ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

========000========

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA

Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật

và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

Mã số: QG. 09. 48

Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học

Hà Nội, năm 2011

1

MỤC LỤC

PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT 3

Bằng tiếng Việt 3

Bằng tiếng Anh 8

PHẦN II. BÁO CÁO T ỔNG KẾT 12

Giải thích chữ viết tắt 13

Danh sách những người tham gia thực hiện ñề tài 13

Danh mục các bảng và hình 14

MỞ ðẦU 15

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 16

1.1 Kháng sinh 16

1.1.1. Khái niệm chung 16 1.1.2. Lịch sử phát triển kháng sinh 16

1.1.3. Phân loại kháng sinh 18

1.1.4. Kháng sinh kháng khối u 21

1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21

1.2 Xạ khuẩn 22

1.2.1. Các ñặc ñiểm chung 22

1.2.2. Xạ khuẩn và các chất thứ sinh 23

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 23

1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu 24

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1. Nguyên vật li ệu 25

2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 25

2.1.2. Hóa chất 25

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25

2.2.2. Các vi sinh vật kiểm ñịnh 26

2.2.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27

2.2.4. Chiết bằng ethyl-acetate 28

2.2.5. Sắc ký các chất chiết thu ñược 28

2.2.6. Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29

2.2.7. Phép thử ñộc tế bào 30

2

2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30

CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở

Vườn Quốc gia Cát Bà 32

3.2. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33

3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35

3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36

3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 36

3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38

3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42

3.5.1. ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42

3.5.2. Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44

3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45

3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46

3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào 46

3.7.2. Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate

của các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 47

KẾT LUẬN VÀ KI ẾN NGHỊ 53

TÀI LI ỆU THAM KH ẢO 55

PHỤ LỤC 62

3

PHẦN I. BÁO CÁO TÓM T ẮT

1. Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh

vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn 2. Mã số: QG.09.48

3. Thời gian thực hiện: 2 năm (2009 - 2011)

4. Cấp quản lý: ðại học Quốc gia Hà nội

5. Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ðHQGHN

ðiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: quyennhm@vnu.edu.vn

6. Cán bộ tham gia: - TS. Nguyễn Quỳnh Uyển

- TS. ðinh Thúy Hằng

- CN. Lê Phương Chung

- ThS. Phan Thị Hà

- CN. Lê Hồng Anh

7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ

khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo

Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do

các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.

Cụ thể là:

- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh

giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng

- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao

- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược

- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng

(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải

trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.

4

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của chất chiết từ dịch

nuôi của một số chủng có tiềm năng

- Phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính kháng tế bào

ung thư làm cơ sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.

8. Các kết quả ñạt ñược

8.1. Kết quả về mặt khoa học

- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu

thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ñọc

trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc

nhóm xạ khuẩn hiếm. Các chi xạ khuẩn hiếm có tỷ lệ cao trong bộ sưu tập này là

Micromonospora (hơn 7% trong tổng số 424 chủng), Nonomuraea (4%) và Nocardia

(gần 3%).

- 424 chủng xạ khuẩn này ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm

ñịnh ñại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli,

Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi

(Fusarium oxysporium).

- 115 chủng trong số 424 chủng nói trên ñã biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong

bốn vi sinh vật kiểm ñịnh.

- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh

vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)

kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427

và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14

chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn

Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng

có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm

men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh

vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. ðiều thú vị là 17 chủng

này chỉ thuộc 2 chi Streptomyces (10 chủng) và Nonomuraea (7 chủng).

- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate

ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate

(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).

5

So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng

A396).

- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích

sắc ký bản mỏng (TLC) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,

erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng

thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,

A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ

có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,

A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi

của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi

chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có

băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của

chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần

với ñối chứng này.

- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược ñược tiếp tục phân tích

qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng

sinh chuẩn. Kết quả cho thấy ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ

chloramphenicol, tất cả các mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các

kháng sinh ñối chứng.

- Một trong những nghiên cứu nữa ñược thực hiện với 17 chủng chọn lọc ñược là thực

hiện thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc pH. ðây là phép thử ñặc hiệu ñối với các

chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Qua ñó nhận thấy có hai chủng có

biểu hiện dương tính với phép thử này là A1018 và A1073.

- Như vậy với các bước nghiên cứu liên quan, từ 17 chủng có hoạt tính kháng sinh

tương ñối cao, 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư

người là A1018 (có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng),

A1022 (có phổ TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH).

- Bằng thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim,

các hợp chất chiết từ dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác

dụng dương tính với cả ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây

chết 50% tế bào ung thư, tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn)

thì thấy trong ba mẫu nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số

này thấp nhất và thấp gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng

6

diệt tế bào) của phép thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp

hơn ñáng kể so với hai chủng còn lại. ðây là một trong những kết quả nổi bật nhất của

ñề tài, làm tiền ñề cho các hướng nghiên cứu tiếp theo.

- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư

nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng

tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,

Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết

quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ

chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ

liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói

trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó. ðây là một kết quả thể hiện sự hợp tác

quốc tế của ñề tài.

8.2. Kết quả ñào tạo

ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc

chương trình ñào tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là:

“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,

Vietnam”. Học viên Nguyễn Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả

xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng 2 năm 2011.

8.3. Bài báo

Kết quả của ñề tài ñã ñược ñúc kết thành 02 bài báo:

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,

Vietnam. Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).

• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở

vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội

(ñã nhận ñăng).

9. Tình hình sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí của ñề tài ñược duyệt: 100.000.000 VNð

- Tổng kinh phí của ñề tài ñã quyết toán: 100.011.400 VNð, bao gồm các mục:

+ Chi phí thuê mướn: 40.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 49.084.000

+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm: 4.235.000

7

+ Hội họp: 1.500.000

+ Thông tin liên lạc: 442.000

+ Chi khác (lệ phí của ñơn vị DT): 4.750.000

Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài

Xác nhận của ðại học Quốc gia

8

SUMMARY

1. Project title: Investigation and study some substances which have antibiotic

activities against microorganisms and cancer cell lines from

actinomycetes

2. Code: QG.09.48

3. Duration: 2009 – 2011

4. Organizer: Institute of Microbiology and Biotechnology,

Vietnam National University, Hanoi (VNUH)

5. Project leader: Dr. Nguyen Huynh Minh Quyen

6. Key participants: Dr. Nguyễn Quỳnh Uyển

Dr. ðinh Thúy Hằng

BSc. Lê Phương Chung

MSc. Phan Thị Hà

BSc. Lê Hồng Anh

7. Objectives and study contents

Objective: This project was carried out to study biodiversity and to screen antibiotics from

actinomycete strains collected from a national park with high biodiversity in Vietnam,

named Catba National Park. The antibiotics produced by these strains were studied

further in order to find out their nature.

Study contents:

• Isolating actinomycete strains from soil and litter samples on Catba island (Hai

Phong) and then evaluating their biodiversity

• Screening the strains possessing high antibiotic activities

• Primary extracting the antibiotics from these strains

• Studying the properties of these antibiotics by use thin layer chromatography

(TLC) and high pressure liquid chromatography (HPLC)

• Classifying and identifying the strains possessing high antibiotic activities by use

their morphology and the sequences of 16S rDNA gene

• Testing cytotoxic activity of some potential strains

• HPLC analyses of the extracts from the strains capable of producing anticancer

agents to obtain data base in order to study their nature.

8. The obtained results

9

• 424 actinomycete strains, including 353 strains from soil and 71 strains form litter

samples, were collected at Cat Ba island and then were classified. As the result

through their observation morphology and the sequences of 16S rDNA gene, the

genus Streptomyces occupied about 70%, the rare actinomycetes were the rest.

Among the latter, Micromonospora occupied more than 7%, Nonomuraea

appeared about 4% and Nocardia was 3% in total.

• 424 above strains were screened their antibiotic activity against 4 tested

microorganisms, representative for bacteria (Negative Bacterium: Escherichia coli;

Positive Bacterium: Micrococcus luteus), yeast (Candida albicans) and fungi

(Fusarium oxysporium).

• Of 424 strains above, 115 strains out were shown antimicrobial activity against at

least one of the 4 testes microrganisms.

• Among these 115 strains, 2 strains (A1073, A1393) were shown activity against all

of the 4 tested microrganisms, 7 strains (A232, A390, A1018, A1022, A1041,

A1043 và A1470) against 3, 8 strains (A45, A149, A154, A160, A396, A410,

A427 và A444) against 2 testes microrganisms. Regarding the tested

microorganisms, 14 strains were shown inhibitory activity to Negative bacterium

(E. coli), 14 strains were shown inhibitory activity to Positive bacterium (M.

luteus); 11 strains were shown activity against both of these; 12 strains were shown

activity against fungi (F. oxysporium) and just only 6 strains were shown activity

against yeast (C. albicans). In general, 17 strains in total possessing activity

against at least 2 tested microoragnisms were selected for further study.

Interestingly, 17 these strains jsut belonged to 2 genus Streptomyces (10 strains)

and Nonomuraea (7 strains).

• 17 strains were cultured to get their cultured broths and the cultured broths were

extracted by ethyl acetate in order to obtain bioactive compounds. The yeild of

extracted substances soluble in ethyl acetate (from 1 liter cultured broth) was

variable from 30mg (strains A154) to 2152mg (strains A444). In comparison with

their respective dry mass, extracted subtances occupied from 0,51% (strains A154)

to 14,89% (strains A396).

• The substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 17 actinomycete

strains were analysed by thin layer chromatography (TLC) to compare their profile

with that of three standard antibiotics (chloramphenicol, kitasamycin,

10

erythromycin) and the cultured broth of control strain, capable of producing

anthracycline (A16). The bands obtained after chromatography were varied from 1

to 4 bands. 8 strains (A149, A154, A160, A232, A410, A427, A1073, A1393) were

shown 1 band, 3 strains (A396, A444, A1018) were shown 2 bands, 4 strains (A45,

A1041, A1043, A1470) - 3 bands and 2 strains (A390, A1022) - 4 bands. In

comparison with the standard antibiotics, the substances extracted from the

cultured broth of strain A396 were shown the similar band to chloramphenicol;

substances extracted from the cultured broth of the strains A45 and A410 were

shown the same band of erythromycin, none of them were shown the band similar

to the bands of antibiotic kitasamycin. In comparison with cultured broth of control

strain producing anthracycline, samples A1018 and A1022 were shown the

chromatography profile very close with this of the control.

• The substances soluble in ethyl acetate of the 17 selected strains were analysed by

high performance pressure chromatography (HPLC) in the same condition as that

of the standard antibiotics. Except strain A396, which was shown the peak similar

to that of chloramphenicol, the rest of the samples were not shown any connection

with the control antibiotics.

• Furthermore 17 selected strains tested to change the colour based on the

enviromental pH. This is a specific test for strains producing antibiotic of group

anthracycline. Two strains A1018 and A1073 were shown positive results in this

test.

• 3 strains out of 17 strains above (A1018 (the TLC profile and change the coulour

based on pH were similar to that of the control strain), A1022 (TLC profile is

similar to that of the control) and A1073 (change the coulour based on pH)) with

relatively high antibiotic activity, were selected to test cytotoxicity against human

cancer cell lines. Crude extracts of three strains above exhibited significant

cytotoxic activity against hepatocellular carcinoma, lung cancer, and

rhabdosarcoma human cell lines.

• By testing with hepatocellular carcinoma, lung cancer, and rhabdosarcoma human

cell lines, the substances extracted from the cultured broths of three selected strains

exhibited positive results against all of these cell lines. By the comparison of IC50

value (i.e., the concetration of agents kills 50% cancer cells in number, which

means the smaller this value is, the higher the cytotoxicity is), the substance

11

extracted from strain A1073 was shown the lowest value and this value is very

close to that of the positive control of this test. This value is also as low as that of

the control strain producing anthracycline and significant lower in comparison with

the rest of the two strains. This is one of the outstanding results of the project and

this provides the base to develop further research.

• Substances soluble in ethyl acetate of the cultured broths of 3 strains above were

analysed by HPLC at the same chromatography condition for similar subjects at

Molecular Microbiology Lab, International Center for Biotechnology, Osaka

University. HPLC analyses of ethyl acetate crude extracts of the three strains

A1022, A1018 revealed relatively high complexity, possessing 5 peaks, 8 peaks

and 6 peaks, respectively. Their data base is going to compare with that available

at this Lab in order to find out the nature of these substances. This is one of

international collaboration of the project.

9.1. Education results

The project contributes to educating 01 Master student, field Biotechnology,

belonged to international program jointed with University of Liege, Belgium. The

dissertation is: “Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from

Catba island, Vietnam”. The master students Nguyễn Phương Chung did defend

successfully on Feb 24th, 2011.

9.2. Publication:

All of the results above resulted in 02 publications:

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,

Vietnam. Journal of Biotechnology (accepted).

• Primary screening anticancer antibiotic from actinomycetes isolated at Cát Bà

National Park, Journal of Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam

National Unversity, Hanoi (accepted).

Xác nhận của cơ quan Chủ trì ñề tài

Xác nhận của ðại học Quốc gia

12

PHẦN II. BÁO CÁO T ỔNG KẾT

13

GIẢI THÍCH CH Ữ VIẾT TẮT

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

DNA: Deoxyribonucleic acid

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

HPLC: High-performance liquid chromatography

rDNA 16 S: gene 16S của DNA ribosome

TE: ñệm có 10mM Tris-HCl và 1mM EDTA, pH8,0

TLC: Thin layer Chromatography

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA TH ỰC HIỆN ðỀ TÀI

1. Chủ trì: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

2. Những người thực hiện:

- TS. Nguyễn Quỳnh Uyển

- TS. ðinh Thúy Hằng

- CN. Lê Phương Chung

- ThS. Phan Thị Hà

- CN. Lê Hồng Anh

14

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn

Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược

Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn lọc

ñược

Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces

Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào

Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ 3 chủng có hoạt tính gây ñộc

tế bào ung thư

Danh mục hình

Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm

Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và idarumycin (IDA)

Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn

Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ chủng A396 (B)

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces

Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces

Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ

khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea

Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073

Hình 3.8. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018

Hình 3.9. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022

Hình 3.10. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073

15

MỞ ðẦU

Sức khỏe luôn là một trong những vấn ñề ñược chú trọng nhất trong mỗi quốc gia.

Mặc dù các thành tựu có ñược trong ngành hoá dược ñã ñem lại sự phong phú về chủng

loại dược phẩm, nhưng việc tìm kiếm và sử dụng trực tiếp các sản phẩm tự nhiên có hoạt

tính sinh học trong việc chữa trị các bệnh nan y vẫn luôn là hướng ñược quan tâm hiện

nay. Trong một tổng kết về các loại dược phẩm hiện ñang lưu hành trên thế giới, Newman

và cộng sự (2003) ñã cho biết từ năm 1981 ñến năm 2002 trong tổng số 868 loại thuốc

ñược phép ñưa vào sử dụng thì có ñến 58% là có nguồn gốc tự nhiên. ðặc biệt con số này

là 62% ñối với thuốc dùng trong ñiều trị bệnh ung thư.

