Bazı bitki örneklerinin antioksidan kapasitenin spektrofotometrik ve kromatografik tayini

İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

İSTANBUL

BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE

KROMATOGRAFİK TAYİNİ

Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı

Analitik Kimya Programı

Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN

II. Danışman

Prof. Dr. Reşat APAK

Haziran, 2007

İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ

FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

YÜKSEK LİSANS TEZİ

İSTANBUL

BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE

KROMATOGRAFİK TAYİNİ

Leyla YILDIZ Kimya Anabilim Dalı

Analitik Kimya Programı

Danışman Yrd. Doç. Dr. Kevser SÖZGEN BAŞKAN

II. Danışman

Prof. Dr. Reşat APAK

Haziran, 2007

Bu çalışma İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliğinin T-919/06102006 numaralı projesi ile desteklenmiştir.

i

ÖNSÖZ

Yüksek lisans öğrenimim boyunca birikimlerini benimle paylaşan ve olumlu düşünceleriyle beni teşviklendiren tez danışmanım Yrd. Doç. Dr. Kevser Sözgen BAŞKAN’a, ulusal ve uluslararası kimya alanında önemli bir yere sahip olan değerli hocalarım, ikinci danışmanım Prof. Dr. Reşat APAK’a ve Prof. Dr. Esma TÜTEM’e, aynı süre boyunca desteklerini, yardımlarını esirgemeyen ve özellikle lisans öğrenim boyunca deneysel uygulamalarda önemli bir tecrübe kazandığım Doç. Dr. Erol ERÇAĞ ve Ar. Gör. Ayşem ARDA’ya, birlikte çok şey paylaştığımız değerli arkadaşım ve meslektaşım Şeyda KARAMAN’a ve daha ismini sayamadığım sevgili hocalarıma, arkadaşlarıma ve değerli aileme en içten dileklerimle teşekkür ederim. Tezimle aynı ismi taşıyan T-919/06102006 sayılı projeme maddi destek sağlayan İ.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Yürütücü Sekreterliği’ne teşekkür ederim. 105T402 nolu, ‘Antioksidanlar ve Polinitro-Aromatikler için Spektrofotometrik Yöntem Tasarımı’ isimli araştırma projesi ile, tezim sırasında bana burs sağlayan TÜBİTAK’a teşekkür ederim. Haziran, 2007 Leyla YILDIZ

ii

İÇİNDEKİLER

ÖNSÖZ .................................................................................................... i

İÇİNDEKİLER ...................................................................................... ii

ŞEKİL LİSTESİ ..................................................................................... vi

TABLO LİSTESİ ....................................................................................x

SEMBOL LİSTESİ .............................................................................. xii

ÖZET ................................................................................................... xiii

SUMMARY ............................................................................................xv

1. GİRİŞ ...................................................................................................1

2. GENEL KISIMLAR ............................................................................3

2.1. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR ...................................3

2.2. DOĞAL ANTİOKSİDANLAR........................................................................5

2.2.1. C Vitamini..................................................................................................5

2.2.2. E Vitamini..................................................................................................6

2.2.3. Karotenoidler.............................................................................................7

2.2.4. Polifenolik Bileşikler..................................................................................9

2.2.4.1. Flavonoidler .........................................................................................9

2.2.4.2. Fenolik Asitler ....................................................................................17

2.2.4.3. Fenolik Polimerler (Tanenler) ............................................................19

2.3. ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI

ETKİLERİ VE ETKEN BİLEŞİKLERİ......................................................20

2.3.1. Civanperçemi ( Achillea millefolium ).....................................................20

2.3.2. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )................................................20

2.3.3. Dereotu ( Anethum graveolens ) ..............................................................21

2.3.4. Kereviz ( Apium graveolens )...................................................................21

2.3.5. Nane ( Mentha piperita ) ..........................................................................21

iii

2.3.6. Mercanköşk ( Origanum sp. ) ................................................................22

2.3.7. Maydanoz ( Petroselinum crispum ) ......................................................22

2.3.8. Adaçayı ( Salvia triloba )........................................................................23

2.3.9. Kekik ( Thymus sp. ) ..............................................................................23

2.3.10. Ihlamur ( Tilia sp. ) ................................................................................23

2.3.11. Isırgan ( Urtica sp. )...............................................................................23

2.4. TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ..............26

2.4.1. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu

İndirgeme Antioksidan Kapasite) Yöntemi .........................................26

2.4.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks

Eşdeğeri Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi ............................26

2.4.3. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu

İndirgeyici Antioksidan Gücü) Yöntemi..............................................28

2.4.4. Folin Ciocalteu Yöntemi.......................................................................28

2.4.5. TRAP (Total Radical Trapping Parameter; Toplam Radikal

Tutma Parametresi) Yöntemi...............................................................29

2.4.6. Luminol Yöntemi..................................................................................29

2.4.7. Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi....................................30

2.4.8. Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler .......................................................30

2.4.9. Krosin Yöntemi.....................................................................................31

2.4.10. DPPH Yöntemi .....................................................................................32

2.4.11. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal

Absorbans Kapasitesi) Yöntemi...........................................................33

2.4.12. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam

Oksiradikal Süpürme Kapasitesi) Yöntemi.........................................33

2.4.13. Siklik Voltametri Yöntemi ...................................................................33

2.5. BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE

KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER

VE HPLC UYGULAMALARI ....................................................................34

3. MALZEME VE YÖNTEM ...............................................................39

3.1. KULLANILAN CİHAZLAR.........................................................................39

3.2. KİMYASAL MADDELER ...........................................................................39

iv

3.2.1. Çözeltilerin Hazırlanması .......................................................................40

3.3. BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI............................40

3.3.1. Bitki Örneklerinin Kurutulması .............................................................40

3.3.2. Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu ..........................................................40

3.3.2.1. Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu .....................................40

3.3.2.2. Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon .......................41

3.3.3. Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi)..........................................41

3.3.4. Bitki Örneklerinin Hidrolizi ...................................................................41

3.3.4.1. Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi.............................................................41

3.3.4.2. Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi.........................................................42

3.3.4.3. Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi ...........................................................42

3.4. SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI.......................................42

3.4.1. Sentetik Karışım-1...................................................................................42


3.5. UYGULANAN YÖNTEMLER .....................................................................43

3.5.1. Spektrofotometrik Yöntemler.................................................................43

3.5.1.1. CUPRAC Yöntemi ..............................................................................43

3.5.1.2. ABTS-Persülfat Yöntemi ....................................................................44

3.5.2. Kromatografik Analizler.........................................................................45

3.5.2.1. HPLC Analizi .....................................................................................45

4. BULGULAR ......................................................................................47

4.1. BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE

Cu(I)-Nc KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI ..............47

4.1.1. Mirisetin...................................................................................................48

4.1.2. İzokuersitrin ............................................................................................49

4.1.3. Luteolin....................................................................................................50

4.1.4. Kamferol ..................................................................................................51

4.1.5. Apigenin...................................................................................................52

4.1.6. Rozmarinik Asit.......................................................................................53

4.2. BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA

KATSAYILARI VE TEAC DEĞERLERİ...................................................54

v

4.3. HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON

DOĞRULARININ OLUŞTURULMASI......................................................56

4.4. BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI .....................................................59

4.4.1. Maydanoz ( Petroselinum sativum ).........................................................59

4.4.2. Kereviz Yaprağı ( Apium graveolens ) ....................................................65

4.4.3. Nane ( Mentha piperita ) ..........................................................................69

4.4.4. Isırgan ( Urtica dioica ) ............................................................................72

4.4.5. Adaçayı ( Salvia triloba )..........................................................................73

4.4.6. Ihlamur ( Tilia rubra ) .............................................................................77

4.4.7. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )................................................78

4.4.8. Dereotu ( Anethum graveolens ) ..............................................................80

4.4.9. Civanperçemi ( Achillea millefolium ).....................................................82

4.4.10. Mercanköşk ( Origanum majorona ) .....................................................84

4.4.11. Kekik ( Thymus vulgaris )......................................................................86

4.5. SENTETİK KARIŞIMLARIN ANALİZ SONUÇLARI ..............................87



5. TARTIŞMA VE SONUÇ ..................................................................94

KAYNAKLAR .....................................................................................101

ÖZGEÇMİŞ .........................................................................................110

vi

ŞEKİL LİSTESİ

Şekil 2.1 : Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar.............................................................................5

Şekil 2.2 : Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları...............................6 Şekil 2.3 : α-tokoferol’ün kimyasal yapısı ...............................................................7 Şekil 2.4 : β-karoten, likopen ve lutein’in kimyasal yapıları ....................................8 Şekil 2.5 : Flavonoidlerin genel yapısı ..................................................................10 Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin’in

kimyasal yapıları..................................................................................11 Şekil 2.7 : Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin’in

kimyasal yapıları..................................................................................11 Şekil 2.8 : Apigenin, luteolin ve krisin’in kimyasal yapıları ..................................12 Şekil 2.9 : Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve

epigallokateşin gallat’ın kimyasal yapıları............................................12 Şekil 2.10 : Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol’ün

kimyasal yapıları..................................................................................13 Şekil 2.11 : Daidzein ve genistein’in kimyasal yapıları ...........................................13 Şekil 2.12 : Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları........14 Şekil 2.13 : Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri................18 Şekil 2.14 : Rozmarinik asit’in kimyasal yapısı.......................................................18 Şekil 2.15 : Gallik, protokateşik, vanilik asit’in kimyasal yapıları ...........................19 Şekil 2.16 : Fenolik polimerin kimyasal yapısı........................................................20 Şekil 2.17 : Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri ...........................24 Şekil 2.18 : Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin

resimleri ..............................................................................................25 Şekil 2.19 : ABTS.+ radikal katyonunun yapısı........................................................27 Şekil 2.20 : ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu ............................27 Şekil 4.1 : Mirisetinin kalibrasyon doğrusu ...........................................................48 Şekil 4.2 : Mirisetinin CUPRACN spektrumu........................................................48 Şekil 4.3 : İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu......................................................49 Şekil 4.4 : İzokuersitrinin CUPRACN spektrumu ..................................................49 Şekil 4.5 : Luteolinin kalibrasyon doğrusu ............................................................50 Şekil 4.6 : Luteolinin CUPRACN spektrumu.........................................................50 Şekil 4.7 : Kamferolün kalibrasyon doğrusu..........................................................51 Şekil 4.8 : Kamferolün CUPRACN spektrumu .....................................................51 Şekil 4.9 : Apigeninin kalibrasyon doğrusu...........................................................52 Şekil 4.10 : Apigeninin CUPRACİ spektrumu.........................................................52 Şekil 4.11 : Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu.................................................53 Şekil 4.12 : Rozmarinik asitin CUPRACN spektrumu..............................................53 Şekil 4.13 : Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın

kromatogramı.......................................................................................57 Şekil 4.14 : Rozmarinik asit standartının kromatogramı ..........................................57

vii

Şekil 4.15 : Mirisetin standartının kromatogramı ....................................................58 Şekil 4.16 : Askorbik asit standartının kromatogramı ..............................................58 Şekil 4.17 : Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş

maydanoz örneklerinin spektrumu........................................................60 Şekil 4.18 : Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin

spektrumu ............................................................................................60 Şekil 4.19 : Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz

örneklerinin spektrumu ........................................................................60 Şekil 4.20 : %100 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.................61 Şekil 4.21 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı..................61 Şekil 4.22 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı..................61 Şekil 4.23 : % 100 bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı .........62 Şekil 4.24 : % 100 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı...................62 Şekil 4.25 : % 70 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.....................62 Şekil 4.26 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı.....................63 Şekil 4.27 : % 70 metanollü maydanoz ekstraktının 2 ve 4 saat hidroliz sonucu

elde edilen hidrolizat kromatogramları .................................................63 Şekil 4.28 : Kurutulmuş maydanoz örneklerine uygulanan 2 ve 4 saat hidroliz

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları .....................................64 Şekil 4.29 : Yaş maydanozda askorbik asit analizi sonucu elde edilen

kromatogram........................................................................................64 Şekil 4.30 : Çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı

örneklerinin spektrumu ........................................................................65 Şekil 4.31 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı..........66 Şekil 4.32 : % 50 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı..........66 Şekil 4.33 : % 50 etanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı.............66 Şekil 4.34 : Kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve kurutulmuş örnek

hidrolizatının spektrumu.......................................................................67 Şekil 4.35 : % 70 metanollü kereviz yaprağı ekstraktının 4 saat hidroliz sonucu

elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................67 Şekil 4.36 : Kurutulmuş kereviz yaprağına doğrudan uygulanan 4 saat hidroliz

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................68 Şekil 4.37 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş nane kromatogramı ..........................69 Şekil 4.38 : Kurutulmuş naneye doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen

hidrolizat kromatogramı .......................................................................69 Şekil 4.39 : Nane ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu............................................................................................70 Şekil 4.40 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin kromatogramı .......................70 Şekil 4.41 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................71 Şekil 4.42 : Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................71 Şekil 4.43 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ısırgan kromatogramı .......................72 Şekil 4.44 : Kurutulmuş ısırgana doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde

edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................72 Şekil 4.45 : Isırgan ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu ............................................................................................73 Şekil 4.46 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş adaçayı kromatogramı......................74

viii

Şekil 4.47 : Kurutulmuş adaçayına doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................74

Şekil 4.48 : Adaçayı ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu ............................................................................................75

Şekil 4.49 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin kromatogramı...................75 Şekil 4.50 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................76 Şekil 4.51 : Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin asit+metanol ile

hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı ...........................76 Şekil 4.52 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ıhlamur kromatogramı .....................77 Şekil 4.53 : Kurutulmuş ıhlamura doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde

edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................77 Şekil 4.54 : Ihlamur ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu ............................................................................................78 Şekil 4.55 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş arslanpençesi kromatogramı ............79 Şekil 4.56 : Kurutulmuş arslanpençesine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu

elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................79 Şekil 4.57 : Arslanpençesi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki

hidrolizatının spektrumu.......................................................................80 Şekil 4.58 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş dereotu kromatogramı......................81 Şekil 4.59 : Kurutulmuş dereotuna doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde

edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................81 Şekil 4.60 : Dereotu ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu ............................................................................................82 Şekil 4.61 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş civanperçemi kromatogramı.............82 Şekil 4.62 : Kurutulmuş civanperçemine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu

elde edilen hidrolizat kromatogramı .....................................................83 Şekil 4.63 : Civanperçemi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki

hidrolizatının spektrumu.......................................................................83 Şekil 4.64 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş mercanköşk kromatogramı...............84 Şekil 4.65 : Kurutulmuş mercanköşke doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde

edilen hidrolizat kromatogramı.............................................................85 Şekil 4.66 : Mercanköşk ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu ............................................................................................85 Şekil 4.67 : % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kekik kromatogramı.........................86 Şekil 4.68 : Kurutulmuş kekiğe doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen

hidrolizat kromatogramı .......................................................................86 Şekil 4.69 : Kekik ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu............................................................................................87 Şekil 4.70 : Sentetik Karışım-1’in kromatogramı ....................................................88 Şekil 4.71 : Sentetik Karışım-1’in 2 saat hidrolizi sonucunda elde edilen

hidrolizat kromatogramı .......................................................................88 Şekil 4.72 : Sentetik Karışım-1’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı.......................................................................................88 Şekil 4.73 : Sentetik Karışım-2’in kromatogramı ....................................................89 Şekil 4.74 : Sentetik Karışım-2’in 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı.......................................................................................90 Şekil 4.75 : Sentetik Karışım-2’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı.......................................................................................90

ix

Şekil 5.1 : Rozmarinik asit standartının 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .......................................................................96

Şekil 5.2 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin kromatogramı ........97 Şekil 5.3 : % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin 2 saat hidrolizi

sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı .........................................98

x

TABLO LİSTESİ

Tablo 2.1 : Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları ............................................................................................15

Tablo 4.1 : Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................48

Tablo 4.2 : İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...............................................................................................49

Tablo 4.3 : Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................50

Tablo 4.4 : Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri...............................................................................................51

Tablo 4.5 : Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ..............................................................................................52

Tablo 4.6 : Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri ...............................................................................................53

Tablo 4.7 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ........................................54

Tablo 4.8 : Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ........................................55

Tablo 4.9 : Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri ..................................................................55

Tablo 4.10 : Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları ..............................................................................56

Tablo 4.11 : Maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................65

Tablo 4.12 : Kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................68

Tablo 4.13 : Nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................71

Tablo 4.14 : Isırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................73

Tablo 4.15 : Adaçayı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................76

Tablo 4.16 : Ihlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................78

Tablo 4.17 : Arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................80

Tablo 4.18 : Dereotu örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................82

Tablo 4.19 : Civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................84

xi

Tablo 4.20 : Mercanköşk örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................85

Tablo 4.21 : Kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki) ...............................................................................87

Tablo 4.22 : Sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) .................................................................89

Tablo 4.23 : Sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) .................................................................90

Tablo 4.24 : Bitki örneklerinin ve sentetik karışımların toplam antioksidan kapasitesinin HPLC yardımıyla belirlenebilen %’si ..............................91

xii

SEMBOL LİSTESİ

ROS : reaktif oksijen türleri CUPRAC : bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasitesi ABTS : 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) TEAC : troloks eşdeğeri antioksidan kapasite HPLC : yüksek performanslı sıvı kromatografisi Cu(II)-Nc : bakır(II)-neokuproin Cu(I)-Nc : bakır(I)-neokuproin ABTS.+ : ABTS radikal katyonu FRAP : demir(III) iyonu indirgeyici antioksidan gücü TPTZ : tripridiltriazin FCR : Folin Ciocalteu reaktifi TRAP : toplam radikal tutma parametresi AAPH : azobis (2-amido propan)dihidroklorür DCFH-DA : diklorofloresin-diasetat DCF : diklorofloresin PE : fikoeritrin DPPH : 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil ORAC : oksijen radikal absorbans kapasitesi AUC : eğri altında kalan alan KMBA : α-keto-γ metiolbutirik asit CUPRACN : normal CUPRAC yöntemi CUPRACi : inkübasyonlu CUPRAC yöntemi TR : troloks ε : molar absorplama katsayısı tR : alıkonma zamanı M : molar derişim v/v : hacim/hacim w/v : ağırlık/hacim eks. : ekstrakt hid. : hidrolizat met. : metanol eta. : etanol dem. : demleme çöz. : çözelti

xiii

ÖZET

BAZI BİTKİ ÖRNEKLERİNDE ANTİOKSİDAN KAPASİTENİN SPEKTROFOTOMETRİK VE KROMATOGRAFİK TAYİNİ Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olmaktadır. Bu hasarı sınırlandırmak için vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir ve genellikle besinlerle alınan C ve E vitaminleri, selenyum, β-karoten, likopen, lutein ve diğer karotenoidler de bu savunmaya yardımcı antioksidanlar olarak rol almaktadır. Bunlara ilave olarak flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir. Bu da antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi amaçla kullanılan ve antioksidan bileşikler bakımından zengin olan şifalı bitkilerin insan sağlığı açısından önemini ortaya koymaktadır. Son yıllarda, şifalı bitkiler ve bunlardan elde edilen aktif maddeler üzerindeki çalışmalar yoğunlaşmıştır. Bu çalışmada, insanlar tarafından yiyecek veya içecek olarak tüketildiği gibi çeşitli hastalıkların tedavisinde de kullanılan adaçayı, arslanpençesi, civanperçemi, dereotu, ıhlamur, ısırgan, kekik, kereviz yaprağı, maydanoz, mercanköşk ve nane bitkilerinde bulunan antioksidan özelliğe sahip olan temel bileşiklerin ve bunların neden olduğu toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışma üç aşamadan oluşmaktadır. Spektrofotometrik olarak toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesinde Cu(II)-neocuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) reaktifinin kullanıldığı, maliyeti düşük, uygulanması basit olan ve kısa sürede gerçekleştirilen genel adı ‘bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasite tayini’ kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi kullanılmıştır. Antioksidan kapasiteye neden olan temel türlerin belirlenmesi ise yine antioksidan özelliğe sahip pek çok bileşiğin tanınmasında kullanılan HPLC (Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi) yönteminden yararlanılarak yapılmıştır. Bir bitki ekstraktında mevcut antioksidanların tümü belirlenirse, bunların derişimleri denel olarak saptanmış TEAC (troloks eşdeğeri antioksidan kapasite) katsayıları ile çarpılarak ve bu çarpımlar toplanarak ekstraktın kuramsal olarak beklenen toplam antioksidan kapasitesi hesaplanabilir. Eğer HPLC kromatogramından tüm antioksidanlar saptanmış ise bu yolla bulunan kapasite, denel olarak ölçülen antioksidan kapasite ile bağdaşmalıdır. Çalışılan bitki örneklerinin HPLC ile elde edilen kapasite değerleri; CUPRAC yöntemi ile belirlenen kapasite değerlerinin ısırgan ekstraktında % 82’lik; maydanozun farklı hidrolizatlarında % 60-77; nane ekstraktında % 63; mercanköşk ekstraktında % 61; kereviz yaprağının farklı hidrolizatlarında % 41-57’lik kısmına karşılık gelmektedir. Kromatogramlarda belirlenemeyen türlerin bu sonuca yol açtığı düşünülmektedir.

xiv

Çalışılan bitki örneklerinin ekstraktlarında CUPRAC yöntemi ile belirlenmiş olan toplam antioksidan kapasitesi sıralaması; arslanpençesi > kekik > ıhlamur > mercanköşk > adaçayı > nane > civanperçemi > kereviz yaprağı> dereotu > ısırgan > maydanoz şeklindedir.

xv

SUMMARY

SPECTROPHOTOMETRIC AND CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF ANTIOXIDANT CAPACITY IN SOME PLANT SAMPLES Excessive amounts of free radicals that are produced from various metabolic reactions in the organism and are highly reactive due to their unpaired electrons cause significant damage in tissues, organs and physiological systems. The organism has developed a great many defence mechanisms for restricting this damage, and the food-ingested C and E vitamins, selenium, β-carotene, lycopene, lutein and other carotenoids act as antioxidants aiding this defence. Flavonoids as secondary plant metabolites and terpenoids may be considered as additional defense elements. This signifies the importance for human health of the antioxidant-rich fruits and vegetables as well as of traditionally used medicinal plants also bearing these antioxidants. In recent years, studies focusing on therapeutic plants and the active principles isolated from them have intensified. In this study, it has been aimed to identify the essential compounds having antioxidant properties contained in a number of food and medicinal plants such as sage, lady’s mantle, yarrow, dill, linden, nettle, thyme, celery leaves, parsley, oregano and mint, and to determine the total antioxidant capacity caused by these compounds. The study consists of three parts. For determining total antioxidant capacity, the cupric ion reducing antioxidant capacity assay (abbreviated as the CUPRAC method) that is low cost, easily applied, and rapid, utilizing the copper(II)-neocuproine (2,9-dimethyl-1,10-phenanthroline) reagent was used, and the results were compared to those found by the ABTS/persulfate assay, the widely used method for antioxidant capacity measurement. For identification and individual quantitation of basic species giving rise to antioxidant capacity, the HPLC (High Performance Liquid Chromatography) method that has also found wide use in the identification of various antioxidant compounds was selected. If all the antioxidants in a plant extract are identified, then the theoretically expected total antioxidant capacity can be calculated by multiplying the concentration of each antioxidant with its TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) coefficient and summing up the described products. In case when all the antioxidants were successfully identified, from the HPLC chromatogram, then the so calculated theoretically expected capacity should be in accord with the experimentally found antioxidant capacity. The theoretically calculated-with the aid of HPLC-capacity values of the tested plant samples compensated for the experimentally found CUPRAC capacities at the following percentages: nettle extract 82 %, different hydrolyzates of parsley 60-77 %, mint extract 63 %, oregano extract 61 %, and different hydrolyzates of celery leaves 41-

xvi

57 %. It was thought that unestimated species in the chromatograms were responsible for this case. The order of plant samples with respect to CUPRAC total antioxidant capacity was: lady’s mantle > thyme > linden > oregano > sage > mint > yarrow > celery leaves > dill nettle > parsley.

1

1. GİRİŞ

İnsan sağlığı açısından büyük risk oluşturan başta kanser olmak üzere kalp ve damar

hastalıkları gibi pek çok hastalığın ortaya çıkma riskini azaltan veya olumlu etkiler

gösteren antioksidanlar, günümüzde oldukça ilgi çeken ve üzerinde pek çok araştırmalar

yapılan bir konudur [1-3].

