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BASI MOLECOLARI DELL’AZIONE DEL FARMACOBIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE
LEZIONE 5
CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
Adriana Maggi
http://users.unimi.it/mpl/lezioni.html
ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation "ChIP” con la tecnologia del micro array(microarray technology “chip").
read-outNormalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati
“estrazione delle informazioni”
Sito DNA
arricchimento proteina di interesse
Le prime analisi si sono focalizzate sulle differenze tra animali in Proestro e Metestro, per vedere se la differenza dei livelli di Estradiolo circolante avesse degli effetti sull’espressione genica.Come atteso, gli animali LID non mostrano nessuna significativa differenza nell’espressione genica nelle due fasi del ciclo, come se quest’ultimo fosse appiattito. Gli animali WT, al contrario, mostrano deboli ma rilevabili differenze nelle due fasi; tuttavia, il quadro osservato e’ totalmente inatteso, in quanto i geni differenzialmente espressi sono tutti geni MAGGIORMENTE espressi nella fase di metestro o, guardando all’inverso, downregolati nella fase di Proestro. Considerando cio’ che abbiamo sempre osservato, vale a dire un’attivazione del recettore degli estrogeni in fase di proestro, questo stupisce.
WT M vs WT P WT P vs WT M
Downregulated in P
Upregulated in M
SEM Analysis
GO Term Analysis
Una volta identificati i trascritti differenzialmente espressi nei due gruppi (t test & SAM analysis, tenendo in considerazione solo quelli con Fold Indution >=1,5), si cerca di capire se questi geni sono implicati in determinati ‘Biological Process’ o hanno particolari ‘Molecular Function’ o interferiscono in un determinato ‘Pathway’.
Questa analisi si puo’ fare a diversi “livelli”, i risultati riportati si riferiscono ad un livello piuttosto superficiale, ma per questo piu’ generale e credo indicativo.
Riporto:- BP = Biological Process- MF = Molecular Function- Pathway
L’analisi e’ stata fatta principalmente conhttp://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsppiu’ molti altri software e websites (le risorse sono infinite)
Term Count % PValueBP00019:Lipid, fatty acid and steroid metabolism 40 20.00% 1.57E-19BP00076:Electron transport 25 12.50% 1.96E-08BP00020:Fatty acid metabolism 17 8.50% 9.20E-04BP00013:Amino acid metabolism 9 4.50% 9.33E-04BP00180:Detoxification 11 5.50% 1.92E-03BP00064:Protein phosphorylation 31 15.50% 1.98E-03BP00148:Immunity and defense 25 12.50% 4.40E-03BP00150:MHCI-mediated immunity 27 13.50% 7.00E-03BP00001:Carbohydrate metabolism 11 5.50% 7.97E-03BP00143:Cation transport 42 21.00% 9.66E-03BP00295:Steroid metabolism 10 5.00% 1.21E-02BP00063:Protein modification 32 16.00% 1.52E-02BP00271:Other homeostasis activities 4 2.00% 2.77E-02BP00273:Chromatin packaging and remodeling 13 6.50% 3.04E-02BP00069:Protein disulfide-isomerase reaction 9 4.50% 3.12E-02BP00267:Homeostasis 5 2.50% 3.63E-02BP00147:Other transport 4 2.00% 4.27E-02BP00044:mRNA transcription regulation 87 43.50% 4.74E-02BP00008:Tricarboxylic acid pathway 5 2.50% 4.83E-02BP00151:MHCII-mediated immunity 15 7.50% 6.80E-02BP00289:Other metabolism 30 15.00% 7.38E-02BP00156:Interferon-mediated immunity 3 1.50% 8.79E-02
I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_BP_WTall_vs_LIDAll.xls’
Biological Process - WTall vs LIDall
Considerando tutti i trascritti differentemente espressi, sia upregolati che downregolati.
