PRÁCTICA : DETERMINACIÓN DE NIVELES TERAPÉUTICOS DE FÁRMACOS

MEDIANTE TÉCNICAS DE FLUORESCENCIA

Introducción

La medida de la concentración de ciertos fármacos en los fluidos corporales se realiza para obtener información sobre utilización de drogas de abuso o para monitorizar los niveles de fármacos.

El concepto de monitorización de fármacos (TDM o Therapeutic Drug Monitoring) es relativamente reciente, y surge de la observación de que no todos los pacientes responden de la misma forma ante una cantidad de medicamento, incluso después de una ajuste de la dosis en función de la masa corporal. La respuesta farmacológica a un medicamento depende de muchos factores: dosis, vía de administración, LADME del medicamento, acceso a los receptores y la propia sensibilidad de éstos. Por estas razones, la administración y manejo de ciertos grupos terapéuticos debe llevarse a cabo de forma individual.

La medida de los niveles de fármacos en suero proporciona una buena correlación con la respuesta farmacológica para muchos de ellos: antibióticos aminoglucósidos, teofilina, antiarrítmicos, anticonvulsivantes, etc., permitiendo una personalización del tratamiento con mayor eficacia, menor toxicidad y costes menores.

Este concepto de individualización de la terapia es relativamente reciente, y sólo se ha hecho posible gracias a los avances en la sensibilidad y especificidad de los métodos de análisis, así como la mayor capacidad de interpretación por parte del clínico, al ir mejorando el conocimiento de la farmacocinética de diversos grupos de fármacos.

Los objetivos que se persiguen con la TDM (y sus aplicaciones más importantes) se dirigen a:

- Disminuir los episodios tóxicos por sobredosificación cuando el índice terapéutico es muy estrecho ( Ej: teofilina, 10-20 μg/ml ). En estos casos, los niveles séricos permiten predecir mejor la respuesta que la exploración clínica.

- Conocer los niveles reales de fármacos en los que es difícil diferenciar los efectos tóxicos de los terapéuticos (digoxina, antiarrítmicos)

- Identificar a los pacientes no colaboradores, que no siguen su medicación (incumplimiento terapéutico)

- Realizar la adaptación del régimen terapéutico a los cambios que se producen con la evolución de la enfermedad o la situación fisiológica (insuficiencia renal, hipoproteinemia, etc) Entre los métodos de dosificación de fármacos más empleados en la TDM se

encuentran los métodos fluorométricos, por presentar una mayor sensibilidad frente a metodologías convencionales y por ser accesibles a laboratorios no especializados.

Medicamentos monitorizados más frecuentemente

Analgésicos-antiinflamatorios: AAS, Paracetamol

Antibióticos aminoglucósidos: Gentamicina, Tobramicina, Amikacina, Netilmicina

Inmunosupresores: Ciclosporina, TacrolimusAntiepilépticos: Fenitoína, Fenobarbital,

Carbamacepina, Etosuximida, Acido Valproico, Primidona

Antineoplásicos: Metotrexato

Broncodilatadores: Teofilina

Antiarrítmicos: Lidocaína, Procainamida, Propanolol, Quinidina

Glucósidos cardíacos: Digoxina, Digitoxina

Psicofármacos: AT ( Imipramina, Amitriptilina Nortriptilina), Litio

Los métodos fluorométricos se basan en la cuantificación de la energía emitida por determinadas moléculas con propiedades fluorescentes cuando son excitadas por la radiación, pues esa energía emitida o fluorescencia es proporcional a la concentración de la molécula. Cada molécula fluorescente tiene unas características determinadas de absorción y emisión que serán tenidas en cuenta en el ensayo, pero la radiación emitida es siempre de otro color y de menor energía (longitud de onda mayor) que la luz incidente.

Son escasos los fármacos que tienen propiedades fluorescentes y que por lo tanto se pueden medir directamente, por lo que son frecuentes la técnicas de inmunoensayo que combinan anticuerpos ligados a fluorocromos como la fluoresceína o rodamina. Entre los fármacos que se comportan como fluorescentes se encuentra la Quinidina, antiarrítmico de clase IA empleado en arritmias supraventriculares y ventriculares. Debido a su gran cantidad de efectos adversos (cinconismo, alteración del QRS del ECG, hepatotoxicidad, alteraciones hematológicas, etc) se considera hoy en día un fármaco de segunda elección. Además, presenta un estrecho margen terapéutico (2-5 μg/ml), por lo que en su utilización clínica precisa seguir una monitorización plasmática.

