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1
Bakterielle Infektionen und Pathogeninaktivierung
Prof. Harald Klüter Institut für Transfusionsmedizin und Immunologie
DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen Medizinische Fakultät Mannheim
Universität Heidelberg
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Surr
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NAT
-Tes
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r HIV
/HC
V
Risiko transfusions-assoziierter Infektionen (TTI)
Aktuelles Infektionsrisiko
1 : 360.000 (CI: 0.19-3.36 Mio.) HBV
1 : 10.88 Mio. (7.51-19.72 Mio.) HCV
1 : 4.3 Mio. (2.39-21.37 Mio.)
HIV
Risko einer ta-Virusinfektion
Hourfar MK, et al. Transfusion Transfusion 2008;48:1558-1566
2
Risiko transfusions-assoziierter Infektionen (TTI)
Bush & Kleinmann, Transfusion 2000; 40: 143-159
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CV
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4-A
ntig
en
NAT
-Tes
tung
fü
r HIV
/HC
V
Bakterien
Aktuelles Infektionsrisiko
1 : 360.000 (CI: 0.19-3.36 Mio.) HBV
1 : 10.88 Mio. (7.51-19.72 Mio.) HCV
1 : 4.3 Mio. (2.39-21.37 Mio.)
HIV
Risko einer ta-Virusinfektion
Hourfar MK, et al. Transfusion Transfusion 2008;48:1558-1566
Schrezenmeier H, et al. Transfusion 2007;47:644-652
Kontaminiertes Thrombozytenkonzentrat
1:1.428
Risiko einer Sepsis 1:50.000
Risiko einer ta-Bakterieninfektion
1996-2009
unclassif ied 7 (0,10%)
IBCT 2637 (39,64%) I&U 421 (6,33%) HSE 703 (10,57%)
Anti-D 721 (10,84%)
ATR 1234 (18,55%)
HTR 443 (6,66%)
TRALI 257 (3,86%)PTP 49 (0,74%)
TACO 52 (0,78%)TAD 5 (0,07%)
Autologous 42 (0,63%)TTI 69 (1,04%)
ta-GVHD 13 (0,19%)
Nebenwirkungen der Bluttransfusion Serious Hazard of Transfusion (SHOT) - Report 1996-2009
N = 6646
3
Todesfälle bis 2009
PTP 2
TACO 5
TAD 0
TRALI 42HTR 11ATR 19
IBCT 27
Anti-D 0HSE 0
I&U 4
unclassif ied 0 ta-GVHD 13TTI 15
Autologous 0
IBCT
I & U
HSE
Anti-D
ATR
HTR
TRALI
PTP
TACO
TAD
Autologous
TTI
ta-GVHD
unclassif ied
Mortalität Serious hazards of transfusion (SHOT), Annual Report 1996-2009
N = 138
= 10,8%
Ereignisse Involvierte Patienten
Todesfälle Erkrankungsfälle
HAV 3 3 3
HBV 10 11 11
HCV 2 2 2
HEV 1 1 1
HIV 2 4 4
HTLV 1 2 2 2
Bakterien 40 43 11 32
Malaria 2 2 1 1
Prionen 1 1 1
vCJD 3 3 3
Total 66 72 15 57
Transfusion-assoziierte Infektionen (TTI) Serious hazards of transfusion (SHOT), Annual Report 1996-2009
SHOT Annual Report 2009
SHOT Annual Report 2009
Art des Blutproduktes und bakterielle Kontamination
4
PTP 101%
TTVI 475% AB0-Inkompatibilität 58
7% TBBI 799%
HTR 13916%
TRALI 19723%
ATR 31737%
TA-GVHD0%
TACO2%
sonstige0%
Kumulative Anzahl der Transfusionsreaktionen (1997-2009) entsprechend den EHN*-Kriterien Hämovigilanzreport PEI, 2009
* ENH: european (intenational) hemovigilance network (INH): definition of adverse events, http://www.ihn-org.net
Transfusionsbedingte bakterielle Infektionen - TBBI - (1997-2009) Hämovigilanzreport PEI, 2009
Transfusionsbedingte bakterielle Infektionen - TBBI - (1997-2009) Hämovigilanzreport PEI, 2009
5
Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung (1997-2009)
Hämovigilanzreport PEI, 209
Gram negativ
Symptome einer bakteriellen Infektion
• Fieber, Schweißausbruch • Schüttelfrost • Übelkeit, Erbrechen • Hypotonie / Hypertonie • Tachykardie • septischer Schock • Atemnot • Rückenschmerzen
Klinik: während / bis zu einigen Stunden nach Transfusion:
Kontaminierte Blutpräparate
Plasma: Bakteriell bedingte Transfusionsreaktion sind extrem selten (Wasserkeime - Pseudomonaden)
Erythrozytenkonzentrate: Vorrangig kälteliebende Keime gram negative - Wachstumsoptimum unter 37 °C
Thrombozytenkonzentrate: Vorrangig gram positive Keime Optimale Wachstumsbedingungen aufgrund der Lagerung bei 22 ± 2 °C
!
