BAHAN DAN METODE - repository.ipb.ac.id · Percobaan, FATETA-IPB; dan Laboratorium Histologi, ... Formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol absolut, xylol,

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan April 2005 sampai dengan

September 2006. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pascapanen, Balai Besar

Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor; Laboratorium Hewan

Percobaan, FATETA-IPB; dan Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran

Hewan, IPB.

Bahan dan Alat

Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: Gabah dan

beras giling sebanyak 10 varietas berasal dari Balai Penelitian Padi, Sukamandi.

Varietas tersebut terdiri atas 4 varietas lokal (Pandan wangi, Rojolele, Bengawan

Solo, dan Cenana yaitu beras merah dari Bali), serta 6 varietas unggul baru, yaitu

2 varietas beramilosa rendah (Memberamo dan Lusi), 2 varietas beramilosa

sedang (Celebes dan Ciherang), dan 2 varietas beramilosa tinggi (Batang Piaman

dan Cisokan). Teh hijau diperoleh dari Kebun Percobaan Pasir Sarongge, Cianjur.

Untuk pengujian aktivitas hipoglikemik secara in vivo digunakan tikus putih

strain Sprague Dawley jantan.

Bahan-bahan kimia untuk analisis, antara lain: α-amilase, alkohol,

amiloglukosidase, horseradish peroksidase, chromogenico dianisidine, NaOH,

etanol, Kalium Iodida, buffer tris maleat, enzim termamyl, enzim pankreatin,

KOH, buffer Na-asetat, glukosa oksidase, HCLO4, indikator phenol red, pereaksi

Cu, pereaksi Nelson, glukosa bubuk murni, dan buffer Na-fosfat. Untuk analisis

histologi antara lain digunakan: NaCl fisiologis, larutan Bouin (campuran asam

pikrat jenuh, Formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1),

alkohol absolut, xylol, parafin, gliserin, pewarna Hematoxylin dan Eosin,

NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4.12H2O, monoklonal anti-insulin (Sigma I2018), H2O2,

metanol, akuades, diaminobenzidine (DAB), DAKO envision peroxidase (Code

No. K1491) dan bahan perekat preparat (neophren:toluen = 1:9). Selain itu

Formatted: Left: 4 cm, Right: 3 cm, Width: 21 cm, Height: 29,7 cm, Different first page

Deleted: ialah

37

digunakan aloksan (Sigma A6313) untuk membuat hewan model diabetes melitus,

sekam, serta bahan-bahan untuk ransum hewan percobaan, yaitu kasein, minyak

jagung, vitamin (Fitkom), mineral mix, dan selulosa.

Alat

Peralatan yang digunakan yaitu: glukometer, HPLC, Soxhlet, Kieljtek

Protein Analyser, rotary evaporator, sonde, freeze dryer, oven, spektrofotometer,

ekstraktor, tanur, pH meter, water bath, grinder, hot plate, centrifuge, dan neraca

analitik, serta alat-alat gelas. Untuk pembuatan produk diperlukan rice cooker,

dandang bertekanan (presto), kompor, panci serta perlengkapan lain untuk uji

organoleptik.

Peralatan untuk analisis histologi antara lain: Tissue embedding console,

bunsen, cetakan, gelas obyek, gelas penutup, kotak preparat, keranjang preparat,

jar, stop watch, mikrotom, mikroskop, pipet Eppendorf, magnetic stirer, mikrotip,

kertas label dan aluminium foil, serta alat-alat gelas. Untuk pemeliharaan hewan

percobaan diperlukan kandang plastik, tempat pakan dan minum tikus percobaan,

serta peralatan untuk pembuatan ransum.

Metode Penelitian

Penelitian ini dibagi dalam empat tahapan percobaan. Masing-masing

tahapan percobaan, diuraikan sebagai berikut:

Percobaan 1. Penapisan Aktivitas Hipoglikemik danAnalisis Komposisi Kimia

Berbagai Varietas Beras Indonesia

Sepuluh varietas beras terdiri atas 4 varietas lokal (Pandan wangi, Rojolele,

Bengawan solo dan Cenana/ beras merah dari Bali) serta 6 varietas unggul baru,

yaitu 2 varietas beramilosa rendah (Memberamo dan Lusi/ketan), 2 varietas

beramilosa sedang (Celebes dan Ciherang) dan 2 varietas beramilosa tinggi

(Batang Piaman dan Cisokan), diuji aktivitas hipoglikemiknya menggunakan

tikus percobaan. Sampel beras digiling dengan derajat sosoh 90%. Sebagai

pembanding digunakan beras ponni herbal Taj Mahal (beras impor yang

mencantumkan klaim sesuai untuk penderita diabetes).

Formatted: Finnish

Formatted: Finnish

Deleted: pagoda

Deleted: k

Deleted: serta Evaluasi Sifat Fisiko

Deleted: dan Gizi

38

Sebanyak tiga varietas yang memiliki aktivitas hipoglikemik tertinggi dan

beras Taj Mahal sebagai pembanding diuji komposisi kimianya, terutama yang

berkaitan dengan indeks glikemik. Analisis meliputi: komposisi proksimat beras

(air, abu, lemak, protein dan karbohidrat), pati, komposisi amilosa dan

amilopektin, gula total, pati resisten, serat pangan dan daya cerna pati in vitro.

Berdasarkan hasil analisis, ditentukan satu varietas terpilih untuk diproses lebih

lanjut menjadi beras fungsional untuk penderita diabetes melitus.

Uji Aktivitas Hipoglikemik

Pengujian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas hipoglikemik dari 10

varietas beras Indonesia dan beras Taj Mahal sebagai pembanding, menggunakan

tikus percobaan (n = 6). Tikus putih (Ratus novergicus) strain Sprague-Dawley

jantan dengan berat sekitar 150-200 g, dipuasakan selama satu malam, tetapi tetap

diberi minum secara ad libitum. Keesokan harinya, kadar glukosa tikus diukur

menggunakan glukometer (pengukuran menit ke-0). Selanjutnya tikus diberi

sampel ekstrak pati beras yang akan diuji aktivitas hipoglikemiknya. Pati beras

dilarutkan dalam air dan diberikan secara oral (4.5 g/kg berat badan). Setelah 30

menit, tikus diberi larutan D-glukosa 10% sebanyak 1 ml secara oral. Tiga puluh

menit kemudian, kadar glukosa darah tikus diukur dengan glukometer

(pengukuran menit ke-30). Pengukuran kadar glukosa yang sama dilakukan pada

menit ke-60, 90 dan 120. Hasil pengukuran kadar glukosa seluruh sampel beras

yang diuji dibuat kurva dan dibandingkan aktivitas hipoglikemiknya.

Bentuk sampel uji pada percobaan ini ialah ekstrak pati beras. Sampel pati

beras dipersiapkan dengan cara berikut: beras giling diproses menjadi tepung,

kemudian ditambah air 1:3 (b/v) dan diblender sehingga diperoleh slurry.

Selanjutnya slurry disaring, filtrat diuapkan sebagian airnya menggunakan rotary

evaporator, kemudian dikeringbekukan menggunakan freeze dryer.

Pengukuran Kadar Glukosa Darah pada Tikus Percobaan

Kadar glukosa darah ditentukan dengan metode glucose oxidase biosensor,

menggunakan alat ”One Touch Ultra” (alat monitoring glukosa darah, diproduksi

oleh Lifescan Johnson & Johnson Company, 2002). Darah diambil dari ekor

tikus, dengan cara ekor tikus uji dibersihkan lalu dipijat atau diurut perlahan-

Formatted: Font: Italic

Deleted: Seluruh sampel

Deleted: penelitian

Deleted:

Deleted: sifat fisikokimia dan zat gizinya

Deleted: (disebut: beras X)

Deleted: BI

Deleted: buat

Deleted:

Deleted: vapor

Deleted: menggunakan

Deleted: B

Deleted: I

Deleted: BIl

39

lahan, kemudian bagian ujung ditusuk dengan jarum (lancet). Darah yang keluar

kemudian ditempelkan pada strip glukometer (Soemardji 2004). Kadar glukosa

darah akan terukur dan nampak pada layar glukometer setelah 5 detik, dinyatakan

dalam mg/dl.

