2019.10.30.

1

A BAKTÉRIUMOK GENETIKÁJA, A

BAKTÉRIUMOK VIZSGÁLATA

MOLEKULÁRIS MÓDSZEREKKEL

1

A genetikai anyag (genom) jellemz ői

• maghártya hiányzik

• nincs elkülönült sejtmag

• fajonként eltér ő méret

• fenotípusos különbségeket eredményez

• a genetikai anyag összetev ői

• kromoszóma

• plazmidok

• bakteriofágok

2

Kromoszóma

• dupla szálú DNS

• haploid

• kivétel Burkholderia: 2 kromoszóma

• cirkuláris

• kivétel Borrelia: lineáris

• hosszúság: 1-1.4 mm

• szuperhélix

• topoizomerázok, giráz

• 0,6-10 millió bázispár

• molekulatömeg: 2,7 x 10 9

• 3000-5000 gén

3

Kromoszóma

• szemikonzervatív kett őződés

• origóból indul

• DNS-polimeráz, DNS-ligáz

• topoizomerázok, giráz

• funkció

• életfontosságú tulajdonságok

• általában lineáris elrendez ődés

• IS szekvenciák

4

E. coli kromoszóma

5

Plazmidok

• dupla szálú DNS, általában cirkuláris

• molekulatömeg 10 5 - 106

• független replikáció

• szabad vagy a kromoszómába integrált forma

• nem életfontosságú funkciók

• előnyt jelenthetnek

• egyes kórokozókban virulenciafaktorok

• számuk változó

• sejtosztódásnál véletlenszer ű megoszlás

• spontán elt űnhetnek

• plazmid-inkompatibilitás

6

2019.10.30.

2

Legfontosabb plazmidok

• F: fertilitás

• konjugáció

• R: rezisztencia

• antibiotikum-rezisztencia

• egyéb küls ő hatásokkal szembeni rezisztencia

• Col: colicin

• kolicinek termelése

• Ent: enterotoxin

• toxinok termelés ( B. anthracis, E. coli, S. aureus)

• Hly: haemolysin

• hemolizinek termelése

7

Bakteriofágok

• változatos morfológia (fonal, fej-farok, ikozahedrá lis-pentagonális)

• DNS vagy RNS tartalom, szimpla vagy duplaszál

• általában sz űk gazdaspektrum

• formái

• lítikus fágok

• virulens fágok

• lítikus ciklus: replikáció, baktériumok szétesnek

• temperált fágok

• avirulens fágok

• lizogén ciklus

• integrálódik a baktériumgenomba (profág) vagy szaba don

• fennmarad a baktériumban8

A baktériumok változékonysága

A genotípus változásai

• mutáció

• nukleotidszekvencia változása egy génben

• rekombináció

• új gének beépülése a genomba

A fenotípus változásai

• a genotípus változásai következtében

• fenotípusos változás

9

Mutáció

• bázissorrend változása

• stabil, örökletes

• a mutáció oka

• spontán:

• átírási hiba, 1 / 1 millió sejtosztódás

• indukált

• fizikai, kémiai, biológiai hatás következtében

• ultraibolya sugárzás

• bázisanalógok

• akridinfestékek

10

Mutáció

• a mutáció formái

• pontmutáció

• szubsztitúció: báziscsere

• deléció, inzerció: bázis elvesztése vagy beépülése

• fáziseltoló mutáció

• +1 vagy -1 eltolódás

• inverzió

• egy DNS-szakasz megfordult beépülése a genomba

• transzlokáció

• egy DNS-szakasz áthelyez ődése a genomban

• duplikáció

• egy DNS-szakasz ismételt beépülése

11

• a mutáció következménye

• misszensz mutáció: eltér ő aminosav épül be

• nonszensz mutáció: nem létez ő triplet, stopkodon

• mutáció felismerése:

• a genom eltér az eredeti baktériumétól

• szelektív bélyeg

• felismerhet ő, szelekció

• reverzió

• valódi reverzió

• ismételt mutáció a korábbi mutáció helyén

• eredeti szekvencia helyreáll

• szuppresszió: fenotípusos korrekció

• tRNS antikodonja változik

12

2019.10.30.

