuk menguji potensi antibiotik secara

mikrobiologik, dengan membandingkan antibiotik yang diuji dengan antibiotik

baku. Uji potensi antibiotik adalah suatu teknik untuk menetapkan potensi suatu

antibiotik dengan mengukur efek senyawa tersebut terhadap pertumbuhan

mikroorganisme yang peka dan sesuai. Penetapan suatu antibiotika dilakukan

dengan mengukur efek senyawa tersebut terhadap pertumbuhan bakteri uji dengan

metode lempeng atau difusi agar. Prinsip umumnya lempengan yang berisi agen

antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme

yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Zona bening mengindikasikan

adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antibiotik pada

permukaan media agar. Prinsip dari percobaan ini adalah dengan menggunakan

media padat yang telah diinokulasikan mikroorganisme uji secara merata

kemudian diletakkan pencadang yang telah diteteskan atau diberi senyawa

antibiotika yang akan diuji dan diinkubasi pada suhu tertentu. Selama inkubasi

akan terjadi proses difusi antibiotika pada media padat dan membentuk daerah

hambatan (zona bening). Faktor–faktor yang mempengaruhi metode difusi agar

antara lain aktivitas mikrorganisme, ukuran inokulum, waktu per inkubasi, suhu

inkubasi, pengaruh pH, pemilihan medium dan komposisi suatu medium. Zona

hambat merupakan kemampuan suatu antimikroba untuk menghambat

pertumbuhan mikroorganisme, sedangkan zona bunuh merupakan kemampuan

suatu antimikroba membunuh mikroorganisme. Cara membedakan zona bunuh

dan zona hambat ialah dengan melihat zona di sekitar paper disk. Pada zona

bunuh, zona yang terbentuk bening tidak ada koloni bakteri yang tumbuh

sedangkan pada zona hambat masih ada koloni bakteri yang tumbuh tetapi hanya

sedikit. Selain itu, untuk memastikan zona bunuh atau hambat dapat dilanjutkan

dengan uji lanjutan, yaitu dengan menginokulasikan bagian zona bening ke dalam

medium cair yang sesuai, jika ada perubahan warna medium menjadi keruh, maka

dipastikan zona bening yang terbentuk adalah zona hambat, karena masih ada

mikroba atau bakteri yang tumbuh dan jika tidak ada perubahan maka zona

bunuh. Cara pengukuran zona bening menggunakan alat mikrometer sekrup.

Dilakukan pengukuran secara triplo dengan menarik garis dari garis tengah

lingkaran zona. Pengulangan dilakukan tiga kali dengan posisi yang berbeda

kemudian dibagi tiga, rata-rata itulah yang digunakan sebagai luas zona bening

diukur garis tersebut dengan mikrometer sekrup. Pengukuran dilakukan secara

triplo karena zona bening yang terbentuk tidak terbentuk bulatan sempurna. Selain

dengan metode difusi agar potensi antibiotik dapat menggunakan metode

turbidimetri. Prinsip turbidimetri ialah dengan menggunakan medium cair,

hambatan pertumbuhan diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan

dengan suatu alat yang cocok, misalnya spektrofotometer.

Difusi adalah proses perpindahan molekul secara acak dari satu posisi ke

posisi yang lain (konsentrasi tinggi ke rendah). Pencadang yang berisi antibiotik

akan berdifusi pada media agar. Pencadang yang digunakan adalah kertas saring.

Secara kimia kertas saring mengandung selulosa 98-99 %, β selulosa 0,3-1 %,

pentosa 0,4- 0,8 %. Paper disk digunakan untuk menyerap larutan antibiotik.