Vücutta çeşitli metabolik reaksiyonlar sonucu oluşan ve bir veya daha fazla eşleşmemiş

elektronu olması sebebiyle oldukça reaktif olan serbest radikallerin aşırı miktarları

(reaktif oksijen türleri üretiminin, tüketiminden fazla olması ‘oksidatif stres’ olarak

adlandırılır) bir çok doku, organ ve sistemlerde hasarlara neden olur [4-6]. ROS (Reaktif

Oksijen Türleri) düzeylerini ve bunların meydana getirdiği hasarı sınırlandırmak için

vücutta birçok savunma mekanizması geliştirilmiştir. Süperoksit dismutaz, katalaz ve

glutatyon peroksidaz gibi enzimlerin serbest radikallere karşı savunmada önemli rolleri

vardır. C vitamini, E vitamini, selenyum, β-karoten, likopen, lutein ve diğer

karotenoidler de yardımcı antioksidanlar olarak kullanılmaktadır. Bunların haricinde

flavonoidler gibi ikincil bitki metabolitleri ve terpenoidler de sayılabilir [7,8]. Bu da

antioksidan bileşikler içeren meyve ve sebzelerin yanı sıra geleneksel olarak tıbbi

amaçla kullanılan ve şifalı bitkiler olarak bilinen bitki türlerinin insan sağlığı açısından

önemini ortaya koymaktadır.

Bu bitkiler, günümüzde tıbbın tamamlayıcısı olarak ya da alternatif tıpta oldukça geniş

kullanım alanı bulmaktadır. En önemli üstünlükleri, ucuz olmaları, kolaylıkla elde

edilebilmeleri ve ham olarak ya da basit preparatları halinde kullanılabilmeleridir. Şifalı

bitkilerin değişik kısımları (kökleri, yaprakları, dalları/gövdeleri, kabukları, çiçekleri ve

meyveleri) genellikle fenolik bileşikler (flavonoidler, fenolik asitler, stilbenler,

tanninler, kumarinler, lignanlar ve ligninler) bakımından zengindir. Bunlar antioksidan

aktivite de dahil olmak üzere pek çok biyolojik etkiye sahiptir [9].

2

İnsan sağlığı açısından önemli olan bu antioksidan bileşiklerin biyolojik sıvı, gıda ve saf

bileşiklerde antioksidan kapasitelerini ölçmek amacıyla birçok yöntem geliştirilmiştir

[10-30]. Bu çalışmada ise daha önce biyolojik bakımdan önemli indirgenler [31], sistein

[32], E vitamini [33], C vitamini [34] ve proteinlerin [35] spektrofotometrik tayini için

kullanılan, bakır(II)-neokuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) reaktifinin,

spektrofotometrik yolla bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesinin

belirlenmesine uyarlandığı maliyeti düşük, uygulanması basit ve kısa sürede

gerçekleştirilen [36] ve bazı bitkisel çay ve kayısı örneklerinde [37,38] ve insan

serumunda [39] uygulanmış genel adı ‘bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan kapasite

tayini’ kısaca CUPRAC yöntemi, karşılaştırma yöntemi olarak ise antioksidan

kapasitenin belirlenmesinde yaygın kullanımı olan ABTS/persülfat yöntemi [40]

kullanılmıştır.

HPLC ile çok sayıda antioksidan bileşenin mümkün olan en kısa sürede ayrılması ve

belirlenebilmesi için uygun sabit faz ve hareketli faz bileşimi öncelikle antioksidan

yapay örnekleri kullanılarak saptanmış ve her bir bileşen için ayrı kalibrasyon grafikleri

oluşturulduktan sonra bunlardan yararlanarak bitki örneklerindeki antioksidan

bileşiklerin kalitatif ve kantitatif değerlendirilmesi yapılmıştır.

Sonuç olarak HPLC yöntemi ile belirlenen antioksidan bileşenlerin derişimlerinin

troloks eşdeğeri antioksidan kapasite (TEAC) katsayıları (Bir antioksidanın TEAC

katsayısı, o antioksidanın 1 mM'lık çözeltisinin indirgeme gücü bakımından eşdeğer

olduğu troloks çözeltisinin mM derişimidir) ile çarpılması ile elde edilen toplam

antioksidan kapasite, CUPRAC ve ABTS/persülfat yöntemleri ile elde edilen toplam

antioksidan kapasite değerleri ile karşılaştırılmıştır.

3

2. GENEL KISIMLAR

2.1. SERBEST RADİKALLER VE ANTİOKSİDANLAR

Bir veya birden fazla eşleşmemiş elektronu bulunan atom ya da moleküllere serbest

radikaller denir. Bu tip maddeler, eşleşmemiş elektronu olması sebebiyle oldukça

reaktiftirler. Biyolojik sistemlerde serbest radikaller önemli role sahiptir. Serbest

radikaller herhangi bir etkileşime girerek elektron alırlar veya elektron verirler. Bu

nedenle, pozitif, negatif veya nötral olabilirler. Oksijen türevi serbest radikaller

proteinlere, yağlara, karbonhidratlara ve nükleik asitlere zarar verebilir. Plazma

membranları, serbest radikal reaksiyonlarının en önemli hedefidir.

Antioksidanlar ise radikal oluşumunun sınırlandırılması, radikal reaksiyonlarının sona

erdirilmesi, oluşan radikallerin etkisiz hale getirilmesi ve hasarlı moleküllerin ortadan

kaldırılmasından sorumlu moleküllerdir. Reaktif oksijen türlerinin üretimi ve çeşitli

antioksidan savunmaları arasındaki dengesizlik, antioksidanların yetersizliğinden

ve/veya reaktif oksijen türlerin artan oluşumundan çıkan oksidatif stresle sonuçlanır

[41].

Antioksidanlar, yiyecek veya vücutta düşük konsantrasyonlarda bulunduğu zaman,

oksidasyonu önemli derecede engelleyen veya geciktiren maddelerdir [42]. Gıda

üreticileri gıdaların bozunmasını önlemek ve gıdanın besin değerini korumak amacıyla

sentetik gıda koruyucu antioksidanları kullanırlar. Antioksidanlar, biokimyacıların ve

sağlık uzmanlarının ilgi konusudur, çünkü reaktif oksijen türlerinin ve dejeneratif

hastalıkların neden olduğu zararlara karşı vücudu korumaktadırlar.

Antioksidanların yağ moleküllerinin farklı oksidatif kademelerinde rol oynadığı

bilinmektedir. Antioksidanlar; oksijen derişimini azaltmada, singlet oksijeni

durdurmada, hidroksil radikali gibi başlatıcı radikalleri süpürerek birinci başlatıcı zinciri

engellemede, reaktif oksijen türlerinin üretim katalizleyicisi metal iyonlarını bağlamada,

4

radikal olmayan bileşiklerin temel ürünlerini bozundurmada ve substratlardan hidrojen

alınmasını önlemek amacıyla zincir kırmada görev alırlar.

Yağların yükseltgenme derecesi, yağ asidlerinin kimyasal yapısına bağlı olduğu kadar,

gıdaların saklanma koşulları ve reaksiyon ortamına da bağlıdır [43]. Besinlerde

otoksidasyon ve acılaşmanın oluşma prosesi; başlama, ilerleme ve sonlanma kademeleri

ile yürümektedir [44]. Başlama kademesinde radikal üretilir, ilerleme kademesinde

molekülden hidrojen atomu çıkışı ile radikal, doymamış yağ asidi ile reaksiyona girer.

Sonlanma reaksiyonuna kadar ilerleme kademesinde bir zincir reaksiyonu devam eder.

Başlama;

LH → L. (2.1)

İlerleme;

L. + O2 → LOO

. (2.2)

LOO. + LH → LOOH + L

. (2.3)

Sonlanma;

LOO. + LOO

. → Radikal olmayan ürünler (2.4)

LOO. + L


L. + L


Antioksidanlar (AH), yukarıdaki oluşumu aşağıda gösterilen reaksiyonlarla doymamış

yağlardan oluşan radikallere bir hidrojen atomu veya elektron vererek bozarlar.

LOO. + AH → LOOH + A

. (2.7)

5

A. + LOO


A. + A


Oksidan ve radikaller; triplet oksijen, su ve doymamış yağ moleküllerinden oluşan

oldukça reaktif türlerdir. Bundan dolayı, lipid peroksidasyonu sadece yenilebilen yağ ve

gıda endüstrisi için değil aynı zamanda insan sağlığı için de bir problemdir. Şekil 2.1’de

reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar

görülmektedir [45].

Şekil 2.1: Reaktif oksijen türlerinin çeşitli doku, organlarda neden olduğu hastalıklar ve hasarlar

2.2. DOĞAL ANTİOKSİDANLAR

2.2.1. C Vitamini

C vitamini (askorbik asit, askorbat) bitkilerde yaygın olarak bulunan, suda çözünen bir

vitamindir. Altı karbonlu lakton yapısına sahiptir [45]. Çoğu hayvanın karaciğer veya

böbreklerinde glikozdan, bitkilerde ise yaprak kısımlarında özellikle kloroplastlarında

[46] sentezlenir. İnsanlar bu vitamini vücutta sentezleyemezler [47]. Bundan dolayı bu

ihtiyaçlarını taze sebze ve meyvelerden karşılarlar [48]. Özellikle çilek, papaya,

portakal, kivi, greyfurt, kavun, mango gibi meyvelerde, brokoli, brüksel lahanası,

kırmızı veya yeşil biber, domates, lahana, patates, karnıbahar gibi sebzelerde, portakal

suyu, domates suyu gibi meyve sularında bol miktarda bulunmaktadır [45].

Reaktif oksijen türleri

Atheroskleroz İskemik; beyin,kalp

Diabet

Kanser

Bulaşıcı: sıtma,AIDS

Yaşlanma

İltihap

Kireçlenme

Şok

Soğuk kızarması

Parkinson Radyasyon Hasarı

6

C vitamini, reaktif oksijen (süperoksit, peroksil radikalleri, singlet oksijen, ozon),

reaktif azot (peroksinitrit, azot dioksit) ve reaktif klor (hipoklorik asit) türlerini kolayca

süpürür ve bu suretle diğer substratları oksidatif hasardan korur [49].

Hem askorbik asit hem de bunun bir elektron yükseltgenmiş hali olan askorbil radikali

düşük redüksiyon potansiyeline sahiptir [50]. Böylece ilgili radikal ve oksidanlarla

reaksiyona girebilir. Askorbil radikali, eşleşmemiş elektronun rezonans kararlılığı

nedeniyle düşük redüksiyon potansiyeli gösterir ve kolayca askorbat ve dehidroaskorbik

asite dönüşür [51]. Bununla birlikte, askorbik asit, hem askorbil radikalinden hem de

dehidroaskorbik asitten enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla kolaylıkla üretilir.

Bu özelliklerinden dolayı askorbik asit etkili bir antioksidandır [45].

Askorbat ( AH- ) Askorbil Radikali ( A.- )

Dihidroaskorbik Asit (DHA)

Şekil 2.2: Askorbik asitte meydana gelen redoks reaksiyonları

2.2.2. E Vitamini

E vitamini α-, β-, γ-, δ- tokoferolleri ve tokotrienolleri içeren grubu kapsamaktadır. α-

tokoferol, özellikle D-α-tokoferol, (Şekil 2.3) en yüksek biyolojik aktiviteye sahip

tokoferoldür [52,53]. E vitamini dokularda önemli zincir kırıcı bir antioksidandır ve

7

lipid peroksidasyonuna karşı savunma etkisinin olduğu, hücre membranlarını serbest

radikal saldırısına karşı koruduğu düşünülmektedir [54,55].

Yağca zengin bitkiler, E vitaminin temel doğal kaynaklarıdır. Tokotrienoller, palm

yağında ve pirinç kepeğinde yüksek miktarda, hindistan cevizi yağı, kakao yağı, soya

fasülyesi, arpa, buğday, kırmızı et ve yumurtada bulunmaktadır. Ayçiçeği, yer fıstığı,

ceviz, susam ve zeytin yağı ise sadece tokoferol içermektedir [56,57].

O

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3

Şekil 2.3: α-tokoferol’ün kimyasal yapısı

2.2.3. Karotenoidler

Doğal pigmentler olan karotenoidler bitkilerde ve çoğu mikroorganizmalarda

sentezlenir. Şimdiye kadar doğal kaynaklardan 600’ü aşkın karotenoid izole edilmiştir

[58]. Çoğu çiçek ve meyvelerin renkleri gibi birçok kuş, böcek ve deniz hayvanlarının

renklerinden de sorumludurlar. Karotenoidler, yağda çözünen poliizoprenoid

bileşiklerdir ve 2 ana gruba ayrılırlar.

(a): Karotenler veya sadece hidrojen ve karbon içeren hidrokarbon karotenoidler

(b): Hidroksi, keto, epoksi, metoksi veya karboksilik asit grubu gibi en az bir oksijen

grubu taşıyan oksijenlenmiş hidrokarbon türevleri olan ksantofiller [59].

Likopen, β-karoten ve α-karoten, karotenler olarak adlandırılan; β-kriptoksantin, lutein

ve zeaksantin, ksantofiller olarak adlandırılan karotenoid sınıfına örnek olarak

verilmektedir [45]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar, kimyasal, biyokimyasal ve

fiziksel özelliklerini etkiler [59].

8

β-karoten

Likopen

Lutein

Şekil 2.4: β-karoten, likopen ve lutein’in kimyasal yapıları

Bu farklı yapı polien zinciri boyunca etkili bir elektron delokalizasyonuna yol açar.

Likopende açık zincir veya asiklik polien yapısı görülürken, β-karoten molekülün her

iki ucunda β-iyonon halkasına sahip disiklik yapı göstermektedir [45].

Hidroksil grubu taşıyan karotenoidler (ksantofiller) doğada genellikle glikozidleri veya

uzun zincirli yağ asidleri ile esterleşmiş haliyle bulunurlar ve daha hidrofobik özellik

gösterirler [60]. Yapılarındaki konjuge çift bağlar sebebiyle yüksek antioksidan aktivite

gösterirler. Bu yapısal özellikleri, bazı molekülleri süpürme veya etkisiz hale getirmeye

olanak sağlar. Sonuç olarak, karotenoidler singlet oksijen türlerini giderme ve doğrudan

serbest radikalleri süpürme etkisine sahiptirler [61,62]. Konjuge çifte bağ sistemine

sahip karotenoidlerin bazı koşullar altında pro-oksidan (lipid ve benzeri substratların

oksidasyonunu hızlandırıcı) aktivite de gösterdiği düşünülmektedir [63]. β-karoten

fizyolojik koşullarda, düşük oksijen kısmi basıncı altında serbest radikalleri süpürme

özelliği gösterirken, yüksek oksijen basıncında ve özellikle yüksek derişimlerde pro-

oksidan etki göstermektedir [45].

9

2.2.4. Polifenolik Bileşikler

Polifenoller, fitokimyasalların en geniş sınıflarından biri olup bitki aleminde geniş çapta

yer almaktadırlar [45]. Polifenoller güçlü antioksidanlardır ve aktiviteleri kimyasal

yapılarına bağlıdır [19,64,65]. Bitki polifenolleri çok fonksiyonlu olup hidrojen atomu

verici, singlet oksijeni süpürücü ve indirgeyici olarak davranır [45]. Bazı polifenoller ise

antioksidan özelliklerini metal iyonlarını kelatlama özelliklerine borçludurlar [66].

Bir polifenolun antioksidan olarak tanımlanabilmesi için iki temel özelliğin sağlanması

gerekmektedir [45]. Bunlar,

a) Okside olabilen substratlara oranla düşük konsantrasyonlarda bulunduklarında,

otooksidasyonu veya serbest radikal merkezli oksidasyonu erteleyebilmeli,

geciktirebilmeli veya önleyebilmelidir.

b) Süpürme sonunda oluşan radikal, oksidasyon zincir reaksiyonunu kesmekte

kararlı olmalıdır.

Polifenolik antioksidanlar (PPH), peroksil radikaline (ROO.) hızlı bir şekilde hidrojen

atomu vererek denklem 2.10’da görüldüğü gibi onları alkil hidroperoksit (ROOH)

yapısına dönüştürerek lipid peroksidasyonunu inhibe eder.

ROO . + PPH → ROOH + PP . (2.10)

Oluşan polifenol fenoksil radikali bir başka hidrojen atomu vererek ve kinonların

oluşumu ile kararlı hale gelmekte veya başka fenoksil radikali gibi bir radikal ile

reaksiyona girerek yeni bir zincir reaksiyonu başlanmadan kesilmektedir.

Besin fenolikleri; flavonoidler, fenolik asitler, fenolik polimerler (tanenler) olmak üzere

üç sınıfa ayrılır.

2.2.4.1. Flavonoidler

Bitki fenollerinin en geniş sınıfını difenilpropan (C6C3C6) iskeletine sahip flavonoidler

oluşturmaktadır. Şu ana kadar bitkilerin yaprak, tohum, kabuk ve çiçek kısımlarında

4000’in üzerinde farklı yapıda flavonoid belirlenmiştir. Molekül yapısı; aromatik A

halkası yanında bulunan heterosiklik C halkası ve bu halkaya bağlı ikinci aromatik B

10

halkasından oluşmaktadır. Bu halkalara bağlanan çeşitli fenolik hidroksil grupları, bu

yapıların antioksidan aktivite göstermelerini sağlar. Farklı türdeki bitkilerde veya aynı

bitkinin değişik kısımlarında bulunan flavonoidlerin büyük yapısal farklılıkları vardır

[45].

Çoğu flavonoid doğada D-glikoz, L-ramnoz, glukoramnoz, galaktoz, lignin ve arabinoz

gibi şekerli bileşikleri (glikozidleri) şeklinde bulunur [67]. Bağırsaklarda

hidrolizlenerek biyolojik bakımdan aktif aglikonlara dönüşürler [68]. İnsan ve

hayvanlarda mide-bağırsak sisteminden emilirler veya değişmeden ya da metabolitleri

halinde idrar ve dışkı ile atılırlar. Lipid peroksidasyonunu inhibe eden flavonoidler

etkili antioksidan, serbest radikal süpürücü, metal kelatlayıcıdır [69].

Şekil 2.5: Flavonoidlerin genel yapısı

Flavonoidler; antosiyaninler ve antoksantinler şeklinde sınıflandırılır. Antoksantinler ise

renksiz veya beyazdan sarıya dönük renkte olurlar ve flavonol, flavanol, flavon,

flavanon ve izoflavonlar olarak sınıflandırılırlar. Antosiyaninler, antosiyanidinlerin

glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı, mavi ve mor renkleri veren, suda

çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır [45]. Flavanonlar ve flavonlar çoğunlukla

birlikte bulunur ve belirli enzimlerle bağlıdırlar. Çoğu bitki familyasında, flavonlar ve

flavonoller arasında karşılıklı bir dışlama vardır ve flavanonca zengin bitkilerde

antosiyaninler neredeyse hiç yoktur [70].

11

Flavonol Flavon Flavanon

Flavanol İzoflavon Antosiyanidin

Şekil 2.6 : Flavonol, flavon, flavanon, flavanol, izoflavon ve antosiyanidin’in kimyasal yapıları

Flavonoidlerin en yaygın sınıfı flavonollerdir ve en önemli bileşikleri kuersetin,

kuersetin glikoziti rutin, kamferol, mirisetin, izoramnetindir. Kuersetin bitkilerin en

temel flavonollerindendir ve soğan, elma, lahana ve çayda yüksek miktarda

bulunmaktadır.

Kuersetin Rutin İzokuersitrin

Kamferol Mirisetin İzoramnetin

Şekil 2.7: Kuersetin, rutin, izokuersitrin, kamferol, mirisetin ve izoramnetin’in kimyasal yapıları

12

Flavon sınıfına ait temel bileşikler apigenin, luteolin ve krisindir. Maydanoz, kereviz ve

zeytinde bol miktarda bulunmaktadırlar.

Apigenin Luteolin Krisin

Şekil 2.8: Apigenin, luteolin ve krisin’in kimyasal yapıları

Flavanoller ise flavonların indirgenmiş türevleridir. En önemlileri kateşin ve epikateşin’

dir. Kateşin ve epikateşinin gallik asitle kombinasyonları sonucu kateşin ve epikateşin

gallatlar meydana gelir. Bu bileşikler çoğunlukla yeşil çay, kırmızı şarap, şeftalide fazla

miktarda, ayrıca beyaz şarap ve elmada bulunurlar.

Kateşin Epikateşin Epigallokateşin

Epikateşin gallat Epigallokateşin gallat

Şekil 2.9: Kateşin, epikateşin, epigallokateşin, epikateşin gallat ve epigallokateşin gallat’ın kimyasal yapıları

13

Flavonların dihidro türevleri ise flavanonlardır. En önemlileri eriodiktol, naringenin,

naringin, hesperidin ve hesperetin’dir. Naringin naringenin’in, hesperidin hesperetin’in

glikozitidir. Greyfurt ve portakalda bol miktarda bulunurlar.

Naringin Naringenin Eriodiktol

Hesperidin Hesperetin

Şekil 2.10: Naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin ve eriodiktol’ün kimyasal yapıları

Flavonların izomeri olan izoflavonların en bilinen bileşikleri genistein ve daidzein olup

baklagil ve soya fasülyesinde fazla miktarda bulunmaktadırlar.

Daidzein Genistein

Şekil 2.11: Daidzein ve genistein’in kimyasal yapıları

Antosiyaninler, antosiyanidinlerin glikozidleri olup çiçeklere ve meyvelere kırmızı,

mavi ve mor renkleri veren, suda çözülebilen en önemli bitki pigment sınıfıdır. En

önemlileri; apigenidin, siyanidin, malvidin ve delfinidin’dir.

14

Siyanidin Malvidin

Apigenidin Delfinidin

Şekil 2.12: Siyanidin, malvidin, apigenidin ve delfinidin’in kimyasal yapıları

Flavonoid sınıfına ait bileşiklerin sübstitüsyon konumları ve yaygın olarak bulundukları

besin kaynakları Tablo 2.1’de [71] özetlenmiştir.

15

Tablo 2.1: Flavonoid sınıflarına ait bileşikler, sübstitüsyon konumları ve besin kaynakları

Aşağıdaki özelliklerden bir ya da daha fazlasına sahip yapıda olan flavonoidler oldukça

yüksek antioksidan etki gösterirler [19].

a) Radikal formun daha yüksek kararlılığını sağlayan ve elektron

delokalizasyonuna katılan, B halkasındaki o-dihidroksi yapısı (aynı zamanda bu

yapıdan kararlı 3’,4’-dikinonlar oluşur)

b) 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağ, C halkasının 4. karbon atomunda

keto grubunun oluşmasını sağlar ve bu da B halkasında radikalin elektron

delokalizasyonunu artırır. Antioksidan güç, aromatik çekirdeğin elektron

delokalizasyonuna bağlıdır. Bu bileşikler serbest radikallerle reaksiyona

SINIFI ADI SÜBSTİTÜSYON

KONUMLARI BESİN KAYNAKLARI

Flavanol

(+)-Kateşin (-)-Epikateşin Epigallokateşin gallat

3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH,3-gallat

Çay Çay Çay

Flavon Krisin Apigenin Luteolin

5,7-OH 5,7,4’-OH 5,7,3’,4’-OH

Meyve kabuğu Maydonoz, kereviz Kırmızı biber

Flavonol

Kamferol Kuersetin Mirisetin Rutin

3,5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,7,3’,4’,5’-OH 5,7,3’,4’-OH, 3-rutinoz

Pırasa, brokoli, hindiba, greyfurt, siyah çay Soğan, marul,brokoli, , çay, k.şarap, mor meyveler, zeytinyağı, elma kabuğu Yabanmersini,üzüm,k. şarap K.şarap, kara buğday, domates kabuğu, turunçgiller

Flavanon

Naringin Naringenin Taksifolin Hesperidin Eriodiktol

5,4’-OH, 7-ramnoglukoz 5,7,4’-OH 3,5,7,3’,4’-OH 3,5,3’-OH,4’-OMe,7-rutinoz 5,7,3’,4’-OH

Turunçgiller, greyfurt Turunçgiller Turunçgiller Portakal Limon

İzoflavon

Genistin Genistein Daidzin Daidzein

5,4’-OH,7-glukoz 5,7,4’-OH 4’-OH, 7-glukoz 7,4’-OH

Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi Soya fasulyesi

Antosiyanidin

Apigenidin Siyanidin

5,7,4’-OH 3,5,7,4’-OH,3,5-OMe

Renkli meyveler Kiraz, ahududu, çilek

16

girdiğinde üretilen fenoksil radikalleri aromatik çekirdeğin rezonans etkisiyle

kararlı hale getirilir. 2,3-çifte bağı, tüm moleküldeki rezonansı arttırır.

c) C halkasının 4. karbon atomunda keto grubu ile beraber C ve A halkalarındaki 3.

ve 5. pozisyondaki hidroksil grupları maksimum radikal-süpürme potansiyeli

için gereklidir. Aynı zamanda 5-hidroksi-4-keto grubu güçlü bir metal

kelatlayıcı olarak da antioksidan etkinliğe katkıda bulunur.