6
Ursachen einer Kontamination
• Subchronische Infektionen
Osteomyelitiden, Endokarditiden
• Bakterielle Infektionen des Intestinaltraktes
• Zahnärztliche, endoskopische Eingriffe
Endogene Keime
• Mangelnde Hände- oder Hautdesinfektion
• Verarbeitung, Lagerung
• Unsachgemäße Handhabung
z. B. Auftauen von gefrorenem Frischplasma
Exogene Keime
Prevention bakterieller Kontamination
• Anamneseerhebung bei dem Spender
Exogene Keime
Endogene Keime
• Pre-donation Sampling (Juli 2003)
• Hautdesinfektion
z.B. Bakteriennachweismethoden Pathogeninaktivierung
• In-line filtration (Oktober 2001)
• Einführung zusätzlicher Behandlungsschritte:
Prinzip: Pre-donation Sampling
Die ersten 20 ml werden in eine separaten Pouch gefüllt
Klemme 1 Klemme 2
7
Vergleichsuntersuchungen (De Korte et al. Transfusion 2006;46:476-485)
2002-2003: Thrombozytenkonzentrate hergestellt aus Vollblutspenden
Flüssigkultur positiv (%)
Kein Pre - donation Pre - donation
Variable Arm- desinfektion
Anzahl
2x 70% Isopropanol
Anzahl
Kultur positiv (%)
42.582 4.362
405 (0,95) 22 (0,50)
59.400 6.749
505 (0.85) 25 (0,37)
p = 0,05 p = 0,18
p = 0,002
p = 0,001
Kultur positiv (%)
Flüssigkultur positiv (%)
373 (0,88)
427 (0.76)
18 (0,41)
17 (0,25)
Prevention bakterieller Kontamination
• Anamneseerhebung bei dem Spender
Exogene Keime
Endogene Keime
• Pre-donation Sampling (Juli 2003)
• Hautdesinfektion
z.B. Bakteriennachweismethoden Pathogeninaktivierung
• In-line filtration (Oktober 2001)
• Einführung zusätzlicher Behandlungsschritte:
Probennahme nach Herstellung
Nach Herstellung: geringe Bakterienzahl 10 ml Probe
Am Ende der Lagerung: hohe Bakterienzahl
Nach 4 Tagen
Sepsis / Tod Probe steril
8
Spätere Probennahme
Nach Herstellung: geringe Bakterienzahl
Thrombozytenpräparat fast am Ende der Lagerung
Nach 4 Tagen
Probenziehung
Wachstumsverhalten von Bakterien im Blut
Kontaminiertes Blutpräparat
10 - 100 Bakterien
Wachstum bis zu 108-9/ml
~ 6 h 24 h Tage
Klinische Relevanz
cut off Schnellmethode
cut off Inkubationsmethode
cut off Pathogeninaktivierung
• BacTAlert
• Pall eBDS(
Inkubationsmethode
Schnellmethode
• NAT (nucleic acid amplification)
• BactiFlow flow cytometer
Bakterien-Screening-Methoden
9
BactAlert Colorimetrie - Technologie
Farb-Sensor
Farb-Sensor
• 2 x 5 - 10 ml Probe
• Kontinuierliche Messung des Bakterienwachstums
• CO2 Produktion als Indikator für Wachstum
• Farb-Sensor in Silikonmembran im Flaschenboden
• Sensitiv gegenüber löslichem pCO2
• 1 - 2 Bakterien pro Probe
• Farbumschlag: Gelb: positiv
Grau: negativ
Inkubations-Methode
BactAlert Colorimetrie - Technologie Inkubations-Methode
Problem: Unspezifische Reaktionen
Positive Ergebnisse, aber im Ausstrich kein
Bakterienwachstum
0,28%
Positive Reaktionen nach Tag 5
Propionibakterien, deren klinische Relevanz offen ist
Diphteroide Keime, gram positive Keime, Staph. spez.