Kadar Amilosa (Khush et al. 1986)

Sampel tepung beras (60 mesh) sebanyak 100 g dimasukkan ke dalam labu

ukur 100 ml, ditambah 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1 N. Campuran tersebut

disimpan pada suhu kamar selama 24 jam. Sampel kemudian ditambah air

destilata sampai batas 100 ml, dan dikocok sempurna. Larutan pati diambil 8 ml,

dimasukkan ke dalam tabung Autoanalyzer. Larutan segar (fresh working

solution) dipersiapkan dari 1 ml asam asetat 1 N dan 3 ml larutan stok iodine (2

mg iodine dan 200 mg potasium iodine per ml) dilarutkan sampai 100 ml. Sampel

dan standar beras yang telah diketahui kadar amilosanya dianalisis menggunakan

Technicon Autoanalyzer. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase kadar amilosa

beras giling, basis kering.

Perhitungan:

Faktor konversi (fk) = Cs/ A608

Cs = Kadar amilosa standar

A608 = Absorban larutan standar pada λ = 608 nm

Kadar amilosa (%) = A608 x fk,

Dimana A608 = Absorbansi sampel pada λ = 608 nm

Kadar Air, metode oven (AOAC 1995)

Sampel sebanyak 0.2 gram ditimbang dalam wadah yang sudah diketahui

beratnya, kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 100 – 1050C selama 2

jam, setelah itu didinginkan dalam eksikator dan ditimbang. Pengeringan

dilakukan lagi sebanyak 2 x selama 4 jam dan didinginkan lalu ditimbang,

sehingga didapatkan sampel dengan berat yang konstan, selisih berat bahan

sebelum dan sesudah penguapan merupakan jumlah air bahan.

Kadar air = Berat bahan awal-berat bahan akhir x100 % Berat bahan awal

Deleted: Tetesan d

Deleted: diperoleh

Deleted: alat

Deleted: L

Deleted: BI

Deleted: ¶

Deleted: ¶

40

Daya Cerna Pati in vitro (Muchtadi 1989)

Prinsip metoda ini ialah pati dihidrolisis oleh enzim α-amilase. Kemudian

maltosa yang dihasilkan diukur jumlahnya menggunakan spektrofotometer setelah

direaksikan dengan asam dinitrosalisilat. Daya cerna pati sampel dihitung sebagai

persentase relatif terhadap pati murni.

Prosedur analisis daya cerna pati sbb:

Suspensi tepung (1% dalam air destilata) dipanaskan dalam penangas air

selama 30 menit sampai mencapai suhu 90ºC, kemudian didinginkan, diambil

sebanyak 2 ml larutan tepung, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah

3 ml air destilata dan 5 ml larutan bufer Na-fosfat 0.1 M, pH 7.0. Kemudian

diinkubasikan dalam penangas air 37ºC selama 15 menit. Kedalam larutan

tersebut ditambahkan 5 ml larutan enzim α-amilase dan diinkubasikan lagi

pada suhu 37ºC selama 15 menit.

Kedalam tabung reaksi lain ditempatkan 1 ml campuran reaksi. Kemudian

ditambahkan 2 ml pereaksi dinitrosalisilat, dan selanjutnya dipanaskan dalam

penangas air 100ºC selama 10 menit. Setelah didinginkan, campuran reaksi

diencerkan dengan menambahkan 10 ml air destilata. Warna oranye-merah

yang terbentuk dari campuran reaksi diukur absorbansinya menggunakan

spektrofotometer, panjang gelombang 520 nm.

Kadar maltosa dari campuran reaksi dihitung dengan menggunakan kurva

standar maltosa murni yang diperoleh dengan cara mereaksikan larutan

maltosa standar dengan pereaksi dinitrosalisilat menggunakan prosedur seperti

diatas. Daya cerna pati sampel dihitung sebagai persentase relatif terhadap pati

murni sebagai berikut:

Kadar maltosa sampel setelah reaksi enzim Daya cerna = --------------------------------------------------------- x 100 Kadar maltosa pati murni setelah reaksi enzim

Penentuan Kadar Serat Pangan

Penentuan serat pangan larut, serat pangan tidak larut dan serat pangan total

dilakukan menggunakan metoda enzimatik (Asp et al. 1983 diacu dalam

Muchtadi 1992), sebagai berikut:

Deleted: ¶¶

Deleted: .

41

Satu gram sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Kedalamnya

ditambahkan 25ml bufer Natrium Fosfat, dan dibuat menjadi suspensi.

Penambahan bufer dimaksudkan untuk menstabilkan enzim termamyl.

Selanjutnya ditambah 100 μl termamyl, ditutup dan diinkubasi pada suhu

100oC selama 15 menit, sambil sesekali diaduk. Tujuan penambahan termamyl

dan pemanasan ialah untuk memecahkan pati dengan menggelatinisasikan

terlebih dahulu. Setelah dingin, ditambah 20 ml air destilata dan pH-nya diatur

menjadi 1.5 dengan menambahkan HCl 4 M. Selajutnya ditambahkan 100 mg

pepsin. Pengaturan pH hingga 1.5 dimaksudkan untuk mengondisikan agar

aktivitas enzim pepsin maksimum.

Erlenmeyer ditutup dan diinkubasikan pada suhu 40oC dan diagitasi

selama 60 menit. Kemudian ditambah 20 ml air destilata dan pH diatur

menjadi 6.8 dengan NaOH. Pengaturan menjadi pH 6.8 ditujukan untuk

memaksimumkan aktivitas enzim pankreatin. Ditambahkan 100 ml enzim

pankreatin. Ditutup dan diinkubasi pada suhu 40oC selama 60 menit sambil

diagitasi. Selanjutnya pH diatur dengan HCl menjadi 4.5, disaring melalui

crucible kering yang telah ditimbang beratnya (porositas 2) yang mengandung

0.5 g celite kering (berat tepat diketahui). Dicuci dengan 2 x 10 ml air

destilata.

Residu (Serat pangan tidak terlarut = IDF)

Hasil diatas dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95% dan 2 x 10 ml aseton, lalu

dikeringkan pada suhu 105oC, sampai berat tetap (sekitar 12 jam), dan

ditimbang setelah didinginkan di dalam desikator (D1). Selanjutny diabukan ke

dalam tanur 500oC selama paling sedikit 5 jam, lalu ditimbang setelah

didinginkan dalam desikator (I1).

Filtrat (Serat pangan larut = SDF)

Volume filtrat diatur dengan air sampai 100 ml, lalu ditambah 400 ml etanol

95% hangat (60oC), diendapkan selama 1 jam. Selanjutnya disaring dengan

crucible kering (porositas 2) mengandung 0.5 celite kering, dicuci lagi dengan

2 x 10 ml etanol 78 %, dan 2 x 10 ml aseton

Deleted: BI

Deleted: BI

Deleted: BI

42

Penentuan Kadar Pati Resisten

Bahan yang diperlukan: Buffer tris maleat, α-amilase, pancreatic, etanol,

KOH, asam asetat, enzim amiloglukosidase, buffer Na-asetat dan pereaksi untuk

glukosa oksidase. Pelarut : Larutan enzim amilase 50 unit/ml dalam buffer tris

maleat 0.1 M pH (4mμ calcium clorida), Etanol 80%, KOH 4M, Asam asetat 2M,

Amiloglukosidase (200 unit/ml dalam buffer Na-asetat 0.1M, pH 4.5)

Prosedur analisis :

Sampel bebas lemak ditimbang sebanyak 100 mg, ditambah 10 ml larutan

enzim amilase, kemudian dikocok pada suhu 37oC selama 16 jam, ditambah

40 ml etanol dan dibiarkan selama 1 jam. Lalu disentrifuse (400 rpm),

endapan dibilas dengan etanol 80% (2x), dan dikeringkan (60oC),

ditambahkan 1.56 ml H2O kemudian ditambah lagi dengan 1.5 ml KOH 4 M.

Dikocok selama 30 menit pada suhu kamar dan ditambah 12 ml H2O

Campuran diatas diambil 1.5 ml, ditambahkan 0.65 asam asetat 2 M

(mencapai pH 4.5) dan 0.1 ml amiloglukosidase. Kemudian diinkubasikan

selama 90 menit suhu 65oC. Kemudian diambil 2 ml untuk penentuan glukosa

dengan metoda glukosa oksidase.

Penentuan Glukosa Oksidase

Prinsip metode ini ialah glukosa dioksidasi secara enzimatis dengan glukosa

oksidase menghasilkan H2O2. Selanjutnya, H2O2 akan membentuk warna stabil

dengan bantuan enzim peroksidase. Intensitas warna tergantung dari konsentrasi

glukosa.