Lipid peroksidasyonu inhibisyonunda flavonoidlerin yapı-aktivite ilişkisi incelendiğinde

[69];

a) C halkasındaki 3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubunun varlığı;

Bu yapıya sahip fisetin, (+)-kateşin (Şekil 2.9), kuersetin, mirisetin (Şekil 2.7) ve

morin lipid peroksidasyonunu, C-3. karbon atomu üzerinde hidroksil grubu

taşımayan diosmetin, apigenin (Şekil 2.8), hesperetin ve naringenine (Şekil 2.10)

göre daha kuvvetli inhibe eder.

b) C halkasındaki 2. ve 3. karbon atomları arasındaki çifte bağın varlığı;

Bu bağın hidrojenlenmesi antiperoksidatif etkiyi azaltır.

c) Hidroksil gruplarının sayısı;

A ve B halkalarında polihidroksillenmiş yapıların önemi, kuersetin, mirisetin,

mirisetrin, filoretin, (+)-kateşin, morin ve fisetinin, apigenin, hesperetin,

hesperidin, naringenin, naringin, krisin ve 3-hidroksiflavona göre

karşılaştırılmasıyla belirlenmeye çalışılmıştır. İlk gruptakiler 4-6 arasında, ikinci

gruptakiler 1-3 arasında hidroksil taşıyan flavonoidlerdir. Flavonoidlerin

hidroksil radikali süpürme aktivitesi, B halkasındaki hidroksil grupları sayısıyla

(özellikle C-3’ konumunda) artar ve hidroksil grupları sayısının azalmasıyla hızlı

bir şekilde azalır. Mirisetinin (Şekil 2.7) (Hidroksil konumları: 3,5,7,3’,4’,5’)

hidroksil radikali süpürme aktivitesi kamferolden (Hidroksil konumları: 3,5,7,4’)

daha kuvvetlidir.

d) Hidroksil konumları;

A halkasındaki C-5 ve C-7, B halkasındaki C-3’ ve C-4’ ve C halkasındaki C-3

konumundaki hidroksil gruplarının varlığı lipid peroksidasyonun inhibisyonuna

katkıda bulunur. Flavonoller, antiperoksidatif aktivite için C-2’ konumunda bir

hidroksil grubu ve pirogallol grubuna (C-3’, C-4’, C-5’) gereksinim duyarlar.

17

e) Şeker yapısının varlığı;

Genelde flavonoid glikozidler, tekabül eden aglikon türlerinden daha az

antioksidan aktiftir. Malondialdehit üretiminin inhibisyonunda apigenin,

naringenin, hesperetin, diosmetin, kuersetin, filoretin ve mirisetin karşılık gelen

glikozidlerine göre daha etkilidir. Şeker yapısı, sterik engellemeden ötürü çok

bitişik konumda bulunan hidroksil gruplarının antiperoksidasyon verimini

azaltır.

f) Metoksi gruplarının varlığı;

Sterik engellemeden dolayı flavonoidlerin antiperoksidatif verimini azaltır.

Ancak aynı sayıda hidroksil grubu içeren flavonoidlerde –OH’e göre orto- ve

para- konumundaki –OMe grupları, elektron desteğiyle aril oksi radikallerini

stabilize edeceğinden sonuçta antioksidan aktiviteyi arttırırlar.

g) Rutin ve kuersetin gibi (Şekil 2.7) C-4 konumunda karbonil grubu ve C-3 veya

C-5 konumunda hidroksil grubu taşıyan flavonoidler, demir iyonlarıyla kelat

oluşturur. Flavanoidler demir iyonlarıyla kompleks oluşturduktan sonra da

serbest radikal süpürme aktivitelerini yitirmezler.

2.2.4.2. Fenolik Asitler

Fenolik asitler hidroksi benzoik asit ve hidroksi sinnamik asit olarak adlandırılan farklı

iki sınıftan oluşmaktadır [45]. Fenolik asitlerin ve esterlerinin antioksidan aktiviteleri,

sterik engelleme ile güçlenen moleküldeki hidroksil gruplarının sayısına bağlıdır [72].

Benzoik asidlerde karboksilat grubunun elektron-çekme özelliği, hidroksi benzoatların

hidrojen atomu verme yeteneklerine negatif etki yapar. Hidroksi sinnamik asitler

eşdeğer benzoatlarından daha etkilidirler [19].

Hidroksi sinnamik asitler, (fenilpropanoidler), bitkilerin fenolik metabolizmasında

temel rol oynayan ve fenil alaninden biyosentetik olarak türeyen fenolik bileşiklerdir

[73,74]. Bitkilerin hücre duvarı yapısına katılırlar ve flavonoidlerin biyosentetik

öncüsüdürler [74]. Genellikle bu tür fenolik asitler, bitkilerde şeker, organik asit veya

yağlarla birleşmiş veya esterleri halinde bulunurlar ve aralarında etkili bir dönüşüm

görülmektedir [75] (Şekil 2.13). Meyve, sebze, çiçek, tohum ve şarap, çay, kahve,

zeytin yağı gibi bitki türevli ürünlerde bulunmaktadırlar [44,76]. Kafeik asit, onun

kuinik ester türevi klorojenik asit, p-kumarik asit bitkilerde en fazla bulunan hidroksi

sinnamik asitlerdir. Klorojenik asidin, kafeik asidin depolanmış türü olduğu

18

düşünülmektedir, çünkü klorojenik asidin biyosentezi sırasında kuinik asit çiftinin

kafeik kısma olan dönüşümü tersinirdir [77,78]. İki aromatik halkada ikişer tane

hidroksil grubu taşıyan, rozmarinik asit ise kafeik asit ve 3,4-dihidroksifenillaktik asitin

esteridir. Hidroksi sinnamik asidler, doğada trans- konumunda olduklarında daha

kararlıdırlar ama ultraviyole ve görünür ışığa maruz kaldıklarında, yavaş yavaş cis-

konumuna izomerize olurlar [79].

Tirozin

Klorojenik Asit

Şekil 2.13: Hidroksi sinnamik asitlerin yapıları ve biyosentetik ilişkileri

Şekil 2.14: Rozmarinik asit’in kimyasal yapısı

Fenil Alanin Sinnamik Asit p-kumarik Asit Kafeik Asit Ferulik Asit Sinapik Asit

19

Hidroksi Benzoik Asitler, monohidroksi benzoik asidler, orto ve para konumlarında

antioksidan aktivite göstermezken, m-hidroksi asit TEAC katsayısı = 0.84 mM aktivite

gösterir. Fenolik halka ile karboksilat grubu arasına metilen grubu girmesiyle oluşan

fenil asetik asitlerde orto ve meta hidroksi türevleri TEAC katsayısı = 1 mM’a yakın

antioksidan aktivite gösterirken, p-hidroksi fenil asetik asidin aktivitesinde küçük bir

artış olur. Dihidroksi benzoik asit türevlerinin antioksidan aktiviteleri hidroksil

gruplarının pozisyonlarına bağlı olup, o- ve m- pozisyonlarında aktivite yüksek olurken

(2,3-dihidroksi benzoik asit gibi), m-p pozisyonlarına sahip olanlarda (3,4-dihidroksi

benzoik asit-protokateşik asit gibi) aktivite düşer. Gallik asit, üç hidroksil grubuna sahip

olmasından dolayı en fazla aktivite gösteren hidroksi benzoik asittir. Ancak karboksilat

grubu esterlendiğinde aktivite düşer [19].

Gallik Asit Protokateşik Asit Vanilik Asit

Şekil 2.15: Gallik, protokateşik, vanilik asit’in kimyasal yapıları

2.2.4.3. Fenolik Polimerler (Tanenler)

Polimerik yapıdaki yüksek molekül tartısına sahip tanenler kondanse ve

hidrolizlenebilir olmak üzere iki alt sınıfa ayrılır [80]. Kondanse tanenler polimerik

flavonoidlerdir [81]. Hidrolizlenebilir tanenler, gallik asit ve benzer bileşiklerin

karbonhidratlara esterlenmiş yapılarıdır [80]. Bu bileşikler çay, kırmızı şarap, meyve,

baklagil ve tahıllarda bol miktarda bulunmaktadırlar [45].

20

Şekil 2.16: Fenolik polimerin kimyasal yapısı

2.3. ÇALIŞILAN BİTKİLERİN SAĞLIK ÜZERİNDEKİ ŞİFALI ETKİLERİ VE

ETKEN BİLEŞİKLERİ

2.3.1. Civanperçemi ( Achillea millefolium )

Antienflamatuar1, antispazmodik2, etkilidir. Damar hastalıkları, safra ve idrar söktürücü,

hemoroid, safra salgısı yetersizliği ve romatizmada etkilidir. Özellikle sikatrizan3 olarak

kullanılır. Etken bileşikleri; azulen taşıyan uçucu yağ, flavonlar (apigenin ve luteolin

türevleri), seskiterpen laktonlardır.

2.3.2. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )

Tanenlerden dolayı astrenjandır4. Kanama ve ishale karşı yara iyileştirici etkisi

bulunmaktadır. Bazı bitkisel ilaçların bileşimine girerek kadın hastalıklarında

kanamalara ve alt batının zayıflığına karşı, ayrıca böbrek ve idrar yollarındaki taş

düşürücü olarak kullanılır. Etken bileşikleri; tanen (% 6-8 gallotanenler) ve flavonoidler

(kuersetin-3-O-β-D-glukuronit)’dir.

1 İltihap giderici madde 2 Spazmları dindirmek için kullanılan madde 3 Yaraların iyileşmesini kolaylaştıran madde 4 Kan durdurucu

21

2.3.3. Dereotu ( Anethum graveolens )

Aromatik, antispazmodik, galaktagog5 ve bakteriostatik6 etkilidir. Koliklerde7 (özellikle

bebeklerde), öksürük, soğuk algınlığı ve gripte yararlıdır. Antispazmodiklerle (örneğin

Viburnum opulus- gilaburu) kullanılırsa ağrı dindirir. Emziren annelerde sütü arttırır.

İştahsızlıklarda, ağız yaralarında ve mide bulantılarında kullanılır. Etken bileşikleri;

meyvalarda %5 uçucu yağ (% 43-63 karvon ayrıca limonen), sabit yağ, flavonoid,

kumarin, ksanton, tanen, reçine, triterpen ve glikanlardır.

2.3.4. Kereviz ( Apium graveolens )

İdrar yolları temizleyicisi, kan sulandırıcı, romatizmal hastalıklar, zayıflama kürleri

sonunda oluşan sinirlilik hallerinde rahatlatıcı etki gösterir. İdrar söktürücü, adet

düzenleyici, salgı organları düzenleyicisi, zayıflama kürlerinde sinirsel bozukluğu

giderici olarak, ayrıca iştahsızlık ve bitkinliklerde kullanılır. Etken bileşikleri; meyvalar

% 2-3 uçucu yağ, selerin, furanokumarin, furanokumarin glikozit, apigravin, selereoin,

apiumosit gibi kumarin bileşikleri, luteolin-7-O-apiosilglikozit ile krisoeriyol, apigenin

ve izokuersitrin gibi flavonlar taşımaktadır. Uçucu yağ başlıca %6 limonen, %10

selinen ve p-simen, β-terpineol, α-santalol, dihidrokarvon içermektedir. Kökler, % 0.3-

0.7 arasında uçucu yağ (p-apiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), % 1.6 kadar flavon

(başlıca apiin) ve furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butiftalid

benzeri ftalitler ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri

taşımaktadır.

2.3.5. Nane ( Mentha piperita )

Yapraklar taşıdığı uçucu yağdaki mentolden dolayı antibakteriyel, spazmolitik,

kolagog8 etkilidir. Antispazmodik etki özellikle mide-bağırsak sistemi üzerinde

belirgindir. Mide bulantısına karşı ve diğer mide şikayetleri, akut ve kronik gastrit9 ve

enteritte10 etkilidir. Uçucu yağ mide-bağırsak kaslarına spazmolitik etkilidir. Bronşları

yumuşatıcı etki de göstermektedir. Cilde ve mukozaya sürüldüğünde serinlik-ferahlık

5 Süt salgılanmasına yardımcı madde 6 Bakterileri öldürmeden çoğalmasını engelleyen madde 7 Bir kasılmadan dolayı ileri gelen her çeşit karın ağrısı 8 Safra kesesinde ve safra yollarında bulunan safranın onikiparmak bağırsağına akmasını kolaylaştıran madde 9 Mide mukozasının iltihaplanması 10 Bağırsak mukozasının iltihaplanması

22

hissi uyandırır. Dahilen mide spazmlarında, mide bulantısını engelleme, ayrıca soğuk

algınlığında üst solunum yolları antiseptiği11 olarak kullanılır. Etken bileşikleri;

yapraklar % 0.8-4 oranında uçucu yağ ile flavonlar, rozmarinik asit, kafeik ve

klorojenik asit ve triterpenik maddeler taşımaktadır. Uçucu yağ: % 45-50 mentol, % 5-

20 mentol esterleri (mentil asetat ve mentil izovalerat) ile daha az miktarlarda menton,

mentofuran ökaliptol, (-) limonen ve (-) β-karyofillen içermektedir.

2.3.6. Mercanköşk ( Origanum sp. )

Uçucu yağların bileşimindeki fenolik maddeler timol ve izomeri karvakrolün salgı

arttırıcı, bronş spazmını çözücü ve antimikrobiyal etkileri nedeniyle, soğuk algınlığı

öksürüklerinin tedavisinde kullanılır. Düz kaslar üzerine gevşetici etkileri vardır. Uçucu

yağlar cilde sürüldüğünde kızartıcı, yakıcı etki göstermektedir. Soğukalgınlığı

şikayetlerinde, iştahsızlık, hazımsızlık hallerinde kullanılmaktadır. Halk arasında şeker

hastalığına karşı da kullanılmaktaysa da bu etkisi henüz araştırma aşamasındadır. Etken

bileşikleri; türlere ve toplanma yerlerine göre miktarları değişen uçucu yağ, flavonlar,

başta ursolik asit ve oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve Labiatae

tanenleri taşırlar.

2.3.7. Maydanoz ( Petroselinum crispum )

Kuvvetli idrar söktürücüdür, tahriş edici etkisi de vardır. Apiol ve miristisinden dolayı

spazmolitik ve rahim düzenleyicidir. İdrar yolları antiseptiği, ayrıca halk arasında adet

bozukluklarında, safra söktürücü olarak ve haricen saç diplerine de kullanılmaktadır.

Etken bileşikleri; tohumlar % 1-6 uçucu yağ taşır, uçucu yağın başlıca maddeleri fenil

propan türevi olan p-apiol, miristisin ve 1-allil 2,3,4,5-tetrametoksibenzol, ayrıca α- ve

β-pinen, limonen, β-felladrendir. Tohumlar % 25 kadar sabit yağ, flavonlar (apiin ve

benzeri) ve bazı furanokumarinler de içermektedir. Kökler, % 0.3-0.7 arasında uçucu

yağ (p-apiol, miristisin, limonen, terpinolen vb.), flavonlar (başlıca apigenin) ve

furanokumarinler (bergapten, imperatorin vb.), ligustilid ve butilftalid benzeri ftalitler

ile poliasetilen türevi falkarinonol, falkarinol adlı bileşikleri taşımaktadır.

11 Vücut içinde yada dışında, özellikle sindirim borusunda bulunan mikropları yok edebilen ya da onlara karşı koruyan madde

23

2.3.8. Adaçayı ( Salvia triloba )

Ağız ve boğaz mukazasında antiflojistik12 etkilidir, gargara olarak kullanılır. Soğuk

algınlığı ve mide bulantısı şikayetlerinde etkilidir. Etken bileşikleri; yapraklar % 2-3

uçucu yağ, % 5 rozmarinik asit, tanen bileşikleri, flavonlar (salvigenin, luteolin,

hispiludin) ile karnosol gibi diterpenler ve ursolik asit ve benzeri triterpenler içerir.

Uçucu yağ, % 60-64 civarında ökaliptol (1,8-sineol), % 8.2 kafur ve % 5’in altında

tuyon türevleri taşımaktadır.

2.3.9. Kekik ( Thymus sp. )

İştah açıcı, hazım kolaylaştırıcı etkileri bulunmaktadır. Solunum yolları

enfeksiyonlarında, soğuk algınlığında, kuru ve balgamlı öksürüklerde çay veya

ekstrelerinden hazırlanmış bitkisel ilaçlardan yararlanılmaktadır. Etken bileşikleri; tıbbi

amaçla kullanılacakların % 0.6-2.5 oranında uçucu yağ taşıdıkları, bu uçucu yağın da en

az % 20 (timol-karvakrol) fenolik madde içermesi gerektiği kayıtlıdır. Drogda ayrıca

flavonoid bileşikler ve başta ursolik, oleanolik asit olmak üzere triterpenik maddeler ve

Labiatae tanenleri bulunmaktadır.

2.3.10. Ihlamur ( Tilia sp. )

Solunum yolları yumuşatıcısı, gıcık kesici ve ateşli soğuk algınlığı rahatsızlıklarında

kullanılır. Fenil etil alkol esterleri sedatif etkilidir. Uçucu yağ ve flavonoidleri nedeniyle

antispazmodik ve idrar söktürücü etkisi vardır. Etken bileşikleri; flavonlar, özellikle

kamferol ve kuersetin türevleri, % 2 civarında tanen ve lökoantosiyanidin, % 0.02-0.1

oranında uçucu yağ taşımaktadır. Uçucu yağın bileşiminde eikozan, trikozan gibi

hidrokarbürler yanında eser miktarda linalol, geraniol gibi monoterpenik bileşikler ile

fenil etil alkol ve esterleri (etil ve benzoil esterleri) yer almaktadır.

2.3.11. Isırgan ( Urtica sp. )

Topraküstü kısımları idrar söktürücü, kökler miksiyon13 bozukluklarında etkilidir.

Topraküstü kısımlar, dahilen idrar yolları iltihapları, haricen romatizma; kökler prostat

adenomlarının14 I ve II kademelerindeki miksiyon bozukluklarında kullanılır. Etken

bileşikleri; topraküstü kısımlarında özellikle kalsiyum, potasyum ve silisik asit tuzları,

12 İltihaplarla savaşan madde 13 İdrara çıkma 14 Bir salgı bezinde gelişen tehlikesiz epitelyum uru

24

yaprak tüylerinde histamin ve serotonin gibi biyojenik aminler ve köklerde serbest ve

glikozidik β-sitosterol ve skopoletin içermektedir [82].

Kekik Ihlamur

Isırgan Nane

Şekil 2.17: Kekik, ıhlamur, ısırgan ve nane bitkilerinin resimleri

25

Civanperçemi Mercanköşk

Dereotu Adaçayı

Şekil 2.18: Civanperçemi, mercanköşk, dereotu ve adaçayı bitkilerinin resimleri

26

2.4. TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİN YÖNTEMLERİ

2.4.1. CUPRAC (Cupric Reducing Antioxidant Capacity; Cu(II) İyonu İndirgeme

Antioksidan Kapasite) Yöntemi

Apak ve arkadaşlarının [36] geliştirdiği bu yöntemde, 2,9-dimetil-1,10-fenantrolin

(Neocuproin-Nc)’in Cu(II) ile oluşturduğu bakır(II)-neokuproin kompleksinin (Cu(II)-

Nc), 450 nm’ de maksimum absorbans veren bakır(I)-neokuproin [Cu(I)-Nc] kelatına

indirgenme yeteneğinden yararlanarak antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Bu

özellikten yola çıkarak geliştirilen antioksidan kapasite yöntemine ‘bakır(II) iyonu

indirgeme antioksidan kapasite yöntemi’ denilmiştir ve kısaca CUPRAC metodu olarak

adlandırılmıştır.

Yöntem; sulu Cu(II) klorür çözeltisi, alkolde hazırlanmış neokuproin çözeltisi ve sulu

amonyum asetat (pH 7 tamponu) çözeltilerinin karıştırılmasından sonra, üzerine tayin

edilecek herhangi bir antioksidan çözeltisinin ilave edilmesi ve bunu takip eden 30

dakika sonunda, içerisinde antioksidan bulunmayan referansa karşı 450 nm’de

absorbanslarının ölçülmesinden ibarettir. Askorbik asit, gallik asit ve kuersetin için renk

oluşumu hızlı olurken naringin, naringenin gibi yavaş reaksiyona giren antioksidanlar

için 50 oC’de 20 dakika inkübasyon işlemi uygulanmaktadır. Flavonoid glikozidlerine

% 50 metanol içeren son çözeltide 1.2 M HCl ile hidroliz işlemi uygulanarak,

maksimum indirgeme güçlerini daha fazla gösterdikleri aglikon haline dönüşmeleri

sağlanarak yöntem uygulanmıştır.

n Cu(Nc)2

2+ + Ar(OH)n n Cu(Nc)2

+ + Ar(=O)n + n H

+ (2.11)

Yöntem hem hidrofilik hem de lipofilik antioksidanlara uygulanabilir.

2.4.2. TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity; Troloks Eşdeğeri

Antioksidan Kapasitesi) / ABTS Yöntemi

Troloks eşdeğeri antioksidan kapasitesi olarak ifade edilen TEAC/ABTS yöntemi, ilk

olarak Miller ve arkadaşları [10,20] tarafından geliştirilmiştir. Bu yöntem; 2,2’-

azinobis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat) (ABTS) kromojen radikal katyonunun

absorbansının, antioksidanlar tarafından inhibisyonunu temel alır. Antioksidanlar

varlığında ABTS.+ radikal katyonunun (Şekil 2.19) absorbansında belirli bir süre

içindeki azalmadan yararlanarak toplam antioksidan kapasitesi troloks cinsinden

27

bulunur. Bu nedenle bu yönteme “troloks eşdeğeri antioksidan kapasite

yöntemi”(ABTS/TEAC) adı da verilir.

Şekil 2.19: ABTS.+ radikal katyonunun yapısı

660, 734 ve 820 nm’de maksimum veren ABTS.+ radikal katyonu metmiyoglobinin

H2O2 ile aktivasyonu ile üretilen ferrilmiyoglobin radikal türlerinin ABTS ile

etkileşiminden meydana gelmektedir.

ABTS .+ katyon radikalini oluşturmak için, ABTS; myoglobin ve H2O2 ile inkübe edilir

[83].

HX-Feııı + H2O2 X-[Feıv (O] + H2O (2.12)

ABTS + X-[Feıv(O] ABTS .+ + HX-Feııı (2.13)

(HX-Feııı = myoglobin; X-[ FeIV(O] =ferrilmyoglobin)

Orijinal TEAC denemesinin bağıl standart sapma değerleri, gün içi denemeler için %

0.54 - 1.59, günler arası denemeler için % 3.6 - 6.1 olarak bulunmuştur [20].

Şekil 2.20: ABTS.+ radikal katyonunun absorbsiyon spektrumu

28

Re ve arkadaşları [40] tarafından modifiye edilmiş ve geliştirilmiş TEAC yönteminde

potasyum persülfatla ABTS’in oksidasyonu sonucu üretilen ABTS.+ radikal katyonları

kullanılır. Üretilen bu ABTS radikalleri oda sıcaklığında karanlıkta beklediği zaman 2

gün kararlıdır. Geliştirilen bu yöntem, hem lipofilik hem de hidrofilik sistemlerde

kullanılabilmektedir.

2.4.3. FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power; Demir(III) İyonu İndirgeyici

Antioksidan Gücü) Yöntemi

Benzie ve Strain tarafından geliştirilen bu yöntemde [22] demir(III)’in indirgenme

kapasitesi yoluyla antioksidanların toplam miktar tayini yapılmaktadır. Düşük pH larda

oluşan Fe(III) ’ün, kısa adı TPTZ olan tripiridiltriazin ile reaksiyonu sonucu oluşan

[Fe(III)-TPTZ] kompleksi antioksidanların etkisiyle Fe(II)-tripiridiltriazin [Fe(II)-

TPTZ] kompleksine indirgenmektedir. Meydana gelen Fe(II)-TPTZ kompleksinin rengi

koyu mavidir ve 593 nm’de maksimum absorbans vermektedir.

2.4.4. Folin Ciocalteu Yöntemi

Bu yöntem Singleton ve arkadaşları [28,29] tarafından antioksidanların toplam fenolik

içeriğini ölçmek için geliştirilmiştir. Yöntemde kullanılan CuSO4 (bakır(II) sülfat) alkali

ortamda protein veya antioksidanla kompleks yapar. Folin fenol reaktifi (fosfo-

molibdik-fosfotungstik asit) eklendiğinde, folin reaktifi proteine bağlanır. Protein veya

antioksidanla Cu(II)’nin reaksiyonundan açığa çıkan Cu(I) olasılıkla molibdatotungstat

reaktifini heteropoli mavisine indirger ve rengi sarıdan maviye dönüşür. Reaksiyon

tamamlanınca 750 nm’de örnek absorbansları ölçülür.