Term Count % PValueMF00123:Oxidoreductase 33 16.50% 1.69E-16MF00124:Oxygenase 26 13.00% 4.86E-13MF00140:Other transferase 12 6.00% 2.09E-04MF00087:Transfer/carrier protein 12 6.00% 9.62E-04MF00099:Small GTPase 29 14.50% 2.01E-03MF00082:Transporter 13 6.50% 3.45E-03MF00212:Other G-protein modulator 36 18.00% 3.71E-03MF00131:Transferase 27 13.50% 6.35E-03MF00007:Interferon receptor 4 2.00% 6.86E-03MF00254:Actin and actin related protein 13 6.50% 1.72E-02MF00174:Complement component 6 3.00% 1.91E-02MF00042:Nucleic acid binding 74 37.00% 2.68E-02MF00126:Dehydrogenase 9 4.50% 3.83E-02MF00005:Cytokine receptor 6 3.00% 5.09E-02MF00224:KRAB box transcription factor 52 26.00% 5.62E-02MF00074:Translation release factor 4 2.00% 6.44E-02MF00063:Histone 5 2.50% 7.09E-02MF00213:Non-receptor serine/threonine protein kinase 43 21.50% 7.30E-02MF00033:Voltage-gated calcium channel 12 6.00% 7.52E-02MF00211:Kinase activator 11 5.50% 8.12E-02MF00118:Synthase and synthetase 4 2.00% 9.05E-02MF00242:RNA helicase 16 8.00% 9.49E-02MF00217:Other proteases 7 3.50% 9.83E-02
Molecular Function - WTall vs LIDall
I geni per ogni categoria sono nel file Excel ‘Panther_MF_WTAll_vs_LIDAll.xls’
I LIMITI DELLA ANALISI GENOMICA:
RIPRODUCIBILITA’
ANALISI NON QUANTITATIVA
I mRNA NON RIFLETTONO ESATTAMENTELE PROTEINE PRESENTI NELLA CELLULA
proteomica
Il fine della proteomica consiste nella completa identificazione delle proteine e della loro espressione in determinati cellule o tessuti La metodologia su cui si basa la proteomica comprende: gel elettroforesi bidimensionale; HPLC e spettrometria di massa
• (20,000 to 25,000 genes vs. > 500,000 proteins).
• E’ stato calcolato che il corpo umano puo’ esprimere fino a 2 milioni di proteine, ciascuna con differenti funzioni
I metodi della proteomica
• dagli anni ‘70: gel elettroforesi bidimensionale
Limiti di definizione e riproducibilità
•Anni ’90 spettrometria di massa con metodi di ionizzazione alternativi
(electrospray o MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization )
Non si amplificano le proteine: dimensione campioniIdentificazione dei peptidi da miscele complesseRapiditàAnalisi quantitativaLimiti nelle conoscenze di genomi da diversi organismiDisponibilità di strumentazione
electrospray ionization liquid chromatography mass spectrometry
John Bennett Fenn ha ricevuto il premio Nobel per la chimica nel 2002 per lo sviluppo della tecnica di elettrospray per l’analisi di macromolecole biologiche
Stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) per analisi proteomica quantitativa
Mann Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 952–958 (December 2006) | doi:10.1038/nrm2067
Functional and quantitative proteomics using SILAC
SILAC (Stable isotope labelling with amino acids in cell culture)
Proteomica e trascrittomica a confronto
Uno studio in cui si sono comparati i dati di analisi di cellule MCF-7
Su un totale di 7278 geni identificati in modo univoco come messaggi o proteine
55% provengono da analisi proteomica77% provengono da microarray
LE PROSPETTIVE DELLA PROTEOMICA:
•continuo progresso della tecnologia per misure sempre più su larga scala e rapide
• costruzione di banche dati
•protomica interviene in cellule dove mRNA non è informativo (es cellule ematiche)
•La misura proteomica fornisce l’end point, il microarray va verificato con qPCR e da western
•La proteomica permette di studiare la presenza di modificazioni post-traduzionali, di interazioni proteina-proteina
INTERATTOMICA
analisi del trascrittoma, del proteoma e dell’interattoma comparati per arrivare a definire le funzioni fisiologiche di ciascun gene
L’INTERATTOMA O BIOLOGIA DEI SISTEMI
(system biology)
Per grafico intendiamo un insieme di punti, nodi o vertici che sono tra loro collegati non in modo unidirezionale. Nel digrafico la direzionalità o bidirezionalità dell’evento è segnata
L’interattoma rappresenta interazioni molecolari con un sistema digrafico
Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml
Un progetto atto a costruire un vocabolario per descrivere geni e prodotti genici attribuibili a ogni organismo
Questo vocabolario serve per dare un unico nome a un specifico prodotto in modo che questi così compaia nelle diverse banche dati e possa venire rapidamente ritrovato
L'ontologia, una delle branche fondamentali della
filosofia, è lo studio dell'essere in quanto tale, nonché
delle sue categorie fondamentali.