Kertas saring bekerja berdasarkan daya kapilaritas, dimana antibiotik akan

merembes atau terserap kedalam kertas sehingga paper disk akan menampung

antibiotik. Selain itu kapilaritas merupakan unsur penting karena dapat

mempengaruhi kecepatan alir dan kualitas zat yang berdifusi. Keuntungan paper

disk adalah pengerjaannya lebih cepat dan mudah. Kerugiaannya adalah kapasitas

antimikroba yang tertampung tidak maksimal menghambat, dan kemungkinan

adanya heterogenitas komposisi serat kertas, sehingga sebagian antibiotik akan

terikat pada serat kertas tersebut yang menyebabkan diameter hambatan akan

bervariasi.

Pengujian kali ini dilakukan dengan desain 3/3 yaitu digunakan satu baku

pembanding dan satu contoh masing-masing dan tingkat dosis yang diperlukan

dalam satu capet. Tingkatan dosis dipilih sedemikian rupa, sehingga masing-

masing dosis yang lebih rendah berikutnya berbanding tetap, sehingga akan

diperoleh dosis tinggi, dosis menengah dan dosis rendah yaitu 1,25 µg/mL, 2,5

µg/mL dan 5 µg/mL. Dibuat tiga konsentrasi untuk mengetahui konsentrasi

efektif dari suatu antibiotik dalam menghambat atau membunuh mikroba. Dibuat

tiga replikasi agar didapat hasil yang tepat dari hasil rata-rata ketiga replikasi dan

meminimalkan kesalahan.

Pengujiaan ini digunakan dua jenis bakteri yaitu Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus. Sampel yang digunakan adalah kloramfenikol injeksi

kering baru dan kloramfenikol kadaluarsa dengan kloramfenikol baku sebagai

pembanding. Tujuan penggunaan kloramfenikol kadaluarsa untuk mengetahui

potensi dari dua kualitas antibiotik yang berbeda. Medium yang digunakan ialah

medium NA (nutrient agar). Medium NA terdiri dari ekstrak daging, pepton dan

agar. Ekstrak daging mengandung nitrogen organik dan senyawa karbon yang

berfungsi sebagai sumber vitamin dan energi bagi bakteri. Pepton berfungsi

sebagai sumber nitrogen organik dan sumber nutrisi bagi bakteri. Dan agar yang

berfungsi sebagai pemadat medium.

Tahap pertama yang dilakukan ialah pembuatan suspensi bakteri 1:40 dari

biakan bakteri murni dengan NaCl 1:40 dari biakan bakteri murni dengan NaCl

0,9% sebagai pengencer. Tujuan digunakannya NaCl 0,9% selain untuk

pengenceran suspensi bakteri menjadi 1:40 juga untuk menjaga pertumbuhan

bakteri karena larutan NaCl bersifat isotonis. Pengenceran suspensi bakteri 1:40

sebanyak 0,02 mL digunakan karena dianggap telah memenuhi 25% transmittan

untuk bakteri. Langkah selanjutnya ialah pembuatan larutan stok sampel uji

dilanjutkan dengan pembuatan larutan konsentrasi dari larutan stok sampel uji

dengan variasi konsentrasi 1,25 ppm, 2,5 ppm, dan 5 ppm. Variasi konsentrasi ini

untuk melihat potensi suatu antibiotik dengan berbagai konsentrasi dosis yang

baik dalam membunuh bakteri.

Uji ini dilakukan dengan menginokulasikan suspensi bakteri 1:40

sebanyak 0,02 mL ke dalam cawan petri dengan metode tuang. Jumlah 0,02 mL

digunakan agar koloni yang terbentuk tidak terlalu pekat dan zona bening dapat

dilihat dan diamati. Medium yang setengah padat kemudian diletakkan paper disk

yang sebelumnya telah direndam selama 5-10 menit pada tiga variasi konsentrasi

di atas medium. Selain tiga variasi konsentrasi uji dan baku, dilakukan pula

perendaman paper disk pada aquadest sebagai kontrol. Fungsi kontrol disini untuk

melihat apakah pelarut yang digunakan untuk membuat larutan stok dari tiga

variasi konsentrasi mempunyai potensi antimikroba atau tidak. Jika, ditemukan

zona bening pada perlakuan kontrol, hal ini memungkinkan kerja antibiotik uji

dipengaruhi aquades yang digunakan sebagai pelarut. Sehingga dalam hasil

pengamatan luas zona bening antibiotik uji perlu dikurangi luas zona bening

kontrol, sedangkan fungsi perendaman selama 5–10 menit sendiri agar larutan uji

dan baku berdifusi ke dalam paper disk kemudian diinkubasi cawan petri yang

telah diletakkan paper disk selama 1 x 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37 C,