Bu denemede, ard arda geri dönüşümlü bir veya iki elektron indirgeme reaksiyonları,

P(MoW11O40)4- olması muhtemel mavi türlerin oluşumunu sağlar. Esasen, molibdenin

kompleks içinde indirgenmesinin daha kolay olduğuna ve elektron-transfer

reaksiyonunun indirgenler ve Mo(VI) arasında gerçekleştiğine inanılır.

Mo(VI) + e- Mo(V) (2.14)

Fenolik bileşikler FCR (Folin Ciocalteu reaktifi) ile sadece bazik ortamlarda reaksiyon

verirler. (Sodyum karbonat çözeltisi ile pH 10’a ayarlanır). Fenolik protonun

29

dissosiasyonu, reaktifi indirgeme yeteneği bu nedenle artan fenolat anyonunun

oluşumunu sağlar.

2.4.5. TRAP (Total Radical Trapping Parameter ; Toplam Radikal Tutma

Parametresi) Yöntemi

Wayner ve arkadaşları [14] tarafından geliştirilen bu metodda; plazma ve diğer

biyolojik sıvılarda bulunan peroksitlenebilen maddelerden ve 2,2’-azobis (2-amido

propan) dihidroklorürden (AAPH) meydana gelen peroksil radikalleri kullanılır.

Plazmaya AAPH’ün ilavesinden sonra, yükseltgenebilen maddelerin oksidasyonu,

reaksiyon sırasında tüketilen oksijenin ölçülmesi ile belirlenir. Plazma içerisinde

bulunan antioksidanlar oksidasyon reaksiyonunun yavaş gerçekleşmesine sebep olur.

Reaksiyonun gecikme zamanı ölçülerek plazmadaki toplam antioksidan kapasitesi, iç

standart olarak kullanılan troloks eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır.

Wayner ve arkadaşları [82] peroksil radikalleri tarafından oksidasyon başlatılmadan

önce, plazma örneğine linoleik asit ilavesi yaparak yöntemi modifiye etmişlerdir. Bu

yöntemin dezavantajı, oksijen elektrodunun son noktasının tam olarak tespit

edilememesi ve oksijen elektrodunun gereken zaman dilimi içinde kararlılığını

koruyamamasıdır [20].

2.4.6 Luminol Yöntemi

Metsä-Ketelä ve arkadaşları tarafından 1991’de geliştirilen ve yayınlanan

kemiluminesans esaslı TRAP yöntemi daha sonra Alho ve Leinonen tarafından detaylı

şekilde ifade edilmiştir [26]. AAPH’dan üretilen peroksil radikallerinin luminolü

yükseltgemesi sonucu ışık yayan luminol radikalleri meydana gelmektedir. Yayılan ışık

luminometre cihazı ile ölçülür. Örnek içindeki antioksidanlar, kemiluminesans

ışımasının oluşumunu belli bir zaman için engeller. Gecikme zamanı bir örnekteki

toplam antioksidan potansiyeli ile doğrudan orantılıdır. Elde edilen sonuçlar troloks

eşdeğeri cinsinden hesaplanmaktadır.

Whitehead ve arkadaşları [11] 1992 yılında bu kemilüminesans yöntemini biyolojik

sıvılarda antioksidan kapasitenin ölçümü için geliştirmişlerdir. Geliştirilen bu yöntemde

luminol AAPH yerine, H2O2 veya perborat ile yükseltgenerek luminol radikallerini

30

oluşturur. Reaksiyonu daha hızlı gerçekleştirebilmek için katalizör olarak horseradish

peroksidaz kullanılmış ve böylece ışık yayılması daha çabuk olmuştur. Normal şartlar

altında bu reaksiyon, hızla azalan düşük şiddetli bir ışık yayılması olarak gerçekleşir.

Ortama p-iyodofenol ilave edildiği zaman ışık emisyonu daha şiddetli, uzun süreli ve

kararlı hale gelir. Işığın luminol radikalleri tarafından yayılması için ortamdaki bütün

antioksidanların tüketilmesi gerekmektedir.

2.4.7. Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) Yöntemi

TRAP yöntemini temel alan başka bir yöntem ise Valkonen ve Kuusi’ nin geliştirdiği

Diklorofloresin-diasetat (DCFH-DA) yöntemidir. Bu yöntemde AAPH peroksil

radikalini oluşturmak için, DCFH-DA ise yükseltgenebilen substrat olarak

kullanılmıştır. Peroksil radikali ile DCFH-DA arasındaki oksidasyon reaksiyonu

sonucu oluşan diklorofloresin (DCF) yüksek floresans özelliğine sahip olmaktadır. DCF

480 nm de uyarılıp 526 nm de emisyon yapmaktadır. 504 nm de maksimum

absorbsiyon göstermektedir. Bu bakımdan hem floresans yöntemi hem de

spektrofotometrik yöntem kullanılarak DCF miktarı ve buna bağlı olarak toplam

antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır.

Bu yöntemde toplam antioksidan kapasitesi iki kademede bulunmaktadır. İlk kademede

örnek içindeki antioksidanların kapasitesi gecikme zamanı cinsinden hesaplanmaktadır.

Sonra aynı örnek üzerine miktarı bilinen troloks çözeltisi ilave edilmektedir. Troloks

çözeltisi serbest radikaller tarafından tüketildikten sonra ikinci gecikme zamanı

hesaplanır. Bu iki gecikme zamanı arasındaki farktan yararlanarak troloks cinsinden

toplam antioksidan kapasitesi hesaplanmaktadır. Gecikme zamanlarının belirlenmesini

sağlayan TRAP esaslı bu yöntemin gün içi ve günler arası bağıl standart sapma

değerlerinin sırasıyla % 3.4 ve 4.6 olduğu ifade edilmiştir [23].

2.4.8. Fikoeritrin (PE) Esaslı Yöntemler

Ghiselli ve arkadaşları [13] tarafından 1994 yılında yayınlanan bu yöntem, peroksil

radikallerinin kullanıldığı ve 1990 yılında yayınlanan Glazer çalışmasının [16] temelde

bir benzeridir. Glazer, peroksil radikallerini oluşturmak için AAPH, hidroksil

radikallerini oluşturmak için Cu(II)-askorbat, yükseltgenebilir substrat olarak B- veya

R-PE kullanmıştır. B- veya R-PE substratının peroksil veya hidroksil radikalleri

31

varlığında gösterdiği floresansın zamanla lineer olarak azaldığı belirtilmiştir. B- veya

R-PE’nin peroksil veya hidroksil radikallerine karşı sağladığı gecikme zamanının

uzunluğu troloksun sağladığı gecikme zamanına oranlanarak örneğin antioksidan

kapasitesi troloks eşdeğeri cinsinden belirlenir. Ama, PE fluoresans sönümünün

kinetikleri, peroksil veya hidroksil radikalleri varlığında lineer değildir. Ayrıca analiz

edilen örnek, plazma veya serum olduğu zaman gecikme zamanını belirlemek genellikle

zordur [85].

Yeni bir yöntem olarak yayınlanan Ghiselli’ nin yönteminde Glazer’ ın geliştirmiş

olduğu yönteme atıf yapılmamıştır. Ayrıca yapılan çalışmada R-PE fluoresansının

yaklaşık % 80’ in söndürülmesine kadar R-PE fluoresansının zamanla lineer olarak

azaldığı belirtilmiştir. Ancak bu çalışma farklı kişiler tarafından tekrarlandığında aynı

sonuçlar alınamamıştır [12,21]. Ayrıca, yöntemin plazmanın toplam antioksidan

kapasitesini ölçmeye yönelik bir yöntem olduğu belirtilse de yöntemde, yapay plazma

örnekleri kullanılmıştır ve % 0.96 bağıl standart sapma değeri yapay serum örnekleri

için oldukça düşüktür [85].

2.4.9. Krosin Yöntemi

Tubaro ve arkadaşlarının geliştirdiği bu yöntemde kinetik parametreler karşılaştırılarak

plazma içindeki antioksidan kapasitesi ölçülmektedir. Bu yöntem; AAPH tarafından

oluşturulan peroksil radikallerinin krosini yükseltgemesi (rengini gidermesi) esasına

dayanmaktadır Krosinin peroksil radikalleri ile yükseltgenme reaksiyonunda

antioksidanların olmadığı durumdaki hızı (V0) ve antioksidanların olduğu durumdaki

hızı ise (V), 10 dakika içinde ölçülmektedir. Bu ölçülen hızların oranı (V0 / V) x

eksenini, antioksidan konsantrasyonunun [A] krosin konsantrasyonuna [C] oranı y

eksenini oluşturacak şekilde bir grafik oluşturulmaktadır. Oluşan bu lineer grafiğin

eğimi ka / kc oranını yani peroksil radikalleri ile etkileşen bileşiğin göreceli kapasitesini

belirtir. ka ; antioksidanlar ile peroksil radikalleri arasındaki reaksiyon hız sabiti, kc ;

krosin ile peroksil radikalleri arasındaki arasındaki reaksiyon hız sabitidir. Bulunan ka /

kc oranı, daha önceden troloks ile hesaplanan ka / kc oranına bölünerek sonuçlar troloks

cinsinden hesaplanmaktadır. Bu yöntemde iki antioksidanın peroksil radikalleriyle

etkileşimleri kıyaslanabilmektedir.

32

Gün içi denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin % 8’den az olduğunu belirten

Tubaro ve arkadaşları, bu kinetik yaklaşım sayesinde antioksidan koruma etkinliğinin

kesin olarak değerlendirilebileceğine inanmaktadırlar [27]. Ancak bu metod bir

antioksidanın diğer bir antioksidana karşı yarışma yeteneğini ölçmektedir. Ayrıca

kullanılan krosinin konsantrasyonu sabittir (10 µM) fakat analizlenecek olan bileşiğin

farklı konsantrasyonlarının kullanılması için farklı krosin konsantrasyonları

gerekmektedir. [85].

2.4.10. DPPH Yöntemi

Bu yöntem; antioksidanların kararlı bir organik azot radikali olan DPPH (1,1-difenil-2-

pikrilhidrazil) radikalini süpürücü etkilerini ölçmeye dayalı bir yöntemdir. Bu radikal

hidrojen donörlerle etkileştiğinde hidrazine indirgenir. Kırmızı renkli DPPH radikali

515 nm’de maksimum absorbsiyon verir. DPPH çözeltisine antioksidanın ilave

edilmesiyle absorbansta düşüş meydana gelir ve antioksidanların varlığıyla radikalin

rengi kırmızıdan sarıya döner. Bu yöntem antioksidanların radikal süpürme

kabiliyetlerini değerlendiren kolay ve geçerli bir yöntem olarak bilinmektedir [25].

Yöntem hızlı ve basittir. Ancak, bazı bileşenlerin (özellikle karotenoidler) 515 nm’ de

DPPH ile çakışık spektrum vermesi analizin yorumunu güçleştirir. Ayrıca çoğu

antioksidan sterik engellemeden dolayı DPPH ile yavaş reaksiyona girer. Bundan dolayı

yöntem; DPPH. ile reaksiyona giren antioksidanların antioksidan kapasitesi hakkında

doğru bir değerlendirme vermez. Bunlara ek olarak DPPH’ın rengi, ışık, hava oksijeni,

rutubet ve pH'a fazlaca duyarlı olduğundan tekrarlanabilir sonuçlar eldesi güçtür.

N

N.

NO2O2N

NO2

+ AH N

NH

NO2O2N

NO2

(2.15)

33

2.4.11. ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity; Oksijen Radikal Absorbans

Kapasitesi) Yöntemi

ORAC yöntemi [12,21,86]; büyük oranda Glazer [16] tarafından yayınlanan çalışmayı

esas alır. Peroksil radikalini oluşturmak için AAPH, hidroksil radikalini oluşturmak için

Cu(II) - H2O2 ve yükseltgenebilen protein substratı olarak fikoeritrin kullanılmaktadır.

Oluşturulan radikaller ile fikoeritrin arasındaki yükseltgenme reaksiyonu sonucunda,

fikoeritrinin floresansındaki zamana bağlı düşüş ölçülerek toplam antioksidan kapasitesi

hesaplanmaktadır. Serbest radikal etkisini inceleyen ve miktar tayininde eğri altında

kalan alan (area under curve-AUC) tekniğini kullanan bu yöntem, antioksidanların

serbest radikalleri hem inhibe etme yüzdesini ve hem de inhibe etme süresini tek bir

değer olarak ifade edebilen bir yöntemdir [85]. Net AUC, antioksidan miktarıyla

orantılıdır.

2.4.12. TOSC (Total Oxyradical Scavenging Capacity; Toplam Oksiradikal

Süpürme Kapasitesi) Yöntemi

Winston ve arkadaşları tarafından geliştirilmiş olan bu yöntem; AAPH bileşiğinden elde

edilen peroksil radikallerinin α-keto-γ metiolbutirik asiti (KMBA) etilene

yükseltgemesini esas alır [24]. Antioksidanlar varlığında kısmen engellenen etilen gaz

kromatografisi ile ölçülmektedir. Toplam kapasiteyi elde etmek için aşağıdaki denklem

kullanılmaktadır. Denklemde örnek reaksiyon eğrisinden integre edilen alan (∫ SA) ve

kontrol reaksiyon eğrisinden integre edilen alan (∫ CA) kullanılarak işlem yapılır:

TOSC = 100- (∫ SA / ∫ CA × 100) (2.16)

Antioksidan veya TOSC değerleri 0-100 arasında verilmiştir. TOSC yönteminde, gün

içi ve günler arası denemelerin bağıl standart sapma değerlerinin sırasıyla % 2 ve 6

olarak belirtilmiştir [24]. Bu durum kullanılan alan integrallerine göre açık bir

sistemdir, çünkü KMBA sınırlayıcı bir faktör olmazsa, antioksidanların tüketimi

sonrasında KBMA’dan etilen üretimi artabilir [85].

2.4.13. Siklik Voltametri Yöntemi

Kohen ve arkadaşları [87,88] tarafından geliştirilen bu yöntem, biyolojik sıvılarda veya

doku homojenatlarındaki düşük molekül ağırlıklı antioksidanların toplam indirgeme

güçlerini değerlendiren bir yöntemdir. Bu yöntemde örnek hazırlama işlemini takiben,

34

örnek camsı karbon bir çalışma elektrodu, Ag/AgCl den oluşan referans elektrot ve

platin telden oluşan yardımcı elektrot olmak üzere üç elektrotlu bir sistem içine

yerleştirilir. Çalışma elektroduna sabit bir hızla (100 mV/dk) pozitif (indirgeme

cinsinden değerlendirme) ve negatif (yükseltgeme cinsinden değerlendirme)

potansiyeller uygulanmaktadır. Bu işlem sırasında potansiyel akım eğrisi (çevrimsel

voltamogram) elde edilir. Örneğin indirgeme gücü, pik potansiyeli olan [ Ep(a)] ve

anodik akım olan (AC) ye bağlıdır. Ep(a) akımın yarı artışında ölçülür ve yarı dalga

potansiyeli (E1/2) olarak ifade edilir ; bu indirgenlerin türüne bağlıdır. Yarı dalga

potansiyelinin düşük olması durumunda, analizlenen bileşiklerin çalışma elektroduna

elektron verme yeteneği daha yüksektir. Ancak bazı antioksidanlar camsı karbon

elektroduna elektronlarını yeterli miktarda vermez. Örneğin tiyol yapısında glutatyon

camsı karbon elektrodu ile tayin edilemez (Bunun yerine Au/Hg gibi elektrodlara

ihtiyaç duyulur) [87].

2.5. BİTKİLERDE TOPLAM ANTİOKSİDAN KAPASİTE TAYİNİNDE

KULLANILMIŞ OLAN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLER VE HPLC

UYGULAMALARI

Surveswaran ve arkadaşlarının [7] yaptığı çalışmada, Hindistan’daki 133 tane tıbbi

bitkinin antioksidan kapasitesi ABTS, DPPH ve FRAP yöntemleri ile değerlendirilmiş

ve toplam fenolik içerikleri Folin-Ciocalteu yöntemi ile hesaplanmıştır. Bu bitkilerin

antioksidan aktiviteleri, ABTS yönteminde 0.16 – 500.7 mmol TEAC/100 g kuru ağırlık

arasında değişen geniş bir aralık göstermektedir. Antioksidan aktivite değerleri DPPH

ve FRAP yöntemlerinde benzer şekilde değişmektedir. Toplam antioksidan kapasite ve

toplam fenolik içerik arasında önemli ve pozitif doğrusal korelasyon bulunmuştur. Bu

durum, analizlenen tıbbi bitkilerdeki baskın antioksidan bileşenlerin fenolik yapılar

olduğunu göstermektedir. Seçilmiş 83 bitkinin ters-faz HPLC ile yapılan analizlerinde,

temel fenolik bileşiklerin; fenolik asitler, tanenler, flavonoidler, kurkuminoidler,

kumarinler, lignanlar ve kuininler olduğu belirlenmiştir.

Iqbal ve arkadaşlarının [89] yaptığı çalışmada Pakistan’da yetişen 5 buğday türünün

kepek ekstraklarının antioksidan aktiviteleri değerlendirilmiştir. Tüm kepek ekstraktları,

önemli miktarda toplam fenolik içerik (2.12 – 2.37 mg gallik asit eşdeğeri/ g kepek),

35

toplam flavonoid içerik (epikateşin eşdeğeri 262-304 µg/g kepek), kelatlama aktivitesi

(etilendiamintetraasetikasit eşdeğeri 597-716 µg/g kepek), DPPH aktivitesi (% 51-79)

göstermektedir. ABTS kapasitesi 27-36 µmol/g; ORAC kapasitesi 97-123 µmol/g ve

toplam antosiyanin içeriği 30-38 mg/kg kepek olarak bulunmuştur. Tokoferol (22-26

ppm) ve tokotrienol içerikleri (59-74 ppm) ters faz-HPLC ile değerlendirilmiştir.

Oszmianski ve arkadaşları [90] yaptıkları bir çalışmada, Rosaceae familyasından bazı

bitki köklerinde antioksidan tanenleri belirlemeye çalışmışlardır. Polifenoller,

proantosiyanidin polimerlerinin tiyoasidoliz, fenolik asit esterlerinin asit hidrolizinden

sonra analizlenmiştir. Aruncus Silvester ve Potentilla alba köklerinin en baskın

prosiyanidin birimleri (-)epikateşin ve Geum rivale ve Waldsteinia geoides köklerinde

ise (+) kateşin olarak bulunmuştur. En yüksek proantosiyanidin derişimleri, Potentilla

alba (80 g/kg) ve Waldsteinia geoides (64 g/kg) köklerinde belirlenmiştir. G. Rivale

(2.68 g/kg) ve W. geoides (2.75 g/kg) kuru köklerinde yüksek miktarda ellagik asit

bulunmuştur. DPPH yöntemi ile antioksidan aktivite, bitkilerin türüne göre 0.72

(Filipendula vulgaris) ile 4.40 (W.geoides) mM troloks eşdeğeri/kg kuru kök, ABTS

yönteminde ise 1.50 - 6.60 mM troloks eşdeğeri/kg kuru kök arasında değişmektedir.

Chun ve arkadaşlarının [91] yaptığı bir çalışmada, mercanköşk (oregano) doku

kültürlerinden yüksek antioksidan aktivite ve antimikrobiyal potansiyel gösteren, birkaç

fenolik ve rozmarinik asit izole edilmiştir. Araştırmada, fenolik içeriği zengin

mercanköşk ekstraktlarının antioksidan aktivitesi ve antimikrobiyal aktivitesi

Helicobacter pylori kaynaklı ülsere karşı değerlendirilmiştir. Ekstraktlar farklı

bölgelerden sağlanmış ticari mercanköşklerle karşılaştırılmıştır. Toplam fenolik içeriği

%60 etanol ekstraktlarında en yüksek bulunmuştur. Çalışmada uygulanan ABTS+

yöntemi ile toplam fenolik miktarı arasında korelasyon vardır. Mercanköşk

ekstraktlarının fenolik profilleri (protokateşuik asit, kafeik asit, kumarik asit, rozmarinik

asit, kuersetin) HPLC ile analizlenmiştir. C6-C1-COOH fenolik ve C6-C3-COOH

hidroksisinnamik asitlerin fizikokimyasal özellikleri arasındaki farklılığın H.pylori

gelişmesini engellediği varsayılmaktadır.

Apak ve arkadaşlarının [37] yaptığı çalışmada, demlenerek hazırlanan bazı endemik

bitki örneklerinin toplam antioksidan kapasitesi, bakır(II) iyonu indirgeme antioksidan

36

kapasite tayini olarak kısaltılan CUPRAC yöntemiyle belirlenmiştir. Türkiye’nin yerel

marketlerinden temin edilen bitkilerden siyah çay dışındaki en yüksek antioksidan

kapasite, fare kulağı-çuha çiçeği (Anagallis arvensis), fesleğen (Ocimum basilicum),

yeşil çay (Camellia sinensis) ve oğulotu (Melissa officinalis) bitkilerinde sırasıyla; 1.63,

1.18, 1.07, ve 0.99 mmol Troloks eşdeğeri (TR)/g kapasite ile belirlenmiştir.

Demlenerek hazırlanan, hazır poşet çay örneklerinde en yüksek CUPRAC değerleri,

Ceylon harmanlanmış klasik çay (4.41), limonlu yeşil çay (1.61), klasik İngiliz çayı

(1.26) ve yeşil çay (0.94) saptanmıştır. Adaçayı, kekik, kişniş, öksürük otu, böğürtlen ve

altın otunun kapasite değerleri ise 0.5 mmol TR/g civarında belirlenmiştir. Bitkisel

çayların Folin yöntemiyle bulunan toplam fenolik içerikleri, CUPRAC ve ABTS toplam

antioksidan kapasite yöntemleri ile sırasıyla 0.966 ve 0.936 korelasyon katsayıları ile

doğrusallık göstermektedir.

Güçlü ve arkadaşlarının [38] yaptığı çalışmada, Malatya’nın 5 farklı bölgesinden temin

edilen taze, güneşte ve sülfitlenerek kurutulmuş kayısı örneklerinin antioksidan

kapasitesi, CUPRAC, ABTS ve toplam polifenol ölçümleri Folin yöntemleri ile

yapılmıştır. CUPRAC yöntemi ile renk veren sülfit, kuvvetli bazik anyon değiştirici

reçinede pH 3’te HSO3- formunda toplanarak ayrılmıştır. CUPRAC yönteminin ABTS

ve Folin yöntemleri ile korelasyonu (0.93) uygun bulunmuştur. Saf flavonoidlerin ve

standart katkı yapılmış kayısı ekstraktlarının kalibrasyon doğruları paralellik

göstermektedir. CUPRAC yöntemi ile yapılan bu çalışma, hem toplam antioksidan

kapasite hem de çeşitli kayısı örneklerinin sülfit miktarını belirlemektedir.

Toker ve arkadaşları [92], Tilia platyphyllos (ıhlamur) türlerinin, çiçek, taç yaprak ve

yapraklarının flavonoid bileşimini, geliştirdikleri ters faz-HPLC yöntemi ile

değerlendirmişlerdir. Sonuçlar, Türkiye’de yetişen iki ıhlamur türünün (Tilia rubra ve

Tilia argentea ) belirtilen kısımlarında karşılaştırılmıştır. Her iki türün yapılan HPLC

analizleri sonucu, çiçek kısımlarında kuersetin-3,7-diramnozid, izokuersitrin+rutin,

kuersitrin ve astragallin, taç yaprak ve yaprak kısımlarında ayrıca kamferol-3,7-

diramnozid belirlenmiştir. Tilia argentea türünün çiçek, taç yaprak ve yaprak

kısımlarında farklı miktarlarda tiliozid saptanmıştır.

37

Exarchou ve arkadaşlarının [93] yaptığı çalışmada, eczacılıkta kullanılan bazı metanollü

bitki ekstaktlarında, antioksidanların hızlı bir şekilde belirlenmesi için birleştirilmiş

kromatografik yöntemlerden yararlanılmıştır. Tilia europea (ıhlamur), Urtica dioica

(ısırgan), Lonicera periclymenum (hanımeli) ve Hypericum perforatum (sarı

kantaron)’un metanollü ekstraktlarındaki antioksidan bileşenler öncelikle on-line DPPH

ve ABTS radikal süpürme yöntemleri ile görüntülenmiştir. Analitlerin yapısal yorumu

LC-MS ve LC-MS-SPE-NMR ile belirlenmiştir. UV, NMR ve MS uygulama esaslı

çalışmada, ekstraktların antioksidan bileşenleri olarak hem flavonoid glikozidleri hem

de mono- ve dikaffeoilkuinik asitler bulunmuştur.