Với nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú và ña dạng, Việt nam có cơ sở ñể phát

triển ngành công nghệ sinh học theo hướng ứng dụng y-dược này. ðây cũng là một bài

toán ñặt ra cho ngành dược nước nhà trước tình hình thuốc nhập ngoại chiếm vị trí áp ñảo

trên thị trường và trong các bệnh viện lớn. ðể cung cấp nguồn nguyên liệu hỗ trợ cho

ngành dược, các nghiên cứu về ñặc tính sinh học từ vi sinh vật có tác dụng chữa trị bệnh

cần phải ñược chú trọng, nhằm tạo tiền ñề cho việc phát triển dược phẩm mới với tính

năng ñiều trị cao và ít tác dụng phụ không mong muốn. Sự suy thoái môi trường sống ở

Việt nam hiện nay là nguyên nhân dẫn ñến ña dạng hoá các tác nhân gây bệnh. Các bệnh

viêm nhiễm và bệnh ung thư hiện ñang là ñối tượng cần thiết ñể các nhà nghiên cứu ñặt

mục tiêu tìm kiếm các chất có công dụng ức chế từ nguồn vi sinh vật nội ñịa.

Thay ñổi khí hậu, ô nhiễm môi trường sống là những yếu tố gây tác ñộng trực tiếp

ñến sức khỏe của con người. Theo dự báo toàn cầu, tại một số vùng trên thế giới, trong ñó

có Việt nam, tỷ lệ người mắc bệnh viêm nhiễm thông thường hay các bệnh nguy hiểm

như ung thư, tim mạch... ngày càng gia tăng (Ashutosh K., 2008; Goodfellow M., 1998).

Do vậy, việc nghiên cứu ñể tìm kiếm các chất có hoạt tính chữa trị bệnh từ các nguồn gốc

tự nhiên là một trong những hướng nghiên cứu trọng tâm của ngành công nghệ sinh học

tại nhiều quốc gia, ñặc biệt ở các nước phát triển. ðể nắm bắt ñược những kỹ thuật tiên

tiến trong lĩnh vực này và từng bước hoà nhập với sự phát triển chung, ñồng thời ñể ñáp

ứng nhu cầu trong việc bảo vệ sức khoẻ cộng ñồng, Việt nam cần chú trọng khai thác

nguồn ña dạng vi sinh vật của mình làm nguyên liệu ñể phát triển dược phẩm. Vì lẽ ñó

chúng tôi ñã ñề xuất và ñã ñược ðại học quốc gia Hà Nội phê duyệt thực hiện ñề tài:

“ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật và kháng dòng

tế bào ung thư từ xạ khuẩn”

16

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LI ỆU 1. 1 Kháng sinh

1.1.1. Khái ni ệm chung

Theo ñịnh nghĩa truyền thống thì kháng sinh (còn ñược gọi là trụ sinh) là những

chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách ñặc

hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp ñộ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi

khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo ñịnh nghĩa hiện

nay, kháng sinh ñược hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và ở nồng ñộ

thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các) vi sinh vật khác (Nduka,

2007).

Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năng diệt khuẩn gồm các chất

kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao ñổi chất như các acid lactic do các vi khuẩn

lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại ngoại ñộc tố có bản chất protein,

các bacteriocin…. Các “vũ khí sinh học” này ñược quan tâm ñặc biệt do tính ña dạng và

cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret & Milind, 2007).

Thực, ñộng vật bậc cao cũng có khả năng sinh “kháng sinh” tuy nhiên các hợp chất

này nằm ngoài ñịnh nghĩa nói trên. Tương tự như vậy, mặc dù cũng do vi sinh vật sinh ra

nhưng bacteriocin cũng không ñược coi là kháng sinh không chỉ vì chúng có khối lượng

phân tử không lớn như các chất kháng sinh thông thường khác mà còn do chúng chủ yếu

ảnh hưởng ñến các vi sinh vật gần với vi sinh vật sản sinh ra bacteriocin. So với

bacteriocin, các chất kháng sinh ña dạng về bản chất hóa học và tấn công các vi sinh vật

không có quan hệ họ hàng. ðiểm khác biệt quan trọng nữa là trong khi thông tin di truyền

của các chất kháng sinh thường nằm trên một vài gen thì bacteriocin chỉ cần gen ñơn.

(Nduka, 2007). ðến nay ñã có khoảng 16.500 kháng sinh ñược phát hiện từ vi sinh vật, và

hàng năm hàng chục kháng sinh mới ñược phát hiện (Hopwood, 2007).

1.1.2 Lịch sử phát tri ển kháng sinh

Kháng sinh là thuốc ñược con người dùng chủ yếu ñể chống các bệnh truyền

nhiễm. Các bệnh truyền nhiễm chiếm phần rất lớn trong các bệnh của con người và ñộng

vật. Cho ñến nửa sau của thế kỷ 19 người ta ñã phát hiện ra rằng vi sinh vật chính là thủ

phạm gây ra hàng loạt các bệnh truyền nhiễm. Do ñó liệu pháp hóa học nhằm vào các vi

sinh vật gây bệnh ñã ñược phát triển thành liệu pháp ñiều trị chính.

17

Vào năm 1928, Fleming phát hiện ra penicillin và kháng sinh này ñã ñược dùng

trong ñiều trị vào những năm 1940. Ngay sau ñó penicillin ñã trở thành một kháng sinh

nổi tiềng vì ñã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới II (Saga &

Yamaguchi, 2008).

Từ những năm 1940 ñến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới ñược xác

ñịnh hầu hết từ xạ khuẩn, và ñó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh

(Hình 1.1).

Hình 1.1 Kháng sinh ñược phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007).

Năm 1944, streptomycin ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất Streptomyces griseus. Sau

ñó ñến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và

glycopeptide (tức vancomycin) ñược phát hiện từ vi khuẩn ñất. Các kháng sinh tổng hợp

như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone ñã ñược tạo ra vào năm

1962. Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu ñược phổ kháng vi sinh vật rộng

hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn ví dụ như các kháng sinh β-lactam. Lớp β-lactam

gồm penicillin, cephem, carbapenem và monobactam. Penicillin ban ñầu có tác dụng hiệu

quả lên vi khuẩn Gram dương như Staphylococcus aureus. Sau ñó, S. aureus sinh ra các

enzyme phân giải penicillin- penicillinase, nên người ta phát triển methicillin. Bên cạnh

ñó, ñể mở rộng phổ tác dụng của ampicillin (là kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm

Enterobacteriaceae) người ta ñã phát triển ñược piperacillin có thể kháng ñược cả

Pseudomonas aeruginosa (Hình 1.2).

18

Hình 1.2 Sự tiến hóa của penicillin G (Saga et al, 2008)

Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong ñiều trị ở thế kỷ 20 ñã

làm giảm ñáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới ñược

ñưa vào ñiều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày

càng lớn. Bên cạnh ñó, một hiện trạng ñáng báo ñộng là ngày càng tăng các vi sinh vật

gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải ñược

khắc phục bằng việc phát hiện ra các thuốc mới. Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng

nhanh kháng thuốc và tốc ñộ ñó lại nhanh hơn tốc ñộ tạo ñược thuốc mới của con người.

Do vậy, các nghiên cứu cần phải tập trung vào làm thế nào ñể vượt qua tính kháng thuốc

kháng sinh cũng như phát hiện các kháng sinh mới có các cơ chế hoạt ñộng khác nhau

(Fred, 2006).

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có một số phương pháp phân loại kháng sinh. Một trong những phương pháp ñó là

dựa vào kiểu hoạt ñộng tức là kháng sinh ñó tác ñộng lên vách tế bào, kìm hãm protein…

Tuy nhiên có khi một kháng sinh lại có nhiều cơ chế ñồng thời cùng tác ñộng nên cách

phân loại này khó áp dụng. Một số trường hợp kháng sinh ñược phân loại dựa trên vi sinh

vật sản sinh ra kháng sinh ñó. Nhưng khi ñó có trường hợp một vi sinh vật có thể sinh ra

một số kháng sinh như Streptomyces sp. có thể sinh penicillin N và cephalosporin. Ngược

lại một kháng sinh cũng có thể do nhiều vi sinh vật sinh ra. Kháng sinh cũng ñã ñược

phân loại dựa theo con ñường sinh tổng hợp. Phổ tác ñộng cũng ñược dung, ví dụ như tác

19

ñộng lên vi khuẩn, nấm, nguyên sinh ñộng vật… Tuy nhiên một loại/nhóm kháng sinh

như aminoglycoside lại có thể có phổ tác dụng khác nhau (Nduka, 2007; Tortora et al,

2010).

Cách phân loại nêu dưới ñây là dựa trên cấu trúc hóa học của kháng sinh và theo

ñó kháng sinh ñược phân thành 13 nhóm (Bảng 1.1) (Nduka, 2007).

Bảng 1.1 Các nhóm kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Nhóm hóa học Ví dụ

Aminoglycoside Streptomycin

Ansamacrolide Rifamycin

Beta-lactam Penicillin

Chloramphenicol và các chất tương tự

Chloramphenicol

Linocosaminide Linocomycin

Macrolide Erythromycin

Nucleoside Puromycin

Puromycin Curamycin

Peptide Neomycin

Phenazine Myxin

Polyene Amphothericin B

Polyether Nigericin

Tetracycline Tetracycline

Như ñã ñề cập ở trên có nhiều cách phân loại kháng sinh và không có cách nào

thỏa mãn toàn bộ các yêu cầu về phân loại. Do vậy, cách phân loại dựa trên cấu trúc hóa

học nêu ở ñây cũng chỉ mang tính chất tương ñối và các ví dụ nêu ra là ñể dễ dàng nhận

biết nhóm có kháng sinh ñó mà thôi. Sau ñây là một số nhóm kháng sinh thông dụng:

a. Aminoglycoside là nhóm các kháng sinh mà các ñường amino ñược liên kết bằng

liên kết glycoside. Streptomycin và gentamicin là các ví dụ ñiển hình của nhóm này.

Streptomycin vẫn còn là thuốc thay thế trong ñiều trị bệnh lao, nhưng do sự phát triển tính

kháng thuốc nhanh chóng và các ảnh hưởng ñộc hại nghiêm trọng ñã làm hạn chế việc sử

dụng kháng sinh này. Các aminoglycoside kìm hãm tổng hợp protein ở nhiều vi khuẩn

Gram âm và một số vi khẩn Gram dương. ðôi khi chúng ñược dùng kết hợp với penicillin.

20

Thành viên của nhóm này thường có xu hướng ñộc hơn các nhóm kháng sinh khác

(Tortora et al, 2010).

b. Beta-lactam là các kháng sinh ñã ñược sử dụng rất nhiều và rất quan trọng trong ñiều

trị như penicillin, cephalosphorin cũng như các loại tương ñối mới như cephamycin,

nocardicin, thienamycin và clavulanic acid (Nduka, 2007).

Penicillin là chất diệt khuẩn, kìm hãm sự tạo thành vách tế bào. Có 4 loại penicillin:

penicillin-G phổ hẹp, ampicillin và các chất tương tự, các penicillin kháng penicillinase

và các penicillin phổ rộng có thể kháng các vi khuẩn thuộc nhóm Pseudomonas. Các

penicillin-G kháng hiệu quả các chủng Gram dương như Streptococcus, Staphylococcus,

và một số vi khuẩn Gram âm như Meningococcus. Penicillin-G ñược dùng ñể ñiều trị các

bệnh như giang mai, lậu, viêm màng não, lao và bệnh ghẻ cóc (yaws). Penicillin V có

hoạt ñộng tương tự nhưng hiệu lực thấp hơn. Ampicillin và amoxicillin có tác dụng tương

tự penicillin-G nhưng có phổ tác dụng rộng hơn bao gồm cả một số vi khuẩn Gram âm

(Tortora et al, 2010).

c. Chloramphenicol kìm hãm sự sinh trưởng của nhiều vi khuẩn Gram dương và âm,

ñây là kháng sinh phổ rộng ñầu tiên ñược sử dụng trong ñiều trị. Chloramphenicol ñược

sản xuất từ nuôi cấy vi khuẩn ñất Streptomyces venezuelae. Chloramphenicol kìm hãm

sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gây nhiễu hoạt tính xúc tác của peptidyl-

transferase của ribosome trong pha kéo dài của phiên mã. Do phân tử lượng thấp, kháng

sinh này có thể thâm nhập vào nhiều vùng của cơ thể mà các loại thuốc khác không thể

thâm nhập ñược. Tuy nhiên, chloramphenicol có các ảnh hưởng bất lợi, trong ñó quan

trọng nhất là kìm hãm hoạt ñộng của tủy xương do ñó ảnh hưởng ñến sự tạo thành tế bào

máu (Creighton, 1999; Nduka, 2007).

d. Macrolide là nhóm các kháng sinh ñược ñặt tên do có mặt vòng macrocyclic lactone

trong phân tử. Macrolide ñược dùng nhiều nhất trong ñiều trị là erythromycin. Kiểu hoạt

ñộng của nó là kìm hãm tổng hợp protein. Erythromycin có tác dụng hiệu quả lên các cầu

khuẩn Gram dương và thường ñược dùng ñể thay thế penicillin trong các bệnh nhiễm

Streptococcus và Pneumococcus. Macrolide còn ñược dùng trong ñiều trị bệnh bạch hầu

và nhiễm trùng huyết (bacteremia). Tác dụng phụ của nhóm kháng sinh này có thể gồm

nôn, mửa và tiêu chảy, ñôi khi gây suy giảm thính giác (Nduka, 2007).

e. Tetracycline là nhóm kháng sinh phổ tương ñối gần nhau do Streptomyces spp sinh ra.

Tetracycline ảnh hưởng tới sự gắn tRNA mang amino acid vào ribosome ở tiểu ñơn vị

30S của ribosome 70S do ñó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide ñang

tổng hợp. Tetracycline là các kháng sinh phổ rộng kháng các Streptococcus, Bacillus

21

Gram âm, rickettsia (gây sốt thương hàn) và Spirochetes (gây bệnh giang mai). Các kháng

sinh này cũng ñược dùng ñể ñiều trị nhiễm trùng ñường tiết niệu và viêm cuống phổi.

Nhờ phổ tác dụng rộng, tetracycline ñôi khi làm thay ñổi cân bằng hệ vi khuẩn nội sinh

thông thường ñược duy trì/kiểm soát bởi hệ miễn dịch của cơ thể, dẫn ñến việc nhiễm

khuẩn thứ cấp ví dụ như ở hệ tiêu hóa hay âm ñạo. Việc sử dụng tetracycline hiện nay còn

bị hạn chế do sự tăng tính kháng của các chủng vi khuẩn (Nduka, 2007).