digunakan suhu 37 C karena merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan

bakteri begitu pula dengan waktu 1 x 24 jam. Cawan petri diletakkan terbalik

ialah untuk menghindari adanya kontaminasi dari air yang mengembun selama

proses inkubasi dan menghindari rusakanya medium kemudian diamati dan diukur

zona bening.

Berdasarkan hasil pengukuran zona bening dapat diketahui kemampuan

dari antibiotik tersebut dalam menghambat atau membunuh bakteri dengan

membandingkan nilai FH (FHitung) dengan FT (FTabel). F. Hitung diperoleh

menggunakan tabel anava (analisis variasi) yang dihitung dengan perhitungan

statistik. Analisis Varians (Analysis of Variance), merupakan sebuah teknik

inferensial yang digunakan untuk menguji perbedaan rerata nilai. Digunakan

anava untuk menentukan apakah rerata nilai dari dua atau lebih sampel berbeda

secara signifikan. Dengan adanya tabel anava dapat diketahui konsentrasi efektif

yang berpotensi sebagai antimikroba. Dari hasil perhitungan didapatkan nilai FH

lebih rendah dari FT 1% maupun 5% sehingga didapatkan hasil yang non

signifikan atau tidak memiliki perbedaan yang terlalu jauh, namun potensi uji

lebih buruk dibanding baku. Nilai F tabel 1% menyatakan 99% tingkat ketelitian,

sedangkan F tabel 5% menyatakan 95% tingkat ketelitian.

Penentuan rasio potensi untuk kloramfenikol injeksi kering terhadap

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus berturut–turut ialah 0,532 dan 0,535

setelah dibandingkan dengan dosis rendah kloramfenikol 1,25 µg/mL, diketahui

bahwa potensi kloramfenikol uji lebih rendah dari pada bakunya. Sedangkan pada

penentuan rasio potensi untuk kloramfenikol injeksi kering kadaluarsa terhadap

Escherichia coli dan Staphylococcus aureus berturut – turut ialah 0,268 dan 0,226

setelah dibandingkan dengan dosis rendah kloramfenikol yaitu 1,25 µg/mL,

diketahui bahwa potensi kloramfenikol uji lebih rendah dari pada bakunya. Jadi

dapat disimpulkan bahwa Kloramfenikol injeksi kering dan kloramfenikol

kadaluarsa berpotensi terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus

aureus, namun potensi yang dimiliki lebih rendah dibanding kloramfenikol baku.

Berdasarkan literatur konsentrasi efektif kloramfenikol sebagai antibiotik

ialah untuk bakteri gram positif yang pada percobaan ini Staphylococcus aureus

ialah konsentrasi 1-10 µg/mL, sedangkan untuk bakteri gram negatif yaitu

Escherichia coli ialah pada konsentrasi 0,2-5 µg/mL. Berdasarkan dosis yang

digunakan pada percobaan ini yaitu 1,25 µg/mL, 2,5 µg/mL dan 5 µg/mL dapat

disimpulkan bahwa seharusnya dosis kloramfenikol yang diujikan potensinya

hampir sama dengan kloramfenikol baku, melihat semua dosis yang diujikan

sudah termasuk konsentrasi efektif untuk membunuh bakteri Escherichia coli dan

Staphylococcus aureus. Tetapi pada percobaan ini tidak didapat hasil yang sama

dengan literatur karena hasil yang didapat sampel baku lebih berpotensi daripada

sampel uji.