Urbonavičiūtė ve arkadaşlarının [94] yaptığı çalışmada, alıç (Crataegus monogyna

Jacq.) adlı bitkinin yaprak ve filiz kısımlarının sulu etanol ekstraktları kapiler bölge

elektroforezi ile analizlenmiştir. Ekstraktın kalitatif bileşimi ve flavonoid miktarı

üzerinde bitki örtüsünün etkisi incelenmiştir. Farklı sulu etanol derişimleri (% 40-96) ile

ekstraksiyon yapılarak örnek hazırlanmış ve flavonoidlerin geri kazanımında ekstraktant

bileşiminin etkisi araştırılmıştır. Kapiler bölge elektroforezi ile elde edilen sonuçlar,

spektrofotometrik ve HPLC analizleri ile karşılaştırılmış ve etanollü alıç ekstraktlarında;

rutin, viteksin-2’’-O-ramnozid, viteksin, hiperosid, klorojenik asid belirlenmiştir.

Flavonoidlerin bozunmasında ekstraktın saklanma koşullarının etkisi de (güneş ışığı,

sıcaklık, saklama süresi) incelenmiştir.

Justesen ve arkadaşlarının [95] yaptığı çalışmada bazı meyve, sebze ve içeceklerdeki

flavonol, flavon, ve flavononları miktarlandırmak ve belirlemek için, foto-diyot array ve

kütle spektrometrik dedeksiyonlu yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayırma

yöntemi geliştirilmiştir. Dondurularak kurutulmuş gıdaların asit hidrolizinden sonra,

bileşikler aglikon olarak analizlenmiştir. Gıda bileşimindeki flavonoidler, ticari

standartların alıkonma zamanları, UV ve kütle spektrumları ile karşılaştırılmış ve

flavonoid içerikleri pik alanları ile hesaplanmıştır. Çalışmada analizlenen kereviz

yaprağında apigenin ve luteolin; ıhlamurda hesperetin, naringenin ve kuersetin;

maydanozda apigenin, kamferol ve luteolin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır.

Justesen ve arkadaşlarının [96] yaptığı başka bir çalışmada, sıklıkla tüketilen 15 taze

bitkinin flavonoid miktarı belirlenmeye çalışılmıştır. Bu amaçla, fesleğen, frenk soğanı,

38

kişniş, tere, dereotu, oğulotu, selamotu, mercanköşk, maydanoz, biberiye, adaçayı, nane,

tarhun, kekik ve su teresi taze bitkileri HPLC ve kütle spektrometrisi ile analizlenmiştir.

Asit hidrolizinden sonra, 5 temel aglikon flavonoid olarak apigenin, izoramnetin,

kamferol, luteolin ve kuersetin belirlenmiş ve miktarlandırılmıştır. En yüksek flavonoid

miktarları, maydanozda (510-630 mg apigenin/100 g), selamotunda (170 mg

kuersetin/100 g), nanede (18-100 mg apigenin/100 g, ayrıca luteolin) ve dereotunda (48-

110 mg kuersetin/100 g, ayrıca kamferol ve izoramnetin) belirlenmiştir.

Areias ve arkadaşları [97] yaptıkları çalışmada, nanede 10 fenolik bileşiği (eriodiktol-7-

O-rutinozid, eriodiktol-7-O-glikozid, luteolin-7-O-rutinozid, luteolin-7-O-glikozid,

hesperetin-7-O-rutinozid, apigenin-7-O-rutinozid, rozmarinik asit, 5,6-dihidroksi-

7,8,3’,4’-tetrametoksiflavon, pebrellin ve gardenin B) belirlemek için bir ters-faz

yüksek performanslı sıvı kromatografisi yöntemi geliştirmişlerdir. Ekstraksiyon için

farklı organik çözücüler denenmiş, etanolün kalitatif ve kantitatif değerlendirme için en

uygun çözücü olduğuna karar verilmiştir. HPLC’de en iyi ayrım, su-fosforik asit (999:1)

ve asetonitril ikili çözücü sisteminin gradienti ile elde edilmiştir. Geliştirilen yöntem 14

nane örneğine uygulanmıştır.

Karakaya ve arkadaşlarının [98] yaptığı çalışmada, ısırgan (Urtica sp.), kuşburnu (Rosa

cannina), adaçayı (Salvia officinalis), ıhlamur çiçeği (Tilia platyphyllos), siyah çay,

şalgam suyu (Daucus carota L. spp sativus), üzüm pekmezi, bal ve tarhana örneklerinin

kuersetin, luteolin, apigenin ve kamferol içerikleri HPLC ile belirlenmiştir. Siyah çay ve

ıhlamur çiçeğinde kuersetin ve kamferol; adaçayında kuersetin ve luteolin, kuşburnu,

şalgam suyu, tarhana ve üzüm pekmezinde kuersetin; balda apigenin ve kamferol;

ısırganda kuersetin ve apigenin temel bileşenler olarak belirlenmiştir.

39

3. MALZEME VE YÖNTEM

3.1. KULLANILAN CİHAZLAR

Bu çalışmada kullanılan cihazlar; kimyasal madde ve bitki örneklerini tartmak için

Shimadzu-AX 200 analitik terazi, pH ölçümleri için Metrohm Herisau E512 pH metre,

ekstraksiyon işlemleri ve kimyasal maddelerin çözünmesine yardımcı olmak için

Bransonic 221 ultrasonik banyo, inkübasyon işlemleri için 10 kademeli Clifton su

banyosu, hidroliz işlemleri için HB4 basic KIKA-WERKE su banyosu, çözeltileri

karıştırmak için Elektro-mag girdap karıştırıcı, bitki örneklerinin kurutulmasında Telstar

Cryodos freeze-dryer, bidistile su temini için Millipore Simpak 1 Synergy 185 bidistile

su sistemi, absorbans ölçümleri için Cary 1E UV-Vis spektrofotometre, HPLC ayrımları

için Perkin Elmer Series 200 UV-Vis dedektör, Perkin Elmer Series 200 pompa, Perkin

Elmer Series 200 vakum degazer, Perkin Elmer 600 Series Link Chromatography ara

yüzey (interface) ve Hamilton marka 250 x 4.6 mm, HxSil 5 µm C18 HPLC kolonudur.

3.2. KİMYASAL MADDELER

Kullanılan kimyasal maddeler; gallik asit (Fluka), kateşin (Fluka), klorojenik asit

(Sigma), kafeik asit (Aldrich), ferulik asit (Aldrich), p-kumarik asit (Aldrich), naringin

(Aldrich), naringenin (Sigma), hesperidin (Fluka), hesperetin (Sigma), rutin (Sigma),

izokuersitrin (Fluka), kuersetin (Fluka), mirisetin (Acros Organics), rozmarinik asit

(Fluka), kamferol (AppliChem), luteolin (Alfa Aesar), apigenin (Alfa Aesar), askorbik

asit (Sigma-Aldrich), bakır(II)klorür dihidrat (CuCl2.2H2O) (Merck), amonyum asetat

(Riedel-de Haën), neocuproin (2,9-dimetil-1,10-fenantrolin) (Sigma-Aldrich), ABTS

(2,2’-azinobis[3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat]) (Fluka), potasyum persülfat (K2S2O8)

(Merck), % 96’lık etanol (Riedel-de Haën), metanol (Merck), aseton (Riedel-de Haën),

% 37’lik hidroklorik asit (Merck), m-fosforik asit (Sigma), o-fosforik asit (Merck),

potasyum hidroksit (Merck), sodyum hidroksit (Merck) ve tannik asittir (General

Chemical Company).

40

3.2.1. Çözeltilerin Hazırlanması

Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, naringin,

naringenin, hesperetin, rutin, izokuersitrin, kuersetin, mirisetin ve luteolin stok

çözeltileri metanolde; rozmarinik asit ve kamferol stok çözeltileri etanolde; apigenin

(bazik ortamda çözündüğünden) stok çözeltisi KOH ve etanol karışımında; hesperidin

(bazik ortamda çözündüğünden) KOH ve bidistile su karışımında; askorbik asit % 1’lik

m-fosforik asitte; tannik asit % 70 metanolde çözüldü. Tüm stok antioksidan çözeltileri

–20 o C’ de saklanarak kullanıldı.

CUPRAC yönteminde; 1.0 x 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi ve 1 M amonyum asetat

tampon (pH 7) çözeltisi distile suda, 7.5 x 10-3 M neokuproin çözeltisi % 96’lık

etanolde hazırlandı.

ABTS yönteminde; ABTS radikal çözeltisi 7 mM ABTS ve 2.45 mM potasyum

persülfat içerecek şekilde suda hazırlanıp 12-16 saat karanlıkta ve oda sıcaklığında

bekletilerek kullanıldı.

3.3. BİTKİ ÖRNEKLERİNİN ANALİZE HAZIRLANMASI

3.3.1. Bitki Örneklerinin Kurutulması

Yaş maydanoz, kereviz, dereotu, nane, ısırgan örnekleri semt pazarlarından temin

edilerek yaprak kısımları freeze-dryer’da – 40 oC’de 8-14 saat süreyle kurutuldu.

Ihlamur, kekik, mercanköşk, civanperçemi, arslanpençesi, adaçayı örnekleri kurutulmuş

haliyle yerel marketlerden temin edildi. Tüm bitki örnekleri karanlıkta, oda sıcaklığında

ve ağızları kapalı cam erlenler içerisinde saklandı. Analizleri öncesinde porselen havan

ve tokmak kullanarak, ince toz haline gelinceye kadar öğütülüp analizlendi.

3.3.2. Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu

3.3.2.1. Kurutulmuş Bitki Örneklerinin Ekstraksiyonu

Maydanoz yaprakları metanol, etanol ve asetonun % 100; 70; 50 (v/v) oranları ve

sadece bidistile su ile, kurutulmuş kereviz yaprakları ise % 70 ve 50 metanol; %50

etanol ile ekstrakte edildi. Diğer bitki örnekleri % 70 metanol ile ekstrakte edildi.

Bunun için yaklaşık 1 g tartılan kurutulmuş örnekler önce çözücünün 15 mL’si ile 45

41

dakika, 5 mL daha ilave edilerek ikinci bir 45 dakika ve en son 5 mL daha çözücü

ilavesi ile 15 dakika (toplam 105 dakika) ultrasonik banyoda, ağızları kapalı cam

erlenler içinde ekstrakte edildi. Bitki ekstraktları önce süzgeç kağıdından, daha sonra

GF/PET (Glass fiber/polietilentereftalat) 1.0/0.45 µm’lik enjektör uçlu mikro filtreden

geçiririlerek analizlendi. Çalışılan tüm bitki ekstraktlarının (kendi çözücüleri ile 50 veya

100 kat seyreltilerek) aynı çözücülere karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.

3.3.2.2. Yaş Maydanozda C Vitamini Analizi İçin Ekstraksiyon

Maydanoz yaprakları önce mutfak robotundan geçirilip daha sonra porselen havanda

dövüldü. Bu örnekten yaklaşık 5 g alınarak % 1’lik (w/v) m-fosforik asitin 25 mL’si ile

45 dakika ultrasonik banyoda ağzı kapalı cam erlen içerinde ekstrakte edildi [99].

Ekstrakte edilen kısım alınarak, katı örnek üzerine tekrar bir 25 mL % 1’lik m-fosforik

asit ilavesi yapıldı. 45 dakika daha ekstraksiyona aynı şekilde devam edilip (toplam 90

dakika) toplanan ekstraktlar önce % 1’lik m-fosforik asit ile ıslatılmış süzgeç

kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi.

3.3.3. Bitki Örneklerinin İnfüzyonu (Demlenmesi)

Yaklaşık 1 g olarak tartılmış kurutulmuş adaçayı, ısırgan ve nane bitkileri 50 mL

bidistile kaynar su içinde 5 dakika infüze edildi (demlendi). Demlenmiş örnekler önce

süzgeç kağıdından daha sonra mikro filtreden geçirilerek analizlendi.

3.3.4. Bitki Örneklerinin Hidrolizi

3.3.4.1. Bitki Ekstraktlarının Hidrolizi

Bunun için % 70 ve 50 metanollü maydanoz yaprak ekstraktları ve % 70; 50 metanollü

ve % 50 etanollü kereviz yaprak ekstraktları son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl

olacak şekilde 80 oC’de 4 saat hidroliz edildi [100]. Diğer bitki örneklerinin % 70

metanollü ekstraktları ısırgan ve kekik örnekleri için 80 oC’de 4 saat; ıhlamur, nane,

mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu örnekleri için 80 oC’de 2

saat, son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl olacak şekilde hidroliz edildi.

• % 70 metanollü bitki ekstraktların hidrolizinde;

[ 6 mL % 70 metanollü ekstrakt + 5,8 mL metanol + 2 mL derişik HCl + 6,2 mL

bidistile su ] içeren karışım hidroliz edildi (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl).

Hidroliz sonunda hidrolizat hacmi hidroliz balonunu yıkamak suretiyle 25 mL’ye

metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi.

42

Çalışılan tüm bitki ekstrakt hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat

seyreltilerek) % 50 metanole karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.

3.3.4.2. Katı Bitki Örneklerinin Hidrolizi

Yaklaşık 0,2 g olarak tartılmış kurutulmuş bitki örneğine 16 mL % 62.5 metanol ve 4

mL 6 M HCl ilave edilerek (son derişim % 50 metanol ve 1.2 M HCl) 80 o C’de

maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan ve kekik bitkileri için 4 saat; adaçayı, arslanpençesi,

civanperçemi, dereotu, ıhlamur, mercanköşk ve nane bitkileri için 2 saat hidroliz işlemi

uygulandı. Hidroliz sonunda hidrolizat önce metanolle ıslatılmış süzgeç kağıdından

süzülüp katı örnek ve hidroliz balonunu metanolle yıkamak suretiyle hacmi 25 mL’ye

metanolle tamamlandı, mikro filtreden süzülerek analizlendi. Çalışılan tüm katı bitki

örnek hidrolizatlarının (% 50 metanol ile 50 veya 100 kat seyreltilerek) % 50 metanole

karşı 200-800 nm arasında spektrumu alındı.

3.3.4.3. Demlenmiş Bitkilerin Hidrolizi

Nane, adaçayı ve ısırganın demlenme ile hazırlanmış çözeltilerinin hidrolizi; sadece asit

ile (son derişim 1.2 M HCl olacak şekilde ) ve asit + metanol (son derişimde % 50

metanol ve 1.2 M HCl) ile olmak üzere iki şekilde gerçekleştirildi.

• Sadece asit ile yapılan hidrolizde;

12 mL demlenmiş bitki çözeltisi + 4 mL 12 M HCl + 24 mL su içeren karışım 80 oC’de

2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 mL’ye bidistile su ile tamamlandı. Mikro filtreden

geçirilerek analizlendi.

• Asit + metanol ile yapılan hidrolizde;

12 mL demlenmiş bitki çözeltisi + 20 mL metanol + 4 mL 12 M HCl + 4 mL su içeren

karışım 80 oC’de 2 saat hidroliz edildi. Son hacim 50 mL’ye metanolle tamamlandı.

Mikro filtreden geçirilerek analizlendi.

3.4. SENTETİK KARIŞIMLARIN HAZIRLANMASI

3.4.1. Sentetik Karışım-1

Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit stok

çözeltilerinden belirli hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10-4 M olacak şekilde 50

mL’lik sentetik karışım-1 çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 5 mL alınarak; üzerine 10

mL metanol, 2 mL derişik HCl ve 3 mL su (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl)

43

ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 oC’de hidroliz

edildi. Son hacim 25 mL’ye metanolle tamamlandı.


Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve apigenin stok çözeltilerinden belirli

hacimler alınarak son derişimleri 2 x 10-4 M olacak şekilde 25 mL’lik sentetik karışım-2

çözeltisi hazırlandı. Karışımdan 8 mL alınarak; üzerine 10 mL metanol ve 2 mL derişik

HCl (son derişimi % 50 metanol ve 1.2 M HCl) ilavesi yapıldı. Bu şekilde hazırlanan

hidroliz karışımı 2 saat ve 4 saat 80 oC’de hidroliz edildi. Son hacim 25 mL’ye

metanolle tamamlandı.

3.5. UYGULANAN YÖNTEMLER

3.5.1. Spektrofotometrik Yöntemler

3.5.1.1. CUPRAC Yöntemi

• Normal Metod

Bir deney tübü içerisine sırasıyla 1 mL 1.0 x 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi, 1 mL 1 M

amonyum asetat tampon (pH 7) çözeltisi, 1 mL 7.5 x 10-3 M neokuproin çözeltisi ilave

edildi. Daha sonra x mL antioksidan çözeltisinden ve son olarak (1,1 – x) mL distile su

ilave edilerek çözeltiler karıştırıldı. Tüpler oda sıcaklığında ağzı kapalı olarak 30 dakika

bekletildi. Süre sonunda çözeltilerin içinde örnek bulunmayan referans çözeltiye karşı

450 nm’deki absorbansları ölçüldü [36].

Mirisetin için 3.66 x 10-6 M – 1.34 x 10-5 M, izokuersitrin için 1.83 x 10-6 M – 1.65 x

10-5 M, luteolin için 2.33 x 10-6 M – 2.09 x 10-5 M, kamferol için 4.88 x 10-6 M – 4.39 x

10-5 M, apigenin için 1.83 x 10-5 M – 6.70 x 10-5 M, rozmarinik asit için 1.83 x 10-6 M –

6.70 x 10-6 M, kuersetin için 1.95 x 10-6 M – 9.76 x 10-6 M, askorbik asit için 9.76 x 10-6

M – 4.88 x 10-5 M derişim aralığında çalışılarak normal metod uygulandı. Kalibrasyon

doğruları oluşturulup, molar absorplama katsayıları hesaplandı.

Sentetik karışım-1, sentetik karışım-2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz

işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri

hesaplandı.

44

Bitki ekstraktları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri % 50 etanol ile uygun

oranlarda seyreltilerek; bitki ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve

demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin hidrolizatlarından antioksidan

kapasitesi düşük olanlar (maydanoz, kereviz yaprağı, ısırgan) 2 M NaOH ile

nötralleştirildikten sonra % 50 etanol ile, kapasitesi yüksek olanlar ise (kekik, ıhlamur,

nane, mercanköşk, arslanpençesi, adaçayı, civanperçemi ve dereotu) doğrudan % 50

etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek normal metod uygulandı ve toplam antioksidan

kapasiteleri hesaplandı.

• İnkübasyonlu Metod

Normal metoda göre hazırlanmış çözeltiler ağızları kapatılarak 50 oC’lik su banyosunda

20 dakika bekletilerek inkübe edildi. Süre sonunda tüpler soğuk su içinde birkaç dakika

soğutuldu. Tüplerin ağızları açılıp tekrar karıştırıldıktan sonra içinde örnek bulunmayan

referans çözeltiye karşı 450 nm’deki absorbansları ölçüldü [36].

3.5.1.2. ABTS-Persülfat Yöntemi

Bir deney tübü içerisine sırasıyla; (4 – x) mL etanol ve x mL antioksidan çözeltisinden

ilave edildi. Bu şekilde hazırlanan örnek çözeltileri ve sadece 4 mL etanol içeren çözelti

üzerine (radikal çözeltisi) 15’şer saniye aralıklarla 1 mL 1:10 oranında etanolle

seyreltilmiş ABTS radikal çözeltisinden katıldı. Çözeltiler karıştırılıp, 6. dakika

sonunda etanole karşı 734 nm’deki absorbansları ölçüldü. Radikal çözeltisinin

absorbansından, örnek içeren çözeltinin absorbansı çıkarılarak ∆A absorbans değerleri

hesaplandı [40].

Mirisetin için 2.00 x 10-6 M – 1.00 x 10-5 M, izokuersitrin için 6.00 x 10-6 M – 3.00 x

10-5 M, luteolin için 3.82 x 10-6 M – 1.91 x 10-5 M, kamferol için 8.00 x 10-6 M – 4.00 x

10-5 M, apigenin için 1.00 x 10-5 M – 5.00 x 10-5 M, rozmarinik asit için 4.00 x 10-6 M –

2.00 x 10-5 M, kuersetin için 1.60 x 10-6 M – 8.00 x 10-6 M, askorbik asit için 8.00 x 10-6

M – 4.00 x 10-5 M derişim aralığında ABTS yöntemi uygulanıp, derişime karşı ∆A

değerleri kaydedilmek suretiyle kalibrasyon doğruları oluşturularak molar absorbsiyon

katsayıları hesaplandı.

45

Sentetik karışım-1, sentetik karışım-2 çözeltilerine ve bunların 2 saat ile 4 saat hidroliz

işlemi uygulanmış çözeltilerine yöntem uygulanıp antioksidan kapasite değerleri

hesaplandı.

Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt

hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin

hidrolizatlarından % 50 etanol ile uygun oranlarda seyreltilerek yöntem uygulandı ve

toplam antioksidan kapasiteleri hesaplandı.

3.5.2. Kromatografik Analizler

3.5.2.1. HPLC Analizi

HPLC analizlerinde iki elüsyon programı kullanıldı.

• Polifenolik bileşiklerin analizi için geliştirilen HPLC metodunda;

Metanol (A) ve % 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan

hareketli fazın gradient elüsyonu uygulandı. Bunun için 280 nm’de pik dedeksiyonuyla

ve 1 mL/dakika akış hızıyla;

8 dakika % 7 (A) , eğim (0.0); 8-13 dakika % 30 (A), eğim (–4.0); 13-48 dakika % 66

(A), eğim (1.0); 48-55 dakika % 75 (A), eğim (–4.0) gradient elüsyon kullanıldı.

Bu elüsyon metodu ile,

Gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, p-kumarik asit, naringin,

naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin, kuersetin, mirisetin, rozmarinik asit, kamferol,

luteolin, ve apigenin için 4 x 10-5 – 5 x 10-4 M; izokuersitrin için 4 x 10-5 – 3 x 10-4 M

derişim aralığında çalışılarak kalibrasyon doğruları oluşturuldu.

% 70 metanolde çözülerek hazırlanan tannik asit çözeltisi, bu çözeltinin 80 oC’de 2 saat

hidroliz edilen çözeltisi ve 1.5 x 10-3 M 80 oC’de 2 saat hidroliz edilen rozmarinik asit

çözeltisi analizlendi.

Bitki ekstraktları, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltileri, bitki ekstrakt

hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları ve demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin

hidrolizatları analizlendi, kalitatif ve kantitatif değerlendirmeleri yapıldı.

46

• Askorbik asit analizi için;

Metanol (A) ve % 0.2 o-H3PO4 içeren bidistile su (B) ikili çözücü sisteminden oluşan

hareketli fazın izokratik elüsyonu uygulandı. 215 nm’de 1 mL/dakika akış hızıyla;

8 dakika % 7 (A) , eğim (0.0) izokratik elüsyonu kullanıldı.

Bu elüsyon metodu ile;

1 x 10-4 – 1 x 10-3 M derişim aralığında çalışılarak askorbik asit kalibrasyonu

oluşturuldu.

Yaş maydanozun m-fosforik asitli ekstraktında askorbik asit analizi yapıldı.

Çalışılan her bitki örneğinin enjeksiyonu öncesinde 10 dakika metanolle kolonu yıkama

ve 10 dakika % 7 (A): % 93 (B) ile kolonu dengeleme işlemi gerçekleştirildi.

47

4. BULGULAR

4.1. BAZI ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARI VE Cu(I)-Nc

KELATININ GÖRÜNÜR BÖLGE SPEKTRUMLARI

CUPRAC yöntemi ile daha önceden çalışılmamış mirisetin, izokuersitrin, luteolin,

kamferol, apigenin ve rozmarinik asit standart antioksidanlarına normal metod ve

inkübasyonlu metod uygulanarak doğru denklemleri oluşturulmuş ve CUPRAC normal

yöntemle kalibrasyon doğruları çizilmiştir.

Ayrıca mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol ve rozmarinik asit için normal

yöntemle, apigenin için inkübasyonlu yöntemle elde edilen Cu(I)-Nc kelatının görünür

bölge spektrumları çizilerek aşağıda gösterilmiştir.

Doğru denklemlerinde verilen; x: derişim, y: absorbans ve r: korelasyon katsayısı

karşılığını ifade etmektedir.