1.1.4 Kháng sinh kháng ung thư (Anti-tumor antibiotics)

Ở sinh vật bậc cao mỗi tế bào có chức năng nhất ñịnh ñược thực hiện trong mối

tương tác/liên hệ với các tế bào khác. ðôi khi, tế bào mất liên hệ với các tế bào xung

quanh và phân chia một cách không ngừng ñể tạo thành cấu trúc gọi là khối u hay ung thư.

Ung thư ñược ñiều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp gồm phẫu

thuật ñể loại bỏ khối u, chiếu xạ ñể phá hủy chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hóa trị.

Nhiều chất hóa học dùng trong hóa trị liệu ung thư là các sản phẩm thứ cấp do vi sinh vật

sinh ra do ñó ñược gọi là kháng sinh chống/kháng khối u (Nduka, 2007; Carlos et al,

2009). Một số nhóm kháng sinh ñã ñược dùng trong ñiều trị ung thư có thể kể ñến là

anthracycline, actinomycin và bleomycin.

Anthracycline ñược sử dụng rộng rãi trong ñiều trị ung thư như ung thư máu, ung

thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư

vú, ung thư bàng quang (Gewirtz, 1999). Một số

chủng ñược cho là sinh anthracycline là

Streptomyces coeruleorubidus hoặc

Streptomyces peucetius. Nhóm kháng sinh này

cho ñến nay ñược ghi nhận gồm daunorubicin

(DNR), doxorubicin, epirubicin và idarumycin

(IDA) (Hình. 1.3). Daunorubicin và adriamycin

gắn vào các cặp base do ñó kìm hãm tổng hợp

RNA và DNA. Mithramycin và chromomycin

A3 (là các actinomycin), kìm hãm tổng hợp

RNA phụ thuộc DNA. Bleomycin tương tác và

làm ñứt gãy DNA (Nduka, 2007; Carlos et al,

2009).

1.1.5. Nhu cầu phát tri ển kháng sinh mới

Một trong các thành tựu của y học hiện

ñại là phát triển các chất kháng sinh và các chất

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của daunorumycin (DNR) và

idarumycin (IDA)

22

kháng vi sinh vật khác. Tuy nhiên, rõ ràng là các vi sinh vật ñã và ñang phát triển tính

kháng với các kháng sinh hiện có bằng các ñột biến mới hoặc thay ñổi thông tin di truyền

(Arnold et al, 2009). Cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi

khuẩn kháng thuốc, ñặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh (anti-parasitic).

Tuy nhiên việc tìm kiếm các kháng sinh chống ung thư khó hơn nhiều so với các chất

kháng khuẩn hay kháng nấm về mặt phương pháp và biểu hiện (interpretation) (Nduka,

2007). Hơn nữa còn cần các kháng sinh mới cho nông nghiệp ñể làm thuốc chữa bệnh cho

cây trồng và vật nuôi vì các bệnh ñó sẽ ảnh hưởng ñến con người thông qua chuỗi thức ăn.

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Các ñặc ñiểm chung

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất ña dạng trong ñó ña số sinh trưởng hiếu khí

và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn –actinomycete- bắt nguồn từ

tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) và ban ñầu xạ khuẩn ñược coi là nấm nhỏ vì

chúng sinh trưởng giống với nấm. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở

cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất

(Ashutosh, 2008). ða số xạ khuẩn sinh bào tử, bào tử rất khác nhau về hình dạng và kích

thước. ðây là một trong những ñặc ñiểm ñể phân loại.

Xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương có tỷ lệ G+C cao (>55%) trong DNA. ða số xạ

khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong ñất, nước và xác thực vật. Xạ khuẩn

ñóng vai trò về mặt sinh thái quan trọng trong vòng tuần hoàn tự nhiên. Chúng phân hủy

và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong ñất. Nhiều chủng xạ

khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp chất liên quan ñến lignin bằng

cách sinh các enzyme thủy phân cellulose và hemicellulose và các peroxidase ngoại bào

(Pasti et al., 1990; Mason et al., 2001). Các chủng xạ khuẩn cũng xuất hiện trong môi

trường giàu hữu cơ như các compost, ở cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt

(thermophilic) (Steger, 2006), và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa

mycolic acid kết hợp với việc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn ñịnh, ñặc trưng (Seong

et al., 1999, Goodfellow et al., 1996).

Nhìn chung, nhiệt ñộ ôn hòa 25-30°C và pH trung tính là các ñiều kiện tối ưu cho

xạ khuẩn phát triển. Mặc dầu vậy, nhiều loài ñã ñược phân lập ở các môi trường khắc

nghiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh ñược phân lập từ trầm tích hồ ở Nam

cực có thể sống ở nhiệt ñộ 0°C (Chen et al., 2005) và Nocardiopsis alkaliphila ñược phân

lập từ ñất sa mạc ở Ai Cập có thể sống ở pH 9.5-10 (Hozzein et al., 2004).

23

Về mặt phân loại, lớp xạ khuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong ñó bộ ñược nhắc ñến

nhiều nhất (có giá trị trong y học và kinh tế) là bộ Actinomycetales. Bộ Actinomycetales

có 13 dưới bộ, 42 họ và khoảng 200 chi (http://en.wikipedia.org/wiki/Actinobacteria).

Xạ khuẩn thường ñược chia thành hai loại: Streptomyces và không phải

Streptomyces (non-Streptomyces). Chi xạ khuẩn ñược biết nhiều nhất là Streptomyces, với

khoảng 500 loài, tất cả ñều có GC cao (69–73 %) trong DNA. Streptomyces ñặc biệt

nhiều trong ñất nơi chúng phân hủy hoại sinh rất nhiều phức các chất hữu cơ bằng các

enzyme ngoại bào. Thực tế, mùi mốc ñặc trưng của nhiều loại ñất liên quan ñến sự sản

sinh hợp chất hữu cơ dễ bay hơi gọi là geosmin

(http://science.howstuffworks.com/question479.htm). Một phần rất lớn các chất kháng

sinh ñược sự dụng hiệu quả trong ñiều trị có nguồn gốc từ các loài Streptomyces trong ñó

ñược biết ñến nhiều nhất là streptomycin, erythromycin và tetracycline (Stuart, 2005).

1.2.2 Xạ khuẩn và các chất thứ sinh

Xạ khuẩn ñược ñặc biệt quan tâm là do khả năng sinh ra các hợp chất thứ sinh có

giá trị ứng dụng cao. Trong các hợp chất tự nhiên do vi sinh vật sinh ra ñã ñược công bố

sử dụng trên toàn thế giới thì 45% ñược sinh ra từ xạ khuẩn, 38% từ nấm và 17% từ vi

khuẩn ñơn bào (Arnold et al, 2009). Hai phần ba kháng sinh ñã biết ñược sinh ra bởi xạ

khuẩn chủ yếu từ các loài Streptomyces (Miyadoh, 1997). Các hợp chất kháng sinh khác

nhau của xạ khuẩn ñã ñược nghiên cứu ñặc ñiểm gồm aminoglycoside, anthracyclin,

glycopeptide, β-lactam, macrolides, nucleoside, peptide, polyene, polyeste, polyketide,

actinomycin và tetracycline (Goodfellow et al., 1988). Các hợp chất này ñã ñược sử dụng

thành công làm thuốc giệt cỏ, thuốc chống ung thư, thuốc, các chất ñiều hòa miễn dịch và

các chất chống ký sinh trùng (Thomson et al, 1995).

1.3. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam

Ở Việt Nam xạ khuẩn ñã ñược quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong ñó các nghiên

cứu tập trung vào ñặc ñiểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000-2004), tối ưu hóa môi trường

nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh kháng sinh kháng các vi

sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm ñạo ôn, nấm thối cổ

rễ…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật

gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng và cs, 2009). Ngoài ra còn có công trình

nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng

sinh của xạ khuẩn (Vi Thị ðoan Chính, 2000), hay sản xuất kháng sinh b-lactam (Lê Gia

Hy và Phạm Thị Bích Hợp, 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ

24

khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs., 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs,

2005).

Cho ñến nay chưa thấy công trình nào ñề cập ñến kháng sinh kháng ung thư có

nguồn gốc từ xạ khuẩn ở Việt Nam.

1.4. Nội dung và mục ñích của nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ

khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo

Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do

các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.

Cụ thể là:

- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh

giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng

- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao

- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược

- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng

(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải

trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của dịch chiết từ dịch

nuôi của một số chủng có tiềm năng

- Phân tích HPLC chất chiết từ các chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư làm cơ

sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.

25

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên vật li ệu

2.1.1. ðối tượng nghiên cứu

Các chủng xạ khuẩn phân lập từ các mẫu ñất và rác thu thập từ Cát Bà năm 2008 là

ñối tượng nghiên cứu của ñề tài này.

Chủng xạ khuẩn Nonomuraea roseoviolacea có ký hiệu A16 do National Institute

of Technology and Evaluation (NITE, Nhật Bản) cung cấp ñược dùng làm ñối chứng như

xạ khuẩn sinh anthracycline trong các phân tích sắc ký và ñộc tố tế bào.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất ñược sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật ñều là những hóa chất có

tiêu chuẩn chất lượng cao của các hãng cung cấp lớn như Merck (ðức), Sigma (Mỹ). Hoá

chất và một số kit dùng cho phân tích sinh học phân tử do các hãng Bioneer (Hàn Quốc),

Fermentas (ðức), Qiagen (Mỹ), ABI (Mỹ), BioRad (Mỹ) cung cấp. Các hóa chất dùng

cho HPLC ñạt tiêu chuẩn cho phân tích này.

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

Nghiên cứu ñược thực hiện chủ yếu tại Vi ện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học –

ðại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng các thiết bị chuyên môn dùng trong vi sinh vật học,

sinh học phân tử và hoá phân tích ñạt tiêu chuẩn quốc tế.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn

Hai phương pháp phân lập ñã ñược sử dụng trong ñề tài là phương pháp sấy khô

(Nonomura et al, 1969) và phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (rehydration–centrifugation)

(Hayakawa et al, 2000).

Trong phương pháp sấy khô, các mẫu ñất và rác ñược làm khô ở nhiệt ñộ phòng

trong 5-7 ngày rồi xử lý ở nhiệt ñộ 90 – 110 0C trong 10 – 30 phút ñể loại bỏ các vi khuẩn

không sinh bào tử (hầu hết các bào tử xạ khuẩn không chết ở ñiều kiện này). Tiếp theo,

các mẫu ñược trải lên môi trường HV (môi trường thạch có humic acid và vitamin: humid

acid 1 g, CaCO3 0,02 g; FeSO4.7H2O 0,01 g; KCl 1,71 g; MgSO4.7H2O 0,05 g; Na2HPO4

0,5 g, cycloheximine 50 mg, nalidixic acid 20 mg, kabicidine 14 mg, thạch 18 g, H2O 1 L,

pH 7,2) và nuôi ở 28 – 300C trong 7 ñến 14 ngày. Các khuẩn lạc xạ khuẩn với hình thái

khác nhau ñược nhặt và chuyển sang môi trường YS (môi trường thạch chứa dịch chiết

26

nấm men và tinh bột: glucose 10 g, cao nấm men 2 g, thạch 17 g, H2O 1 L, pH 7,0) ñể tạo

sinh khối tế bào nhiều hơn.

Phương pháp ly tâm-hoàn ẩm (RC) là một phương pháp phân lập ñặc hiệu với xạ

khuẩn ñộng. Các bước tiến hành như sau:

− Lấy 0.5 g mẫu ñất và rác ñã ñược phơi khô cho vào bình tam giác 100 ml, nhẹ

nhàng thêm 50 ml ñệm phosphate 10 mM (pH = 7) chứa 10% dịch chiết ñất (trộn

500 g ñất với 500 ml nước cất trong bình tam giác, khử trùng ở 121°C trong 30

phút, lọc hai lần, khử trùng và bảo quản ở 4°C).

− ðậy bình bằng giấy nhôm và nuôi ở 30°C trong 90 phút ñể giải phóng các ñộng bào

tử (motile zoospores).

− Chuyển 8 ml dịch nổi vào ống falcon 15 ml, ly tâm ở nhiệt ñộ phòng trong 20 phút

ở 1,500 g ñể loại bỏ các xạ khuẩn không ñộng. ðể các ống ổn ñịnh trong 30 phút.

− Lấy 1 ml dịch nổi rồi pha loãng bậc 2 bằng nước sạch ñã khử trùng, lấy 0,2 ml của

các bậc pha loãng 10-2, 10-3 và 10-4 cho lên ñĩa môi trường thạch HV và nuôi ở 28 –

30°C trong 2 – 3 tuần ñể tạo khuẩn lạc.

− Nhặt các khuẩn lạc ñược tạo thành và chuyển vào ñĩa môi trường thạch HV mới ñể

thuần khiết lần thứ hai rồi chuyển sang môi trường thạch YS ñể tạo sinh khối.

Tất cả các chủng xạ khuẩn phân lập bằng hai phương pháp nói trên ñều ñược lưu giữ

ở -80°C trong dung dịch glycerol 20% tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (Vietnam

Type Culture Collection-VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðại học Quốc

gia Hà Nội.

2.2.2. Các vi sinh vật ki ểm ñịnh

Bốn chủng vi sinh vật do VTCC cung cấp, gồm Micrococcus luteus (có ký hiệu

VTCC-B-644), Escherichia coli (VTCC-B-428), Candida albicans (VTCC-Y-674) và

Fusarium oxysporium (VTCC-F-239) ñược sử dụng làm ñích ñể sàng lọc hoạt tính kháng

vi sinh vật. Các chủng này ñược nuôi trong các môi trường dinh dưỡng thích hợp, cụ thể

là môi trường Mueller-Hinton (MHA: cao thịt 0,3%; casein thủy phân 1,75%; tinh bột

0,15%; pH 7,4) ñối với E. coli và M. luteus, môi trường cao nấm men/malt (YM; glucose

1%, peptone 0,5%; cao nấm men 0,3%; cao malt 0,3%) ñối với C. albicans và F.

oxysporum. Việc nuôi cấy ñược tiến hành trong ñiều kiện lắc ở 37 °C ñối với E. coli và

M. luteus hoặc 30°C ñối với C. albicans và F. oxysporum.

27

2.2.3 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh

Trước tiên, tất cả các chủng xạ khuẩn ñược hoạt hóa trong ñĩa môi trường YS ở

30°C trong 3–4 ngày. Sau ñó các chủng ñược nuôi trong môi trường ñậu tương lỏng (tinh

bột 25 g, bột ñậu tương 15 g, cao nấm men 1 g, CaCO3 4 g, nước cất 1 L, pH 6,2) ở 30°C

trong 3 ngày có lắc với tốc ñộ 100 vòng/phút. Sau thời gian nuôi cấy, dịch nuôi ñược ly

tâm ở 8.000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch nổi thu ñược ñược dùng ñể ñánh giá hoạt tính

kháng vi sinh vật. Có hai bước ñánh giá hoạt tính:

a. Phương pháp thỏi thạch

Các mảnh thạch có ñường kính 5 mm ñược cắt từ ñĩa môi trường YS có chủng xạ

khuẩn mọc rất tốt ñược ñặt lên bề mặt các ñĩa thạch trước ñó ñã ñược cấy vi sinh vật kiểm

ñịnh và nuôi trong ñiều kiện thích hợp trong 2 ngày. Hiệu quả kìm hãm ñược ñánh giá

thông qua sự tạo thành các vùng kìm hãm quanh mảnh thạch có xạ khuẩn và hoạt tính

ñược ño bằng ñường kính của các vùng này (Ichikawa T. và cộng sự, 1971).

b. Phương pháp khuếch tán dịch nuôi

Các giếng nhỏ ñược ñục trên các ñĩa thạch rắn trước ñó vừa ñược cấy vi sinh vật

kiểm ñịnh. Nhỏ khoảng 25 µl dịch nuôi ñã ly tâm vào các giếng và nuôi trong 2 ngày dưới

các ñiều kiện thích hợp với vi sinh vật kiểm ñịnh. Hoạt tính kháng sinh ñược ñánh giá

thông qua các vòng kìm hãm ñược tạo thành quanh giếng. Các thí nghiệm ñược lặp lại hai

lần và dịch môi trường ban ñầu ñã khử trùng ñược dùng làm ñối chứng âm (Alex Y. l. T.,

Hai M.T. 2006).