Reagen yang diperlukan meliputi: Glukosa oksidase 1000 unit/ml,

Horseradish peroxidase, Chromogenico-dianisidine 2 HCl, Buffer asetat pH 5.5

(larutkan 13.608 gr NaOAc.3H2O dan dijadikan 1 liter dengan H2O, ditambahkan

2.7 ml HOAc dan jika perlu diatur dengan NaOAc atau HOAc)

Larutan penguji : Dilarutkan 40 mg chromogen, 40 mg horseradish peroxidase

dan 0.4 ml glukosa oksidase di dalam buffer asetat dan encerkan hingga volume

100 ml dengan buffer serupa. Larutan standar : Glukosa 1 mg/ml (didiamkan

selama satu jam agar terjadi mutarorasi). Persiapan kurva standar dan dilakukan

penentuan glukosa dalam contoh

Formatted: Bullets andNumbering

Deleted: ¶D

Deleted: 16 jam

Deleted: ,

Deleted: BI

Deleted: BI

43

Percobaan 2. Pengembangan Proses Pembuatan Beras Pratanak dan Beras Instan Fungsional

Beras fungsional dalam penelitian ini dibuat dari beras Memberamo, yaitu

varietas beras terpilih pada Percobaan 1, yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau.

Proses pengolahan dalam pembuatan beras fungsional yang dilakukan adalah:

pengolahan beras pratanak (parboiled rice) dan pengolahan beras instan. Untuk

mendapatkan beras fungsional tersebut, maka pada percobaan ini dibagi dalam

tiga tahap yaitu: a) Penentuan kondisi ekstraksi teh hijau, b) Penentuan kondisi

proses pengolahan beras pratanak dan beras instan, dan c) Proses pengolahan

beras pratanak fungsional dan beras instan fungsional

a) Penentuan Kondisi Ekstraksi Teh Hijau

Pada tahap ini dilakukan optimasi ekstraksi teh hijau sehingga didapatkan

kondisi optimum ekstraksi (waktu, suhu dan rasio teh dengan air). Ekstrak teh

hijau dalam bentuk filtrat, dipekatkan menggunakan rotari evaporator, hingga

diperoleh konsentrat. Analisis yang dilakukan meliputi rendemen dan aktivitas

antioksidan.

Optimasi Ekstraksi Teh Hijau

Tujuan dari tahapan ini adalah mendapatkan metode ekstraksi teh hijau yang

optimum. Ekstraksi dilakukan menurut metode Lee dan Widmer (2000) dengan

modifikasi perlakuan suhu, waktu ekstraksi, dan perbandingan antara teh dengan

air (Gambar 6).

Teh hijau kering dihancurkan dengan dish mill, kemudian diayak

menggunakan ayakan goyang ukuran 32 mesh untuk mendapatkan ukuran teh

hijau yang kecil dan seragam. Bubuk teh tersebut kemudian diekstrak dengan cara

dilarutkan dan diaduk dalam air panas suhu 75, 85, dan 950C dengan

perbandingan masing-masing teh dengan air sebesar 10:100, 15:100, dan 20:100

(b/v). Waktu ekstraksi yang digunakan adalah 2, 4, 6, 8, 10, 15 dan 20 menit. Teh

yang telah diekstrak tersebut kemudian disaring dengan alat saring vacuum untuk

mendapatkan ekstrak teh murni. Kemudian ekstrak teh murni dianalisis TPT

(total padatan terlarut) dengan metode oven dan refraktometer. Hasil TPT oven

dihitung rendemennya.

44

Analisis rendemen dihitung pada setiap perlakuan suhu (75, 85, dan 950C),

dengan pengaruh kombinasi perlakuan waktu ekstraksi (2, 4, 6, 8, 10, 15 dan 20

menit) dan rasio teh dengan air (10:100, 15:100, dan 20:100 (b/v) untuk

mendapatkan kondisi rasio teh dengan air serta waktu ekstraksi optimal pada

setiap perlakuan suhu. Tiga sampel dengan kombinasi optimal dari setiap

perlakuan suhu tersebut dianalisis rendemen dan aktivitas antioksidannya dengan

metode DPPH, sehingga didapatkan satu kombinasi perlakuan suhu, waktu, dan

rasio teh dengan air yang optimal untuk digunakan dalam penelitian selanjutnya.

Gambar 6. Diagram alir proses optimasi ekstraksi teh hijau.

Analisis Ekstrak Teh Total Padatan Terlarut (metode oven)

Cawan kosong dikeringkan dalam oven 1000C selama 15 menit dan

didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang (a gr, untuk cawan alumunium

didinginkan selama 10 menit dan cawan porselin didinginkan selama 20 menit).

Kemudian sampel yang telah dihomogenkan dengan cawan ditimbang dengan

neraca analitik sejumlah kurang lebih 5 gram (x gr) dengan cepat. Cawan beserta

TEH HIJAU

Penggilingan

Ekstraksi : Teh:air = 10:100; 15:100; 20:100 (b/v) t = 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20 menit T = 75, 85, 95ºC

EKSTRAK TEH HIJAU

Pengayakan (32 mesh)

Penyaringan

Deleted: BI

45

isinya ditempatkan di dalam oven selama 6 jam. Kontak antar cawan dengan

dinding oven dihindarkan. Cawan dipindahkan ke dalam deksikator untuk

didinginkan, setelah dingin ditimbang kembali (y gr). Kemudian, dikeringkan

kembali ke dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap. (Apriyantono et al.

1989).

Perhitungan :

TPT (%bk) = y – a / x

a = berat cawan kosong kering (g)

x = berat sampel awal (g)

y = Berat cawan + sampel kering Total Padatan Terlarut ( Refraktometer ABBE)

Prisma refraktometer dibersihkan dengan alkohol, kemudian diteteskan

sampel di atas prisma pengukuran, lalu ditutup. Alat refraktometer diarahkan ke

cahaya dan dibaca skalanya (% brix).

Rendemen

Besarnya rendemen dihitung berdasarkan persentase berat serbuk ekstrak

kering dibagi berat teh hijau kering yang diekstrak. Serbuk ekstrak kering

diperoleh melalui hasil kali berat ekstrak murni teh dengan TPT oven. Rendemen

ditentukan dengan rumus :

Rendemen = a/b x 100 %

a : serbuk ekstrak kering

(berat ekstrak x TPT oven)

b : berat sampel teh hijau

Pengujian Aktivitas Antioksidan.

Buffer asetat 100 mM 1 ml ( pH 5.5), 1.87 ml etanol dan 0.1 ml radikal

bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3 mM dalam metanol dimasukkan

ke dalam tabung reaksi. Kemudian sebanyak 0.03 ml larutan sampel ditambahkan

ke dalam tabung tersebut dan diinkubasi 250C selama 20 menit. Absorbansi yang

dihasilkan dibaca pada 517 nm. Penurunan absorbansi menunjukkan adanya

aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan. Untuk pembuatan kurva standar

46

digunakan Trolox®, sehingga satuannya dinyatakan dalam TEAC (Trolox

Equivalen Antioxidant Capacity). ( Kubo et al. 2002)

Rancangan Percobaan

Pada tahap optimasi proses ekstraksi teh hijau, rancangan percobaan yang

digunakan adalah Rancangan Faktorial menggunakan dua faktor, yaitu rasio teh

dengan air, dan waktu ekstraksi. Faktor rasio teh dengan air terdiri atas tiga taraf,

yaitu: 10:100; 15:100 dan 20:100 b/v. Sedangkan faktor waktu ekstraksi terdiri

atas tujuh taraf, yaitu 2; 4; 6; 8; 10; 15 dan 20 menit.

Model matematik umum yang digunakan adalah :

Yijk = µ + Ai + Bj + (AB)ij + εijk

Keterangan :

Yijk = Rendemen hasil pengamatan dari faktor rasio teh dengan air

level ke-i, faktor waktu ekstraksi level ke-j

µ = Nilai tengah populasi (rata-rata yang sesungguhnya)

Ai = Pengaruh faktor rasio teh dengan air level ke-i,

Bj = Pengaruh waktu ekstraksi level ke-j

(AB)ij = Pengaruh interaksi antara rasio teh dengan air dan waktu ekstraksi

εijk = Faktor galat (sisa)

Data diolah menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika terjadi

beda nyata pada faktor perlakuan pada selang kepercayaan 95%, dilanjutkan

dengan uji beda Duncan. Rancangan ini dilakukan untuk setiap taraf suhu (75;

85 dan 95ºC).