Il termine deriva dal greco ὄντος, òntos (genitivo
singolare del participio presente ὤν di εἶναι, èinai, il
verbo essere) più λόγος, lògos, letteralmente "discorso
sull'essere”
Potenziamento dell'interoperabilità delle banche dati
biologiche mediante la standardizzazione della terminologia
biochimica e l'introduzione di un'ontologia condivisa
Combinazione dei diversi punti di forza di gruppi europei
attivi in vari ambiti della normalizzazione per la terminologia
biochimica all'interno delle banche dati, allo scopo di
sviluppare e applicare un vocabolario controllato e
un'ontologia comune per la descrizione degli attributi
biologici nelle banche dati biologiche
Gene Ontology
Gene Ontology http://www.geneontology.org/index.shtml
Ogni gene/proteina si contraddistingue per un numero identificativo unico (GO:nnnnnnn) e un nome (es: cellula, fibroblasto, fattore di crescita, trasduttore del segnale).
Ogni termine viene assegnato a una delle tre suddivisioni della banca (ontology):
1.Funzioni molecolari2.Componenti cellulari3.Componenti I processi biologici
Gene Ontology (GO, ontologia genica): un
vocabolario controllato e strutturato per la
descrizione di prodotti genici in termini
• di funzione molecolare,
• di ruolo biologico e
• di ubicazione cellulare
A gene product might be associated with or located in one or more cellular components; it is active in one or more biological processes, during which it performs one or more molecular functions.
For example, the gene product cytochrome C can be described by:
the molecular function term oxidoreductase activity,
the biological process terms oxidative phosphorylation and induction of cell death, and
the cellular component terms mitochondrial matrix and mitochondrial inner membrane.
Topology
The ontologies are structured as directed acyclic graphs, which are similar to hierarchies but differ in that a more specialized term (child) can be related to more than one less specialized term (parent).
For example, the biological process term:
hexose biosynthetic process has two parents,
hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.
This is because biosynthetic process is a type of metabolic process and a hexose is a type of monosaccharide. When any gene involved in hexose biosynthetic process is annotated to this term, it is automatically annotated to both hexose metabolic process and monosaccharide biosynthetic process.
‘OMICSAPPLICAZIONI MEDICHE
Informazioni sulla malattia
Farmacogenetica
Test genetici
Terapia genica
Farmacogenetica nella ricerca e sviluppo di nuovi farmaci
Farmacogenetica: lo studio di variazioni genetiche e del loro effetto nella risposta a farmaci
Scoperta e sviluppo di nuovi farmaci
Studi genetici per la identificazione di nuovi bersagli terapeutici
Inizi anni ‘80 si cercano polimorfismi associati alla manifestazione di Alzheimer
Anni ‘90 ApoE appare associato a apparizione precoce di AD (60 anni negli omozigoti); In soggetti con ApoE2/3 la malattia generalmente appare dopo I 90 anni
Dati confermati da genome-wide association studiesdove si studiano più di 500.000 SNP per volta
A. Roses, NDD 2008
Traslocasi della membrana mitocondriale esterna
Studi genetici per lo studio dell’efficacia di un trattamento
farmacologico
ROSIGLITAZONE IN PAZIENTI CON ALZHEIMER PORTATORI E NON DEL GENE APOE4
Studi genetici per l’ identificazione di pazienti a rischio di manifestare
effetti collaterali specifici in seguito a trattamenti farmacologici
1.CYP2C9 e metabolismo di warfarina
2.Pazienti con AIDS che sviluppano una sindrome da ipersensibilità a trattamento con abacavir
Farmacovigilanza