3

• a genom védelmében szerepl ő enzimek

• metiltranszferázok

• endonukleázok

• DNS-reparáló enzimek

13

• mutagenitás vizsgálata: Ames-test

• hisztidint igényl ő auxotróf S. Typhimurium

• DNS reparáló enzimek hiányoznak a baktériumból

• mutációra hajlamos

• patkánymáj-kivonatban szuszpendáljuk: metabolitok ké pzése

• vizsgálandó anyag sz űrőpapírban

• pozitív: baktériumnövekedés

• mutáció révén hisztidinszintézis

• negatív: nincs növekedés

14

A mutáció hatása baktériumokban

1. Sejtszerkezet változása

2. Anyagcsere változása

3. Rezisztencia változása

4. Virulencia változása

15

1. A sejtszerkezetet érint ő mutációk

• sejtfal LPS

• O-specifikus oldallánc elvesztése

• telepforma S/R

• sejtfalszintézis

• protoplaszt, szféroplaszt

• buroktermelés elvesztése

• burok nélküli változatok

• virulencia csökkenése, elvesztése

• csillóképzés elvesztése

• fimbriaképzés elvesztése

• virulencia elvesztése

16

2. Anyagcserét érint ő mutációk

• egyes metabolitok szintézise

• anabolikus enzimvesztés,

• auxotróf mutánsok (egyes metabolitokat igényelnek)

• egyes anyagok bontása

• katabolikus enzimvesztés

• egyes anyagokat nem tud hasznosítani

• egyes enzimek, toxinok termelésének elvesztése

• virulencia csökkenése

17

3. A rezisztenciát befolyásoló mutációk

• antibakteriális:

• mutáció a riboszómán

• a kötőhelyet érint ő mutáció

• transzportot érint ő mutáció

• bakteriofág:

• a kötőhelyen mutáció

18

2019.10.30.

4

4. A virulenciát befolyásoló mutációk

• virulenciafaktorok elvesztés

• toxintermelés elvesztése

• extracelluláris enzimek elvesztése

• buroktermelés elvesztése

• fimbriaképzés elvesztése

19

Rekombinációk

• új tulajdonságot kódoló gének

• felvétele

• beépülése

• új tulajdonságokat hordozó baktériumok (rekombináns ok)

• formái:

1. transzformáció

2. transzdukció

3. fágkonverzió

4. konjugáció

20

1. Transzformáció

• aktív folyamat

• dupla szálú DNS, oldott

• minimális molekulatömeg 10 6

• kompetens fázisban

• kromoszómaszakasz, plazmid,

bakteriofág (transzfekció)

• homológ és heterológ transzformáció

• mesterségesen:

• kémiai anyagok

• elektroporáció

21

2. Transzdukció

• bakteriofág visz át baktérium-DNS-t

• kromoszomális DNS

• plazmid DNS

• lítikus fágok

• általános transzdukció

• bármilyen bakteriális DNS-t átvihet

• vektor

• temperált fágok

• specifikus transzdukció

• DNS az integrált bakteriofág

környezetéb ől

22

3. Fágkonverzió

• információ a fág-DNS-ben

• temperált fág

• a baktériumkromoszómába beépül

• fágkonverzióval nyert tulajdonságok

• toxin

• S. pyogenes,

• C. diphtheriae,

• C. botulinum C,D

• E. coli VT

• antigén (Salmonella, Shigella)

23

4. Konjugáció

• F plazmid

• plazmidreplikációt irányít

• szexfimbria képzését irányítja

• konjugációt irányítja

• donorrá tesz (F +)

• szexfimbrián (plazmahíd) keresztül

• szimpla szálú DNS megy át

• plazmid (R, Col)

• kromoszóma DNS

• egyirányú

• időfügg ő

• homológ – heterológ konjugáció24

2019.10.30.