Untuk menentukan waktu ekstraksi, rasio teh dengan air dan suhu

optimum dilakukan analisis data rendemen dan aktivitas antioksidan

Yij = µ + Ai + εij

Keterangan

Yij = Nilai hasil pengamatan dari faktor A level ke-i, ulangan ke-j


Ai = Pengaruh suhu ekstraksi

εijk = Faktor galat (sisa)

Formatted: Justified

Formatted: German(Germany)









Formatted: Swedish (Sweden)

Formatted: Indent: Left: 0cm

Formatted: Danish

Formatted: Dutch(Netherlands)






Formatted: Indent: First line: 1,01 cm

Formatted: No underline

Formatted: Font: Not Bold


Formatted: Font: Not Bold,Swedish (Sweden)

Formatted: No underline







Formatted: Spanish(Spain-Modern Sort)

Formatted

Formatted

Formatted ... [2]

... [1]

... [3]

47

Data diolah menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA). Jika terjadi beda

nyatapada faktor perlakuan pada selang kepercayaan 95%, dilanjutkan dengan

uji beda Duncan.

b) Penentuan Kondisi Proses Pengolahan Beras Pratanak dan Beras Instan

Pada tahap ini dilakukan penentuan cara pembuatan beras pratanak dan

beras instan yang sesuai untuk diaplikasikan dalam pengolahan beras fungsional

un tuk penderita diabetes melitus.

Proses Pembuatan Beras Pratanak

Pembuatan beras pratanak merupakan proses yang unik, karena tahap

pengolahan dimulai pada saat bahan masih berbentuk gabah (Garibaldi 1972; De

Datta 1981). Oleh sebab itu proses ini dikenal dengan istilah pratanak

(parboiled). Cara pembuatan beras pratanak sangat beragam, namun pada

prinsipnya melalui tiga tahapan proses, yaitu perendaman (steeping) di dalam air,

pengukusan (steaming), dan pengeringan (drying). Sebelum proses pratanak

dimulai, bahan yaitu gabah terlebih dahulu dilakukan pembersihan (precleaning).

Beberapa perlakuan yang diaplikasikan untuk mendapatkan proses yang

diinginkan, akan diuraikan dibawah ini.

Pembersihan

Tujuan pembersihan adalah untuk mendapatkan gabah yang bersih

dari kotoran-kotoran yang terdapat dalam gabah seperti jerami, kerikil dan

tanah. Cara yang biasanya dilakukan, yaitu cara pengapungan dengan air,

sehingga gabah hampa dan jerami dapat mengapung di bagian atas

instalasi pembersih. Cara lain menggunakan aspirator untuk memisahkan

kotoran kecil dan ringan, atau menggunakan mesin pembangkit magnit

untuk memisahkan kotoran besar tetapi ringan dan kotoran kecil tetapi

berat.

Menurut Garibaldi (1972), kotoran-kotoran tersebut dapat

mempengaruhi hasil pratanak. Selama perendaman kotoran akan

terdekomposisi, terfermentasi dan meninggalkan suspensi di dalam air

kotor. Air terpolusi ini kemudian terabsorbsi oleh gabah yang

mempengaruhi flavor, bau dan warna bahkan mengurangi mutu pangan.

Formatted: Portuguese(Brazil)

Formatted: Indent: Left: 0,62cm, Hanging: 0,04 cm, Tabs:Not at 2,31 cm

Formatted: Justified

Formatted: Font: Not Italic,Portuguese (Brazil)

Formatted: Font: Not Bold,Not Italic, Portuguese (Brazil)

Formatted: Indent: First line: 0,99 cm

Deleted: ¶

Deleted: BI

Deleted: (precleaning)

Deleted: , dll

Deleted: BI

Deleted: s

48

Pembersihan gabah penting sekali guna mendapatkan kondisi optimum

dan keseragaman hasil. Selain itu, tingkat kemurnian varietas yang tinggi

akan menghasilkan beras pratanak yang bermutu bagus.

Perendaman

Perendaman merupakan tahap pertama di dalam pembuatan beras

pratanak. Perendaman dilakukan pada suhu 60oC, dengan perbandingan

gabah dan air 1:2 dan 1:3 dan dengan lama perendaman 4 jam sehingga

menghasilkan kadar air gabah ± 30 %. Suhu yang terlalu tinggi akan

menghasilkan kadar air gabah lebih dari 30 % dan waktu perendaman

yang terlalu lama menyebabkan terjadinya fermentasi (Garibaldi 1972).

Pengukusan

Pengukusan atau pemasakan dilakukan dengan menggunakan presto

pada tekanan 80 Kpa (= 0.7895 ATM), dan mampu menghasilkan gabah

dengan sekam yang sedikit pecah. Dengan sedikit pecahnya sekam

diharapkan pada proses tersebut ekstrak teh hijau dapat masuk ke dalam

gabah.

Lama pemasakan dalam presto dilakukan dengan berbagai waktu

pemasakan yaitu 10, 15, 20 dan 25 menit untuk mendapatkan gabah yang

cukup tergelatinisasi dengan sekam yang sedikit terbuka (pecah).

Gelatinisasi terjadi apabila suspensi pati dalam air dipanaskan. Perubahan

selama terjadinya gelatinisasi yaitu, mula-mula suspensi pati keruh seperti

susu, kemudian berubah jernih pada suhu tertentu tergantung pada jenis

pati yang digunakan. Terjadinya translusi larutan pati tersebut biasanya

diikuti oleh pembengkakan granula.

Pengeringan

Pengeringan terhadap gabah yang telah direndam dan dimasak harus

dilakukan dengan segera untuk menghindarkan pertumbuhan jamur dan

terjadinya fermentasi. Pengeringan ini merupakan tahap akhir dalam

pengolahan gabah secara pratanak. Pengeringan gabah pratanak ini

menggunakan oven yang dilakukan dalam 2 tahap untuk mendapatkan

kadar air 12-14 %. Pengeringan tahap pertama, pada suhu 100oC hingga

mencapai kadar air 18-20 %.

Deleted: ¶

Deleted: BI

Deleted: h

49

Gambar 7. Diagam alir proses pembuatan beras pratanak (parboiled rice).

Apabila suhu yang digunakan kurang dari 100oC maka akan

menambah waktu pengeringan, dan waktu pengeringan yang terlalu lama

akan menyebabkan gabah terfermentasi. Sedangkan bila suhu pengeringan

lebih dari 100oC, maka penguranga air terlalu cepat sehingga jumlah

gabah retak akan semakin banyak dan beras yang patah akan semakin

banyak saat dilakukan penggilingan. Untuk mencegah retak pada butir

beras selama pengeringan, proses pengeringan dihentikan untuk sementara

waktu apabila kadar air telah mencapai 18-20%, kemudian pengeringan

dimulai lagi. Pengeringan tahap kedua dilakukan secara lambat untuk

mencegah butir beras retak lebih banyak, yaitu pada suhu 60oC hingga

Perendaman: suhu 60oC Air:gabah = 1:2 dan 1:3

Pemasakan: P= 80 kPa t = 10, 15, 20 dan 25 menit

Pengeringan I, T = 100oC t = 35, 45, 55, 60 menit (Ka 18-20%)

Penggilingan

Pengeringan II, T = 60oC t = 25, 30, 35, 40 menit (Ka <12-14%)

Gabah

Beras pratanak

Tempering selama 3 jam suhu kamar

Gabah pratanak

Kadar air 30%?

Tergelatinisasi?

Deleted: Apabila proses pengeringan tahap pertama telah selesai maka diperlukan interval waktu selama 3 jam pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan tahap kedua pada suhu 60oC, dengan variasi waktu yaitu 25, 30, 35, dan 40 menit sampai mendapatkan kadar air 12-14%. Pengeringan secara perlahan-lahan bertujuan untuk menghindari terjadinya beras pecah saat penggilingan. Tahap penentuan proses beras pratanak disajikan pada Gambar 7.¶

Deleted: n

50

mencapai kadar air 12-14 %. Pengeringan tahap pertama pada suhu 100oC

dilakukan dalam 4 variasi waktu yaitu: 35, 45, 55, dan 60 menit untuk

mencapai kadar air 18-20%.

Apabila proses pengeringan tahap pertama telah selesai maka

diperlukan interval waktu selama 3 jam pada suhu kamar. Kemudian

dilanjutkan proses pengeringan kedua pada suhu 60oC, dengan variasi

waktu yaitu 25, 30, 35, dan 40 menit sampai mendapatkan kadar air 12-

14%. Pengeringan secara perlahan-lahan bertujuan untuk menghindari

terjadinya beras pecah saat penggilingan. Tahap penentuan proses beras

pratanak disajikan pada Gambar 7.