48

4.1.1. Mirisetin

Tablo 4.1. Mirisetin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACİ

ABSORBANSI

3.66 x 10-6 0.2293 0.3629

6.10 x 10-6 0.4141 0.5871

8.54 x 10-6 0.5855 0.7922

1.10 x 10-5 0.7471 1.0277

1.34 x 10-5 0.9336 1.2285

(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 7.14 x 104 x – 0.028 r = 0.9997

(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 8.91 x 104 x + 0.039 r = 0.9998

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 3 6 9 12 15

Derişim x 106 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.1: Mirisetinin kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.2: Mirisetinin CUPRACN spektrumu

49

4.1.2. İzokuersitrin

Tablo 4.2: İzokuersitrin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACİ

ABSORBANSI

1.83 x 10-6 0.1148 0.1542

5.49 x 10-6 0.2968 0.4126

9.15 x 10-6 0.5057 0.6624

1.28 x 10-5 0.6816 0.9025

1.65 x 10-5 0.8834 1.1360

(CUPRACN) Doğru Denklemi: y = 5.24 x 104 x + 0.016 r = 0.9997

(CUPRACİ) Doğru Denklemi: y = 6.69 x 104 x + 0.041 r =0.9997

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 3 6 9 12 15 18

Derişim x 106 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.3: İzokuersitrinin kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.4: İzokuersitrinin CUPRACN spektrumu

50

4.1.3. Luteolin

Tablo 4.3: Luteolin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACİ

ABSORBANSI

2.33 x 10-6 0.1285 0.1681

6.99 x 10-6 0.3613 0.4497

1.16 x 10-5 0.5922 0.7355

1.63 x 10-5 0.8086 1.0019

2.09 x 10-5 1.0301 1.2512



0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 4 8 12 16 20 24

Derişim x 106 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.5: Luteolinin kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.6: Luteolinin CUPRACN spektrumu

51

4.1.4. Kamferol

Tablo 4.4: Kamferol için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACİ

ABSORBANSI

4.88 x 10-6 0.1518 0.2213

1.46 x 10-5 0.4325 0.5945

2.44 x 10-5 0.6781 0.9499

3.41 x 10-5 0.8955 1.2620

4.39 x 10-5 1.1221 -----



0

0,3

0,6

0,9

1,2

0 1 2 3 4 5

Derişim x 105 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.7: Kamferolün kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.8: Kamferolün CUPRACN spektrumu

52

4.1.5. Apigenin

Tablo 4.5: Apigenin için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACİ

ABSORBANSI

1.83 x 10-5 0.1210 0.3635

3.05 x 10-5 0.1793 0.5361

4.27 x 10-5 0.2401 0.7233

5.49 x 10-5 0.2935 0.9402

6.70 x 10-5 0.3435 1.0879



0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1 2 3 4 5 6 7

Derişim x 105 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.9: Apigeninin kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.10: Apigeninin CUPRACİ spektrumu

53

4.1.6. Rozmarinik Asit

Tablo 4.6: Rozmarinik asit için CUPRAC yöntemi ile belirlenen kalibrasyon değerleri

DERİŞİM

(mol L-1)

CUPRACN

ABSORBANSI

CUPRACN

ABSORBANSI

1.83 x 10-6 0.1740 0.2084

3.05 x 10-6 0.2905 0.3519

4.27 x 10-6 0.4132 0.4948

5.49 x 10-6 0.5197 0.6241

6.70 x 10-6 0.6341 0.7560



0

0,2

0,4

0,6

0 1 2 3 4 5 6 7

Derişim x 106 M

Ab

so

rb

an

s

Şekil 4.11: Rozmarinik asitin kalibrasyon doğrusu

Şekil 4.12: Rozmarinik asitin CUPRACN spektrumu

54

4.2. BAZI ANTİOKSİDANLARIN MOLAR ABSORPLAMA KATSAYILARI VE

TEAC DEĞERLERİ

Mirisetin, izokuersitrin, luteolin, kamferol, apigenin, rozmarinik asit, kuersetin ve

askorbik asit standart antioksidanlarına uygulanan CUPRAC normal ve inkübasyonlu

yöntem ve ABTS-Persülfatlı yöntem sonrasında, absorbans ve derişim arasında çizilen

kalibrasyon grafiğinin eğiminden molar absorplama katsayıları (ε) bulunarak, bu

değerin troloksun molar absorplama katsayısına bölünmesiyle elde edilen troloks

eşdeğeri antioksidan kapasiteleri (TEAC) hesaplanmıştır.

Yöntemde daha önceden çalışılan troloks, gallik asit, kateşin, klorojenik asit, kafeik asit,

p-kumarik asit, ferulik asit, naringin, naringenin, hesperidin, hesperetin, rutin için

hesaplanan molar absorplama katsayıları ve TEAC değerleri kullanılmıştır [36].

Tablo 4.7’de çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen, Tablo 4.8’de

ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları ve

Tablo 4.9’da çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen

TEAC değerleri görülmektedir.

Tablo 4.7: Çeşitli antioksidanların CUPRAC yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları

MOLAR ABSORPLAMA KATSAYISI

(ε) Lmol-1cm-1 ANTİOKSİDAN

CUPRACN CUPRACİ

DOĞRUSAL ARALIK

(mol L-1)

Troloks 1.67 x 104 1.86 x 104 2.60 x 10-6 – 7.50 x 10-5

Mirisetin 7.14 x104 8.91 x 104 3.66 x 10-6 – 1.34 x 10-5

Luteolin 4.84 x104 5.85 x104 2.33 x 10-6 – 2.09 x 10-5

Kamferol 2.46 x104 3.57 x104 4.88 x 10-6 – 4.39 x 10-5

Apigenin 4.59 x103 1.52 x104 1.83 x 10-5 – 6.70 x 10-5

İzokuersitrin 5.24 x104 6.69 x104 1.83 x 10-6 – 1.65 x 10-5

Rozmarinik Asit 9.43 x104 1.12 x105 1.83 x 10-6 – 6.70 x 10-6

55

Tablo 4.8: Çeşitli antioksidanların ABTS yöntemi ile elde edilen molar absorplama katsayıları ve doğrusal aralıkları

Tablo 4.9: Çeşitli antioksidanların CUPRAC ve ABTS yöntemlerine göre elde edilen TEAC değerleri

ANTİOKSİDAN

MOLAR

ABSORPLAMA

KATSAYISI

(ε) Lmol-1cm-1

DOĞRUSAL ARALIK

(mol L-1)

Troloks 2.60 x 104 5.00 x 10-6 – 3.00 x 10-5

Mirisetin 8.93 x104 2.00 x 10-6 – 1.00 x 10-5

Luteolin 2.63 x104 3.82 x 10-6 – 1.91 x 10-5

Kamferol 2.25 x104 8.00 x 10-6 – 4.00 x 10-5

Apigenin 1.69 x104 1.00 x 10-5 – 5.00 x 10-5

İzokuersitrin 2.63 x104 6.00 x 10-6 – 3.00 x 10-5

Rozmarinik Asit 5.99 x104 4.00 x 10-6 – 2.00 x 10-5

TEACCUPRAC

ANTİOKSİDAN TEACN TEACI

TEACABTS

Mirisetin 4.27 4.79 3.43

Kuersetin 5.49 5.57 3.21

Kamferol 1.47 1.92 0.86

Rutin 2.56 2.56 1.15

İzokuersitrin 3.14 3.60 1.01

Apigenin 0.27 0.82 0.65

Luteolin 2.90 3.14 1.01

Kateşin 3.09 3.56 3.14

Naringin 0.02 0.13 0.62

Naringenin ---- 2.28 0.64

Hesperidin 0.97 1.11 1.40

Hesperetin 0.99 1.05 1.11

Gallik asit 2.62 3.48

Rozmarinik Asit 5.65 6.02 2.30

Ferulik asid 1.20 1.23 2.16

p-Kumarik asid 0.55 1.00 1.63

Kafeik asid 2.89 2.96 1.39

Klorojenik asid 2.47 2.72 1.21

Askorbik asid 1.06 1.34 1.15

56

4.3. HPLC İLE ANTİOKSİDANLARIN KALİBRASYON DOĞRULARININ

OLUŞTURULMASI

Tablo 4.10’da belirtilen standart antioksidanların HPLC’de geliştirilen metodla elde

edilen alıkonma zamanları ve pik alanları ile derişim arasında çizilen doğru denklemleri

görülmektedir.

Tabloda verilen tR : Alıkonma Zamanı, y: Pik Alanı, c: Derişim ve r: Korelasyon

katsayısını ifade etmektedir.

Tablo 4.10: Çeşitli antioksidanların HPLC ile elde edilen doğru denklemleri ve alıkonma zamanları

Antioksidan tR

(dakika)

Doğrusal Aralık

(mol L-1) Doğru Denklemi

(r)

Askorbik Asit 3.55 1 x 10-4 – 1 x 10-3 y = 3.16 x 109 c + 16794 0.9999

Gallik Asit 12.96 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.04 x 109 c + 73233 0.9997

Kateşin 18.11 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 3.79 x 109 c + 4474 0.9997

Klorojenik Asit 20.19 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.00 x 109 c + 37950 0.9996

Kafeik Asit 22.72 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.44 x 109 c + 69934 0.9999

p-kumarik Asit 28.00 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.48 x 1010 c + 30571 0.9999

Ferulik Asit 29.01 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.05 x 1010 c - 24807 0.9998

Rozmarinik Asit 31.17 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.49 x 109 c + 64341 0.9995

Naringin 32.25 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.69 x 1010 c + 9146 0.9999

Hesperidin 33.06 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.65 x 1010 c - 44514 0.9988

Rutin 34.99 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 8.79 x 109 c + 3687 0.9999

İzokuersitrin 34.99 4 x 10-5 – 3 x 10-4 y = 6.43 x 109 c + 55614 0.9991

Mirisetin 38.67 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 5.93 x 109 c - 42007 0.9996

Naringenin 42.95 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.47 x 1010 c + 5985 0.9999

Hesperetin 43.67 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.43 x 1010 c - 81556 0.9983

Kuersetin 44.41 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.12 x 109 c + 88516 0.9989

Luteolin 45.97 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 9.02 x 109 c - 79509 0.9990

Kamferol 48.90 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 7.23 x 109 c - 36137 0.9996

Apigenin 50.17 4 x 10-5 – 5 x 10-4 y = 1.04 x 1010 c - 1727 0.9999

57

Şekil 4.13: Çeşitli standart antioksidanları içeren sentetik karışımın kromatogramı

1. pik: Askorbik Asit; 2.pik: Gallik Asit; 3. pik: Kateşin; 4. pik: Klorojenik Asit; 5.pik: Epikateşin; 6. pik: Kafeik Asit ; 7. pik: p-

kumarik Asit; 8. pik: Ferulik asit + Sinapik Asit; 9. pik: Naringin; 10. pik: Hesperidin; 11. pik: Rutin + İzokuersitrin; 12. pik:

Naringenin; 13. pik: Hesperetin; 14. pik: Kuersetin; 15. pik: Luteolin; 16 pik: Kamferol; 17. pik: Apigenin

Şekil 4.14: Rozmarinik asit standartının kromatogramı

58

Şekil 4.15: Mirisetin standartının kromatogramı

Şekil 4.15’de mirisetin standartının kromatogramı görülmektedir. Kalibrasyon doğrusu

1 numara ile gösterilen pike göre oluşturulmuştur.

Şekil 4.16: Askorbik asit standartının kromatogramı

Şekil 4.16’da görülen kromatogramda 1 numara ile belirtilen pik askorbik asite aittir.

Öncesinde gelen pik askorbik asitin çözünmesinde kullanılan m-fosforik asitin pikidir.

59

4.4. BİTKİ ANALİZLERİNİN SONUÇLARI

Bitki ekstraktları, ekstrakt hidrolizatları, katı bitki hidrolizatları, demlenerek hazırlanan

bitki örnek çözeltileri, demlenerek hazırlanan bitki örnek çözeltilerinin

hidrolizatlarından antioksidan kapasitesi spektrofotometrik olarak CUPRAC-normal,

CUPRAC-inkübasyonlu ve ABTS yöntemleri ile, antioksidan bileşenleri ise HPLC

uygulaması ile belirlenmiştir. HPLC’de pik alanlarıyla madde derişimleri arasında

çizilen kalibrasyon doğruları yardımıyla, bitki örneklerinin bireysel antioksidan

içerikleri bulunmuştur. Derişimler bileşenlerin TEAC değerleri ile çarpılmış ve örnek

içinde bileşenlerin kuramsal olarak göstermesi gereken kapasiteler belirlenmiştir.

Bileşenlerin hesaplanan kapasiteleri toplanarak, bitkinin toplam antioksidan kapasitesi

hesaplanmıştır. Bu şekilde HPLC verilerinden toplam antioksidan kapasite hesabına

geçilmiştir. Tablo 4.11 - 4.23’de gösterilen HPLC-CUPRACN, HPLC-CUPRACİ ve

HPLC-ABTS ifadeleri HPLC’de belirlenen derişimlerin sırasıyla CUPRAC-normal,

CUPRAC-inkübasyonlu ve ABTS yöntemindeki TEAC katsayıları kullanılarak

hesaplanan kapasiteyi ifade etmektedir. Hesaplanan bu kapasite değerleri hem

kromatografik hem de spektrofotometrik verilere dayandığından bunları ifade ederken

her iki enstrümental tekniğin sembolleri kullanılmıştır.

(Antioksidan Kapasite)Toplam = i=1

C∑ i

n

TEACi (2.17)

(ci : i- bileşeninin HPLC yoluyla bulunan derişimini; TEACi : i- bileşeninin seçilen

kapasite ölçüm yöntemine göre TEAC katsayısını ifade etmektedir.)

4.4.1. Maydanoz ( Petroselinum sativum )

Şekil 4.17-4.19 olarak belirtilen spektrumlarda; çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte

edilen maydanoz örneklerinin spektrumları görülmektedir.

60

Şekil 4.17: Metanolün farklı oranları ve sadece bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu

Şekil 4.18: Etanolün farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu

Şekil 4.19: Asetonun farklı oranları ile ekstrakte edilmiş maydanoz örneklerinin spektrumu

61

Şekil 4.20 - 4.26 ile gösterilen kromatogramlarda çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte

edilen maydanoz örneklerinin kromatogramları görülmektedir.

Şekil 4.20: %100 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı

Şekil 4.21: %70 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı

Şekil 4.22: % 50 metanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı

62

Şekil 4.23: % 100 bidistile su ile ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı

Şekil 4.24: % 100 etanolle ekstrakte edilmiş maydanoz kromatogramı


63


Şekil 4.27 ve 4.28’de; maydanoz örneklerinin 2 saat ve 4 saat hidroliz edilmesi sonucu

elde edilen hidrolizatların kromatogramları görülmektedir. Maydanoz hidrolizatlarının

HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak; p-kumarik asit, mirisetin ve

apigenin belirlenmiştir.

Şekil 4.27: % 70 metanollü maydanoz ekstraktının 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları

1. pik: p-kumarik asit; 2. pik: mirisetin; 3. pik: apigenin

64

Şekil 4.28: Kurutulmuş maydanoz örneklerine uygulanan 2 ve 4 saat hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramları

1. pik: p-kumarik asit; 2. pik: mirisetin; 3. pik: apigenin

Yaş maydanozda askorbik asit analizi için yapılan çalışmada elde edilen kromatogram

Şekil 4.29’da görülmektedir.

Şekil 4.29: Yaş maydanozda askorbik asit analizi sonucu elde edilen kromatogram

1.pik: askorbik asit

Tablo 4.11’de maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri

görülmektedir.

65

Tablo 4.11: Maydanoz örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)

ÖRNEK CUPRACN CUPRACİ ABTS HPLC

(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)

% 100 Metanollü Ekstrakt



% 100 Sulu Ekstrakt

% 100 Etanollü Ekstrakt

%70 Etanollü Ekstrakt

%50 Etanollü Ekstrakt

% 100 Asetonlu Ekstrakt



% 50 Met. Eks. 4 saat Hid.



Katı Bitki 2 saat Hidrolizatı


m-fosforik Asitli Ekstrakt

0,094

0,049

0,036

0,023

0,068

0,084

0,055

0,054

0,095

0,053

0,033

0,056

0,058

0,082

0,093

0,016

0,112

0,079

0,059

0,054

0,087

0,113

0,089

0,068

0,131

0,093

0,063

0,099

0,104

0,166

0,193

0,023

0,035

0,040

0,038

0,044

0,030

0,062

0,075

0,037

0,062

0,069

0,014

0,011

0,012

0,022

0,021

7.95 x 10-3

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0,023

0,043

0,034

0,049

0,035

8.44 x 10-3

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0,033

0,067

0,062

0,074

0,068

0,011

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

0,024

0,051

0,049

0,056

0,054

9.16 x 10-3

4.4.2. Kereviz Yaprağı ( Apium graveolens )

Şekil 4.30’da çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilen kereviz yaprağı örneklerinin

spektrumu görülmektedir.

Şekil 4.30: Çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı örneklerinin

spektrumu

66

Şekil 4.31 - 4.33 ile gösterilen kromatogramlarda çeşitli çözücü ve oranları ile ekstrakte

edilen kereviz yaprağı örneklerinin kromatogramları görülmektedir.

Şekil 4.31: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı

Şekil 4.32: % 50 metanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı

Şekil 4.33: % 50 etanolle ekstrakte edilmiş kereviz yaprağı kromatogramı

67

Şekil 4.34’de kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve katı bitki hidrolizatının

spektrumu görülmektedir.

Şekil 4.34: Kereviz yaprağı ekstrakt hidrolizatlarının ve kurutulmuş örnek hidrolizatının

spektrumu

Şekil 4.35 ve 4.36’da; kereviz yaprağı örneklerinin 4 saat hidroliz edilmesi sonucu elde

edilen hidrolizatların kromatogramları görülmektedir. Kereviz yaprağı hidrolizatlarının

HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak; klorojenik asit, mirisetin, luteolin

ve apigenin belirlenmiştir.

Şekil 4.35: % 70 metanollü kereviz yaprağı ekstraktının 4 saat hidroliz sonucu elde edilen

hidrolizat kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: apigenin

68

Şekil 4.36: Kurutulmuş kereviz yaprağına doğrudan uygulanan 4 saat hidroliz sonucu elde

edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: apigenin

Tablo 4.12’de kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri

görülmektedir.

Tablo 4.12: Kereviz yaprağı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)



% 50 Etanollü Ekstrakt

% 70 Met. Eks. Hidrolizatı


% 50 Eta. Eks. Hidrolizatı

Katı Bitki Hidrolizatı

0,148

0,135

0,138

0,141

0,140

0,151

0,179

0,180

0,176

0,179

0,169

0,164

0,178

0,229

0,087

0,086

0,090

0,096

0,099

0,094

0,133

-

-

-

0,067

0,057

0,061

0,069

-

-

-

0,097

0,083

0,092

0,095

-

-

-

0,053

0,046

0,049

0,049

Maydanoz ve kereviz yaprağında çeşitli organik çözücü oranları ile ekstraksiyon

yapılmış, gerek spektrofotometrik gerekse kromatografik çalışmalarda en uygun

çözücünün % 70’lik metanol olduğuna karar verilmiştir. Bundan dolayı diğer bitki

örnekleri % 70 metanol ile ekstrakte edilmiştir. % 70 metanollü ekstrakt hidrolizatları

ve katı örnek hidrolizatlarının kromatogramları değerlendirildiğinde belirlenen bileşen

69

açısından farklılık olmadığı için bundan sonra belirtilen bitkilerde katı bitki örneklerinin

hidrolizat kromatogramları verilmiştir.

4.4.3. Nane ( Mentha piperita )

Şekil 4.37’de % 70 metanollü nane ekstraktının ve Şekil 4.38’de katı nane hidrolizatının

kromatogramı görülmektedir. Nane ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde

katkısı yapılarak rozmarinik asit; hidrolizatlarında ise kafeik asit, rozmarinik asit ve

luteolin belirlenmiştir.

Şekil 4.37: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş nane kromatogramı

1.pik: rozmarinik asit

Şekil 4.38: Kurutulmuş naneye doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: luteolin

70

Şekil 4.39’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş nane ekstraktının, ekstrakt

hidrolizatının ve katı bitki hidrolizatının spektrumu görülmektedir.

Şekil 4.39: Nane ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Şekil 4.40 - 4.42’de demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin, bu çözeltinin sadece asit

ile olan hidrolizi ve asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizatların

kromatogramları görülmektedir.

Şekil 4.40: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin kromatogramı

71

Şekil 4.41: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde edilen

hidrolizat kromatogramı

Şekil 4.42: Demlenerek hazırlanan nane çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde


Tablo 4.13’de nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.

Tablo 4.13: Nane örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




Demleme Çözeltisi

Dem. Çöz. Asit ile Hid.

Dem. Çöz. Asit+Met. Hid.

0,391

0,366

0,598

0,346

0,362

0,354

0,402

0,468

0,742

0,421

0,421

0,468

0,183

0,177

0,252

0,054

0,156

0,160

0,245

0,058

0,088

-

-

-

0,261

0,061

0,094

-

-

-

0,099

0,024

0,037

-

-

-

72

4.4.4. Isırgan ( Urtica dioica )

Şekil 4.43’de % 70 metanollü ısırgan ekstraktının; Şekil 4.44’de katı ısırgan

hidrolizatının kromatogramı görülmektedir. Isırgan ekstraktının HPLC analizlerinde

standart madde katkısı yapılarak kateşin ve klorojenik asit; hidrolizatlarında ise kafeik

asit ve klorojenik asit belirlenmiştir.

Şekil 4.43: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ısırgan kromatogramı

1.pik: kateşin; 2. pik: klorojenik asit

Şekil 4.44: Kurutulmuş ısırgana doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit

73

Şekil 4.45’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş ısırgan ekstraktının, ekstrakt


Şekil 4.45: Isırgan ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.14’de ısırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.

Tablo 4.14: Isırgan örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




Demleme Çözeltisi



0,076

0,077

0,186

0,050

0,072

0,078

0,097

0,094

0,247

0,081

0,103

0,116

0,058

0,060

0,170

0,036

0,027

0,027

0,062

0,017

0,017

-

-

-

0,069

0,018

0,018

-

-

-

0,038

8.32 x 10-3

8.38 x 10-3

-

-

-

4.4.5. Adaçayı ( Salvia triloba )

Şekil 4.46’da % 70 metanollü adaçayı ekstraktının, Şekil 4.47’de katı adaçayı

hidrolizatının kromatogramı görülmektedir. Adaçayı ekstraktının HPLC analizlerinde

standart madde katkısı yapılarak naringin, rozmarinik asit ve mirisetin; hidrolizatlarında

ise kafeik asit, rozmarinik asit, mirisetin, naringenin, luteolin ve apigenin belirlenmiştir.

74

Şekil 4.46: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş adaçayı kromatogramı

1.pik: naringin; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: mirisetin

Şekil 4.47: Kurutulmuş adaçayına doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat

kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: rozmarinik asit; 3.pik: mirisetin; 4.pik: naringenin; 5.pik: luteolin; 6.pik: apigenin

Şekil 4.48’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş adaçayı ekstraktının, ekstrakt


75

Şekil 4.48: Adaçayı ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Şekil 4.49-4.51’de demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin, bu çözeltinin sadece asit

ile olan hidrolizi ve asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizatların

kromatogramları görülmektedir.

Şekil 4.49: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin kromatogramı

76

Şekil 4.50: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin sadece asit ile hidrolizi sonucu elde


Şekil 4.51: Demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin asit+metanol ile hidrolizi sonucu elde


Tablo 4.15: Adaçayı örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




Demleme Çözeltisi



0,504

0,458

0,726

0,349

0,414

0,416

0,526

0,541

0,875

0,425

0,484

0,515

0,238

0,317

0,468

0,154

0,104

0,105

0,168

0,089

0,121

-

-

-

0,180

0,103

0,138

-

-

-

0,081

0,050

0,068

-

-

-

77

4.4.6. Ihlamur ( Tilia rubra )

Şekil 4.52’de % 70 metanollü ıhlamur ekstraktının, Şekil 4.53’de katı ıhlamur

hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.

Şekil 4.52: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş ıhlamur kromatogramı

Ihlamur hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik

asit, mirisetin, kuersetin ve kamferol belirlenmiştir.

Şekil 4.53: Kurutulmuş ıhlamura doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: kamferol

78

Şekil 4.54’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş ıhlamur ekstraktının, ekstrakt


Şekil 4.54: Ihlamur ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.16’da ıhlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri

görülmektedir.

Tablo 4.16: Ihlamur örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




0,616

0,758

0,680

0,734

0,928

0,835

0,375

0,267

0,258

-

0,136

0,067

-

0,142

0,070

-

0,082

0,039

4.4.7. Arslanpençesi ( Alchemilla xantochlora )

Şekil 4.55’de % 70 metanollü arslanpençesi ekstraktının, Şekil 4.56’da katı

arslanpençesi hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.

79

Şekil 4.55: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş arslanpençesi kromatogramı

Arslanpençesi hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak

klorojenik asit, kafeik asit, p-kumarik asit, mirisetin, kuersetin ve kamferol

belirlenmiştir.

Şekil 4.56: Kurutulmuş arslanpençesine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: p-kumarik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: kuersetin; 6.pik: kamferol

Şekil 4.57’de % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş arslanpençesi ekstraktının, ekstrakt


80

Şekil 4.57: Arslanpençesi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.17’de arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri

görülmektedir.