Desarrollo de la práctica

a) OBJETIVO

Asumiendo que la Quinidina es un fármaco antiarrítmico muy tóxico y de estrecho margen terapéutico, que requiere ser monitorizado terapéuticamente, se pretende determinar sus niveles plasmáticos en una muestra problema, basándonos en su propiedad de emitir fluorescencia ( λ=535) cuando se excita con radiación de λ= 485.

b) MATERIAL (cada 2 taquillas):

• Placa microtiter de 96 pocillos• Pipeta multicanal (por lado de mesa)• Reservorio de dispensación para pipeta multicanal• Micropipeta automática P-200• Solución estándar de trabajo de Quinidina (1 μg/ml)• Muestra problema• Agua destilada

c) PROCEDIMIENTO

C-1) Realización de la curva patrón de Quinidina:

- En la placa microtiter, dispensar en la columna 1 (en todos los pocillos desde A hasta H) un volumen de 200 μl de solución estándar de Quinidina, haciendo uso de la micropipeta - Dispensar 100 μl de agua destilada con la pipeta multicanal en todas las columnas desde la 2 a la 10- Realizar diluciones seriadas a ½ desde la columna 1 hasta la columna 9.

Para ello, se toma un volumen de 100 μl de la columna 1 y se dispensa en la columna 2, donde se mezcla con los 100 μl de diluyente que ya existe en los pocillos; es decir, estamos haciendo una dilución a ½.

- Repetimos la operación con las restantes columnas- Este procedimiento permitirá obtener una curva patrón de 9 puntos (con 8 réplicas), desde una concentración de 1 μg/ml hasta 3,9 μg/ml

ESQUEMA:

COLUMNA 1: 200 μl solución estándarCOLUMNA 2: 100 μl agua + 100 μl solución de la Columna 1COLUMNA 3: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 2COLUMNA 4: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 3COLUMNA 5: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 4COLUMNA 6: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 5COLUMNA 7: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 6COLUMNA 8: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 7COLUMNA 9: 100 μl agua + 100 μl de la Columna 8COLUMNA 10: 100 μl agua COLUMNA 11: 100 μl solución problemaCOLUMNA 12: 100 μl agua destilada

c-2) Muestra problema de Quinidina

- Dispensar 100 μl de la muestra problema en la columna 11 con la micropipeta de 200 μl- Dispensar 100 μl de agua destilada en la columna 12 con la micropipeta de 200

c-3) Lectura de fluorescencia de patrones y muestras en el Fluorímetro:

1

- Se seleccionan las longitudes de onda de excitación / emisión (485 / 535 respectivamente) y las condiciones de lectura- Se introduce la placa microtiter en el equipo y se realiza la lectura, que proporcionará los datos de fluorescencia emitida en Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (UAF)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH

1 μg/ml

0.5 μg/ml

0.25 μg/ml

0.125μg/ml

0.06 μg/ml

0.03 μg/ml

0.015μg/ml

0.0078μg/ml

0.00 μg/ml

0 Problema

Agua

d) RESULTADOS

D-1) Construir la curva patrón:

- El resultado de la lectura de fluorescencia se plasma en papel milimetrado, donde el eje X representa la concentración de Quinidina (μg/ml) y el eje Y representa las Unidades Arbitrarias de Fluorescencia (UAF).

- Trazar la recta, que debe pasar entre todos los puntos

D-2) Calcular la concentración de la muestra problema por extrapolación en la recta

e) CALCULOS

PRÁCTICA : DETERMINACIÓN DE BARBITÚRICOS EN UNA MUESTRA PROBLEMA

1.- FUNDAMENTO

1.1.- PROPIEDADES FARMACOLÓGICAS GENERALES DE LOS

BARBITURICOS

Los barbitúricos son derivados del ácido barbitúrico µ -malonilurea. El ácido

Barbitúrico no es hipnótico pero por sustituciones de los hidrógenos del C5 y del N1 de

la molécula del Ácido Barbitúrico se obtienen una serie de derivados con propiedades

hipnóticas que provocan frecuentes intoxicaciones agudas o crónicas.

La intoxicación por barbitúricos es una forma de suicidio muy corriente.

También es importante la intoxicación crónica por el abuso terapéutico ya que son unos

de los medicamentos mas comúnmente dados a extradosis. Tanto en las intoxicaciones

agudas como en las crónicas, los síntomas se pueden confundir con los producidos por

otros compuestos como morfina, heroína o cocaína.

1.2.- PROPIEDADES FISICO QUÍMICAS DE LOS BARBITURICOS

Los barbitúricos son productos sólidos bien cristalizados, de punto de fusión bastante elevado

Los barbitúricos pueden encontrarse en forma libre y formando sales

dependiendo del pH. Por lo tanto, la solubilidad de los barbitúricos en diferentes

disolventes, depende, fundamentalmente del pH del medio. Como norma general, la

solubilidad de los barbitúricos en diferentes disolventes a diferentes pH se resume en:

• Solubles en soluciones apolares ( cloroformo) a pH neutro

• Solubles en soluciones polares ( agua) a pH básico ( sales)

• Insolubles en soluciones apolares a pH básico

• Insolubles en soluciones polares a pH neutro ( forma libre)

1.3.- PROPIEDADES DE LA ABSORCIÓN ULTRAVIOLATA DE LOS

BARBITURICOS

La absorción ultravioleta de las soluciones acuosas de los barbitúricos, está

íntimamente influenciada por su pH ( las formas no ionizadas absorben débilmente).

