BD Pharmingen

Cytometric Bead Array(CBA) Kit ManualHuman Th1/Th2 Cytokine CBA

BD Biosciences

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Section 1

はじめに

フローサイトメーターは粒子を大きさと蛍光によって判別する解析ツールです。1つのサンプル中のさまざまな成分を同時に測定することをMultiplexingと呼びます。BD Cytometric Bead Array（CBA）は、フローサイトメーターとMultiplexing技術と組み合わせたものであり、複数の可溶性成分を粒子の大きさや蛍光の異なる粒子を用いて測定します。

BD CBAシステムは、従来のイムノアッセイの利点と、フローサイトメーターの高い蛍光感度という両者の利点を併せ持っています。CBAの各ビーズの表面は蛋白質に特異的に結合する抗体がコーティングされており、ELISAプレートの各コーティングされたウェルと同じ様な機能を果たします。蛍光検出の幅広いダイナミックレンジと、複数の成分の同時検出は、従来のELISA法に比べて、少量のサンプル量、より少ないサンプル希釈回数、より短時間で、未知のサンプルの測定が可能です。

BD Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kitを使用すると、1つのサンプル中に存在するInterleukin-2

（IL-2）、Interleukin-4（IL-4）、Interleukin-5（IL-5）、Interleukin-10（IL-10）、Tumor Necrosis

Factor-α（TNF-α）、Interferon-γ（IFN-γ）蛋白レベルを測定できます。このキットは、細胞培養上清、EDTA血漿、および血清サンプル中の特定のサイトカイン蛋白の生理学的な濃度（pg/mLレベル）を測定するのに適切な性能を持っています。

BD CBAシステムは、BD Biosciencesの製品です。本システムは、BD Immunocytometry Systems

（BDIS）とBD Pharmingenが共同開発しました。本キットは従来の製品と同様に、品質、信頼性の高さ、行き届いたサービスの点でBDISとBD Pharmingenが自信を持ってお使いいただける製品です。

2

Section 2

測定の原理

蛍光強度の違う6種類のビーズは、それぞれIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ蛋白と特異的に結合する抗体でコーティングされています。これらの6種類のビーズを混合してCBAを形成し、BD FACSTMフローサイトメーターのFL3チャンネルで検出します。

Figure 1

はじめに、サイトカイン結合ビーズをPE標識検出抗体と混合します。次に、リコンビナントスタンダードまたはテストサンプルとともにインキュベートし、サンドイッチ複合体を形成します。フローサイトメーターによるサンプル データの取り込み後、BD CBA解析ソフトウェアによって、解析結果の図および表が作成されます。このキットには、サンプルの定量解析を50テスト、スタンダードカーブを2回作成する試薬が含まれています。

104

103

102

101

100

5

10

15

20

25

0

30

IFN-γ TNF-α IL-10

IL-5

IL-4

IL-2

FL3-H

Cou

nts

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2.1 利点

CBAは、従来のELISA法に比べて次の利点があります。

● 1つのサンプルで6種類の成分を測定できるため、従来のELISA法に比べて少なくとも6分の1のサンプル量で解析ができる。

● 希釈されたスタンダード1セットで、各成分のためのスタンダードカーブを作成することができる。● 1回の実験に費やす時間がELISA法よりCBAの方が短く、また、1回のCBA実験でELISA法6回分の実験結果を得ることができる。

2.2 限界

Human Th1/Th2 Cytokine CBAの感度は従来のELISA法と同等ですが、複数検体を測定することによる複雑さとカイネティックス上の問題のため、実際の実験では多少バラツキがあります（セクション12.1および12.5の感度と精度についての記述を参照してください）。

BD CBAをFACStarTM、FACSVantageTMのようなストリームインエアー方式のフローサイトメーターで測定することは推奨しておりません。このようなサイトメーターで測定すると、蛍光強度が減少し、感度に不利な影響を与えます。

4

Section 3

キットに含まれる試薬

3.1ビース試薬

Human Cytokine Capture Beads（A1～A6）：特定の蛋白と結合するビーズ。それぞれ蛍光強度が違い、以下の表に示すように、明るいものから暗いものまでがあります。