2.2.4 Chiết bằng ethyl acetate

Dịch nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn trong môi trường ñậu tương lỏng sau ly tâm

(ở 8000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt ñộ phòng) loại bỏ tế bào ñược tách chiết theo mô

tả của Guoliang Yin và cộng sự với một số thay ñổi cho phù hợp (Guoliang Yin và cs,

2010). Bốn thể tích ethyl acetate ñược thêm vào rồi ñược lắc kỹ trong 1 giờ. Phần hòa tan

ñược thu lại bằng bình chiết sau ñó ñược bổ sung sulfate natri sao cho có nồng ñộ là 5

g.L-1. Dung môi ñược loại bỏ bằng máy loại dung môi. Phần cắn thu ñược sẽ ñược xử lý

tùy theo mục ñích thí nghiệm tiếp theo.

ðể tiến hành sắc ký, phần cắn sẽ ñược hòa tan trong chloroform (Westley J.W., và

cs., 1979). Tuy nhiên trước khi tiến hành sắc ký, dịch chiết thô trong chloroform sẽ ñược

kiểm tra lại hoạt tính kháng vi sinh vật bằng phương pháp ñã mô tả 2.2.3.b với chloroform

là chứng âm.

28

ðối với phép thử ñộc tố tế bào cắn ñược thu lại ở dạng rắn. Việc tiến hành xử lý tiếp

theo ñược tuân thủ theo quy trình mô tả ở 2.2.7.

2.2.5 Sắc ký các chất chiết thu ñược

2.2.5.1. Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)

Phân tích TLC ñược tiến hành trên bản Silica Gel G (20 x 10 cm) với hệ dung môi

chloroform : methanol (90:10). Chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin dịch chiết

thô của anthracyclines (do chủng A16 sinh ra) ñược dùng làm chuẩn so sánh. Các băng

ñược hiển thị bằng tia UV (bước sóng 254 và 366 nm) hoặc bằng phun sulfuric acid

(H2SO4) 10% và cố ñịnh ở 120 °C trong 5-10 phút (Irena C., 2010, Matook S. M., Fumio

H., 2005).

2.2.5.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography - HPLC)

a. Sắc ký so sánh với các kháng sinh chuẩn

Phân tích này ñược tiến hành trên hệ thống Agilent 1100 series HPLC (Mỹ) với cột

C18 Synchropak RP-4 (250 mm × 4.6 mm, ID 11704457 Agilent, Mỹ) và UV detector.

Dung dịch các kháng sinh chuẩn (chloramphenicol, kitasamycin, erythromycin) ñặc ñược

pha trong methanol ở nồng ñộ 1 mg.ml−1 và bảo quản ở 4 °C trong tối. Nồng ñộ và ñiều

kiện sắc ký áp dụng cho các chất chuẩn thay ñổi tùy theo bản chất hóa học của chúng và

ñược nêu cụ thể ở bảng 2.1.

Bảng 2.1 ðiều kiện phân tích HPLC của các chất chuẩn

Kháng sinh Bản chất hóa học ðiều kiện phân tích Tài li ệu tham khảo

Chloramphenicol

Công thức: C11H12Cl2N2O5

MW: 323.132

Pha mang: 25% acetonitril (pH 6)

Vận tốc: 1 ml min−1

Nhiệt ñộ cột: 30 °C

Bước sóng: 270 nm

Jeffrey R.K. (1978)

Erythromycin

Công thức: C37H67NO13

MW: 733.93 Có một vòng lactone lớn gắn với hai ñường không có oxy

Pha mang: acetonitril (25%) : phosphate buffer (0.05M, pH 6.3) = 3 : 7 (vol:vol)

Vận tốc: 1 ml min−1

Nhiệt ñộ cột: 35 °C

Bước sóng: 200 nm

Stubbs C., et. al. (1985)

29

Kitasamycin

Công thức: C35H59NO13

MW: 701.84

Pha mang: acetonitril (25%) : phosphate buffer (0.05M, pH 2.5) = 58 : 42 (vol:vol)

Vận tốc: 0.5 ml min−1

Nhiệt ñộ cột: 40 °C

Bước sóng: 232 nm

Horie M., et.al.

(1996); Leo M. L. N. (2000)

Anthracyclines

R1=CH3, R2=H: Daunorubicin R1=CH3, R2=OH: Adriamycin

Pha mang: Dung môi A (0.1% formic acid trong nước) : Dung môi B(0.1% formic acid trong acetonitril) = 70 : 30 (vol:vol)

Vận tốc: 1 ml min−1

Nhiệt ñộ cột: 30 °C

Bước sóng: 480 nm

Kristof M.

(2009), Young S.R., et. al., 2001

Các mẫu ñược phân tích với mỗi chuẩn trong cùng ñiều kiện. Trước khi cho mẫu

cột ñược rửa bằng ñệm cho ñến khi cân bằng. Thể tích mẫu là 10 µl.

b. Sắc ký phân tích trên các bước sóng khác nhau

Phân tích ñược tiến hành trên hệ thống tự ñộng Agilent 1200 series HPLC (Mỹ) với

DAD detector với các ñiều kiện: cột: Varian, Microsorb MV 100C18, 100mm x 4.6 mm,

kích thước hạt 3 µm; pha ñộng : 0,15 % KH2PO4 (pH 3,5) và acetonitril (CH3CN) có

gradient (0 - 3 phút: 15 %, 3 - 6 phút: 40 %, 6 - 12 phút: 40 %, 12 - 19 phút: 45 %, 19 -

22 phút: 85 %, 22 - 29 phút: 85 %, 29 - 32 phút: 15 %); vận tốc: 1,2 ml/phút; nhiệt ñộ lò

cột: 30 'C; bước sóng: UV/VIS 190 - 600 nm (khoảng cách 2 nm). Các mẫu chất chiết

ñược hòa tan trong DMSO. Phần nghiên cứu này ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi

sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế (International Centre of

Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản.

2.2.6 Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline

Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn ñược sàng lọc bằng phép thử

màu. Bản chất của phép thử như sau: Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo

hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu

da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base. ðặc tính này ñược dùng ñể sơ bộ sàng lọc

30

các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập ñược (Trease G. E.,

Evans W. C., 1996).

Cách tiến hành như sau: ñục 2 giếng nhỏ trên ñĩa thạch trước ñó ñã ñược nuôi xạ

khuẩn (khoảng 4 – 5 ngày tuổi). Nhỏ vào mỗi giếng 25 µl HCl (1N) hoặc NaOH (2N).

Quan sát màu quanh giếng sau 10 – 20 phút.

2.2.7. Phép thử ñộc tế bào

Khả năng gây ñộc tế bào của các chất chiết ñược từ dịch nuôi xạ khuẩn ñược xác

ñịnh theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) và Likhiwitayawuid và cộng sự

(1993) hiện ñang ñược áp dụng tại Vi ện Nghiên cứu ung thư quốc gia (Hoa Kỳ) và trường

Dược, ðại học Illinois, Chicago (Hoa Kỳ). Phép thử ñược thực hiện tại Phòng Sinh học

thực nghiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam. Cụ thể là:

Ba dòng tế bào ung thư của người gồm ung thư gan (hepatocellular carcinoma, Hep-

G2), ung thư phổi (lung cancer, Lu) và ung thư cơ vân tim (rhabdosarcoma, RD) ñược

dùng ñể sàng lọc hoạt tính gây ñộc tế bào bằng phép thử Sulforhodamine B (SRB assay).

Các dòng tế bào này ñược cho vào ñĩa 96 giếng (mỗi giếng chứa 2x103 tế bào) rồi

cho chất cần thử (ở ñây là chất chiết từ dịch nuôi xạ khuẩn như ñã mô tả ở 2.2.4. với các

nồng ñộ pha theo thang 10) hòa tan trong DMSO. Sau ñó các ñĩa ñược nuôi trong tủ CO2

ở 37 ºC trong 7 ngày. Vào ngày thứ 3 môi trường nuôi ñược thay mới. Tỷ lệ phần trăm

sống sót của tế bào ñược hiện thị màu bằng SRB (sulforhodamine B) và ñược ñọc bằng

máy ñọc ELISA (ELISA reader) ở bước sóng 495 nm.

Hoạt tính gây ñộc tế bào ñược tính bằng phần trăm ức chế khi so sánh mật ñộ quang

học của giếng ñược xử lý với mẫu nghiên cứu và chứng âm (DMSO). Nồng ñộ ức chế

50% (IC50) ñược suy ra từ ñường cong phát triển tế bào và nồng ñộ chất thử (phần trăm

sống sót so với nồng ñộ chất thử).

2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

a. Qua ñặc ñiểm hình thái

Các ñặc ñiểm hình thái của xạ khuẩn ñược quan sát sau hai tuần nuôi ở các ñiều

kiện như ñã mô tả. Các ñặc ñiểm hiển vi như hệ sợi cơ chất, hình thái sợi khí sinh, cấu

trúc chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (Carl-Zeiss) có nối máy ảnh

và phần mềm chụp ảnh. Atlas hình thái xạ khuẩn (Gernot, 1997) và Sổ tay nhận dạng xạ

khuẩn (Identification Manual of Actinomycetes) (Miyadoh et al, 2001) ñược dùng ñể

31

tham khảo về ñặc ñiểm phân loại.

b. Bằng sinh học phân tử

Tách chiết DNA

DNA genome của các chủng xạ khuẩn ñược tách chiết theo phương pháp ñã ñược

Marmur (1961) và Saito (1963) mô tả với một số cải tiến. Cụ thể là, nuôi xạ khuẩn trong

môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở 30°C và thu tế bào bằng ly tâm ở 3000 vòng/phút

trong 5 phút. Tế bào sau khi ñã ñồng nhất (bằng que nhựa vô trùng, rửa bằng 2 ml ñệm

1�TE 2 – 3 lần và hòa tan lại trong 0.5 ml EDTA 5 mM, pH 8) bị phá vỡ bằng xử lý với

lysozyme (50 µl có nồng ñộ 40 mg.ml−1) ở 37°C qua ñêm, rồi ñược xử lý với SDS (50 µl

có nồng ñộ 20%) và proteinase K (50 µl có nồng ñộ 4 mg.ml−1) ở 55°C trong 1 giờ. DNA

ñược chiết bằng bổ sung một thể tích tương ñương hỗn hợp phenol:chloroform:isoamine

alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn và ly tâm ở 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C. Bước

chiết này ñược lặp lại 3 lần. DNA nhiễm sắc thể ñược kết tủa bằng 2 thể tích 2-propanol

lạnh, rồi làm khô bằng ethanol 70% ở nhiệt ñộ phòng và hòa tan trong 100 µl nước cất.

Phản ứng PCR, giải trình tự và phân tích cây chủng loại phát sinh

Gene rDNA 16S ñược khuếch ñại bằng cặp primer:

27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)

1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)

Hỗn hợp phản ứng (50 µl) gồm 5 µl ñệm (0.2 M Tris-HCl pH 8.3, 0.25 M KCl, 20

mM MgCl2), 20 nM mỗi loại deoxynucleotide, 50 pM mỗi loại primer, 2.5 U Taq DNA

polymerase, và 1 µl DNA khuôn (nồng ñộ khoảng 10-20 ng). Chu trình PCR gồm 5 phút

sốc nhiệt ở 95°C, tiếp ñến là 30 chu kỳ gồm 95°C trong 30 giây, 52°C trong 30 giây, và

72°C trong 1 phút, cuối cùng là 72°C trong 7 phút. Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel

agarose, cắt và tinh sạch băng DNA bằng kit QIAquick gel extraction (Qiagen), và ñọc

trình tự bằng máy tự ñộng ABI 3110 Avant Appied Biosystems sequencer.

Trình tự gen sau ñó ñược phân tích so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có

liên quan hiện ñã công bố trên Database DDBJ/EMBL/GenBank sử dụng phần mềm

BLAST Search. So sánh tương ñồng với các trình tự liên quan ñược thực hiện bằng phần

mềm CLUSTAL_X, phiên bản 1.8 (Thompson et. al., 1997). Cây phân loại ñược dựng

theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong ñó ñịnh dạng cây ñược

tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh ña chiều (Felsenstein, 1985).

32

CHƯƠNG III. K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở Vườn Quốc gia Cát Bà

Việt Nam với hơn 1.700 km bờ biển trải từ bắc xuống nam với rất nhiều ñảo có

mức ña dạng sinh học cao. Một số ñảo của Việt Nam ñã ñược công nhận là vườn quốc gia

ñể bảo tồn và phát triển bền vững nguồn gene sinh học. Trong khi hệ thực vật và ñộng vật

ở các vườn quốc gia của Việt Nam ñã ñược quan tâm nghiên cứu về mức ñộ ña dạng rất

nhiều thì vi sinh vật chưa ñược quan tâm ñúng mức cho dù vi sinh vật ñóng vai trò chủ

ñạo trong sự phát triển của công nghệ sinh học. Hiện vẫn còn ít các nghiên cứu liên quan

ñến sự ña dạng cũng như khả năng ứng dụng của hệ vi sinh vật ở các vườn quốc gia này.

Trong số các ñảo của Việt Nam, Cát Bà là ñảo lớn nhất của Vịnh Hạ Long, di sản

thiên nhiên thế giới. ðảo hiện có 620 loài thực vật bậc cao, 32 loài ñộng vật có vú, 69 loài

chim và 20 loài bò sát. Cũng tương tự như hầu hết các khu bảo tồn ở Việt Nam, Vườn

quốc gia Cát Bà chưa ñược nghiên cứu về mức ñộ ña dạng và tiềm năng sử dụng của vi

sinh vật.