Tablo 4.17: Arslanpençesi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




1,230

1,010

1,610

1,520

1,240

1,930

0,766

0,591

0,798

-

0,121

0,156

-

0,135

0,173

-

0,092

0,117

4.4.8. Dereotu ( Anethum graveolens )

Şekil 4.58’de % 70 metanollü dereotu ekstraktının, Şekil 4.59’da katı dereotu


81

Şekil 4.58: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş dereotu kromatogramı

Dereotu hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak mirisetin

ve kuersetin belirlenmiştir.

Şekil 4.59: Kurutulmuş dereotuna doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin

Şekil 4.60’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş dereotu ekstraktının, ekstrakt


82

Şekil 4.60: Dereotu ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.18: Dereotu örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




0,103

0,132

0,268

0,129

0,146

0,368

0,049

0,100

0,118

-

0,039

0,059

-

0,042

0,063

-

0,027

0,041

4.4.9. Civanperçemi ( Achillea millefolium )

Şekil 4.61’de % 70 metanollü civanperçemi ekstraktının, Şekil 4.62’de katı

civanperçemi hidrolizatının kromatogramı görülmektedir.

Şekil 4.61: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş civanperçemi kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: ferulik asit; 4.pik: naringin; 5.pik: mirisetin; 6.pik: luteolin

83

Civanperçemi ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak

klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, naringin, mirisetin ve luteolin; hidrolizatlarında

ise klorojenik asit, kafeik asit, ferulik asit, mirisetin, naringenin, luteolin ve apigenin

belirlenmiştir.

Şekil 4.62: Kurutulmuş civanperçemine doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: klorojenik asit; 2.pik: kafeik asit; 3.pik: ferulik asit; 4. pik: mirisetin; 5.pik: naringenin; 6.pik: luteolin; 7.pik: apigenin

Şekil 4.63’te % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş civanperçemi ekstraktının, ekstrakt


Şekil 4.63: Civanperçemi ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

84

Tablo 4.19’da civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri

görülmektedir.

Tablo 4.19: Civanperçemi örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




0,283

0,262

0,349

0,300

0,329

0,457

0,125

0,253

0,338

0,048

0,055

0,044

0,054

0,066

0,057

0,035

0,032

0,027

4.4.10. Mercanköşk ( Origanum majorona )

Şekil 4.64’de % 70 metanollü mercanköşk ekstraktının, Şekil 4.65’de katı mercanköşk


Şekil 4.64: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş mercanköşk kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: naringin; 3.pik: rozmarinik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: luteolin

Mercanköşk ekstraktının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik

asit, naringin, rozmarinik asit, mirisetin ve luteolin; hidrolizatlarında ise kafeik asit, p-

kumarik asit, rozmarinik asit, mirisetin, naringenin ve luteolin belirlenmiştir.

85

Şekil 4.65: Kurutulmuş mercanköşke doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: p-kumarik asit; 3.pik: rozmarinik asit; 4.pik: mirisetin; 5.pik: naringenin; 6.pik: luteolin

Şekil 4.66’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş mercanköşk ekstraktının, ekstrakt


Şekil 4.66: Mercanköşk ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.20: Mercanköşk örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




0,616

0,555

0,821

0,640

0,688

0,994

0,341

0,360

0,495

0,377

0,068

0,107

0,410

0,083

0,124

0,177

0,036

0,056

86

4.4.11. Kekik ( Thymus vulgaris )

Şekil 4.67’de % 70 metanollü kekik ekstraktının, Şekil 4.68’de belirtilen katı kekik


Şekil 4.67: % 70 metanolle ekstrakte edilmiş kekik kromatogramı

Kekik hidrolizatlarının HPLC analizlerinde standart madde katkısı yapılarak kafeik asit,

mirisetin ve luteolin belirlenmiştir.

Şekil 4.68: Kurutulmuş kekiğe doğrudan uygulanan hidroliz sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: kafeik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: luteolin

87

Şekil 4.69’da % 70 metanol ile ekstrakte edilmiş kekik ekstraktının, ekstrakt


Şekil 4.69: Kekik ekstrakt, ekstrakt hidrolizatı ve katı bitki hidrolizatının spektrumu

Tablo 4.21’de kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri görülmektedir.

Tablo 4.21: Kekik örneklerinde toplam antioksidan kapasite değerleri (mmol TR/ g bitki)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)




0,890

0,900

1,420

1,100

1,010

1,650

0,483

0,467

1,010

-

0,040

0,064

-

0,044

0,071

-

0,027

0,044

4.5. SENTETİK KARIŞIMLARIN ANALİZ SONUÇLARI


Şekil 4.70’de sentetik karışım-1’in, Şekil 4.71’de sentetik karışım-1’in 2 saat hidroliz

sonrası; Şekil 4.72’de sentetik karışım-1’in 4 saat hidroliz sonrası kromatogramı

görülmektedir.

88

Şekil 4.70: Sentetik Karışım-1’in kromatogramı

1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: izokuersitrin; 3.pik: mirisetin; 4. pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin

Şekil 4.71: Sentetik Karışım-1’in 2 saat hidrolizi sonucunda elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin

Şekil 4.72: Sentetik Karışım-1’in 4 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: rozmarinik asit; 2.pik: mirisetin; 3.pik: kuersetin; 4.pik: luteolin; 5.pik: kamferol; 6.pik: apigenin

89

Tablo 4.22’de sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının hesaplanan toplam antioksidan

kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) görülmektedir.

Tablo 4.22: Sentetik karışım-1 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)

Sentetik Karışım

Sentetik Karışım 2 saat Hid.


4,03

3,75

3,52

4,54

4,31

3,98

1,99

1,17

1,15

3,49

2,95

1,94

3,99

3,38

2,23

1,65

1,81

1,19


Şekil 4.73’de sentetik karışım-2’nin, Şekil 4.74’de sentetik karışım-2’in 2 saat hidroliz

sonrası; Şekil 4.75’de sentetik karışım-2’in 4 saat hidroliz sonrası kromatogramı

görülmektedir.

Şekil 4.73: Sentetik Karışım-2’in kromatogramı

1.pik: izokuersitrin; 2. pik: mirisetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin

90


1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin


1.pik: mirisetin; 2.pik: kuersetin; 3.pik: luteolin; 4.pik: kamferol; 5.pik: apigenin

Tablo 4.23’de sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının hesaplanan toplam antioksidan

kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri) görülmektedir.

Tablo 4.23: Sentetik karışım-2 ve hidrolizatlarının toplam antioksidan kapasite değerleri (mM TR-eşdeğeri)


(CUPRACN)

HPLC

(CUPRACİ)

HPLC

(ABTS)

Sentetik Karışım



2,60

2,94

2,80

2,88

3,27

3,24

1,42

0,90

0,91

2,28

2,51

2,54

2,70

2,87

2,89

1,28

1,59

1,60

91

Tablo 4.24; HPLC’den hesaplanan kapasite değerlerinin, spektrofotometrik kapasite

değerlerine bölünmesiyle, HPLC yardımıyla hesaplanan kapasitenin spektrofotometrik

yolla bulunan kapasitenin % kaçını belirleyebildiğini ifade etmektedir.

Tablo 4.24: Bitki örneklerinin ve sentetik karışımların toplam antioksidan kapasitesinin HPLC yardımıyla belirlenebilen %’si

ÖRNEK % CUPRACN % CUPRACİ % ABTS

MAYDANOZ



% 70 Met Eks. 4 saat Hid.



m-fosforik Asitli Ekstrakt

70

77

59

60

38

53

52

68

60

45

35

48

>> 100

>> 100

>> 100

>> 100

>> 100

115

KEREVİZ YAPRAĞI


% 50 Met. Eks Hidrolizatı

% 50 Eta. Eks. Hidrolizatı


48

41

40

38

57

51

52

41

55

46

52

37

NANE




63

16

15

65

13

13

54

14

15

ISIRGAN




82

22

9

71

19

7

66

14

5

92


ADAÇAYI




33

19

17

34

19

16

34

16

14

IHLAMUR



18

10

15

8

31

15

ARSLANPENÇESİ



12

10

11

9

16

15

DEREOTU



30

22

29

17

27

35

CİVANPERÇEMİ




17

21

13

18

20

12

28

13

8

MERCANKÖŞK




61

12

13

64

12

12

52

10

11

KEKİK



4

5

4

4

6

4

93


SENTETİK KARIŞIM-1

Sentetik Karışım

Sent. Karışım 2 saat Hid.


87

79

55

88

78

56

83

>> 100

103

SENTETİK KARIŞIM-2

Sentetik Karışım



88

85

90

94

88

89

90

>> 100

>> 100

94

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Yiyecek ve içecek olarak tüketildiği gibi geleneksel olarak çeşitli hastalıkların

tedavisinde kullanılan pek çok bitki içinden seçilmiş olan adaçayı, arslanpençesi,

civanperçemi, dereotu, ıhlamur, ısırgan, kekik, kereviz yaprağı, maydanoz, mercanköşk

ve nane bitkilerinde bulunan ve antioksidan özelliğe sahip olan temel bileşiklerin neler

olduğunun, türlere göre nasıl bir dağılım gösterdiğinin, aynı zamanda türün toplam

antioksidan kapasitesine ne oranda katıldığının araştırıldığı çalışmada değişik

yöntemlerle elde edilen sonuçlar, mevcut sınırlı sayıdaki standart madde ile

karşılaştırma yapılarak değerlendirilmiştir.

Bu çalışmada spektrofotometrik toplam antioksidan kapasite tayininde; CUPRAC

yöntemi aşağıdaki avantajları nedeniyle seçilmiştir.

� Yöntem kolay, hızlı, etkili ve maliyeti düşük bir yöntemdir.

� Absorbansların toplamsallığı ilkesi geçerlidir.

� CUPRAC yöntemi ile hidrofilik antioksidanlar kadar lipofilik antioksidanların

da kapasiteleri ölçülebilmektedir.

� CUPRAC yönteminde kullanılan reaktif ABTS, DPPH gibi kromojenik radikal

reaktiflerinden çok daha kararlıdır. Ayrıca Folin reaktifiyle yükseltgenebilen

sitrik asit ve basit şekerler, CUPRAC reaktifi ile yükseltgenmezler.

� CUPRAC yöntemi ile tiyol içerikli (glutatyon ve sistein gibi) antioksidanların da

kapasite tayinini yapılabilirken FRAP yöntemi ile, bu yapıdaki antioksidanların

kapasite tayinleri yapılamaz. Bu durum Cu (II) ve Fe(III)’ün farklı kinetik

davranışlara sahip olması ile açıklanabilir. Cu (II)’nin reaksiyon kinetiği Fe(III)’

e göre daha hızlı gerçekleşir. Çünkü, Fe(III)’ ün yüksek spin d-orbitallerinin yarı

dolu oluşu ona kinetik bakımdan bir inertlik verir. Oysa Cu(II) ‘nin elektronik

konfigürasyonu, daha hızlı kinetik etki göstermesine imkan tanır. Sert ve

Yumuşak Asit-Baz teorisine göre; Cu(II) (yumuşak asit), Fe (III)’e göre tiyol

tipi (yumuşak baz) antioksidanlarla daha fazla etkileşir.

� CUPRAC yöntemi ile fizyolojik pH'a yakın ortamlarda çalışılabilirken,

fizyolojik pH’dan daha asidik koşullarda (FRAP; pH 3.6) örneğin indirgeme

95

kapasitesi, fenolik antioksidanların protonlanması sebebiyle bastırılır. Daha

bazik koşullarda ise (Folin; pH 10) fenolik türlerin dissosiasyonu nedeniyle

örneğin indirgeme kapasitesi artar.

Seçilen bitki örneklerinin analize hazırlanması için metanol, etanol ve aseton’un %100 ,

% 70 ve % 50 (v/v)’lik çözeltileri ve bisdistile su kullanılarak ekstraksiyon işlemi

uygulanmıştır. Maydanoz ve kereviz yaprağı ile yapılan ön denemeler sonucunda %

70’lik metanol çözeltisi ile 105 dakika ekstraksiyon işlemi uygulamanın uygun olduğu

görülmüştür. Bu nedenle de diğer örneklerde sadece belirlenen koşullarda ekstraksiyon

yapılmıştır. Literatürde metanolün koruyucu rolü olduğu ve fenolik bileşiklerin

fenoloksidaz gibi enzimlerle yükseltgenmesini engellediği de belirtilmiştir [101]. Bunun

haricinde yine antioksidan özelliğe sahip bileşiklerden olan askorbik asit açısından

zengin bir kaynak olduğu bilinen maydanoz bitkisinde ayrıca taze örnek kullanılarak %

1 (w/v)’lik m-fosforik asit çözeltisi ile ekstraksiyon yapılarak örnek hazırlanmıştır [99].

Adaçayı, nane ve ısırgan bitkileri için demleme işlemi uygulanarak, demleme çözeltileri

de hazırlanmış ve analiz işlemleri uygulanmıştır. Hazırlanan bütün örnekler 0.45 µm’lik

filtrelerden süzüldükten sonra ve gerektiği durumlarda seyreltme yapılarak

kullanılmıştır.

Antioksidan özelliğe sahip maddelerin en çok rastlanılanlarından olan flavonoid sınıfı

bileşikler genellikle glikozidleri halinde bulunmaktadır ve bu haliyle belirlenmeleri, her

biri için ayrı bir standart madde ihtiyacı gündeme geldiğinden dolayı oldukça zordur.

Bu sorunu ortadan kaldırmak için bitki örnekleri hidroliz edilmiş ve aglikon türevlerine

dönüştürülerek miktarlandırılmıştır. Bitki örnekleri, 1.2 M HCl ve % 50 metanol içeren

ortamda 80 oC’de 2 saat süre ile hidroliz edilmiştir. [100]. Civanperçemi, adaçayı,

mercanköşk ekstraktlarında belirlenen naringinin, hidroliz sonrasında aglikon türevi

naringenine dönüştüğü görülmüştür. Ancak özellikle maydanoz ve kereviz yaprağı gibi

apigeninin glikozidleri halinde bulunduğu bitkilerde, literatürde de belirtildiği gibi [102]

4 saatlik hidroliz uygulanmıştır. Şekil 4.27 ve 4.28’deki kromatogramlardan da

görüldüğü gibi 36. dakikada gelen pik 4 saatlik hidroliz sonunda oldukça azalmakta ve

apigenin pikinde artış olmaktadır. Ancak bu kadar uzun hidroliz süresinde maydanozda

belirlenen mirisetinin 4 saatlik hidroliz sonunda bulunan miktarı, 2 saatlik hidroliz

sonrasında bulunan miktarın yaklaşık yarısı kadardır. Dolayısıyla bu uzun hidroliz

96

süresinde mirisetinin, literatürde verilen bilgiye göre de [103,104,105] kısmen

bozulduğu bu çalışmada doğrulanmıştır.

Ayrıca bu hidroliz koşullarında fenolik asitlerin büyük oranda bozunmaya uğradığı

görülmüştür [103,105,106]. Isırganda yapılan çalışmada, ekstraktta yüksek oranda

klorojenik asit belirlenirken (Şekil 4.43), hidroliz sonrası miktarı önemli derecede

azalmaktadır (Şekil 4.44). Buna ek olarak ekstraktın kendisinde kafeik asit

belirlenemezken hidroliz sonrası kafeik asite rastlanması, literatürde de klorojenik asitin

kafeik asitin depolanmış türü olduğu ve klorojenik asitin biyosentezi sırasında kuinik

asit çiftinin kafeik kısma olan dönüşümü tersinir olduğu belirtildiğinden Şekil 2.13’de

de görüldüğü gibi klorojenik asitin kafeik asite dönüşebileceği ihtimali düşünülmektedir

[77,78]. Yine aynı şekilde nane ekstraktında ve adaçayı ekstraktlarında kafeik asit esteri

olan rozmarinik asit belirlenirken, hidroliz sonrasında rozmarinik asit miktarında bir

azalma görülmekte, ekstraktın kendisinde kafeik asit belirlenmezken hidroliz sonrasında

belirlenmesi türlerin dönüşümünü düşündürmektedir. Bu amaçla rozmarinik asit

standartı hidroliz edilmiş, bozunma ürünlerinden birinin standart madde katkısıyla

kafeik asit olduğu belirlenmiştir (Şekil 5.1).

Şekil 5.1: Rozmarinik asit standartının 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

1.pik: Kafeik asit; 2.pik Rozmarinik asit

97

Bunların sonucu olarak, örnek ekstraktları ve hidrolizatları için spektrofotometrik olarak

belirlenmiş olan toplam antioksidan kapasite değerleri farklı olduğu gibi, HPLC

yardımıyla hesaplanmış olan değerler arasında da farklılıklar ortaya çıkmıştır. Elde

edilen verilerden yola çıkılarak türlerde bulunan antioksidan bileşiklerden aglikon ya da

glikozid halinde neler bulunduğu ve bunların toplam antioksidan kapasiteye olan

katkıları belirlenmeye çalışılmıştır.

Çalışılan bitkilerde HPLC ile belirlenebilen bileşenler açısından literatür ile tutarlılık

görülmektedir. Maydanozda apigenin [82,95,96]; kereviz yaprağında apigenin, luteolin

[82,95,100]; nanede rozmarinik asit [82,97]; luteolin [96,97], ısırganda klorojenik asit

[93]; ıhlamurda kuersetin, kamferol [82,92,93,98]; adaçayında rozmarinik asit, luteolin

[82]; dereotunda kuersetin [96]; arslanpençesinde kuersetin [82]; mercanköşkte kafeik

asit, kumarik asit, rozmarinik asit [91]; civanperçeminde apigenin ve luteolin [82]

belirlenmiştir.

Bunların dışında, bitkilerde kuvvetle olması muhtemel ve gerek CUPRAC gerekse

ABTS yöntemi ile reaksiyon veren tannik asitin (tanenler) kapasiteye etkisi

değerlendirilmek istenmiş ancak aşağıdaki kromatogramdan da görüldüğü gibi olasılıkla

polikondanse tanenlerden kaynaklanan çok sayıda pikin mevcut olduğu bir

kromatogram elde edilmiştir (Şekil 5.2). Bundan dolayı bitki örneklerinde kalitatif ve

kantitatif tannik asit değerlendirilmesi yapılamamıştır.

Şekil 5.2: % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin kromatogramı

98

Çalışılan bütün bitki örneklerinin hidrolizat kromatogramların da görüldüğü gibi,

yaklaşık 12.5 ve 17.5 dakika alıkonma zamanına sahip piklerin tanımlanmasında

zorluklar yaşanmıştır. 12.5 dakikada gelen ilk pikin , gelme zamanı olarak gallik asit

olabileceği düşünülmüş yapılan standart madde katkı neticesinde gallik asit olmadığı

belirlenmiştir. Bunun gallik asit türevi bir yapı olabileceği tahmin edilmektedir. 17.5

dakikada gelen pikin, gelme zamanı olarak kateşin olabileceği düşünülmüş, standart

madde katkısıyla bazı bitki hidrolizatlarının pikinde artış yaratırken bazılarında tam

ayrılamayan pikler oluşturmuştur. Dolayısıyla standart kateşin katkısıyla piklerinde artış

yaratan bitkilerde de kateşin olarak kapasite hesabı yapılmamıştır. Ayrıca demlenerek

hazırlanan nane çözeltisinin sadece asit ile olan hidrolizinde (Şekil 4.41) kateşin olması

düşünülen pik görülmezken, metanollü HCl hidrolizinde (Şekil 4.42) bu pik

görülmektedir. Ancak spektrofotometrik kapasite sonuçları değerlendirildiğinde, sadece

asit ile ele geçen hidrolizatın kapasite değeri az da olsa metanollü HCl hidrolizinden

fazla çıkmakta (Tablo 4.13) dolayısıyla bu belirlenemeyen pikin kateşin olmadığı da

doğruluk kazanmaktadır. Yine aynı şekilde, demlenerek hazırlanan adaçayı çözeltisinin

asit ile olan hidrolizinde (Şekil 4.50) pik görülmemekte ancak metanollü HCl

hidrolizinde (Şekil 4.51) görülmektedir. Tablo 4.15’de, iki farklı hidroliz durumunda

toplam kapasite açısından farklılık olmadığı görülmektedir. Ayrıca, literatürde

kateşinlerin hidroliz koşullarında büyük oranda bozunduğu da belirtilmektedir

[103,104,106]. 280 nm’de belirlenen karakteristik bu iki pikin Şekil 5.3’de görüldüğü

gibi tannik asitin hidrolizi sonucu oluşan ürünler olduğu tahmin edilmektedir.

Şekil 5.3: % 70 metanolde hazırlanan tannik asit çözeltisinin 2 saat hidrolizi sonucu elde edilen hidrolizat kromatogramı

99

Farklı yöntemler (spektrofotometri ve HPLC) kullanılarak elde edilmiş olan farklı

bulguların doğru olarak değerlendirilmesini yapabilmek için en çok rastlanılan

maddelerin standartları ile sentetik karışımlar hazırlanmış ve analiz yöntemleri

uygulanmıştır. Sentetik karışımların 2 saat ve 4 saat hidrolizatlarında ve antioksidan

kapasitesi düşük bitki örneklerinin hidrolizatlarında NaOH ile pH ayarlaması (∼ pH 6.0

-6.5) gerçekleştirilmiş, ancak ABTS yöntemi ile 6. dakikaya varmadan bu örneklerde

bulanıklık oluştuğu gözlenmiştir. Bu nedenle asidik örnekler uygun oranlarda

seyreltilerek, pH ayarlaması yapılmaksızın ABTS yöntemi uygulanmıştır. Sonuçlara

bakıldığında HPLC yardımıyla hesaplanan kapasite değerleri ile ABTS yöntemi ile elde

edilen kapasite değerleri arasında büyük bir uyumsuzluğun olduğu, HPLC kapasite

değerlerinin çok yüksek çıkmasıyla beklenen kapasitenin gerçekleşmediği görülmüştür.

Ancak sentetik karışımların ve hidrolizatlarının CUPRAC yöntemi ve HPLC analizleri

ile elde edilen toplam kapasite değerleri arasında uyum vardır. Bu da CUPRAC

yönteminde absorbansların toplamsallığı varsayımını doğrulamaktadır.

Tablo 4.9’daki TEAC (troloks eşdeğer antioksidan kapasite) verilerinin

incelenmesinden şu özellikler görülmektedir:

a) CUPRAC yönteminin, kuersetin ve rozmarinik asit için en yüksek TEAC

katsayılarını verdiği görülmektedir. Her iki bileşikte de –OH gruplarının

sayısına ve konumuna, aynı zamanda molekülün toplam konjugasyon derecesine

bakıldığında bu bileşiklerin en yüksek antioksidan etkinliği göstermesi

beklenmelidir ki CUPRAC yöntemi buna olanak vermektedir. Rozmarinik asitin

antioksidan aktivitesinin; troloks, α-tokoferol ve BHT’ye göre defalarca yüksek

olması gerektiği literatürde belirtilmiştir [107,108]. Rozmarinik asitin,

antioksidan aktivitesini doğrulamak bakımından CUPRAC yöntemi, ABTS

yöntemine göre üstündür.

b) Hidroksi sinnamik asitlerde CUPRAC yönteminin gösterdiği TEAC sırası:

Rozmarinik asit > kafeik asit ≥ klorojenik asit > ferulik asit > p-kumarik asit

şeklindedir (Tablo 4.9). Bu sıra, -OH gruplarının sayısı ve konumuna olduğu kadar

toplam konjugasyon derecesine ve orto- /para- mevkiinde elektron destekleyici

metoksi gruplarının varlığına duyarlı ve bunlarla uyum içindedir. Oysa bu

bileşiklerin ABTS yöntemine göre TEAC değerleri, belirtilen yapı-aktivite

100

ilişkileriyle uyarlı değildir [109]. Bu da CUPRAC yönteminin ABTS/TEAC’a bir

üstünlüğü sayılmalıdır.

Çalışılan bitki örneklerinin HPLC ile edilen kapasite değerleri; CUPRAC yöntemi ile

elde edilen kapasite değerlerinin ısırgan ekstraktında % 82’lik; maydanozun farklı

hidrolizatlarında % 60-77; nane ekstraktında % 63; mercanköşk ekstraktında % 61;

kereviz yaprağının farklı hidrolizatlarında % 41-57 ve adaçayı ekstraktında 33’lük

kısmını belirlemektedir (Tablo 4.24). Ancak civanperçemi, ıhlamur ve arslanpençesi

hidrolizatlarında bu oran gerek CUPRAC gerekse ABTS yöntemleri ile % 10-20

arasında kalmaktadır. Standart madde eksikliğinden dolayı bazı bileşenlerin

belirlenememesi, tanenlerin kapasiteye katkısının değerlendirilememesi, hidroliz sonucu

türlerin birbirine dönüşümü gibi bir çok faktör göz önünde bulundurulduğunda HPLC

ile doğrulamanın güç olduğu görülmektedir.