5

4. Konjugáció

• Hfr törzsek

• F plazmid a kromoszómába épül

25

Fenotípusos változékonyság (Modifikáció):

• környezeti hatásra

• nem örökl ődik

• teljes populáció

• időleges

• eredménye:

• morfológia

• burokképzés, csillóképzés,

• rezisztencia (vegyszer, antibakteriális anyagok)

• adaptív rezisztencia

• enzimtermelés

• enzimindukció

26

A baktériumgenom vizsgálata

1. Baktériumokból kivont DNS vizsgálata

2. Hibridizációs technikák

3. DNS amplifikáláson (PCR) lapuló módszerek

4. DNS szekvencia-meghatározás

27

1. A baktériumokból kivont DNS vizsgálata

1.1. G/C tartalom meghatározása

• fajra, nemzetségre jellemz ő,

• konstans

• rendszertani besorolás

1.2. Restrikciós endonukleáz analízis (REA, Restrict ion fragment

length polymorphism, RFLP)

• restrikciós endonukleázokkal hasítás

• PAGE-val szétválasztás

• fragmentumok száma

• fragmentumok molekulatömege

• azonosság/hasonlóság vizsgálata

28

1. A baktériumokból kivont DNS vizsgálata

1.3. Pulzáló mezej ű gél-elektroforézis

• változó áramirány

• nagy méret ű DNS molekulák szétválasztása

29

2. Hibridizációs technikák

2.1. DNS-DNS hibridizáció

• DNS szálainak szétválasztása

• jelölt DNS hozzáadása

• asszociáció,

• heteroduplexek képz ődnek

• Southern-blot

2.2. Ribotipizálás

• riboszóma RNS-t (16S rRNS, 23S rRNS) kódoló rDNS kim utatása

• erősen konzervatív szakaszok

30

2019.10.30.

6

2. Hibridizációs technikák

2.3. Mikroarray technológiák

• hordozóhoz rögzített szimplaszálú DNS-szakaszok

• jelölt vizsgálandó DNS-sel reagál

31

3. DNS amplifikáláson (PCR) lapuló módszerek

3.1. Polimeráz láncreakció (PCR)

• kis mennyiség ű DNS kimutatása is lehetséges

• lépései

• hevítés

• 2 primer (rövid, szintetikus DNS szimpla szál)

• DNS polimeráz: komplementer DNS-szálakat szintetizá l

• ciklusos ismétlés

• megsokszorozott DNS vizsgálata

32

3. DNS amplifikáláson (PCR) lapuló módszerek

3.1. polimeráz láncreakció (PCR)

• specificitás

• alkalmazás

• virulenciafaktorok génjeinek kimutatása

• nehezen vagy nem tenyészthet ő baktériumok kimutatása

3.2. PCR-RFLP

• PRC amplikonok restrikciós endonukleázokkal emésztve

3.3. Fészek PCR

• több primerpár

3.4. Real-time PCR

• kvantatív

33

4. DNS szekvencia-meghatározása

• szakaszos szekvenciameghatározás

• számítógépes elemzés (bioinformatics)

• 16S rDNS meghatározása (1542 bázis)

34

A baktériumok genetikai anyagának megváltoztatása

Új tulajdonságot hordozó baktérium el őállítása

• génszakasz el őállítása (kivonás, szintézis)

• vektorplazmid

• emésztés restrikciós endonukleázokkal

• „ragadós vég” képzése

• klónozás

• vektorplazmid bevitele a recipiensbe (transzformáci ó, bakteriofág)

• új tulajdonság megjelenésének vizsgálata

• vakcinák

35

Genetikusan módosított baktérium el őállítása

36

2019.10.30.

7

Ragadós száj- és körömfájás VP3 fehérje

előállítása

37

Plazmid bevitele recipiensbe transzformációval

38

39

A baktériumok genetikai anyagának megváltoztatása

• eukariota sejtb ől származó DNS

• átírás reverz transzkriptázzal

• mRNS →cDNS

• inzulin, interferon, STH

E. coli →inzulintermelés)