Proses Pembuatan Beras Instan

Beras instan pada dasarnya sudah mengalami pemasakan awal dan

gelatinisasi sampai tingkat tertentu di dalam air, atau dikukus, atau dilakukan

keduanya. Beras yang dimasak sampai matang atau hampir matang tersebut

kemudian dikeringkan sedemikian rupa hingga biji-biji beras menjadi banyak

berpori dan dalam keadaan struktur yang terbuka. Hasil olahan akhir berupa biji-

biji kering, yang lepas satu sama lain, tanpa menggerombol, dan besar volumenya

1.5-3.0 kali volume beras mentahnya. Air mendidih yang digunakan pada

penyiapan akhir untuk penyajian harus dapat meresap ke dalam biji-biji beras

dengan waktu yang relatif pendek.

Penentuan Kondisi Pengolahan Beras Instan

Secara umum, proses pembuatan beras instan terdiri atas 5 tahap,

yaitu: 1) Pencucian, 2) Perendaman, 3) Pemasakan dengan tekanan, 4)

Pembekuan, dan 5) Pengeringan. Diagram alir proses pembuatan beras

instan dapat dilihat pada Gambar 8.

1) Pencucian

Beras varietas terpilih dari percobaan 1, dilakukan pencucian

untuk menghilangkan pasir, tanah atau kotoran yang lain. Pencucian

dilakukan hingga tidak ada lagi benda kotor terlihat. Pencucian

dilakukan sebanyak 3 kali.



Formatted: Line spacing: single

51

2) Perendaman

Proses perendaman dilakukan dalam tiga suhu yang berbeda,

yaitu: 30, 40 dan 50oC, masing-masing selama 2 jam. Tahapan

perendaman dilakukan untuk mendapatkan kadar air yang sesuai

dengan persyaratan kadar air akhir setelah perendaman. Kadar air

akhir yang diinginkan dalam proses perendaman yaitu 40%.

Perbandingan air perendaman dan beras adalah 1:1, atau untuk setiap

100 g beras, digunakan air perendaman sebanyak 100 ml.

3) Pemasakan dengan Tekanan

Penentuan metode pemasakan dengan tekanan dilakukan dalam

satu faktor yaitu waktu pemasakan. Pada perbandingan air dengan

beras adalah 1:1 atau untuk 100 gram beras maka air pemasakan 100

ml. Pemasakan pada beras instan dilakukan dengan presto yang

bekerja pada tekanan 80 Kpa. Penentuan waktu pemasakan dilakukan

dengan tiga taraf yaitu 5, 10, dan 15 menit.

Tujuan perlakuan ini untuk mendapatkan nasi yang matang dan

telah tergelatinisasi sempurna. Penentuan tingkat kematangan nasi

mengikuti metode IRRI (1986). Kriteria mutu nasi yang telah matang

yaitu pada nasi sudah tidak ada lagi bintik putih seperti tepung, tetapi

telah berubah menjadi bening atau transparan.

4) Pembekuan

Proses pembekuan dilakukan secara cepat dan tidak boleh

ditunda hingga nasi dingin. Perlakuan pembekuan pada beras instan

dilakukan selama 24 jam pada suhu -4oC. Setelah tahap pembekuan,

kemudian dilakukan proses thawing. Proses thawing dilakukan dengan

suhu 50oC selama 5 menit, hal ini dilakukan agar beras instan tidak

menggumpal.

5) Pengeringan

Pengeringan dilakukan pada suhu 60oC selama 4 jam hingga

bahan menjadi kering dan berbentuk seperti kristal bening dan keras.

52

Uji k.a. 40%

Uji mutu tanak Gambar 8. Diagram alir pembuatan beras instan.

c) Pengolahan Beras Pratanak Fungsional dan Beras Instan Fungsional

Tahap ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi ekstrak teh hijau

optimum yang mempunyai aktivitas hipoglikemik terbaik dari masing-masing

cara pengolahan beras fungsional. Beras fungsional antidiabetes diproses dari

beras Memberamo yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau [hasil tahap a)].

Pengolahan Beras Memberamo Pratanak Fungsional

Penentuan Konsentrasi Penggunaan Ekstrak Teh Hijau

Penentuan konsentrasi ekstrak teh hijau dilakukan dalam dua taraf,

yaitu 7 dan 14%.

Beras X

Pencucian

Perendaman Beras:air = 1:1; t = 2jam T: A1 = 30 oC A2 = 40 oC; A3 = 50 oC

Permasakan bertekanan P = 80 kPa; Beras: air = 1:1 t: 5 ; 10,15 menit

Pembekuan t = 24 jam; T = -4 oC

Thawing t = 5 mnt; T = 50 oC

Pengeringan t = 4 jam; T = 60 oC

Beras Instan

Deleted: 3) Pemasakan dengan tekanan¶Penentuan metode pemasakan dengan tekanan dilakukan dalam satu faktor yaitu waktu pemasakan. Pada perbandingan air dengan beras adalah 1:1 atau untuk 100 gram beras maka air pemasakan 100 ml. Pemasakan pada beras instan dilakukan dengan presto yang bekerja pada tekanan 80 Kpa. Penentuan waktu pemasakan dilakukan dengan tiga taraf yaitu 5, 10, dan 15 menit. Tujuan perlakuan ini untuk mendapatkan nasi yang matang dan telah tergelatinisasi sempurna. Penentuan tingkat kematangan nasi mengikuti metode IRRI (1986). Kriteria mutu nasi yang telah matang yaitu pada nasi sudah tidak ada lagi lapisan putih seperti tepung, tetapi telah berubah menjadi bening atau transparan.¶

53

Pembuatan Beras Pratanak Fungsional

Gambar 9. Diagam alir proses pembuatan beras pratanak fungsional dengan ekstrak teh hijau.

Pada konsentrasi tersebut diharapkan mampu mendapatkan kadar total

fenol dalam beras pratanak sebesar 1%. Penambahan ekstrak teh hijau

dalam pembuatan beras pratanak fungsional dilakukan dalam dua tahap,

yaitu tahap perendaman dan tahap pemasakan.

Diagam alir proses pembuatan beras pratanak fungsional dengan

ekstrak teh hijau dapat dilihat pada Gambar 9. Proses pembuatan beras

pratanak dengan penambahan ekstrak polifenol teh hijau dilakukan dengan

cara pembersihan, perendaman selama 4 jam pada suhu 60oC, pemasakan

Perendaman T=60oC, t=4 jam Ekstrak teh hijau 7 dan 14%

Pemasakan P=80 kPa, t=20 menit Ekstrak teh hijau 7 dan 14%

Pengeringan I, T= 100oC, t=60 menit (k.a. 18-20%)

Penggilingan, 2 kali sosoh

Pengeringan II, T=60oC t=25 mnt (k.a. <12-14%)

Gabah Memberamo

Beras Memberamo pratanak fungsional

Gabah pratanak

Tempering pada suhu kamar selama 3 jam

Formatted: Justified, Indent:Left: 1 cm, First line: 0,98 cm,Line spacing: 1.5 lines

Deleted: Proses pembuatan beras pratanak dengan penambahan ekstrak polifenol teh hijau dilakukan dengan cara pembersihan, perendaman selama 4 jam pada suhu 60oC, pemasakan dengan menggunakan presto pada 80 Kpa selama 20 menit, serta pengeringan tahap I pada suhu 100oC selama 60 menit dan pengeringan tahap II pada suhu 60oC selama 25 menit.

54

dengan menggunakan presto pada 80 kPa (0.7895 STM) selama 20 menit,

serta pengeringan tahap I pada suhu 100oC selama 60 menit dan

pengeringan tahap II pada suhu 60oC selama 25 menit.

Rancangan Percobaan

Pada tahap percobaan proses pembuatan beras pratanak dengan penambahan

ekstrak teh hijau ini, rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan

Faktorial menggunakan dua faktor, yaitu proses pembuatan beras pratanak dan

konsentrasi ekstrak teh. Faktor proses pembuatan beras pratanak fungsional,

terdiri atas dua taraf yaitu perendaman dan pemasakan. Sedangkan faktor

konsentrasi ekstrak teh hijau menggunakan dua taraf, yaitu 7 dan 14%.

Faktor A = Perendaman taraf 7% (A1) dan 14% (A2)

Faktor B = Pemasakan taraf 7% (B1) dan 14% (B2)

Model matematik umum yang digunakan adalah :

Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk

Keterangan :

Yijk = Nilai pengamatan pada satuan percobaan ke-k yang memperoleh

kombinasi perlakuan ij (taraf ke-i dari faktor A dan taraf ke-j dari

faktor B)


αi = Pengaruh perlakuan pada beras taraf ke-I dari faktor A

βj = Pengaruh konsentrasi ke-j dari faktor B

(αβ)ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B

εijk = Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh

kombinasi perlakuan ij.

Jika F hitung menunjukkan perbedaan nyata, maka dilanjutkan dengan uji

beda Duncan.