Nhằm góp phần nghiên cứu về nhóm xạ khuẩn có ở ñảo Cát Bà, ñề tài ñã tiến hành

phân lập xạ khuẩn theo hai phương pháp khác nhau như ñã mô ở chương II. Qua ñó ñã

phân lập ñược 424 chủng xạ khuẩn từ các mẫu ñất và lá cây mục thu tại Cát Bà. Trong số

424 chủng ñó, 353 chủng (83.25%) phân lập ñược từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá

cây mục.

Tiếp theo, các chủng xạ khuẩn phân lập ñược ñã ñược phân loại theo hình thái ñể

phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn hiếm) (Bảng 3.1). ðể

ñịnh loại chính xác hơn nhóm xạ khuẩn hiếm phương pháp ñọc trình tự một phần rDNA

16S (khoảng 900 bp) ñã ñược thực hiện và so sánh với các trình tự ñã có trên cơ sở dự

liệu bằng công cụ Blast Search.

Qua bảng 3.1 chúng tôi nhận thấy 296 chủng phân lập ñược là Streptomyces (chiếm

khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) (chiếm

khoảng 30,19%). Các nghiên cứu trước ñây cho thấy Streptomyces là một trong những

nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong ñất và phân bổ rộng rãi trên thế giới (Hopwood A. D.,

2007). Do vậy tỷ lệ cao của Streptomyces trong bộ sưu tập xạ khuẩn ở Cát Bà khẳng ñịnh

kết luận này.

Nhìn chung, hầu hết các chủng Streptomyces phân lập ñược mọc nhanh và khỏe,

xuất hiện trước tiên trong các ñĩa phân lập và dễ phân lập. Ngược lại, các chủng xạ khuẩn

hiếm (non-Streptomyces) mọc chậm, khuẩn lạc nhỏ, khó phân lập và nuôi cấy. Số lượng

33

xạ khuẩn hiếm thu ñược từ phương pháp ly tâm-hoàn ẩm nhiều hơn bằng phương pháp

sấy khô truyền thống.

Bảng 3.1 Sơ bộ phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập ñược

Các nhóm xạ khuẩn Số lượng chủng %

Streptomyces 296 69.81

Xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces)

Micromonospora 27 6.36

Nonomuraea 17 4.00

Nocardia 12 2.83

Kineosporia 8 1.90

Microbispora 7 1.65

Actinomadura 7 1.65

Pseudonocardia 6 1.42

Nocardiopsis 6 1.42

Micrococcus 5 1.18

Streptosporangium 5 1.18

Khác (mỗi loại ít hơn 1%) 28 6.60

Tổng cộng 424 100.00

Xét về mức ñộ ña dạng, chúng tôi nhận thấy các chi Micromonospora, Nonomureae

và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu

thập tại Cát Bà (Bảng 3.1). Các loài thuộc ba chi này cũng thường ñược phân lập ở các

ñịa ñiểm khác ở Việt Nam (Duong V.H., Ando K., 2010).

Các chủng phân lập ñược hiện ñược lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật

(Vietnam Type Culture Collection, VTCC), Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học trong

glycerol 20% ở −80 °C.

3.2 Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh

ðể sàng lọc các chủng sinh kháng sinh, 4 chủng vi sinh vật ñại diện cho vi khuẩn

Gram âm và dương; nấm và nấm men ñã ñược lựa chọn làm vi sinh vật kiểm ñịnh.

Bước sàng lọc ñầu tiên ñược thực hiện bằng phương pháp mảnh thạch như ñã mô tả

ở chương II. Qua ñó cho thấy trong 424 chủng xạ khuẩn nghiên cứu chỉ có 115 chủng

34

(chiếm khoảng 27,12%) cho hoạt tính ñáng kể kháng ít nhất một trong bốn vi sinh vật

kiểm ñịnh.

Tiếp theo 115 chủng này ñược dùng làm ñích cho bước sàng lọc thứ hai sử dụng

phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy. Một số hình ảnh ñại diện cho bước phân tích này

ñược trình bày ở hình 3.1. Từ bước sàng lọc này 17 chủng thể hiện hoạt tính tương ñối

cao với ít nhất hai trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn. Hoạt tính tương ñối

của các chủng này ñược trình bày ở bảng 3.2.

Hình 3.1. ðánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn

Một số hình ảnh tiêu biểu minh họa cho phương pháp khuếch tán dịch nuôi cấy.

Trong số 17 chủng chọn lọc ñược, 14 chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram

âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn Gram dương (M. luteus) và 11 chủng có hoạt

tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn. Với các tế bào nhân thật, gồm nấm (F. oxysporium) và

nấm men (C. albicans), 12 chủng có hoạt tính kháng nấm và chỉ 6 chủng có hoạt tính

kháng nấm men (Bảng 3.2).

Bảng 3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của 17 chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

Hiệu quả ức chế vi sinh vật ki ểm ñịnh (ñường kính vòng kìm hãm, mm)

Chủng

E. coli M. luteus F. oxysporium C. albicans

A45 10 0 6 0

A149 8 6 0 0

A154 8 8 0 0

A160 0 6 0 10

A232 6 7 0 12

A390 10 10 18 0

A396 8 12 0 0

A410 24 0 10 0

A427 16 0 12 0

E. coli F. oxysporium M.luteus C. albicans

35

A444 0 7 8 0

A1018 0 40 10 16

A1022 16 30 10 0

A1041 22 28 6 0

A1043 8 32 6 0

A1073 21 30 10 10

A1393 14 18 14 6

A1470 15 26 12 0

Kết quả còn cho thấy 9 trong số 17 chủng chọn lọc ñược có hoạt tính mạnh với cả vi

khuẩn và nấm (ñường kính vòng kìm hãm > 10 mm). ðặc biệt là hai chủng A1073 và

A1393 kìm hãm cả bốn chủng vi sinh vật kiểm ñịnh (bảng 3.2, các dòng ñược bôi ñậm).

3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

17 chủng chọn lọc ñược ñã ñược tiến hành nuôi cấy lỏng và sơ bộ tách chiết dịch

ngoại bào ñể tiến hành các phân tích tiếp theo. Hiện nay có nhiều công bố liên quan ñến

việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ vi sinh vật. Qua tham khảo tài

liệu chúng tôi nhận thấy ethyl acetate thường ñược sử dụng trong bước ñầu tiên khi tách

chiết hợp chất có hoạt tính kháng sinh từ vi sinh vật. Ethyl acetate ñược coi là một trong

những dung môi hữu cơ tương ñối ít ñộc hại, dễ loại bỏ do có ñộ bay hơi cao và là dung

môi ñược dùng phổ biến trong tách chiết nhiều chất hóa học. Ethyl acetate hiện ñược sử

dụng trong nhiều ngành công nghiệp trong ñó có cả công nghiệp thực phẩm (làm bánh

kẹo). Vì vậy sử dụng dung môi này sẽ an toàn cho người thực hiện (Dutia, Pankaj, 2004).

Do ñó chúng tôi ñã lựa chọn ethyl acetate làm dung môi ñể chiết các chất tan trong dịch

nuôi thu ñược từ các chủng chọn lọc ñược. Quy trình tách chiết ñã ñược mô tả chi tiết ở

chương II. Hiệu quả tách chiết các chất tan trong ethyl acetate ñược trình bày ở bảng 3.3.

Qua ñó cho thấy từ 01 lít dịch nuôi cấy (sau khi ñã loại bỏ tế bào) thu ñược từ vài chục

miligram ñến vài gram chất tan trong ethyl acetate. So với chất khô thì lượng chất tan này

chiếm từ 0,5% ñến gần 15% tùy theo từng chủng xạ khuẩn. Trong ñó dịch nuôi của chủng

A396 có tỷ lệ chất tan này cao nhất (14,89%), còn thấp nhất là chủng A154 (chỉ chiếm

0,51%).

Bảng 3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

(từ 1 lít dịch nuôi ñã loại tế bào)

TT Chủng Chất khô (gam) Chất tan trong

ethyl acetate (mg)

Phần trăm so với chất khô (%)

36

1 A45 5,040 504,76 10,02

2 A149 33,445 103,20 3,09

3 A154 5,883 30,15 0,51

4 A160 14,114 72,96 0,52

5 A232 16,556 158,76 0,96

6 A390 13,076 361,40 2,76

7 A396 6,209 924,64 14,89

8 A410 9,699 113,60 1,17

9 A427 18,238 101,92 0,56

10 A444 18,413 2152,36 11,69

11 A1018 28,650 544,96 1,90

12 A1022 30,076 257,04 0,85

13 A1041 25,825 268,64 1,04

14 A1043 23,413 310,40 1,33

15 A1073 30,333 388,72 1,28

16 A1393 28,911 309,04 1,07

17 A1470 20,348 726,80 3,57

3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate

3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC)

Chất chiết ñược từ dịch ngoại bào của 17 chủng xạ khuẩn sau khi hòa tan lại trong

chloroform ñã ñược cho chạy TLC cùng với các ñối chứng là chloramphenicol,

kitasamycin, erythromycin và chất chiết dịch ngoại bào chủng A16 ñược coi là ñối chứng

cho anthracycline. Kết quả ñược trình bày trên hình 3.2.

Kết quả thu ñược cho thấy phổ các băng TLC của 17 chủng rất khác nhau. Số băng

thu ñược dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232, A410, A427,

A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ có 2 băng, 4

chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390, A1022) cho phổ

4 băng.

37

Hình 3.2. Phổ TLC chất chiết từ dịch ngoại bào của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược. A, B và C – phổ TLC dưới ánh sáng UV. D – phổ minh họa các băng ñược hiển thị. Viết tắt: CAP-Chloramphenicol; Kita-Kitasamycin; Ery-Erythromycin; các số biểu diễn số của tên chủng. Mũi tên chỉ hướng pha ñộng.

So sánh với từng ñối chứng chúng tôi nhận thấy:

- Chloramphenicol cho phổ TLC chỉ gồm 01 băng. Trong 17 mẫu nghiên cứu chỉ có

mẫu A396 (có hai băng) là có băng có cùng ñộ di ñộng tương ñối với kháng sinh

này.

- Kitasamycin cho một phổ hai băng. Không có mẫu nào trong 17 mẫu nghiên cứu có

phổ TLC cũng như băng sắc ký trùng với phổ hay băng của kháng sinh này.

- Erythromycin cũng có phổ gồm hai băng nhưng có ñộ di ñộng tương ñối nhỏ hơn

so với hai băng của kitasamycin. Có hai mẫu có băng tương tự với băng nhận ñược

từ erythromycin. ðó là băng có ñộ di ñộng tương ñối thấp nhất (tức băng chậm

D

38

nhất) của A45 (cùng ñộ di ñộng với băng chậm của kháng sinh này) và băng duy

nhất của A410 trùng với băng nhanh của kháng sinh này.

- Chất chiết từ chủng A16 cho phổ TLC gồm 5 băng. Trong số 5 băng này có 2 băng

(băng thứ hai và băng thứ năm tính từ phía xuất phát) là không tìm thấy ở bất kỳ

phổ TLC nào của 17 mẫu nghiên cứu. Ba băng còn lại có thể quan sát thấy ở mẫu

A1043 (băng thứ nhất); A232, A390, A1018 và A1022 (băng thứ ba); A45, A427,

A1018, A1022 và A1470 (băng thứ tư). Như vậy trong 17 mẫu nghiên cứu có hai

mẫu (A1018 và A1022) có 2 băng TLC trùng với 2 băng của mẫu ñối chứng này.

Như vậy qua phân tích TLC dường như các hợp chất chiết ñược không hoàn toàn tương

ñồng với một trong các kháng sinh ñược dùng làm chuẩn trong nghiên cứu này. Tuy nhiên

ñể trả lời chính xác liệu các hợp chất ñó có phải là các chất ñã biết hay là các hợp chất

mới cần phải có các phân tích sâu hơn.

3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tiếp theo nhằm tìm hiểu sâu hơn các hợp chất tách chiết ñược từ xạ khuẩn, chúng

tôi ñã tiến hành chạy HPLC của các mẫu với cùng ñiều kiện sắc ký của các chất chuẩn (là

các kháng sinh như ñã ñề cập ở phần phân tích TLC).

Với các ñiều kiện chạy HPLC như ñã mô tả ở phần phương pháp, kết quả phân tích

ñược tổng kết ở bảng 3.4, sắc ký ñồ ñược ñính kèm ở phần phụ lục của báo cáo.

Bảng 3.4. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ các chủng xạ khuẩn chọn

lọc ñược

TT

Chất chuẩn/chủng

Số lượng ñỉnh thu ñược

Thời ñiểm

thôi của các ñỉnh

chính (phút)

Tỷ lệ so với tổng số thu ñược

Ghi chú

I Kitasamycin 7 3.714

4.427

17,77 %

62,82 %

1 A232 3 7.062

7.291

7.662

10,65 %

54,83 %

34,03 %

các ñỉnh không tách rõ rệt

2 A390 2 7.276

7.672

7.276 %

7.672 %

các ñỉnh không tách rõ rệt

39

3 A1018 5 5.723

6.174

64,09 %

28,67 %

4 A1041 6 6.456

6.648

7.266

7.622

5,28 %

6,92 %

50,77 %

36,10 %

5 A1073 5 7.266

7.619

8.180

55,60 %

40,53 %

3,2 %

6 A1393 5 7.293

7.641

60,43 %

38,50 %

các ñỉnh ko tách rõ rệt

7 A1470 4 3.396

3.898

5.877

5,61 %

22,47 %

71,46 %

không tách tốt

8 Các chủng còn lại (10 chủng và chủng ñối chứng A16)

không tách rõ rệt

II Erythromycin 6 3.117

3.357

53%

24,7%

1 A149 11 8.661

9.166

50%

40%

nhưng không tách biệt hoàn toàn

2 A154 5 9.107 96% nhưng không tách tốt

3 A160 8 8.789 94% nhưng không tách tốt

4 A232 9 3.925

4.054

21.19%

71.16%

5 A390 11 4.024 88,53%

6 A396 8 phân ñoạn từ 6 – 12 phút không tách

7 A427 12 3.363

4.775

8.607

8,98%

6,70%

70%

nhưng không tách

8 A444 8 3.044 1,2 %

40

3.339

9.107

1,1 %

93%

nhưng không tách

9 A1018 10 3,999

4.063

5.892

26,34 %

56,95 %

6,68 %

10 A1022 13 3.977

4.567

5.755

62,58 %

11,49 %

14,49 %

11 A1041 10 3.985 81,25%

12 A1043 8 3.333

8.585

2%

86%

nhưng không tách tốt

13 A1073 11 4.011 84,89 %

14 A1393 12 4.007 81,85%

15 A1470 8 3.038

3.343

9.467

1%

2,38%

93,62%

nhưng không tách tốt

16 A16: chủng ñối chứng dương

8 9.539 95% nhưng không tách tốt

17 Các chủng còn lại: 2 chủng không tách tốt

III Chloramphenicol 1 5.498 100%

1 A232 10 1.186

4.192

5.153

5,16 %

62,27 %

15,60 %

2 A390 7 1.195

4.190

29,61 %

66,82 %

3 A396 8 3.609

3.876

4.464

5.407

6.185

10.852

6,15 %

18,64 %

17,96 %

4,33 %

11,04 %

40,22 %

4 A1018 8 1.184 8,65 %

41

4.210

5.905

8.212

60,80 %

16,31 %

11,08 %

5 A1022 12 1.195

4.189

5.876

8.174

4,55 %

36,76 %

28,13 %

25,72 %

6 A1041 9 1.182

4.111

10,23 %

71,33 %

7 A1073 7 1.201

4.193

16,14 %

66,39 %

8 A1393 7 1.201

4.193

17,59 %

80,14 %

9 Các chủng còn lại: 9 chủng và chủng ñối chứng dương A16

không tách tốt

Qua phân tích kết quả thu ñược từ HPLC, chúng tôi nhận thấy các hợp chất thu ñược

từ các chủng xạ khuẩn nghiên cứu chưa thể khẳng ñịnh thuộc vào nhóm nào trong số các

chất chuẩn ñã sử dụng, trừ mẫu A396 có một ñỉnh (thôi ở 5.476 phút) tương ứng với

chloramphenicol (Hình 3.3). Kết quả này cũng ñược khẳng ñịnh từ phân tích TLC (Hình

3.2).