La absorbancia ultravioleta de los barbitúricos pude determinarse mediante

técnicas de espectrofotometría

1.4.- ESPECTROFOTOMETRÍA

Es una técnica de laboratorio tanto cualitativa como cuantitativa:

• Cualitativa: permite la identificación de una sustancia en una muestra.

• Cuantitativa: permite conocer la concentración exacta de la sustancia en la muestra.

Mediante la Espectrofotometría vamos a medir la ABSORBANCIA. Si hacemos

incidir un haz de luz sobre una muestra de estas sustancias contenidas en una cubeta de

paredes transparentes, parte de la luz queda absorbida por la muestra y parte consigue

atravesarla. El espectrofotómetro mide la parte absorbida por la muestra o

ABSORBANCIA.

Según la Ley de Lambert-Beer la absorbancia de una sustancia es directamente proporcional a su concentración. Esta relación lineal entre absorbancia y concentración nos permite hacer antes de cualquier determinación espectrofotométrica la curva de calibración.

CONCENTRACIÓN DE LA

DISOLUCIÓN

SOLUCIÓNACUOSA DE BARBITÚRICOS

ABSORBANCIA

HAZ DE LUZ ULTRAVIOLETA

LUZ UV NO ABSORBIDA POR LA

SOLUCIÓN

UV ABSORBID

A

Lambert-Beer

2.- DESARROLLO DE LA PRACTICA

2.1.- CURVA PATRON DE BARBITURICO

A) REACTIVOS

• NH3 2M

• NaOH 0,45 M

B) METODO

a) En 5 matraces aforados de 100 ml tomar alícuotas exactas de 2, 4, 6, 8 y 10 ml

de la disolución madre de barbitúrico que contiene 200 µg/ml. Enrasar con agua

destilada y calcular la concentración de cada una. ( CI . VI = Cf . Vf )

b) De cada disolución patrón preparada, tomar dos alícuotas de 2ml en las

cubetas de cuarzo y en el momento de la lectura, añadir a una 0,5ml de NH3 2M

(pH=10) y a la otra 0,5ml de NaOH 0,45 M (pH=13).

c) Realizar la lectura de cada disolución patrón a 258nm, tomando la cubeta a

pH=10 como referencia.

d) Obtener la curva patrón representando concentración de cada disolución

patrón frente a absorbancia.

2.2.- EXTRACCIÓN DE LOS BARBITURICOS DE LA MUESTRA

A) MATERIALES

• Embudo de decantación 250 ml

• Tubos de ensayo

• 1 pipeta aforada 10 ml y 1 pipeta graduada de 10 ml

• Probeta

B) REACTIVOS

• Tampón fosfato 0,5 M (pH=7)

• Cloroformo

• NaOH 0,45 M

C) MÉTODO

a) Poner 10 ml de la muestra problema en el embudo de decantación y añadir 2ml de la

disolución tampón. Después de agitar, adicionar 25 ml de cloroformo. Agitar

enérgicamente durante tres minutos y dejar que se separen las dos fases, orgánica y

acuosa (10-15 minutos).

b) Recoger la capa clorofórmica en otro embudo de decantación y descartar la fase

acuosa. Adicionar al embudo de decantación 7 ml de NaOH 0,45 M y agitar

enérgicamente durante tres minutos y dejar que se separen de nuevo las dos fases.

c) Una vez separadas, recoger la fase acuosa alcalina en un tubo de ensayo. Se descarta

la fase clorofórmica. (la fase acuosa alcalina, se utiliza para la determinación

cuantitativa de barbitúricos)

2.3.- DETERMINACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA DIFERENCIAL

A) MATERIALES

• 2 pipetas graduadas 1 ml

• 1 pipeta aforada 2 ml

B) REACTIVOS

• NH4Cl 2M

• NaOH 0,45 M

C) MÉTODO

a) Tomar dos alícuotas de 2 ml de la fase acuosa alcalina, situar primero en el

espectrofotómetro, una primera alícuota a la que añadiremos 0,5 ml de NH4Cl 2M

(proporcionará un pH 10) y posteriormente la otra con 2 ml de la fase acuosa y 0,5 ml

de NaOH 0,45 M (proporcionará un pH 13). Realizar la lectura a 258nm utilizando la

alícuota de pH 10 como referencia (blanco).

b) Calcular la concentración de barbitúrico mediante la curva patrón.

3.- RESULTADOS Y CONCLUSIONES DE LA PRACTICA

3.- RESULTADOS Y CONCLUSIONES DE LA PRACTICA