Pengolahan Beras Memberamo Instan Fungsional

Pembuatan Beras Instan Polifenol Ekstrak Teh

Pembuatan beras instan dengan penambahan ekstrak teh hijau

dilakukan pada dua tahapan inti yaitu: perendaman (Steeping) dan

Deleted: ¶Pembuatan beras pratanak fungsional dilakukan dengan penambahan ekstrak teh hijau pada 2 tahap dengan konsentrasi yang berbeda yaitu pada tahap perendaman dan pemasakan, masing-masing menggunakan 2 taraf konsentrasi yaitu 7 dan 14%. Analisis yang dilakukan terhadap beras pratanak fungsional tersebut meliputi uji organoleptik pada beras pratanak (warna dan tekstur) serta nasi pratanak (warna, rasa dan tekstur), serta analisis komposisi kimia meliputi kadar air, abu, amilosa, pati, total fenol, dan serat pangan (serat larut dan serat tidak larut air). ¶¶

55

pemasakan dengan tekanan (Pressure cooking). Penambahan ekstrak teh

hijau ini dilakukan untuk mendapatkan hasil terbaik penyerapan polifenol

dalam beras instan.

Gambar 10. Diagram alir pembuatan beras instan fungsional

Perlakuan penambahan ekstrak teh hijau pada beras instan adalah

sebagai berikut : pada saat perendaman, digunakan dua konsentrasi ekstrak

teh hijau, yaitu: C1 = 2% dan C2 = 4%, serta pada saat pemasakan juga

digunakan dua konsentrasi, yaitu D1 = 2% dan D2 = 4%. Diagram alir

proses pengolahan dapat dilihat pada Gambar 10.

Pengolahan Beras Memberamo Fungsional

Beras Memberamo fungsional (BMF) tidak termasuk perlakuan, tetapi

sebagai pembanding. BMF dibuat dengan merendam beras dalam ekstrak

Beras Memberamo

Pencucian

Perendaman T = 50 oC, t = 2 jam Beras : ekstrak teh 2 dan 4% = 1 : 1

Permasakan T= 10 mnt; P = 80 Kpa Beras: ekstrak teh 2 dan 4% = 1:1

Pembekuan t = 24 jam; T = -4 oC

Thawing t = 5 menit; T = 50 oC


Beras Memberamo Instan Fungsional

Deleted: ¶

56

teh hijau 4% (T = 50ºC, t = 2 jam, perbandingan ekstrak teh hijau dengan

beras = 1 ; 1), kemudian dikeringkan hingga kadar air 12 %.

Gambar 11. Diagram alir pembuatan beras Memberamo fungsional

Analisis Komposisi Kimia

Analisis komposisi kimia yang dilakukan terhadap beras Memberamo

instan fungsional meliputi: kadar air, abu, total fenol bebas, daya cerna pati.

Uji Aktivitas Hipoglikemik

Tikus putih (Ratus novergicus) strain Sprague-Dawley jantan dengan berat

badan 150 – 200 g dipuasakan selama satu malam, tetapi tetap diberi minum

secara ad libitum (n = 6). Keesokan harinya, kadar glukosa tikus percobaan

diukur menggunakan glukometer (kadar glukosa darah puasa), dilanjutkan

pemberian ekstrak pati beras pratanak fungsional atau beras instan fungsional

yang akan diuji aktivitas hipoglikemiknya. Sampel dibuat tepung lalu dilarutkan

dalam air, dan diberikan secara oral (4.5g/kg berat badan tikus). Setelah 30 menit,

tikus percobaan diberi 1 ml larutan D-glukosa 10% secara oral. Tiga puluh menit

Beras Memberamo

Pencucian

Perendaman Beras : ekstrak teh 4 % = 1 : 1

T = 50 oC, t = 2 jam

Penirisan

Beras Memberamo Fungsional


Formatted: Italian (Italy)

Deleted: ¶

Deleted: dan Gizi

Deleted: mutu kimia dan gizi

Deleted: -

Deleted: . Se

Deleted: nya tikus percobaan

Deleted: di

Deleted: sampel

57

kemudian, kadar glukosa darah tikus percobaan diukur menggunakan glukometer

(pengukuran menit ke-30). Pengukuran kadar glukosa yang sama dilakukan pada

menit ke-60, 90, dan 120. Hasil pengukuran kadar glukosa seluruh sampel beras

fungsional yang diuji dibuat kurva dan dibandingkan pengaruh aktivitas

hipoglikemiknya. Pada masing-masing cara pengolahan diambil satu perlakuan

terpilih untuk penelitian selanjutnya.

Percobaan 3. Evaluasi Daya Hipoglikemik Beras Fungsional dan Analisis Histologi Jaringan Pankreas

Beras fungsional dari varietas terpilih (Memberamo) diuji daya

hipoglikemiknya menggunakan tikus percobaan sebagai hewan model DM. Empat

macam beras yang diuji yaitu: beras Memberamo instan fungsional (BMIF) dan

beras Memberamo pratanak fungsional (BMPF), serta beras Memberamo

fungsional (BMF) dan beras Taj Mahal (BTM). BMF bukan perlakuan dalam

penelitian ini, namun digunakan sebagai pembanding apakah terdapat perbedaan

daya hipoglikemik dengan beras Memberamo yang diproses pratanak dan instan.

BMF dibuat dengan cara merendam beras Memberamo di dalam ekstrak teh hijau

dengan konsentrasi 4 % (sesuai dengan perendaman beras instan) lalu dikeringkan

hingga kadar air 12-14 %. Kontrol yang digunakan ialah beras Memberamo (tanpa

perlakuan ekstrak teh hijau). Lama perlakuan adalah 36 hari. Pengamatan

dilakukan terhadap konsumsi ransum per hari, peningkatan berat badan setiap 3

hari, dan kadar glukosa darah diukur setiap 3 hari menggunakan ”One Touch

Ultra” glukometer. Pada akhir percobaan dilakukan pengamatan : morfologi

jaringan pankreas dengan pewarnaan Hematoxylin-Eosin dan sel-β pankreas

dengan pewarnaan imunohistokimia

Uji Daya Hipoglikemik

Tikus normal dan model yang digunakan dalam penelitian ini ialah tikus

putih strain Sprague Dawley berumur sekitar 60 hari, berat badan rata-rata 150-

200 gram. Tikus model dikondisikan menjadi diabetes (DM) melalui penyuntikan

dengan aloksan, dosis 110 mg/kg BB (Kesenja 2005). Aloksan akan merusak sel-

β pankreas sehingga tikus tidak mampu menghasilkan insulin. Kondisi tersebut

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Formatted

Deleted: dengan

Deleted: s X

Deleted: perlakuan

Deleted:

Deleted: pada hewan model

Deleted:

Deleted: X

Deleted: ,

Deleted: X

Deleted: (hasil terpilih dari

Deleted: . Sebagai

Deleted: pembanding adalah

Deleted: X

Deleted: adalah beras X

Deleted: yang di

Deleted: terpilih

Deleted: , lalu

Deleted: Sebagai k

Deleted: positif

Deleted: X

Deleted: non-fungsional

Deleted: Kontrol negatif, yaitu

Deleted: ,

... [6]

... [10]

... [11]

... [18]

... [21]

... [19]

... [12]

... [22]

... [5]

... [7]

... [8]

... [24]

... [9]

... [13]

... [17]

... [20]

... [14]

... [26]

... [15]

... [4]

... [25]

... [27]

... [16]

... [23]

... [28]

58

menyebabkan timbulnya DM. Tikus dikatakan DM jika kadar glukosa darah

sesaat di atas 200 mg/dL.

Masing-masing tikus yang akan digunakan dalam penelitian, ditimbang dan

dicatat berat badannya. Kemudian, sebanyak 30 ekor tikus DM dibagi dalam lima

kelompok, ditambah satu kelompok tikus normal (enam ekor tikus per kelompok).

Jadi dalam percobaan ini terdapat enam kelompok tikus percobaan sebagai

berikut:

1. Kelompok KN (kontrol negatif): tikus normal diberi ransum standar,

sumber pati dari beras Memberamo (BM)

2. Kelompok KP (kontrol positif): tikus DM diberi ransum standar, sumber

pati beras Memberamo (BM)

3. Kelompok BMIF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras

Memberamo instan fungsional.

4. Kelompok BMPF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras

Memberamo pratanak fungsional.

5. Kelompok BMF : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras

Memberamo fungsional.