Hình 3.3. Phổ HPLC của chloramphenicol (A) và chất chiết từ dịch nuôi chủng A396 (B)

Abs

270

A B

Thời gian (phút)

42

3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

ðối với nghiên cứu về vi sinh vật, việc ñịnh loại là hết sức quan trọng. Như ñã trình

bày ở phần 3.1 (ða dạng sinh học của các chủng xạ khuẩn phân lập ở Cát bà), trong 424

chủng phân lập ñược có khoảng 70% thuộc Streptomyces còn lại là xạ khuẩn hiếm (non-

Streptomyces). Sau ñây là các thông tin cụ thể hơn về 17 chủng chọn lọc ñược trong bộ

sưu tập nói trên. 17 chủng chọn lọc ñược chỉ thuộc 2 chi là Streptomyces (10 chủng) và

chi Nonomuraea (7 chủng).

3.5.1 ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces

Như ñã trình bày, các chủng xạ khuẩn phổ biến (Streptomyces) có ñặc ñiểm hình

thái ñiển hình có thể dùng ñể nhận dạng [11], [29]. Từ các ñặc ñiểm ñó 10 chủng (gồm

A390, A410, A427, A1018, A1022, A1041, A1043, A1073, A1393 và A1470) trong số

17 chủng chọn lọc ñược thuộc về chi Streptomyces.

Các khuẩn lạc của các chủng này rất khác biệt về mặt kích thước (trong hoặc bầu

dục), bề mặt khuẩn lạc (mềm, cứng, nhăn nheo, cấu trúc hạt), và ñộ dày (phồng hay dẹt).

Các khuẩn lạc tạo thành hệ sợi cơ chất và sợi khí sinh với các loại màu khác nhau như

trắng, vàng, ñỏ hoặc nâu. Các khuẩn lạc này ñược phủ kín bởi một lớp sợi khí sinh hoặc

ñường ñồng tâm. Kích thước khuẩn lạc phụ thuộc vào các chủng và ñộ tuổi nhưng dao

ñộng từ vài mm ñến 1 cm (hình 3.4).

Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc một số chủng Streptomyces

Liên quan ñến việc tạo thành hệ sợi khí sinh và chuỗi bảo tử, 10 chủng Streptomyces

này tạo thành hệ sợi khí sinh với các chuỗi bào tử dài trên môi trường thạch YS. ðặc ñiểm

bào tử và chuỗi bào tử ñược quan sát dưới kính hiển vi phản pha (hình 3.5).

A1018

A1073

(A) A1018

(B) A390

A1043 A390 A1073 A1018

43

Hình 3.5. Hệ sợi mang bào tử của một số chủng Streptomyces A, B – Dạng thẳng; C, D – Dạng hình xoắn của sợi mang bào tử

Dựa trên quan sát dưới kính hiển vi, chuỗi bào tử của các chủng Streptomyces có thể

chia thành hai loại:

- Dạng thẳng (Hình 3.5.A và B) có chuỗi bào tử thẳng hoặc ngoằn ngoèo, hệ sợi khí

sinh phân nhánh màu trắng. Các chủng thuộc nhóm này gồm A390, A427, A1018, A1022,

A1393 và A1470.

- Dạng xoắn (hình 3.6. D và D) có hệ sợi khí sinh tạo thành sợi mang bào tử phân

nhánh có hình móc, vòng mở, các xoắn dài, rộng hay vuốt dài (hình 3.5.C) hoặc các xoắn

với 3 -5 vòng (hình 3.5.D). Các chủng thuộc loại này gồm A410, A1041, A1043 và

A1073.

Các bào tử có hình bầu dục hoặc hình xoắn, sắp xếp thành chuỗi dài. Không quan

sát thấy các cấu trúc ñặc biệt khác như túi bào tử hay các cơ quan dự trữ.

Thông tin chi tiết về ñặc ñiểm nhận dạng của các chủng thuộc chi Streptomyces

ñược tổng hợp ở Bảng 3.5.

44

Bảng 3.5. Các ñặc ñiểm nhận dạng của 10 chủng thuộc chi Streptomyces

TT Chủng ðặc ñiểm khuẩn lạc ðặc ñiểm chuỗi bào tử

1 A390 ñường kính 0,5cm, màu tím nhạt, có sợi khí sinh, bề mặt khuẩn cao

Dạng thẳng

2 A410 ñường kính 0,2 cm, bề mặt phẳng, sợi khí sinh tâm màu xám, vòng ngoài màu trắng, các khuẩn lạc già tạo những giọt dịch thể màu nâu ở tâm khuẩn lạc

Dạng xoắn

3 A427 ñường kính 0,2 cm - 0,3 cm, bề mặt lồi, xung quanh có màu trắng, sợi cơ chất màu trắng

Dạng thẳng

4 A1018 ñường kính 0,1 cm, khí sinh màu trắng xám, cơ chất màu be

Dạng thẳng

5 A1022 ñường kính 0,2 cm, sợi khí sinh màu trắng sau chuyển sang vàng, tâm khuẩn lạc già tạo giọt nước, cơ chất màu vàng nâu

Dạng thẳng

6 A1041 ñường kính 0,3 cm - 0,5cm, sợi khí sinh màu xám, bề mặt hơi dẹt

Dạng xoắn

7 A1043 ñường kính 0,1 cm - 0,2cm, sợi khí sinh màu nâu, bề mặt hơi dẹt

Dạng xoắn

8 A1073 ñường kính 0,2cm - 0,3cm, sợi khí sinh màu xám ngả vàng, ngoài màu trắng xám, bề mặt hơi dẹt

Dạng xoắn

9 A1393 ñường kính 0,2cm - 0,3cm, khuẩn lac nhỏ, lồ cao, sợi khí sinh màu trắng

Dạng thẳng

10 A1470 ñường kính 0,3cm, bề mặt lồi, sợi khí sinh xung quanh màu xám, tâm màu trắng

Dạng thẳng

3.5.2 Giải trình t ự 16S rDNA ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea

Như ñã trình bày ở phần 3.1. phương pháp sinh học phân tử (giải trình tự và so sánh

16S rDNA ñã ñược dùng ñể phân biệt các chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm. ðiều thú vị

là cả 7 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm chọn lọc ñược lại cùng thuộc chi Nonomuraea.

Quan hệ di truyền giữa các chủng này ñược trình bày ở hình 3.6. và qua ñó cho thấy 7

chủng này có thể chia thành 5 nhóm.

Tóm lại, mặc dù bộ sưu tập xạ khuẩn từ Cát Bà có mức ñộ ña dạng về phân loại

nhưng các chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật cao chỉ thuộc về hai chi Streptomyces và

Nonomuraea.

45

Hình 3.6. Cây chủng loại phát sinh trình tự rDNA 16S cho thấy vị trí của 7 chủng xạ khuẩn hiếm trong chi Nonomuraea

Giá trị tại các ñiểm phân nhánh lớn hơn 500 ñược biểu diễn trên cây. Thước ño là 5% khác biệt trong trình tự DNA. Microbispora parva ñược chọn làm gốc phân nhánh

3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược

Một trong những nhóm kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn hiện ñang ñược sử

dụng ñể ñiều trị nhiều loại ung thư là anthracycline. ðể bước ñầu tìm hiểu xem liệu 17

chủng chọn lọc ñược có chủng nào sinh anthracycline không chúng tôi ñã tiến hành phép

thử ñặc hiệu với nhóm hợp chất này – thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc vào pH.

Nguyên tắc của phép thử này là ở chỗ do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo

hóa học, các anthracycline thay ñổi màu sắc theo pH của môi trường, cụ thể là có màu da

cam ở pH acid và màu tím khi ở pH base.

Trên cùng ñĩa nuôi, hai pH khác nhau ñược tạo thành bằng cách nhỏ dung dịch acid

và base vào hai giếng ñược ñục ở chỗ khuẩn lạc mọc tốt. Sau khoảng 20 phút quan sát

màu sắc quanh các giếng ñể có kết luận bước ñầu về kháng sinh mà chủng xạ khuẩn ñó

sinh ra. Kết quả cho thấy, trong 17 chủng nghiên cứu chỉ có 2 chủng (A1018 và A1073) là

thể hiện phản ứng này tức chuyển màu da cam khi có pH acid và màu tím khi có pH base

46

(hình 3.7). Như vậy, rất có thể hợp chất do hai chủng xạ khuẩn này sinh ra thuộc nhóm

kháng sinh anthracycline.

Hình 3.7. Sự thay ñổi màu sắc theo pH môi trường của các chủng A1018 và A1073. A: giếng có pH acid; B: giếng có pH base. A16 – chủng ñối chứng sinh anthracyclin.

3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính gây ñộc tế bào

3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào

Như vậy, qua các nghiên cứu ở trên có ba chủng xạ khuẩn ñược thấy là có tiềm

năng sinh chất kháng sinh kháng ung thư là A1018, A1022 và A1073. Trong ñó A1022 có

phổ TLC gần với chủng ñối chứng sinh anthracycline A16 (xem mục 3.4.1); A1018 vừa

có phổ TLC tương tự ñối chứng lại vừa ñược chọn từ phép thử thay ñổi màu do thay ñổi

pH (xem các mục 3.4.1 và 3.6); còn A1073 thì ñược lựa chọn từ phép thử pH (xem mục

3.6).

Các chất chiết từ dịch nuôi của ba chủng này và của chủng ñối chứng sinh

anthracycline (A16) ñược gửi thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào tại Phòng Sinh học

thực nghiệm, Viện Hóa các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Quy trình thử nghiệm, các dòng tế bào dùng trong thử nghiệm ñã ñược trình bày ở

phân phương pháp của báo cáo này. Kết quả nhận ñược cho thấy cả 4 chất chiết từ dịch

nuôi các chủng ñều có kết quả dương tính với cả 3 dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2),

ung thư phổi (Lu) và ung thư cơ vân tim (RD) của người (bảng 3.6).

Hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư ñược thể hiện thông qua phần trăm tế bào sống

sót và IC50 (trong trường hợp này ñược hiểu là nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào). Trong

ñó chủng A1073 cho hoạt tính cao nhất và cao một cách có nghĩa so với hai chủng còn lại

mà chúng tôi lựa chọn thử nghiệm. Hoạt tính của A1073 tương ñương với chủng ñối

47

chứng A16. Cả ba chủng ñều có hiệu quả gây ñộc cao với dòng RD – ung thư cơ vân tim.

ðiều thú vị là khi sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm ñịnh ba chủng này cũng là các

chủng thể hiện hoạt kháng vi sinh vật nhân thật (tức F. oxysporium và C. albicans) khá

cao. Vậy phải chăng có mối liên hệ giữa hoạt tính kháng vi sinh vật và hoạt tính kháng tế

bào ung thư? Cho ñến nay chưa có tài liệu nào ñề cập ñến mối liên hệ này.

Bảng 3.6. Kết quả xác ñịnh hoạt tính gây ñộc tế bào

Dòng tế bào TT Mẫu

Hep-G2 Lu RD

Kết luận

Phần trăm sống sót (%) 1 Chứng âm (DMSO) 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Âm tính 2 Chứng dương 1,8 ± 0,5 1,2 ± 0,1 0,5 ± 0,0 Dương tính 3 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1018 12,3 ± 0,6 7,6 ± 0,1 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả

3 dòng 4 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1022 50,1 ± 0,2 25,1 ± 0,7 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả

3 dòng 5 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1073 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả

3 dòng 6 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A16 0,6 ± 0,4 3,9 ± 0,0 0,0 ± 0,0 Dương tính với cả

3 dòng Giá trị IC50 (µg/ml) 1 Chứng dương 0,310 0,420 0,220 Dương tính 2 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1018 4,170 1,440 2,700 Dương tính với cả

3 dòng 3 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1022 20,000 5,250 0,446 Dương tính với cả

3 dòng 4 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A1073 0,510 0,450 0,550 Dương tính với cả

3 dòng 5 Chất chiết từ dịch

nuôi chủng A16 0.585 0.545 0.469

Dương tính với cả 3 dòng

Chứng dương: là một trong những chất có khả năng diệt tế bào (ellipithine, vinblastine hoặc taxol) pha trong DMSO. Hep-G2: dòng tế bào ung thư gan, Lu: dòng tế bào ung thư phổi, RD: dòng tế bào ung thư cơ vân tim. IC50: nồng ñộ chất làm chết 50% tế bào ung thư.

3.7.2. Phân tích HPLC các hợp chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính

kháng tế bào ung thư

Sau khi ñã nhận ñược kết quả khả quan khẳng ñịnh khả năng gây ñộc tế bào ung thư,

các chủng A1018, A1022 và A1073 ñược tiếp tục nuôi với thể tích lớn nhằm thu ñược

nhiều hơn chất tan trong ethyl acetate. Các chất tan này sau ñó ñược tiến hành sắc ký trên

48

HPLC ñể so sánh với cơ sở dữ liệu hiện có tại ðại học Tổng hợp Osaka nhằm tìm hiểu

bản chất của các chất này. Các ñiều kiện sắc ký ñã ñược trình bày chi tiết ở phần phương

pháp (2.2.5.2.b). Kết quả sắc ký ñược tổng kết trong bảng 3.7, sắc ký ñồ ñược trình bày

trong hình 3.8; 3.9 và 3.10.