Bir bitki ekstraktında mevcut antioksidanların tümü belirlenirse, bunların derişimleri

denel olarak saptanmış TEAC (troloks eşdeğeri antioksidan kapasite) katsayıları ile

çarpılarak ve bu çarpımlar toplanarak ekstraktın kuramsal olarak beklenen toplam

antioksidan kapasitesi hesaplanabilir. Eğer HPLC kromatogramından tüm

antioksidanlar saptanmış ise bu yolla bulunan kapasite, denel olarak ölçülen antioksidan

kapasite ile bağdaşmalıdır.

Sonuç olarak; seçilen bitki türlerindeki antioksidan özelliğe sahip bileşiklerin neden

olduğu toplam antioksidan kapasitenin ve bu bileşiklerin toplam kapasiteye olan

katkılarının tek tek belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda ısırgan, maydanoz,

kereviz yaprağı, nane, mercanköşk gibi türlerde başarılı sonuçlar alınırken çok sayıda

farklı özelliğe sahip bileşen içeren diğer türlerde yukarıda açıklamaya çalıştığımız

nedenlerden dolayı değerlendirmede güçlükler ortaya çıkmıştır.

Çalışılan bitki örneklerinin ekstraktlarında CUPRAC yöntemi ile belirlenmiş olan

toplam antioksidan kapasitesi sıralaması; arslanpençesi > kekik > ıhlamur > mercanköşk

> adaçayı > nane > civanperçemi > kereviz yaprağı> dereotu > ısırgan > maydanoz

şeklindedir.

101

KAYNAKLAR

1. NICHENAMETLA, S. N., TARUSCIO, T. G., BORNEY, D. L., EXON, J. H., 2006, A rewiev of the effects and mechanisms of the polyphenolics in cancer, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46, 161-183.

2. CARDENAS, M., MANDER, M., BLANK, V. C., ROGUIN, L. P., 2006,

Antitumor activity of some natural flavonoids and synthetic derivatives on various human and murine cancer cell lines, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 14, 2966-2971.

3. SROKA, Z., 2005, Antioxidative and antiradical properties of plant phenolics,

Zeitschrift für Naturforschung, 60 (11-12) 833-843. 4. ARUOMA, O. I., 1994, Nutrition and health aspects of free radicals and

antioxidants, Food Chemistry Toxicology, 32, 671-683. 5. BURR, M. L., 1994, Antioxidant and cancer, Journal of Human Nutrition and

Dietetics, 7, 409-416. 6. HENNIG, B., TOBOREK, M., 1993, Antioxidants and atherosclerosis, Journal

of Optimal Nutrition, 2, 213-216. 7. SURVESWARAN, S., CAI, Y., CORKE, H., SUN, M., 2007, Systematic

evaluation of natural phenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants, Food Chemistry, 102, 938-953.

8. PARK, E. J., PEZZUTTO, J. M., 2002, Botanicals in cancer chemoprevention,

Cancer and Metastasis Reviews, 21, 231-255. 9. KÄHKONEN, M.P., HOPIA, A. I., VUROELA, H. J., RAUHA, J. P.,

PIHLAJA, K., KUJALA, T. S., et al., 1999, Antioxidant activity of plants extracts containing phenolic compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 3954-3962.

10. MILLER, N. J., RICE EVANS, C. A., DAVIES, M. J., GOPINATHAN, V.,

MILNER, A., 1993, A novel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates, Clinical Science, 84, 407-412.

11. WHITEHEAD, T. P., THORPE, G. H. G., MAXWELL, S. R. J., 1992,

Enhanced chemiluminescent assay for antioxidant capacity in biological fluids, Analytica Chimica Acta, 266, 265-277.

102

12. CAO, G., ALESSIO, H. M., CUTLER, R. G., 1993, Oxygen-radical absorbance capacity assay for antioxidants, Free Radical Biology & Medicine, 14, 303-311.

13. GHISELLI, A., SERAFINI, M., MAIANI, G., AZZINI, E., FERRO-LUZZI, A.,

1995, A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability, Free Radical Biology & Medicine, 18, 29-36.

14. WAYNER D.D.M., BURTON G. W., INGOLD K. LOCKE U. S., 1985,

Quantitative measurement of the total peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation, FEBS Letters, 187, 33-37.

15. SALAH, N., MILLER, N. J., PAGANGA, G., TIJBURG, L., RICE-EVANS, C.

A., 1995, Polyphenolic flavonols as scavengers of aqueous phase radicals and as chain-breaking antioxidants, Archives Biochemistry and Biophysics, 322, 339-346.

16. GLAZER, A. N., 1990, Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive

oxygen species, Methods in Enzymology, 186, 161-168. 17. RICE-EVANS, C. A., MILLER, N. J., 1996, Antioxidant activities of flavonoids

as bioactive components of food, Biochemical Society Transactions, 24, 790-795.

18. WANG, H., CAO, G., PRIOR, R.L., 1996, Total antioxidant capacity of fruits,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 701-705. 19. RICE-EVANS, C. A., MILLER, N. J., PAGANGA, G., 1996, Structure-

antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids, Free Radical Biology & Medicine, 20, 933-956.

20. MILLER, N. J., RICE-EVANS, C. A., 1994, Total antioxidant status in plasma

and body fluids, Methods in Enzymology, 234, 279-293. 21. CAO, G., VERDON, C. P., WU, A. H. B., WANG, H., PRIOR, R. L., 1995,

Automated oxygen radical absorbance capacity assay using the COBAS FARA II, Clinical Chemistry, 41, 1738-1744.

22. BENZIE, I. F. F., STRAIN, J. J., 1996, Ferric reducing ability of plasma (FRAP)

as a measure of ‘antioxidant power’; the FRAP assay, Analytical Biochemistry, 239, 70-76.

23. VALKONEN, M., KUUSI, T., 1997, Spectrophotometric assay for total radical-

trapping antioxidant potential in human serum, Journal of Lipid Research, 38, 823-833.

103

24. WINSTON, G. W., REGOLI, F., DUGAS, A. J. Jr., FONG, J. H., BLANCHARD, K. A., 1998, A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids, Free Radical Biology & Medicine, 24, 480-493.

25. SANCHEZ, M. C., LARRAURI, J.A., SAURA, C. F., 1998, A procedure to

measure the antiradical efficiency of polyphenols, Journal of the Science of Food and Agriculture, 76, 270-276.

26. ALHO, H., LEINONEN, J., 1999, Total antioxidant activity measured by

chemiluminescence methods, Methods in Enzymology, 299, 3-14. 27. TUBARO, F., GHISELLI, A., PAPUZZI, P., MAIORINO, M., URSINI, F.,

1998, Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics, Free Radical Biology & Medicine, 24, 1228-1234.

28. SINGLETON, V. L., ROSSI, J. A., 1965, Colorimetry of total phenolics with

phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, 144-158.

29. SINGLETON, V. L., ORTHOFER, R., LAMUELA-RAVENTOS, R. M., 1999,

Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymolology, 299, 152-178.

30. LUSSIGNOLI, S., FRACCAROLI, M., ANDRIOLI, G., BROCCO, G.,

BELLAVITE, P., 1999, A microplate-based colorimetric assay of the total peroxyl radical trapping capability of human plasma, Analytical Biochemistry, 269, 38-44.

31. TÜTEM, E., APAK, R., BAYKUT, F., 1991, Spectrophotometric determination

of trace amounts of copper(I) and reducing agents with neocuproine in the presence of copper(II), The Analyst, 116, 89-94.

32. TÜTEM, E., APAK, R., 1991, Simultaneous spectrophotometric determination

of cystine and cysteine in amino acid mixtures using copper(II)-neocuproine reagent”, Analytica Chimica Acta, 255, 121-125.

33. TÜTEM, E., APAK, R., GÜNAYDI, E., SÖZGEN, K., 1997,

Spectrophotometric determination of vitamin E (α-tocopherol) by the copper(II)-neocuproine reagent, Talanta, 44, 249-255.

34. GÜÇLÜ, K., SÖZGEN, K., TÜTEM, E., ÖZYÜREK, M., APAK, R., 2005,

Spectrophotometric determination of ascorbic acid using copper(II)-neocuproine reagent in beverages and pharmaceutical, Talanta, 65, 1226-1232.

35. SÖZGEN, K., DEMİRCİ-ÇEKİÇ, S., TÜTEM, E., APAK, R., 2005,

Spectrophotometric total protein assay with copper(II)-neocuproine reagent in alkaline medium, Talanta, 68, 1601-1609.

104

36. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., 2004, Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 7970-7981.

37. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., ERÇAĞ, E.,

2006, The CUPRAC antioxidant capacity and polyphenolics content of some herbal teas, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 57, 292-304.

38. GÜÇLÜ, K., ALTUN, M., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., APAK, R.,

2006, Antioxidant capacity of fresh, sun- and sulfited-dried Malatya apricot (Prunus Armeniaca) assayed by CUPRAC, ABTS/TEAC and Folin Methods, International Journal of Food Science Technology, 41, 76-85.

39. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., KARADEMIR, S. E., ALTUN, M.,

2005, Total antioxidant capacity assay of human serum using copper(II)-neocuproine as chromogenic oxidant: The CUPRAC Method, Free Radical Research, 39, 949-961.

40. RE, R., PELLEGRINI, N., PROTEGGENTE, A., PANNALA, A., YANG, M.,

RICE-EVANS C. A., 1999, Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorisation assay, Free Radical Biology & Medicine, 26, 1231-

41. GÖNENÇ, A., ATAK, Y., ORMAN, M. N., ŞIMŞEK, B., 2002, Lipid

Peroxidation and Antioxidant Systems in Hemodialyzed Patients, Dialysis and Transplantation, 31, 88-96.

42. HALLIWELL, B., AESCHBACH, R., LÖLIGER, J., ARUOMA, O. I., 1995,

The characterization of antioxidants, Food and Chemical Toxicology, 33, 601-617.

43. SHAHIDI, F., 1996, Natural Antioxidants, Chemistry, Health Effects and

Applications, AOCS Press, Champaign- Illinois, 0-935315-77-2. 44. SHAHIDI, F., NACZK, M., 1995, Food Phenolics: Sources, Chemistry, Effects

and Applications, Technomic Publ. Co., Lancaster-Basel, 1566762790. 45. CADENAS, E., PACKER, L., 2002, Handbook of Antioxidants, Marcel Dekker,

New York-Basel, 0-8247-0547-5. 46. WHEELER, G. L., JONES, M. A., SMIRNOFF, N., 1998, The biosynthetic

pathway of vitamin C in higher plants, Nature, 393, 365-369. 47. WOODALL, A.A., AMES, B. N., 1997, Diet and oxidative damage to DNA:

The importance of ascorbate as an antioxidant, Vitamin C in Health and Disease, Markel Dekker, New York, 193-203.

48. BENDICH, A., 1997, Vitamin C safety in humans, Vitamin C in Health and

Disease, Markel Dekker, New York, 367-379.

105

49. HALLIWELL, B., 1996, Vitamin C: antioxidant or pro-oxidant in vivo?, Free Radical Research, 25, 439-454

50. BUETTNER, G. R., 1993, The pecking order of free radicals and antioxidants:

lipid peroxidation, α-tocopherol, and ascorbate, Archives Biochemistry and Biophysics , 300, 535-543.

51. BUETTNER, G. R., JURKIEWICZ, B. A., 1996, Catalytic metals, ascorbate and

free radicals: combinations to avoid, Radiation Research, 145, 532-541.

52. BJORNEBOE, A., BJORNEBOE, G. E., DREVON, C. A., 1990, Absorption, transport and distribution of vitamin E, The Journal of Nutrition, 120, 233-242.

53. BRIGELIUS-FLOHE, R., TRABER, M. G., 1999, Vitamin E: function and

metabolism, FASEB Journal, 13, 1145-1155.

54. HORWITT, M. K., 1986, Interpretations of requirements for thiamin, riboflavin, niacin-tryptophan, and vitamin E plus comments on balance studies and vitamin B-6, American Journal of Clinical Nutrition, 44, 973-985.

55. VAN GOSSUM, A., SHARIFF, R., LEMOYNE, M., KURIAN, R.,

JEEJEEBHOY, K., 1988, Increased lipid peroxidation after lipid infusion as measured by breath pentane output, American Journal of Clinical Nutrition, 48, 1394-1399.

56. SHEPPARD, A. J., PENNINGTON, J. A. T., WEIHRAUCH, J. L., 1993,

Analysis and distribution of vitamin E in vegetable oils and foods, Vitamin E in Health and Disease, Markel Dekker, New York.

57. ONG, A. S.H., 1993, Natural sources of tocotrienols, Vitamin E in Health and

Disease, Markel Dekker, New York, 3-8.

58. PFANDER, H., 1987, Key to Carotenoids, Birkhäuser Verlag, Basel, 0817618600.

59. QUIRƠS, A. R.B., COSTA, H. S., 2006, Analysis of carotenoids in vegetable

and plasma samples: A review, Journal of Food Composition and Analysis, 19, 97-111.

60. OLSON, J.A., 1999, Carotenoids, Modern Nutrition in Health and Disease,

Williams & Wilkins, Baltimore, 0781741335.

61. KRINSKY, N. I., 1993, Actions of carotenoids in biological systems, Annual Review of Nutrition, 13, 561-587.

62. SIES, H., STAHL, W., 1995, Vitamins E and C, β-carotene, and other

carotenoids as antioxidants, American Journal of Clinical Nutrition, 62, 1315-1321.

106

63. BURTON, G. W., INGOLD, K. U., 1984, β-carotene: an unusual type of lipid antioxidant, Science, 224, 569-573.

64. RICE-EVANS, C.A., MILLER, N. J., BOLWELL, P.G., BRAMLEY, P. M.,

PRIDHAM, J. B., 1995, The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenolic flavonoids, Free Radical Research, 22, 375-383.

65. VAN ACKER, S., VAN-DEN BERG, D. J., TROMP, M.N., GRIFFIOEN, D.

H., VAN BEBBEKOM, W.P., VAN DER, W.J.F., BAST, A., 1996, Structural aspects of antioxidants activity of flavonoids, Free Radical Biology & Medicine, 20, 331-342.

66. BROWN, J. A., KHODR, H., HIDER, R. C., RICE-EVANS, C., 1998,

Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ ions: implications for their antioxidant properties, Biochemical Journal, 330, 1173-1178.

67. HAVSTEEN, B., 1983, Flavonoids, a class of natural products of high

pharmacological potency, Biochemical Pharmacology, 32, 1141-1148.

68. KUHNAU, J., 1976, The Flavonoids. A class of semi-essential food components: Their role in human nutrition, Wld. Rev. Nutr. Diet., 24, 117-191.

69. COOK, N. C., SAMMAN, S., 1996, Flavonoids –Chemistry, metabolism,

cardioprotective effects, and dietary sources, Nutritional Biochemistry, 7, 66-76. 70. HARBORNE, J. B., 1967, Comparative biochemistry of the flavonoids,

Academic Press, London. 71. HEIM, K. E., TAGLIAFERRO, A. R., BOBILYA, D. J., 2002, Flavonoid

antioxidants: chemistry, metabolism and structure-activity relationships, Journal of Nutritional Biochemistry, 13, 572-584.

72. DZIEDZIC, S. Z., HUDSON, B. J. F., 1983, Polyhydroxychalcones and

flavanones as antioxidants for edible foods, Food Chemistry, 12, 205-212. 73. ABU-AMSHA, R., CROFT, K. D., PUDDEY, I. B., PROUDFOOT, J. M.,

BEILIN, L. J., 1996, Phenolic content of various beverages determines the extent of inhibition of human serum and low density lipoprotein oxidation in vitro: identification and mechanism of action of some cinnamic acid derivatives from red wine, Clinical Science, 91, 449-458.

74. HELLER, W., FORKMANN, G., 1993, Biosynthesis of flavonoids, The

flavonoids: Advances in Research since 1986, Chapman & Hall, London, 499-535.

75. WALLACE, G., FRY, S. C., 1994, Phenolic components of the plant cell wall,

International Review of Cytology, 151, 229-267.

107

76. HERRMANN, K., 1989, Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods, Critical Review Food Science and Nutrition, 28, 315-347.

77. RHODES, M., WOOLTORTON, L., 1976, The enzymic conversion of

hydroxycinnamic acids to p-coumarylquinic and cholorogenic acids in tomato fruits, Phytochemistry, 18, 929-933.

78. ULBRICH, B., ZENK, M., 1979, Partial purification and properties of

hydroxycinnamoyl-CoA: quinate hydroxycinnamoyl transferase from higher plants, Phytochemistry, 18, 929-933.

79. KAHNT, G., 1967, Trans-cis eqilibrium of hydroxy cinnamic acids during

irradiation of aqueous solutions at different pH, Phytochemistry, 6, 755-758. 80. BRUNE, M., ROSSANDER, L., HALLBERG, L., 1989, Iron absorption and

phenolic compound: Importance of different phenolic structures, European Journal of Clinical Nutrition, 43, 547-558.

81. MIDDLETON, E., KANDASWAMI, C., 1993, The impact of plant flavanoids

on mammalian biology: Implications for ımmunity, in flammation and cancer, The Flavonoids: Advances in Research Since 1986, Chapman and Hall, London, 0-412-48070-0.

82. ÇUBUKÇU, B., MERİÇLİ, A. H., MAT, A., SARIYAR, G., SÜTLÜPINAR,

N., MERİÇLİ, F., 2002, Fitoterapi Yardımcı Ders Kitabı, İ.Ü. Basım ve Yayınevi Müdürlüğü, İstanbul, 975-404-647-6.

83. GIROTTI S., FERRI E., MACCAGNANI L., BUDINI R., BIANCHI G., 2002

Plasma Antioxidant Capacity Determination: Comparative Evaluation of Chemiluminescent and Spectrophotometric Assays, Talanta, 56, 407-414.

84. WAYNER, D. D. M., BURTON, G. W., INGOLD, K. U., LOCKE, S., 1986,

The antioxidant efficiency of vitamin C is concentration-dependent, Biochimica et Biophysica Acta, 884, 119-123.

85. CAO, G., PRIOR, R.L., 1999, In vivo antioxidant capacity: comperison of

different analytical methods, Free Radical Biology & Medicine, 27, 1173-1181. 86. CAO, G., PRIOR, R. L ., 1999, The measurement of oxygen radical absorbance

capacity in biological samples, Methods in Enzymology 299, 50-62. 87. KOHEN, R., YANNAI, E., BERRY, E.M., TIROSH, O., 1999, Overall low

molecular weight antioxidant activity of biyological fluids and tissues by cyclic voltammetry, Methods in Enzymology, 300, 285-296.

88. CHEVION, S., BERRY, E. M., KITROSSKY, N. K., KOHEN. R., 1997,

Evaluation of plasma low molecular weight antioxidant capacity by cyclic voltammetry, Free Radical Biology and Medicine, 22, 411-421.

108

89. IQBAL, S., BHANGER, M. I., ANWAR, F., 2007, Antioxidant properties and components of bran extracts from selected wheat varieties commercially available in Pakistan, Food Science and Techonology, 40, 361-367.

90. OSZMIANSKI, J., WOJDYLO, A., LAMER-ZARAWSKA, E., SWIADER, K.,

2007, Antioxidant tannins from Rosaceae plant roots, Food Chemistry, 100, 579-583.

91. CHUN, S., VATTEM, D. A., LIN, Y. T., SHETTY, K., 2005, Phenolic

antioxidants from clonal oregano (Origanum vulgare) with antimicrobial activity against Helicobacter pylori, Process Biochemistry, 40, 809-816.

92. TOKER, G., ASLAN, M., YEŞİLADA, E., MEMİŞOĞLU, M., ITO, S., 2001,

Comparative evaluation of the flavonoid content in officinal Tiliae flos and Turkish lime species for quality assessment, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26, 111–121.

93. EXARCHOU, V., FIANEGOS, Y. C., VAN BEEK, T. A., NANOS, C.,

VERVOORT, J., 2006, Hyphenated chromatographic techniques for the rapid screening and identification of antioxidants in methanolic extracts of pharmaceutically used plants, Journal of Chromatography A, 1112, 293-302.

94. URBONAVİČİŪTĖ, A., JAKSTAS, V., KORNYSOVA, O., JANULIS, V.,

MARUSKA, A., 2006, Capillary electrophoretic analysis of flavonoids in single-styled hawthorn (Crataegus monogyna Jacq.) ethanolic extracts, Journal of Chromatography A, 1112, 339-344.

95. JUSTESEN, U., KNUTHSEN, P., LETH, T., 1998, Quantitative analysis of

flavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables and beverages by high-performance liquid chromatography with photo-diode array and mass spectrometric detection, Journal of Chromatography A, 799, 101-110.

96. JUSTESEN, U., KNUTHSEN, P., 2001, Composition of flavonoids in fresh

herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes, Food Chemistry, 73, 245-250.

97. AREIAS, F. M., VALENTÃO, P., ANDRADE, P. B., FERRERES, F.,

SEABRA, R. M., 2001, Phenolic fingerprint of peppermint leaves, Food Chemistry, 73, 307-311.

98. KARAKAYA, S., EL, N. S., 1999, Quercetin, luteolin, apigenin and kamferol

contents of some foods, Food Chemistry, 66 , 289-292. 99. SINGH, J., UPADHYAY, A. K., BAHADUR, A., SINGH, B., SINGH, K. P.,

RAI, M., 2006, Antioxidant phytochemicals in cabbage (Brassica oleracea L. var. capitata), Scientia Horticulturae, 108, 233-237.

109

100. HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H., VENEMA, D. P., 1992, Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 1591-1598.

101. HARBORNE, J. B., 1998, Phenolic compounds. In J. B. Harborne,

Phytochemical methods; a guide to modern techiques of plant analysis, Chapman and Hall, London.

102. HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H., KATAN, M. B., 1992, Content of

potentially anticarcinogenic flavonoids of 28 vegetables and 9 fruits commonly consumed in the Netherlands, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40, 2379-2383.

103. HÄKKINEN, S. H., KÄRENLAMPI, S. O., HEIONEN, I. M., MYKKÄNEN,

H. M., TORRONEN, A. R., 1998, HPLC method for screening of flavonoids and phenolic acids in berries, Journal of the Science of Food and Agriculture, 77, 543-551.

104. MERKEN, H. M., BEECHER, G. R., 2000, Measurement of food flavonoids by

high-performance liquid chromatography: a review. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, 577-599.

105. NUUTILA, A., M., KAMMIOVIRTA, K., OKSMAN-CALDENTEY, K. -M.,

2002, Comparison of methods for the hydrolysis of flavonoids and phenolic acids from onion and spinach for HPLC analysis, Food Chemistry, 76, 519-525.

106. HUANG, Z., WANG, B., EAVES, D. H., SHIKANY, J., M., PACE, R., D.,

2007, Phenolic compound profile of selected vegetables frequently consumed by African Americans in the southeast United States, Food Chemistry, 103, 1395-1402.

107. CHEN, J. H., HO, C. T., 1997, Antoxidant activities of caffeic acid and its

related hydroxycinnamic acid compounds, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 2374-2378.

108. TEPE, B., EMİNAĞAOĞLU, Ö., AKPULAT, H. A, AYDIN, E., 2007,

Antioxidant potentials and rosmarinic acid levels of the methanolic extracts of Salvia verticillata (L.) subsp. verticillata and S. verticillata (L.) subsp. amasiaca (Freyn & Bornm.) Bornm, Food Chemistry, 100, 985-989.

109. APAK, R., GÜÇLÜ, K., ÖZYÜREK, M., ÇELİK, S. E., 2007, Mechanism of

antioxidant capacity assays and the CUPRAC method, Microchimica Acta, Baskıda, DOI: 10.1007/s00604-007-0777-0.

110

ÖZGEÇMİŞ

08.03.1981 Almanya doğumluyum. İlköğrenimimi Halil Bedii Yönetken İlköğretim Okulu’nda, lise öğrenimimi Bakırköy Sabri Çalışkan Lisesi’nde tamamladım. 1999 yılında Öğrenci Seçme ve Yerleştirme Merkezi tarafından düzenlenen üniversite giriş sınavı sonucunda İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü’ne girmeye hak kazandım. Bir senelik yabancı dil hazırlık ve 4 senelik üniversite öğrenimimi tamamlayıp 2004 yılında mezun oldum. Ayrıca bu süre sonunda İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü’nde yandal programını tamamladım. 2003 yılı yaz döneminde stajımı İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü Analitik Kimya Anabilim Dalı ve Javel Temizlik Maddeleri Ltd. Şti.’de tamamladım. 2003-2004 yılı güz ve bahar döneminde İ.Ü. Mühendislik Fakültesi Kimya Bölümü Analitik Kimya Anabilim Dalı’nda öğrenci asistanlığı yaptım. 2004 yılında İ.Ü. Fen Bilimleri Enstitüsü Analitik Kimya Programı’nda yüksek lisans öğrenimime başladım.

Documents

Bazı bitki örneklerinin antioksidan kapasitenin spektrofotometrik ve kromatografik tayini