6. Kelompok BTM : tikus DM diberi ransum dengan sumber pati beras Taj

Mahal

Seluruh tikus percobaan dalam setiap kelompok diberi perlakuan selama 36

hari. Selama perlakuan berlangsung, berat badan tikus ditimbang per tiga hari,

pengukuran konsumsi ransum per hari, dan pengukuran kadar glukosa darah per

3 hari. Pada akhir percobaan dilakukan pembedahan dan pengambilan organ tikus

untuk pengamatan histologi jaringan pankreas.

Pembuatan Ransum Standar dan Ransum Perlakuan

Pembuatan ransum tikus percobaan mengikuti metode AOAC (1995).

Pemberian ransum dilakukan setiap hari sebanyak 20 g/ekor, dengan komposisi

ransum sebagai berikut:

Protein (a) = . 1.6 x 100 . Kadar N Kasein

Lemak (b) = [ 8 – (a) x Kadar Lemak ] 100


Deleted: atau

Deleted: ,

Deleted: (beras X non perlakuan)

Deleted: atau

Deleted: ,

Deleted: (beras X non perlakuan)

Deleted: X

Deleted: X

Deleted: X

Deleted: akan

59

Mineral (c) = [ 5 – (a) x Kadar Abu ]

100 Air (d) = [ 5 – (a) x Kadar Air ] 100 Serat (e) = [ 1 – (a) x Kadar Serat ] 100 Vitamin (f) = 1 %

Pati = 100 – (a + b + c + d + e + f )

Sumber protein yang digunakan ialah kasein, dan sebagai sumber lemak

ialah minyak jagung. Mineral yang digunakan merupakan mineral mix yang terdiri

atas KI 0.79 g, NaCl 139.30 g, KH2PO4 389.00 g, MgSO4 anhidrat 53.70 g,

CaCO3 381.40 g, FeSO4.7H2O 27.00 g, MnSO4.2H2O 4.01 g, ZnSO4.7H2O 0.55

g, CuSO4.5 H2O 0.48 g, dan CoCl2.6 H2O 0.02 g (Muchtadi 1989). Air yang

digunakan adalah akuades, sebagai sumber serat adalah selulosa dan vitamin

merupakan vitamin mix. Pati yang digunakan ialah tepung beras dari masing-

masing perlakuan seperti yang telah disebutkan sebelumnya (BM, BMPF, BMPF,

BMF dan BTM).

Pengukuran Jumlah Konsumsi Ransum

Jumlah ransum yang dikonsumsi diukur setiap hari selama masa perlakuan

(36 hari). Konsumsi ransum ditentukan dengan cara mengumpulkan dan

menimbang ransum sisa yang ada di dalam wadah makanan maupun yang

tercecer. Ransum yang tercecer diayak terlebih dahulu untuk memisahkan dari

sekam yang tercampur. Ransum sisa selanjutnya ditimbang dan dinyatakan dalam

satuan gram. Jumlah konsumsi ransum dihitung dengan mengurangi jumlah

ransum yang diberikan dengan sisa ransum yang telah ditimbang.

Pengukuran Berat Badan

Berat badan tikus selama masa perlakuan diukur setiap tiga hari, dengan

tujuan untuk memonitor tingkat pertambahan atau penurunan berat badan tikus

percobaan. Pengukuran berat badan tikus dilakukan menggunakan timbangan dan

dinyatakan dalam satuan gram.



Deleted: Untuk p

Deleted: ter

Deleted: diatas

Deleted: ¶

Deleted: ¶

Deleted: ¶

Deleted:

60

Analisis Histologi Jaringan Pankreas

Analisis histologi jaringan pankreas bertujuan untuk mengamati terjadinya

kerusakan pada pankreas tikus setelah diberi ransum ekstrak beras fungsional,

yaitu beras yang diberi perlakuan ekstrak teh hijau. Analisis dilakukan pada akhir

masa perlakuan, dengan cara membedah tikus dan mengambil organ pankreasnya.

Analisis ini terdiri atas delapan tahapan, yaitu pengambilan sampel (sampling),

fixasi (pengawetan), dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi parafin,

pencetakan (embedding), pemotongan (sectioning) dan pewarnaan (staining)

Hematoxylin-Eosin dan imunohistokimia terhadap sel β, serta pengamatan

jaringan pankreas.

Sampling. Tikus yang akan dibedah, dipingsankan terlebih dahulu dengan

cara dislocatio cervicalis. Setelah tikus pingsan, dilakukan pembedahan dan

pengambilan organ pankreas. Kemudian organ pankreas dicuci dalam larutan

fisiologis (NaCl 0.9%) dan dimasukkan ke dalam larutan pengawet.

Fiksasi (Pengawetan) dan Stopping Point. Pengawetan dilakukan dalam

larutan Bouin yang dipersiapkan pada hari pembedahan. Larutan fiksatif (Bouin)

dibuat dengan cara mencampurkan asam pikrat jenuh : formalin p.a. : asam asetat

glasial, dengan perbandingan 15 : 5 : 1. Proses pengawetan (perendaman di dalam

larutan fiksatif) dilakukan selama 24 jam. Kemudian pankreas dipindahkan ke

dalam larutan alkohol 70%. Perendaman di dalam larutan ini berfungsi sebagai

stopping point, berarti proses pengawetan dihentikan, dan organ pankreas dapat

disimpan di dalam larutan ini sampai tahapan berikutnya dilakukan.

Dehidrasi. Tahapan ini dilakukan dengan tujuan untuk menarik air dari

jaringan secara perlahan-lahan. Dehidrasi dilakukan dengan menggunakan larutan

alkohol bertingkat. Sebelum dilakukan dehidrasi, pankreas dipotong

menggunakan silet secara melintang menjadi bagian kecil-kecil dengan ukuran

0.5-1.0 cm3. Potongan-potongan tersebut lalu dimasukkan ke dalam tissue

cassete. Proses penarikan air dilakukan dengan cara merendam tissue cassete

berisi sampel ke dalam alkohol bertingkat, yaitu 24 jam di dalam alkohol 80%, 24

jam di dalam alkohol 90%, dan 12-24 jam di dalam alkohol 95%, dilanjutkan

61

dengan perendaman 1 jam di dalam alkohol absolut I, 1 jam di dalam alkohol

absolut II, dan 1 jam di dalam alkohol absolut III.

Clearing. Tahapan ini bertujuan untuk menjernihkan dan menghilangkan

sisa larutan alkohol yang tersisa dalam jaringan. Penjernihan dilakukan dengan

cara memindahkan tissue cassete berisi sampel dari alkohol absolut III ke dalam

xylol I selama 1 jam (pada suhu kamar), lalu perendaman dilanjutkan ke dalam

xylol II (pada suhu kamar) selama 1 jam dan xylol III selama 30 menit pada suhu

kamar dan 30 menit pada oven bersuhu ± 60oC.

Infiltrasi Parafin. Tahapan ini dilakukan untuk memudahkan pemotongan

jaringan. Parafin dapat larut di dalam xylol, sehingga dalam proses ini diharapkan

xylol yang telah masuk ke seluruh bagian organ, dapat digantikan oleh parafin.

Dengan demikian, jaringan mudah dipotong. Setelah tahapan penjernihan selesai

(jaringan berada dalam xylol III, oven suhu 60oC), potongan jaringan dikeluarkan

dari tissue cassete, lalu dimasukkan ke dalam parafin cair I, II, dan III berturut-

turut selama 1 jam. Infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven suhu 60oC.

Selanjutnya sampel dicetak dalam parafin.

Embedding. Pencetakan potongan jaringan pankreas dalam parafin

(embedding), dilakukan dengan bantuan Tissue Embedding Console. Parafin cair

dituangkan pada cetakan yang telah diberi gliserin dan potongan-potongan

pankreas diletakkan di dalam parafin. Posisi potongan pankreas diletakkan

sedemikian rupa sehingga bagian potongan yang rata dan lebar berada di dasar.

Parafin didinginkan sampai membeku, lalu dilepaskan dari cetakan. Bagian

parafin yang memuat potongan pankreas dipotong menjadi bentuk segi empat,

kemudian ditempelkan pada balok kayu. Sampel diatas balok kayu ini disimpan

di dalam refrigerator minimal 1 jam sebelum dipotong menggunakan mikrotom.

Hal ini dilakukan agar dihasilkan pita jaringan yang baik.

Sectioning. Pemotongan dilakukan menggunakan mikrotom, agar

dihasilkan pita jaringan dengan ketebalan sekitar 5 μm. Sebelum pemotongan

jaringan dengan ketebalan 5 μm, terlebih dahulu dilakukan trimming parafin

dengan ketebalan sekitar 10 μm hingga diperoleh pita jaringan yang baik. Jika

62

telah diperoleh pita yang baik, hasil sayatan di apungkan diatas aquades dingin.