Schrezenmeier et al. Transfusion 2007;47:644 ff
te Boekhorst et al. Transfusion 2005;45:514 ff
Pall system (BDS / eBDS)
• Probennahme in einen
Satellitenbeutel
• Inkubation des
Satellitenbeutels bei 37°C
• Messung des O2-Gehalts
vor Transfusion
• Nachweisgrenze 1-15
Bakterien pro ml
• Erfasst keine Anaerobier
Inkubations-Methode
10
Nucleic Acid Amplification (NAT)
Problem
• Viele verschiedene Bakterienspezies Lösung
• Amplifikation in einer hoch konservierten Genomregion
• Universell bei Mikroorganismen
• z. B. 16s DNA
• Nachweisgrenze 16 - 500 Bakterien pro ml
• Zeitdauer bis zum Nachweis: ca. 2-3 Stunden
Schnell-Methode
PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5
• Durchflussbasierte Nachweismethode
• Prinzip: Ein nicht fluoreszenzierendes Fluorochrom gelangt durch die intakte Zellmembran in die lebendende Zellen. Der Farbstoff wird durch die zellinterne Esteraseaktivität umgewandelt und fluoresziert.
• Nachweis gram - positiver und - negativer Bakterien
• PEI: negative Testung – TK-Haltbarkeit Tag 5
Bacti Flow
Schnell-Methode
Bakterien-Screening-Methoden
• Zeitaufwändig bevor das Ergebnis vorliegt
• Hohe Sensitivität (1 cfu/ml)
• Vermehrung der Bakterien in-vitro
• geringere Bakterienlast ausreichend
• PROBENNAHMEFEHLER
Inkubationsmethode
Schnellmethode • Ergebnis liegt schnell vor
• niedrigere Sensitivität
• keine Bakterienvermehrung in-vitro
• hohe Bakterienlast notwendig
• PROTHRAHIERTE PROBENNAHME
11
Pathogeninaktivierung
• Effektive Inhibierung von Pathogenen (Viren, Bakterien und Parasiten)
• Erhalt der biologischen Funktion der Blutkomponente (Erythrozyten, Thrombozyen, Plasmaproteine) über den Lagerungszeitraum
• Praktikable Methodik
Pathogeninaktivierungsverfahren
• Effektive Inhibierung primär von Viren
• Mechanische Verfahren (Nanofiltration)
• Physikalische Verfahren (ß-Propiolactonbehandlung / UV-Bestrahlung)
• Verwendbar für Plasma
60er / 70er – Jahre
Pathogeninaktivierungsverfahren
• Methylenblau-Licht (590 nm)-Verfahren (MB)
• Solvent-Detergenz-Verfahren (SD)
Seghatchian et al. Transfus Med Hemother 2011;38:55-64
Hellstern et al. Transfus Med Hemother 2011;38:65-70
12
Pathogeninaktivierungsverfahren
80er – Jahre
• Entwicklung neuer Verfahren
• Erhalt der biologischen Funktion auch
von zellhaltigen Blutkomponenten
(Erythrozyten, Thrombozyten)
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Viren, Bakterien, Protozoen und Leukozyten benötigen DNA bzw. RNS für die Proteinbiosynthese bzw. zur Replikation.
• Eine Nukleinsäurefunktion ist nicht erforderlich für die biologische Funktion von Erythrozyten, Thrombozyten und Plasmaproteinen.
Prinzip
Zugabe photoaktiver Substanzen und Lichtbestrahlung - direkte Schädigung des Pathogens - Schädigung des Genoms (DNA / RNA)
Eine Zellvermehrung ist nicht mehr möglich
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
13
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
N
N
N
N CH 3
CH 3
O
H
O
CH 2
CHOH
CHOH
CHOH
CH 2 OH
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
Essentieller Nahrungsbestandteil - täglich empfohlene Menge ist 1,7 mg
Prinzip: Mirasol - Riboflavin und Licht (265-370 nm)
Ito et. al. J Biol Chem 1993; 268: 13221
Pathogen Riboflavin
Elektronenübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf das Pathogen - direkte Zellschädigung
- Genombrüche aufgrund der Interaktion mit der photoaktiven Substanz Energieübertragung von der chemisch wirksamen Substanz auf Sauerstoffmoleküle. Die dabei entstehende aktivierte Form (Singuletzustand) ist reaktiv und kann Lipide, Proteine und DNA/RNA-Basen oxidieren
14
Herstellungsprozess
Zugabe der Riboflavinlösung
Bestrahlung ca. 6-10 Min
Thrombozytenkonzentrat
Transfusion
Riboflavin
• Geeignet für die Pathogeninaktivierung von Thrombozyten- und Erythrozytenkonzentraten sowie Plasma
• Überschuss an Riboflavin wird nicht aus dem Präparat entfernt, da sowohl das Vitamin als auch die Photoprodukte (Lumichrome) als unbedenklich angesehen werden
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
15
Amotosalen-HCl - Wirkmechanismus
Amotosalen- HCl
UV-A Bestrahlung
Kreuzvernetzungen mit DNA/RNA Wollowitz S. Semin Hematol 2001;38(S11):4-11
Herstellungsprozess CAD - Abreicherung der
Photoprodukte 4-16 Std.