Bead Specificity

（Brightest）A1 IL-2

A2 IL-4

A3 IL-5

A4 IL10

A5 TNF-α

（Dimmest）A6 IFN-γ

このキットには、各Capture Bead（A1～A6）についてそれぞれ1バイアル（75テスト）が含まれています。4℃保存。凍結不可。

留意：標識結合ビーズは、時間が経つと沈みます。数秒間よく攪拌し、分離させてからご使用ください。

Cytometer Setup Beads（D）：PMT電圧およびコンペンセーションセッティングの調整に使用するセットアップ用ビーズ1バイアル（30テスト）が含まれており、機器設定10回分です。Cytometer

Setup Beadsは、50 µL/テストでご使用ください。

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3.2 抗体および標準試薬

Human Th1/Th2 PE Detection Reagent（B）： PE標識抗ヒトIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ抗体、1バイアル（75テスト）。50 µL/テストでご使用ください。4℃保存。凍結不可。

PE Positive Control Detector（E1）：PE標識抗体コントロール、1バイアル（10テスト）。50 µL/

テストでご使用ください。この試薬は、Cytometer Setup Beadsとともに、機器のコンペンセーションセッティングに使用します。4℃保存。凍結不可。

FITC Positive Control Detector（E2）： FITC標識抗体コントロール、1バイアル（10テスト分）。50 µL/テストでご使用ください。この試薬は、Cytometer Setup Beadsとともに、機器のコンペンセーションセッティングに使用します。4℃保存。凍結不可。

Human Th1/Th2 Cytokine Standards（C）：凍結乾燥したリコンビナントヒトサイトカイン蛋白、2バイアル。1バイアルを0.2 mLのAssay Diluentで溶解し、10倍濃度標準液にします。この10倍濃度標準液には、リコンビナントヒトIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γがそれぞれ50

ng/mLが含まれています。4℃保存。

留意：Human Th1/Th2 Cytokine Standardsは、キットの有効期限まで安定ですが、調製後は2～

8℃で保存し、12時間以内にご使用ください。（カタログ番号551810として別売しています。）

6

3.3 Buffer試薬

Assay Diluent（G）：1倍濃度蛋白入りBuffer溶液の30mLボトル、1バイアル。Human Th1/Th2

Cytokine Standardsの再溶解と調製、およびテストサンプルの希釈に使用します。4℃保存。

Wash Buffer（F）： 1倍濃度リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の130mLボトル、1バイアル。蛋白*および界面活性剤が含まれ、洗浄ステップと解析サンプルの希釈に使用します。4℃保存。

留意：すべての液体試薬には、0.1％以下のアジ化ナトリウムが含まれています。アジ化ナトリウムは、酸性条件下で毒性の高いアジ化水素酸を生じます。配管中に爆発の可能性のある沈殿物が堆

積しないように、廃棄する際は多量の流水でアジ化物を希釈してください。

* すべての血清蛋白は米国製です。

Section 4

キットに含まれない必要な材料

Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kitに含まれる試薬以外に、次のものが必要です。

● CellQuestTMがインストールされたフローサイトメーター。488 nmのレーザー光を用い、576 nmおよび670 nmの蛍光を検出できるもの（BD FACScanTM 、FACSCaliburTM など）

● 12×75mmフローサイトメーター用サンプル チューブ（BD FalconTMカタログ番号352008など）● BD CBA Software、BD Pharmingen（カタログ番号550065）