Bảng 3.7. Tổng kết kết quả phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của 3 chủng có

hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư

Mẫu

Bước sóng phân tích (nm)

Số lượng ñỉnh

Thời gian thôi mẫu của ñỉnh chính (phút)

%

6.305 9.8890 16.632 46.4839

254,4 27

18.076 11.1244 0.862 15.4892 290,16 14 6.306 29.6140 0.922 19.0729 210,8 30 1.079 67.4264 0.936 36.1242

Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018

230,16 32 1.090 51.1499 7.190 16.5334 254,4 40 8.107 30.9796 7.190 16.3111 290,16 35 8.107 24.5976

210,8 40 1.160 34.3541 0.909 13.1443

Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022

230,16 49 1.081 21.3425 7.182 18.6807 7.336 11.7642

254,4 48

8.099 25.0185 290,16 47 Không có ñỉnh nổi trội

1.080 32.9418 7.182 5.4240 8.099 7.2609

210,8 50

23.073 5.9238 1.023 31.0006 7.182 10.1459 8.098 8.1295

Chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073

230,16 49

23.072 6.0938 [ñỉnh chính ñược hiểu là ñỉnh chiếm % cao so với tổng diện tích sắc ký ñồ hoặc ñỉnh có ñộ cao

(mAU-mili ñơn vị hấp thụ) khác biệt ñáng kể so với các ñỉnh thu ñược sau sắc ký]

49

Hình 3.8. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1018

50

Hình 3.9. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1022

51

Hình 3.10. Sắc ký ñồ HPLC chất chiết từ dịch nuôi chủng A1073

52

Qua phân tích kết quả bước ñầu có thể nhận thấy như sau:

- Với mẫu A1018: có thể gồm 8 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 0.862,

0.922, 0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076

- Với mẫu A1022: có thể gồm 5 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 0.909,

1.081, 1.160, 7.190 và 8.107

- Với mẫu A1073: có thể gồm 6 chất khác nhau với thời gian (phút) thôi ra là 1.023;

1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073

Hiện nay việc so sánh với cơ sở dự liệu các chất có hoạt tính sinh học ñang ñược tiến

hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật phân tử, Trung tâm Công nghệ sinh học quốc tế

(International Centre of Biotechnology-ICBiotech), ðại học Tổng hợp Osaka, Nhật Bản.

53

KẾT LUẬN

Từ kết quả thu ñược, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. 424 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân lập tại Vườn Quốc gia Cát Bà với 353 chủng

(83.25%) từ ñất và 71 chủng (16.75%) từ mẫu lá cây mục.

2. Gần 70% số chủng phân lập ñược thuộc chi Streptomyces, phần còn lại thuộc về 10 chi

xạ khuẩn hiếm trong ñó hơn 6% thuộc chi Micromonospora và 4% thuộc chi

Nonomuraea.

3. Bằng sơ bộ sàng lọc, 115 chủng (chiếm hơn 27% số chủng phân lập ñược) có hoạt tính

kháng ít nhất một trong bốn chủng vi sinh vật kiểm ñịnh.

4. Trong 115 chủng có hoạt tính kháng sinh, 17 chủng có hoạt tính cao và kháng ít nhất

hai trong bốn vi sinh vật kiểm ñịnh. Các chủng này thuộc hai chi Streptomyces (10

chủng) và Nonomuraea (7 chủng). Bằng phân tích quan hệ di truyền, 7 chủng thuộc

chi Nonomuraea có thể xếp vào 5 nhóm.

5. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate (từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg

(chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444). So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm

từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng A396).

6. Qua phân tích TLC, chủng A396 có hai băng có cùng ñộ di ñộng tương ñối với

chloramphenicol; các chủng A45 và A410 (mỗi chủng một băng) có băng có cùng ñộ

di ñộng tương ñối với các băng của erythromycin. Không có mẫu nào có băng tương

ñồng với kitasamycin. Hai chủng A1018 và A1022 có phổ TLC tương ñối gần với

phổ TLC của chủng ñối chứng sinh anthracycline.

7. Qua phân tích HPLC chất chiết từ 17 chủng nghiên cứu, với cùng một ñiều kiện sắc ký

chủng A396 cho một ñỉnh có thời gian thôi tương ứng với kháng sinh

chloramphenicol.

8. Hai chủng A1018 và A1073 có phản ứng tương tự khi có pH thay ñổi ñặc trưng cho vi

sinh vật sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline.

9. Chất chiết từ dịch nuôi của ba chủng A1022, A1018 và A1073 có tác dụng gây ñộc

cho ba dòng tế bào ung thư (gan, phổi và cơ vân tim) trong ñó A1073 có hoạt tính cao

nhất.

10. Qua HPLC, với cùng một ñiều kiện phân tích, chất tan trong ethyl acetate của dịch

nuôi từ chủng A1018 tách thành 8 ñỉnh với thời gian (phút) thôi ra là 0.862, 0.922,

54

0.936, 1.079, 1.090, 6.305, 16.632 và 18.076; từ chủng A1022 tách thành 5 ñỉnh với

thời gian (phút) thôi ra là 0.909, 1.081, 1.160, 7.190 và 8.107; từ chủng A1073 tách

thành 6 ñỉnh có thời gian (phút) thôi là 1.023; 1.080; 7.182; 7.336; 8.099 và 23.073.

KI ẾN NGHỊ

ðể tiếp tục hướng nghiên cứu này một số ñịnh hướng cần tiếp tục:

- Xác ñịnh ñỉnh có hoạt tính sau sắc ký

- Nghiên cứu tinh sạch chất có hoạt tính

- Nghiên cứu cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính sau khi ñã tinh sạch

55

TÀI LI ỆU THAM KH ẢO

Tiếng Việt

1. Ki ều Hữu Ảnh, Phạm Văn Ty, Lê Gia Hy, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Thanh

Huyền, 2003. Tách chiết chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces

hygroscopicus TC-54 có hoạt tính cao chống nấm gây bệnh, Tạp chí Sinh học, tập

25-số 2A, trang 85-91

2. Vi Th ị ðoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của

chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật

dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội.

3. Bùi Th ị Việt Hà, Lê Gia Hy, Ki ều Hữu Ảnh, 1998. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy

xạ khuẩn Streptomyces sp. TC54 sinh chất kháng sinh, Tạp chí Khoa học và Công

nghệ, XXXVI, 6B, tr.155-159

4. Bùi Thị Việt Hà, ðào Duy ðạt, Ki ều Hữu Ảnh, 2004. Phân lập và tuyển chọn xạ

khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Tạp chí Khoa học, T. XX,

No2AP., tr103-107

5. Bùi Th ị Việt Hà, Nguyễn Thanh Huyền, ðinh Xuân Tuấn, Kiều Hữu Ảnh, 2004.

Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở 2 chủng xạ

khuẩn T41, D42, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, tr 50-55, T-4

6. Bùi Vi ệt Hà, 2005. Study on Streptomyces hygroscopicus for control of

phytopathogenic fungi. VNU, J. Scien Nat Tech, T.XXI, N04AP.

7. Lại Thúy Hi ền, Nguyễn Thị Lợi, Lê Gia Hy, Kiều Hữu Ảnh, 1998. ðặc ñiểm phân

loại và khả năng sử dụng dầu mỏ của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiên liệu

JET-A1 ở Việt Nam, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, XXXVI, 6B, tr.64-69

8. Nguyễn Phú Hùng, Liễu Thị Phương, Nguyễn Thị Yên, Trịnh Ngọc Hoàng, Vi

Thị ðoan Chính, 2009. Tuyển chọn và ñịnh loại một số chủng xạ khuẩn có khả năng

ñối kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện. Tạp chí Y học Thực hành, số 2, 8-

2009, tr.81-85.

9. Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Nguyễn Hồng Hà, Vũ Thị Nhung, Phạm Thị Bích

Hợp, Phạm Minh Hương, Ngô ðình Bính, 1992. Tính ñối kháng của xạ khuẩn phân

lập từ ñất Việt Nam ñối với bệnh ñạo ôn. Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr.11 - 12.

56

10. Lê Gia Hy, Phạm Thị Bích Hợp, Ngô ðình Bính, 1992. Nghiên cứu khả năng sinh

chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ñạo ôn của một số chủng xạ khuẩn

(Streptomyces) phân lập ở Việt Nam. Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, tr. 59-63.

11. Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Phạm Thị Bích Hợp, Ngô ðình Bính, 1994. Ảnh

hưởng của môi trường lên men lên khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm gây

bệnh thực vật của chủng xạ khuẩn 5820. Tạp chí Sinh học, tập 16, số 2, tr. 44 - 48.

12. Lê Gia Hy, Phạm Thị Bích Hợp, 2004. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên

cứu sản xuất kháng sinh nhóm b-lactam. Báo cáo khoa học Hội nghị khoa học toàn

quốc: Những vấn ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống ñịnh hướng y dược

học. Nxb KH&KT, Hà Nội, tr. 246-251.

13. Lê Gia Hy, Nguyễn Phương Nhuệ, Phan Thị Hồng Thảo, Phạm Thị Bích Hợp,

2005. Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của chủng

Streptomyces orientalis 4912. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005: Những vấn

ñề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr.

574-577.

14. Biền Văn Minh và cộng sự, 2000. Tìm hiểu khả năng sinh kháng sinh và ñặc ñiểm

phân loại của một số chủng Micromonospora phân lập từ ñất Bình Trị Thiên. Tạp

chí Khoa học, ðại học Huế số 2, 2000, tr: 24 28.

15. Biền Văn Minh và cộng sự, 2000. Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi

Micromonospora từ ñất bùn Thừa Thiên Huế. Tạp chí Khoa học và Công nghệ số

1(38), 2000, tr: 18 - 21.

16. Biền Văn Minh và cộng sự, 2003. Một số tính chất lý hoá của chất kháng sinh M101

chống vi nấm chiết xuất từ Streptomyces craterifer S1. Tạp chí khoa học, Trường

ðHSP Hà Nội số 4, 2003, tr: 91- 93.

17. Biền Văn Minh và cộng sự, 2003. Khảo sát xạ khuẩn sinh kháng sinh thuộc chi

Micromonospora từ ñất bùn ở Bình Trị Thiên. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc

lần thứ 2, NCCB trong Sinh học, Nông nghiệp, Y dược, Huế, 25- 26/07/2003, tr: 177

- 179.

18. Biền Văn Minh và cộng sự, 2004. Phân lập chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ một

số mẫu ñất bùn ở Thừa Thiên Huế. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2004,

NCCB trong khoa học sự sống. ðịnh hướng Nông Lâm nghiệp miền núi, Thái

Nguyên 23/09/2004, tr: 822 - 824.

57

Tiếng Anh

1. Alex Y.l.T., Hai M.T. (2006), Microbial Biotechnology (2nd edition) Principles and

Applications, World scientific, pp. 3 – 23.

2. Arnold L.D., Sergio S. (2009), “Microbial drug discovery: 80 years of progress”, J.

Antibiotics, 62, pp. 5–16.

3. Ashutosh K. (2008), Pharmaceutical Microbiology, New Age International (P) Ltd,

pp. 89 – 101.

4. Burdick M.D., Harris A., Reid C.J., Iwamura T., Hol lingsworth M.A. (1997).

Oligosaccharides expressed on MUC1 by pancreatic and colon tumour cell lines,

J.Biol. Chem. 272, 24198-24202.

5. Carlo O., Carmen M., Jose A.S. (2009), “Antitumor compounds from marine

actinomycetes”, Marine Drugs, 97, pp. 210 – 248.

6. Chen M., Xiao X., Wang P., Zeng X., Wang F. (2005), “Arthrobacter ardleyensis sp.

nov. isolated from Antarctic lake sediment and deep-sea sediment”, Arch Microbiol,

183, pp. 301-305.

7. Creighton T.E. (1999), The encyclopedia of molecular biology, Vol 1-4, John Wiley

& Sons, Inc, pp. 771 – 779.

8. Cruciani R.A., Barker J.L., Zasloff M, Chen H.C., Colamonici O. (1991)

Antibiotic magainins exert cutolitic activity against transformed cell lines through

channel formation. Proc. Natl. Acad. Sci., 3792-3796

9. Dobrzanska J., Szachowicz-Petelska, Sulkowski S., Figaszewski. (2005). Changes

in electric charge and phospholipids composition in human colorectal cancer cells.

Mol. Cell. Biochem. 276, 113-119

10. Duong V.H., Ando K. (2010), Taxonomic and ecological studies of microorganisms

in Vietnam and the utilization, Joint research project between IMBT-VNU and NITE-

DOB, Japan, final report, March 2010, pp. 315 – 358.

11. Dutia, Pankaj (2004). "Ethyl Acetate: A Techno-Commercial Profile" (PDF).

Chemical Weekly: 184.

http://www.chemicalweekly.com/Profiles/Ethyl_Acetate.pdf#page=6. Retrieved

2009-03-21

58

12. Eyassu H.G. (2002), “Antimicrobial resistance: A global public health threat”, J. Erit.

Med. Assoc. Jema, pp. 36 – 40.

13. Felsenstein J. (1985), “Confidence limits on phylogenies: an approach using the

bootstrap”, Evolution, 39, pp. 783–791.

14. Fred C. Tenover (2006), “Mechanisms of antimicrobial resistance in bacteria”, Amer.

J. Med, 119, pp. 3–10.

15. Gernot V. (1997), Morphology of actinomycetes, In Miyadoh S., Hamada M., Hotta

K., Kudo T., Seino T. et al (eds), Atlas of Actinomycetes, Asakura, Tokyo, pp. 180-

191.

16. Gewirtz D.A. (1999), “A critical evaluation of the mechanism of action proposed for

the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin”,

Biochem Pharmacol, 57, pp. 727 – 741.

17. Goodfellow M., Williams S.T., Mordarski M. (1988), Actinomycetes in

biotechnology, Academic Press, London, pp. 1 – 32.

18. Goodfellow M., Davenport R., Stainsby F.M., Curtis T.P. (1996), “Actinomycete

diversity associated with foaming in activated sludge plants”, J. Ind. Microbiol.

Biotechnol, 17, pp. 268-280.

19. Guoliang Yin, Weimin Wang, Sha Sha, Lei Liu and Xiaoping Yu (2010),

“Inhibition and control effects of the ethyl acetate extract of Trichoderma harzianum

fermented broth against Botrytis cinerea”. African Journal of Microbiology Research

Vol. 4(15), pp. 1647-1653.

20. Hayakawa M., Otoguro M., Takeuchi T., Yamazaki T., Iimura Y. (2000),

“ Application of method incorporating differential centrifugation for selective

isolation of motile actinomycetes in soil and plant litter”, Antonie Van Leeuwenhoek,

78, pp. 171 – 185.

21. Horie M., Saito K., Nakazama H. (1996), “Determination of kitasamycin and

josamycin in meat by HPLC”, Japan Analyst, 45, pp. 1089 – 1094.