Sayatan yang bagus diambil dan dibentangkan diatas akuades hangat (45oC), lalu

ditempelkan pada gelas objek, dan diinkubasi selama satu malam pada suhu 37ºC.

Sampel siap untuk diwarnai.

Staining (HE dan Imunohistokimia terhadap Sel β). Dua macam

pewarnaan dilakukan dalam tahapan ini yaitu pewarnaan HE dan pewarnaan

dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan HE dilakukan untuk pengamatan

terhadap struktur umum jaringan. Tahapan pewarnaan dimulai dengan

deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan xylol III, II dan I,

dengan maksud untuk melarutkan parafin dari jaringan. Tahap berikutnya ialah

rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan alkohol (alkohol

absolut III, II, dan I, alkohol 100, 95, 90, 80 dan 70%). Kemudian sediaan

disiram dengan air mengalir (running water), dan dimasukkan ke dalam aquades.

Sediaan kemudian diwarnai dengan pewarna hematoxylin dan kembali disiram

dengan air kran mengalir untuk menguatkan warna hematoxylin, dilanjutkan

dengan memasukkan ke dalam aquades. Sediaan kemudian diberi pewarna Eosin,

selanjutnya dilakukan proses dehidrasi dengan mencelupkan sediaan ke dalam

serial larutan alkohol 70, 80, 90, dan 95 %, alkohol absolut I, II dan III.

Penjernihan atau Clearing dengan xylol I (carboxylol), xylol II dan xylol III.

Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu penempelan gelas penutup

pada sediaan dengan perekat entelan. Sediaan yang telah diwarnai lalu diamati

dengan mikroskop untuk melihat jumlah dan luas pulau Langerhans.

Pewarnaan imunohistokimia dalam penelitian ini bertujuan untuk

mendeteksi sel-β pankreas, yaitu sel penghasil insulin. Tahapan analisis juga

dimulai dengan deparafinisasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan

xylol III, II dan I, dengan maksud untuk melarutkan parafin dari jaringan. Tahap

berikutnya ialah rehidrasi, yaitu sediaan dimasukkan ke dalam serial larutan

alkohol (alkohol absolut III, II, dan I, alkohol 100, 95, 90, 80 dan 70%). Sediaan

lalu direndam dalam air bebas ion (deionized water) selama 5-10 menit, direndam

H2O2 dalam metanol (1:100), selama 15 menit. Sediaan direndam dalam air bebas

ion dan PBS, masing-masing selama 2 x 10 menit. Sediaan lalu diletakkan pada

Deleted: nya peradangan, degradasi sel,

63

kotak sediaan dan ditetesi dengan serum normal 10% dalam PBS (50-60

μl/sediaan), diinkubasi pada suhu 37oC, 30-60 menit. Sediaan dicuci dengan PBS

3 x 5 menit, lalu ditetesi antibodi primer/monoklonal terhadap insulin (Sigma

I2018) dalam PBS (1:1000) sebanyak 50-60 μl/sediaan, inkubasi dalam

refrigerator semalam, lalu dicuci dengan PBS 3 x 10 menit. Sediaan kemudian

ditetesi dengan antibodi sekunder DAKO envision peroxidase (Code No. K1491)

yang telah diencerkan dengan PBS (DAKO : PBS = 3:1), sebanyak 50-60

μl/sediaan, lalu diinkubasi pada ruangan gelap suhu 37oC, 30-60 menit. Sediaan

dicuci dengan PBS 3 x 5 menit, lalu ditetesi DAB (diaminobenzidine) sebanyak

50-60 μl/sediaan dalam tris buffer dan H2O2 . DAB dibiarkan bereaksi pada ruang

gelap selama 25 menit, dan hasilnya dicek dibawah mikroskop. Pewarnaan

dilanjutkan dengan counterstain menggunakan hematoxylin. Kemudian sediaan

dicuci dengan air bebas ion dan didehidrasi dengan alkohol bertingkat (alkohol

70,80, 90, dan 95%, lalu alkohol absolut I, II, dan III). Penjernihan dengan xylol

I, xylol II dan xylol III. Tahap akhir dari pewarnaan ini ialah mounting, yaitu

penempelan gelas penutup pada sediaan dengan perekat entelan. Reaksi positif

ditunjukkan dengan terbentuknya warna coklat pada sel yang mengandung

insulin. Sel positif terhadap pewarnaan ini ialah sel-β

Pengamatan dan Pemotretan. Sediaan yang telah diwarnai dengan metode

HE maupun imunohistokimia kemudian diamati dibawah mikroskop cahaya, yang

telah dilengkapi dengan kamera. Pengamatan pada sediaan yang diberi pewarnaan

HE meliputi pengamatan pulau Langerhans secara deskriptif, penghitungan

jumlah pulau Langerhans per lapang pandang dengan pembesaran 20X. Untuk

sediaan yang diwarnai dengan metode imunohistokimia dilakukan penghitungan

jumlah sel-β per 15 pulau Langerhans per sediaan dengan pembesaran 20X

Percobaan 4. Penentuan Indeks Glikemik Beras

Pada tahap ini akan ditentukan indeks glikemik dari lima sampel uji, yaitu

beras Memberamo, beras Memberamo instan fungsional (BMIF), beras

Memberamo pratanak fungsional (BMPF), serta beras Memberamo fungsional

(BMF), dan beras Taj Mahal (BTM) sebagai pembanding. Hasil yang diperoleh

Formatted: Subscript

Formatted: Subscript

Deleted: air bebas ion (1 ml air bebas ion ditambah 1 tetes reagen 1, 1 tetes reagen 2, 1 tetes reagen 3). DAB

Deleted: BI

Deleted: 10-20

Deleted: 10

64

diharapkan dapat memberikan gambaran bahwa sumber karbohidrat yang sama,

dapat mempunyai indeks glikemik yang berbeda apabila diolah dan diberi

perlakuan yang berbeda.

Penentuan Indeks Glikemik (Miller et al. 1996)

Setiap porsi nasi yang akan ditentukan IG nya (mengandung 50g

karbohidrat) diberikan kepada relawan yang telah menjalani puasa penuh (kecuali

air) selama semalam (sekitar pk 20.00 sampai pk 08.00 besoknya). Relawan yang

digunakan ialah individu normal, tidak menderita diabetes, sebanyak 10 orang.

Selama dua jam pasca konsumsi pangan uji, sampel darah sebanyak 50 μL

(finger-prick cappillary blood samples method) diambil setiap 30 menit untuk

diukur kadar glukosanya (pengukuran kadar glukosa menit ke-30, ke-60, ke-90

dan ke-120). Selang 3 hari, hal yang sama dilakukan dengan memberikan 50 g

glukosa murni (sebagai pangan acuan) kepada relawan. Hal ini dilakukan untuk

mengurangi efek keragaman glukosa darah dari hari ke hari.

Kadar glukosa darah (pada waktu setiap pengambilan sampel) di plot pada

dua sumbu, yaitu sumbu waktu ( X ) dan sumbu kadar glukosa darah (Y). Indeks

Glikemik ditentukan dengan membandingkan luas daerah dibawah kurva antara

pangan yang diukur IG-nya dengan pangan acuan dikalikan 100.

Analisis Data

Analysis of variance. Analysis of variance (ANOVA) dilakukan dengan

menggunakan program SPSS untuk menganalisis perbedaan pada parameter

fisiko kimia dan gizi. Tingkat signifikansinya dinyatakan dalam α = 5 %. Pada

penapisan aktivitas hipoglikemik, rancangan percobaan yang digunakan adalah

rancangan acak lengkap. Sedangkan pada pembuatan beras fungsional rancangan

percobaan yang digunakan ialah rancangan acak faktorial, dengan dua perlakuan,

masing-masing dengan dua kali ulangan.

Deleted: ¶

Deleted: nova

Page 46: [1] Formatted SriWidowati 2/6/2007 1:49:00 PM

Spanish (Spain-Modern Sort)






Italian (Italy)


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish

Page 57: [9] Deleted SriWidowati 2/23/2007 11:30:00 PM

pada hewan model (tikus diabetes)


Finnish


Finnish


Finnish


(hasil terpilih dari percobaan 4)


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Finnish


Kontrol negatif, yaitu beras X non-fungsional yang diaplikasikan pada tikus

normal.


Line spacing: single

Documents

BAHAN DAN METODE - repository.ipb.ac.id · Percobaan, FATETA-IPB; dan Laboratorium Histologi, ... Formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol absolut, xylol,