.
7.
Thrombozytenkonzentrat
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
16
Psoralen S-303 - Wirkmechanismus
• niedriger pH – S 303 • Zugabe zum Erythrozytenkonzentrat - pH Veränderung – Aktivierung von S-303 • Anchor bindet an das Genom • Kreuzvernetzung des Effektorteils mit dem Genom • Abspaltung von Anchor und Linker • Anchor - Linker stellen ein nicht reaktives Produkt dar
Herstellungsprozess
Step 1: Zugabe von GSH (Gluthation) und S -303 zum Erythrozytenkonzentrat
Step 2: Das Erythrozytenkonzentrat wird in ein Zwischenlagerungsbeutel überführt – Inkubation bis zu 20 Std. bei 20–25°C. Step 3: Überstand wird nach Zentrifugation abgepresst
Step 4: Das Erythrozytenkonzentrat wird in den Endlagerungsbeutel überführt
Degeneration von S-303 in S-300
17
Pathogeninaktivierungsmethoden
• Mirasol
Riboflavin (Vitamin B2) + Licht (265-370 nm)
à Plasma
à Thrombozytenkonzentrate
à Erythrozytenkonzentrate
• Psoralen S-59 (Amotosalen-HCL)
+ UV-A Licht (320-400 nm)
à Thrombozytenkonzentrate
à Plasma
• Psoralen S-303 (FRALE) à Erythrozytenkonzentrate
• UV-C Licht (245 nm) à Thrombozytenkonzentrate
• Thrombozytenkonzentraten Phase III Studien in Planung
• Plasma
erste Versuche
UV-C Licht (254 nm)
Amotosalen Riboflavin UV-C
Thrombozyten-konzentrat
Amotosalen HCl (S-59) + UVA
PEI: Zulassungen vorhanden
Europa: Phase III
Deutschland: In-Vitro
In Planung:
Phase III
Plasma Amotosalen HCl (S-59) + UVA
PEI: Zulassungen beantragt
Prä-klinisch
Erste Versuche
Erythrozyten-konzentrat
FRALE (S-303)
Klinische Studien Phase III geplant
Prä-klinisch
Vollblut Erste Ergebnisse Klinische Studien sind geplant
Ausblick
18
• Erhöhung der Sicherheit der Bluttransfusion
• Behandlung unabhängig von Spenderuntersuchung
• Einführung zusätzlicher Untersuchungstest nicht nötig
• Abbau überflüssiger Testverfahren
• zusätzliche Kosten der Blutversorgung
• Nebenwirkung der verwendeten Systeme?
• Qualitätssicherung-System noch zu etablieren
Pathogeninaktivierung von Blutpräparaten - Ausblick -
Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut
Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten
Probenumfang: 0.4 x n
Flüssigmedien:
Nachweis aeroben / anaerober Bakterien und Pilzen in mind. 2 Medien (Thioglycolat-Nährmedien, Fa. Biomerieux, BactAlert)
Inokulum-Volumen: 5 - 10 ml pro Flasche, 7 Tage, 30-37°C (Automaten)
Bei positivem Befund: Ausstrich auf festem Nährmedium – Bebrütung mind. 48 Stunden
Bei positivem Befund: Keimdifferenzierung Wiederholungsansatz
Robert Koch Institut – Arbeitskreis Blut
Votum 16 (V16): Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutprodukten
Ergebnisinterpretation:
Ist der erste Ansatz einer Sterilkontrolle positiv, sind Wiederholungsansätze ratsam. Bleiben bei der Wiederholungsuntersuchung alle Ansätze steril, wird die Sterilkontrolle als negative bewertet. Bei erneutem Nachweis desselben Keims ist das Ergebnis der Sterilkontrolle positiv.
Wird in der Wiederholungsuntersuchung ein anderer Keim als im ersten Ansatz nachgewiesen, sollte die Sterilkontrollmethode kritisch überprüft werden, da der Verdacht auf Sekundärkontamination besteht.
19
Ergebnis der Sterilitätskontrollen Baden-Württemberg – Hessen 2010
FFP (Apherese) 1 / 365 0 / 365
FFP (VB) 6 / 1465 0 / 1465
EK (VB) 15 / 3072 3 / 3072 2 / 3072
EK (Apherese) 0 / 76
TK (VB) 12 / 806 6 / 806 4 / 806
TK (Apherese) 1 / 201 1 / 201 0 / 201
BactAlert 2. Ausstrich 1. Ausstrich