22. Hopwood A. D. (2007), Streptomyces in nature and medicine, the antibiotics maker,

Oxford University Press, pp. 28 – 50.

23. Hoskin DW, Ramamoorthy A. (2008). Studies on anticancer activities of

antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 1778(2), 357-75.

59

24. Hozzein W.N., Li W.J., Ali M.I.A., Hammouda O., Mousa A.S., Xu L.H., Jiang

C.L. (2004), “Nocardiopsis alkaliphila sp. nov., a novel alkaliphilic actinomycete

isolated from desert soil in Egypt”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 54, pp. 247-252.

25. Ichikawa T., Date M., Ishikura T., Ozaki A. (1971), “Improvement of kasugamycin-

producing strain by the agar piece method and the prototroph method”, Folia

Microbiol, 16, pp. 218 – 224.

26. Irena C. (2010), Encyclopedia of chromatography 3rd Edition, CRC Press, pp. 89 –

95.

27. Jeffrey R.K. (1978), “High-Performance Liquid Chromatographyic assay of

chloramphenicol in serum”, Antimicrob Agent Chemother, 14, pp. 439 – 443.

28. Kristof M. (2009), PhD thesis: Quantitative liquid chromatographic analysis of

anthracyclines in biological fluids, Ghent University, Belgium.

29. Leo M.L.N. (2000), Food analysis by HPLC 2nd Ed, Marcel Dekker, New York, pp.

649 – 653.

30. Likhiwitayawuid, K., Angerhofer, C.K., Chai, H., Pezzuto, J.M., Cordell, G. and

Ruangrungsi, N., 1993. Cytotoxic and antimalarial alkaloids from the bulbs of

Crinum amabile. Journal of Natural Products 56 8, pp. 1331–1338.

31. Mason M.G., Ball A.S., Reeder B.J., Silkstone G., Nicholls P., Wilson M.T. (2001),

“ Extracellular heme peroxidases in actinomycetes: a case of mistaken identity”, Appl

Environ Microbiol, 67, pp. 4512-4519.

32. Marmur J. (1961), “A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from

micro-organisms”, J Mol Biol, 3, pp. 208-218.

33. Margaret A. R., Milind A. C. (2007), Bacteriocins: ecology and evolution, Springer,

Berlin Heidelberg New York, pp. 1-5.

34. Matook S. M., Fumio H. (2005), “Antibacterial and antioxidant activities of banana

(Musa, AAA cv. Cavendish) fruits peel”, Amer J Biochem Biotech, 1, pp. 125-131.

35. Miyadoh S., Hamada M., Hotta K., Kudo T., Seino T. (1997), Atlas of

Actinomycete, The Society for Actinomycetes Japan, Asakura Co, pp. 2 – 10.

36. Miyadoh S., Hotta K., Kudo T., Seino A., Suzuki K., Yokota A. (2001),

Identification Manual of Actinomycetes, The Society for Actinomycetes Japan,

Business Center for Acedamic Societies Japan, pp. 2 – 28.

60

37. Nduka O. (2007), Modern Industrial Microbiology and Biotechnology, Science,

Enfield, USA, pp. 429 – 453.

38. Newman D. J., Cragg G. M., and Snader K. M. (2003), Natural Products as

Sources of New Drugs over the Period 1981-2002, J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037.

39. Nonomura H., Ohara Y. (1969), “Distribution of actinomycetes in soil. VI. A culture

method effective for broth preferential isolation and enumeration of Mircobispora

and Streptosporangium strains in soil (Part 1)”, J Ferment Technol, 47, pp. 463 – 469.

40. Pasti M. B., Pometto A. P., Nuti M. P., Crawford D. L. (1990), “Lignin-solubilizing

ability of actinomycetes isolated from termite (Termitidae) gutt”, Appl Environ

Microbiol, pp. 2213-2218.

41. Saga T., Yamaguchi K. (2008), “History of antimicrobial agents and resistant

bacteria”, J Japan Med Assoc, 137, pp. 513 – 517.

42. Saito H., Miura K. (1963), “Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by

phenol treatment”, Biochim. Biophys. Acta, 72, pp. 619–629.

43. Saitou N., Nei M. (1987), “The neighbor-joining method: a new method for

reconstructing phylogenetic trees”, Mol Biol Evol, 4, pp. 406 – 425.

44. Seong C.N., Kim Y.S., Baik K.S., Lee S.D., Hah Y.C., Kim S.B., Goodfellow M.

(1999), “Mycolic acid-containing actinomycetes associated with activated sludge

foam”, J Microbiol, 37, pp. 66-72.

45. Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren

J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R. (1990), “New colorimetric cytotoxicity

assay for anticancer-drug screening”, J. Nat Cancer Inst, 82, pp. 1107-1112.

46. Steger K. (2006), PhD. Thesis: Composition of microbial communities in composts. A

tool to assess process development and quality of the final product. Swedish

University of Agricultural Sciences, Uppsala.

47. Stuart H. (2005), Essential microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England, pp. 191

– 369.

48. Stubbs C., Haigh J. M., Kanfer I. (1985), “Determination of erythromycin in serum

and urine by HPLC with ultraviolet”, J Pharm Sci, 74, pp. 1126-1128.

61

49. Thomson C.J., Bialphos S.H. (1995), Genetics and Biochemistry of antibiotic

production. L.C. Vining, C. Stuttard (eds), Butterworth-Heinemann, Boston, pp. 197

– 222.

50. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. (1997),

“The CLUSTAL X Windows interface: flexible strategies for multiple sequence

alignment aided by quality analysis tools”, Nucleic Acids Res, 25, pp. 4876–4882.

51. Tomoo S., Keizo Y. (2009), “History of antimicrobial agents and resistant bacteria”, J

Japan Med Assoc, 52, pp. 103 – 108.

52. Tortora J. G., Funke R. B., Case L. C. (2010), Microbiology – An Introduction, 10th

ed, Pearson Education, Inc, pp. 553 – 583.

53. Trease GE, Evans WC (1996), A textbook of Pharmacognosy. 14th ed. Bailliere

Tindall Ltd, London, pp. 832.

54. Westley J.W., Evans R.H., Sello L.H., Troupe N., Liu C.M., Blount J.F. (1979),

“Isolation and characterization of antibiotic X-14547A, a novel monocarboxylic acid

ionophore produced by Streptomyces antibiotics NRRL 8167”, J. Antibiot, 32, pp.

100-107.

55. Young S.R., Wan J.K., Dong J.Y., Heun S.K., Soon R.C. (2001), “Synthesis and

antitumor activity of new anthracycline analogues”, Bull. Korean Chem. Soc, Vol. 22,

9, pp. 963 – 968.

56. http://science.howstuffworks.com/question479.htm

62

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Thành phần các môi trường nuôi cấy

1. Môi tr ường Mueller – Hinton (MHA)

- Cao thịt 3 g

- Casein thủy phân 17,5 g

- Tinh bột 1,5 g

- Thạch 17 g

- Nước cất 1 lít

- pH 7,4

2. Môi tr ường tinh bột-cao nấm men

- Glucose 10 g

- Cao nấm men 2 g

- Thạch 17 g

- Nước cất 1 lít

- pH 7,0

3. Môi tr ường dinh dưỡng ñậu tương

- Tinh bột 25 g

- ðậu tương 15 g

- Cao nấm men 1 g

- CaCO3 4 g

- Nước cất 1 lít

- pH 6,2

4. Môi tr ường cao malt- nấm men

- Cao malt 3 g

- Cao nấm men 3 g

- Glucose 10 g

- Pepton 5 g

- Thạch 17 g

- Nước cất 1 lít

5. Môi tr ường thạch vitamin-acid humic

- Acid humic 1 g

- CaCO3 0,02 g

- FeSO4.7H2O 0,01 g

- KCl 1,71 g

63

- MgSO4.7H2O 0,05 g

- Na2HPO4 0,5 g

- Cycloheximide 50 mg

- Nalidixic acid 20 mg

- Kabicidine 14 mg

- Thạch 14 g

- pH 7,2

64

Phụ lục 2. Trình tự các gene rDNA 16S của 7 chủng thuộc chi Nonomuraea

>A0045 Contig1, 1495 bases TTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCCCCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGCTCAGAGATGGGCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCT

>A0149 Contig1, 1436 bases TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCGCCCCCGGCATCGGGTGGTGGTGGAAAGTTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGATCTTCCACGATCTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGCCTGGAGACAGGCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCACTTTGTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAAC

>A0154 Contig1, 1476 bases CATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACGTTCTGTCGCATGACATGAACGTGGAAAGTTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCT

65

GCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAAGCTCTGGAGACAGAGCCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCTACGTGGTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAGCCGTGAGGCGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGGCCAACCCCCAAGGGGGGGAGAGGGCGAAAGTGGGGCTGGCGATTGTGACAAAATCGTAACAAGGTAGCCGTACCGCAAAGTGCGGCTGGATCACCTCCTTATAAAGGAGC >A0160 Contig1, 1440 bases, TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGGTCCAGAGATAGGCCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA

>A0232 Contig1, 1441 bases GCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACACACCCCGGCATCGGGTGTGTGTGGAAAGTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGCAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGAAACGGCCAGAGATGGTCGCCTCTTCGGACTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCCATGTTGCCAGCACGCCCTTCGGGGTGGTGGGGACTCATG

66

GGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCTAAACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA >A0396 Contig1, 1432 bases TGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTCGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGCCTCAGAGATGGGGCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACCTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGT >A0444 Contig1, 1496 bases GTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTCTGGGATAAGCCCGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCGCCTCCGGCATCGGATGGTGGTGGAAAGTTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAGTGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGTTGACGTGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGCTGGTCGCGTCTGCCGTGAAAGCCCGCAGCTTAACTGCGGGTCTGCGGTGGATACGGGCCGGCTAGAGGTAGGTAGGGGCAAGTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGCTTGCTGGGCCTTACCTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGACCCTTCCACGGGTTCCGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGTTTGACATCACCCGGACCGGTCTAGAGATAGGCCTTCCCTTTTGGGCTGGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCTCCATGTTGCCAGCAACACTTTCGGGTGGTTGGGGACTCATGGGGGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAATGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCAGCTTGCTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCG

67

Phụ lục 3. Kết quả phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi các chủng chọn lọc ñược

với các ñiều kiện tương ứng với các kháng sinh chuẩn

68

Phụ lục 4. Bản sao kết quả thử nghiệm gây ñộc tế bào

69

Phụ lục 5. Kết quả phân tích HPLC chất chiết thu ñược từ dịch nuôi của ba chủng

có hoạt tính kháng tế bào ung thư người

70

SẢN PHẨM CỦA ðỀ TÀI Bài báo

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam.

Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).

• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở vườn

Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội (ñã nhận

ñăng).

ðào tạo

ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc chương trình ñào

tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là: “Biodiversity and

antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island, Vietnam”. Học viên Nguyễn

Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng

2 năm 2011.

71

PHIẾU ðĂNG KÝ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ðỀ TÀI KHCN

Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi

sinh vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

Mã số: QG.09.48

Cơ quan quản lý ñề tài: ðại học Quốc gia Hà Nội

ðịa chỉ: 144 ñường Xuân Thủy, Cầu Giấy – Hà Nội

ðiện thoại: 37 54 86 64

Cơ quan chủ trì ñề tài: Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, ðHQGHN

ðịa chỉ: Nhà E2, 144 Xuân Thủy, Cầu Giấy – Hà Nội

ðiện thoại: 37547407

Tổng chi phí thực chi: 100.000.000 ñ

Trong ñó:

− Từ ngân sách NN: 100%

− Nguồn khác: không có

Thời gian nghiên cứu: 2 năm

− Thời gian bắt ñầu: 3/2009

− Thời gian kết thúc: 3/2011

Tên các cán bộ phối hợp nghiên cứu:

− Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

− Cán bộ tham gia: TS. Nguyễn Quỳnh Uyển

- TS. ðinh Thúy Hằng

- CN. Lê Phương Chung

- ThS. Phan Thị Hà

- CN. Lê Hồng Anh

Số ñăng ký ñề tài

Ngày

Số chứng nhận ñăng ký KQNC

Ngày

Bảo mật

A. Phổ biến rộng rãi

Tóm tắt ý nghĩa, kết quả nghiên cứu:

- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu

thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại.

72

- 424 chủng xạ khuẩn ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm ñịnh

cho thấy trong ñó có 115 chủng biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong bốn vi sinh

vật kiểm ñịnh.

- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh

vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)

kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427

và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14

chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn

Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng

có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm

men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh

vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate

ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate

(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).

So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng

A396).

- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích

sắc ký bản mỏng (TCL) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,

erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng

thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,

A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ

có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,

A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi

của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi

chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có

băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của

chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần

với ñối chứng này.

- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược phân tích qua sắc ký lỏng

hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng sinh chuẩn cho thấy

ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ chloramphenicol, tất cả các

mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các kháng sinh ñối chứng.

73

- Bằng phép thử ñặc hiệu (ñổi màu theo pH) với các chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm

anthracycline nhận thấy có hai chủng có biểu hiện dương tính với phép thử này là

A1018 và A1073.

- 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư người là A1018

(có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng), A1022 (có phổ

TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH). Bằng thử nghiệm với ba

dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim, các hợp chất chiết từ

dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác dụng dương tính với cả

ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây chết 50% tế bào ung thư,

tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn) thì thấy trong ba mẫu

nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số này thấp nhất và thấp

gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng diệt tế bào) của phép

thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp hơn ñáng kể so với

hai chủng còn lại.

- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư

nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng

tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,

Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết

quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ

chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ

liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói

trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó.

- ðã ñào tạo ñược 01 thạc sỹ Công nghệ sinh học thuộc chương trình ñào tạo liên kết

quốc tế.

- 02 bài báo ñã ñược tạp chí Công nghệ sinh học và tạp chí Khoa học ðại học Quốc gia

Hà Nội nhận ñăng.

Ki ến nghị về qui mô và ñối tượng áp dụng kết quả nghiên cứu:

- Nghiên cứu bản chất/cấu trúc hóa học của các chất quyết ñịnh hoạt tính sinh học

- Sàng lọc các ñối tượng thu thập tại các ñịa danh khác của Việt Nam nhằm tìm kiếm

thêm các nguồn gene quý giá

- Xây dựng cơ sở dữ liệu sử dụng trong phân tích các chất kháng sinh bằng phương

pháp HPLC

74

Chức vụ

Chủ nhiệm ñề

tài

Thủ trưởng cơ

quan chủ trì ñề

tài

Chủ tịch hội ñồng

ñánh giá chính

thức

Thủ trưởng cơ

quan quản lý ñề

tài

Họ và tên Nguyễn Huỳnh

Minh Quyên

Dương Văn Hợp Phạm Thị Trân

Châu

Học vị TS TS GS. TSKH.

Ký tên

ðóng dấu