留意：CellQuestソフトウェアで使用します。BD CBAソフトウェアを使用するには、Microsoft® Excelと

Macintoshコンピュータが必要です。詳細は、BD CBA Softwareユーザーズガイドを参照してください。

● BD CaliBRITETM 3 Beads（BDカタログ番号 340486）

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Section 5

概要：Human Th1/Th2 Cytokine CBA測定手順

室温で3時間インキュベーション

Cytometer Setup Beads調製手順

（遮光）

室温で30分インキュベーション（遮光）

1. Human Th1/Th2 Cytokine StandardsをAssay Diluentで溶かす（15分間）。

2. Assay Diluentを用いてStandards液を段階希釈する。

3. 各Human Cytokine Capture Bead懸濁液（10 µL/テスト）を混合する（使用前に攪拌）。

4. 混合ビーズ液50 µLをアッセイチューブに入れる。

5. PE Detection Reagent（50 µL/テスト）を加える。6. Standards希釈液およびテストサンプルを適切なサンプルチューブ（50 µL/チューブ）に入れる。

7. Wash Bufferでサンプルを洗浄し、遠心する。

8. 各アッセイチューブおよび解析サンプルにWash Buffer 300 µLを加える。

1. Cytometer Setup Beads（使用前に攪拌）をセットアップ用チューブA、B、Cに加える（50 µL/チューブ）。

2. FITC陽性コントロール50 µLをチューブBに、PE陽性コントロール50 µLをチューブCに加える。

3. Wash Buffer 400 µLをチューブB、Cに加える。

4. Wash Buffer 450 µLをチューブAに加える。

5. チューブA、B、Cを用いて、サイトメーターのセットアップを行う。

8

Section 6

Human Th1/Th2 Cytokine Standards調製手順

Human Th1/Th2 Cytokine Standardsは凍結乾燥されています。Capture BeadsおよびPE

Detection Reagentと混合する前に、溶液に溶かし段階希釈する必要があります。

1. 凍結乾燥されたHuman Th1/Th2 Cytokine Standards 1バイアルをAssay Diluent 0.2 mLに溶かし、

10倍濃度標準液を作成します。段階希釈を行う前に、均一になるように少なくとも15分が必要です。よく攪拌してください。

2. 12×75 mmチューブ（BD Falconカタログ番号352008）にラベルを付け、Top Standard、1：2、1：4、

1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256の順番に並べます。

3. 900 µLのAssay DiluentをTop Standardチューブに加えます。

4. 残りのチューブそれぞれに300 µLのAssay Diluentを加えます。

5. 100 µLの10倍濃度標準液をTop Standardチューブに加えてよく攪拌します。

6. Top Standardから300 µLの溶液を採取し、1：2希釈チューブに加えよく攪拌します。同様に1：2チューブから300 µLの溶液を採取し1：4のチューブに加え攪拌し、1：256まで段階希釈を行います（Figure 2参照）。各チューブをよく攪拌します。Assay Diluentは、陰性コントロールとして使用します。

Figure 2：Human Th1/Th2 Cytokine Standard希釈液の調製手順

300 µl100 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl 300 µl

10× Stock Standard

Top Standard

1:2 Dilution

Tube

1:4 Dilution

Tube

1:8Dilution

Tube

1:16Dilution

Tube

1:32 Dilution

Tube

1:64 Dilution

Tube

1:128 Dilution

Tube

1:256 Dilution

Tube

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各希釈チューブ中のリコンビナント蛋白の適切な濃度（pg/mL）をTable 1に示します。

Table 1：希釈後のHuman Th1/Th2 Cytokine Standard濃度

Ptotein Top 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 1：256（pg/mL） Standard DilutionDilutionDilutionDilutionDilutionDilutionDilutionDilution

Tube Tube Tube Tube Tube Tube Tube Tube

Human IL-2 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Human IL-4 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Human IL-5 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Human IL-10 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Human TNF-α 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Human IFN-γ 5000 2500 1250 625 312.5 156 80 40 20

Section 7

混合Human Th1/Th2 Cytokine Captureビーズの調製手順

Capture Beadsはそれぞれ別のボトルに入っています。PE Detection Reagent、標準液、サンプルと混合する直前に、これらのビーズ試薬（A1～A6）を混合します。

1. 実験に必要なチューブ数（標準およびコントロールを含む）を数えます。たとえば、テスト サンプル8本、

Cytokine Standards希釈液9本、陰性コントロール1本＝計18本など。

2. 混合前に、各Capture Beadの懸濁液を数秒間攪拌します。

3.「実験に必要なチューブ数×10 µL」の量の各Capture Beadsを、"混合Captureビーズ"とラベルしたチューブに加えます。（例： 10 µLのIL-2 Capture Beads×18アッセイ チューブ＝180 µLのCaptureBeadsが必要になります）

4.ビーズ混合液をよく混ぜます。

これでCaptureビーズの混合が終了し、Section 9で示される手順に従ってアッセイチューブ（50 µL

の混合Captureビーズ/チューブ）に使用する準備が整いました。

留意：Capture Beadsは撹拌しすぎないでください。混合後の保存はしないでください。

10

Section 8

テストサンプル調製手順

各サイトカインのスタンダード カーブは、20～5000 pg/mLの濃度に対応しています。テストサンプルの平均蛍光値がスタンダードカーブの範囲内に収まるように、必要に応じてテストサンプルを希釈する必要があります。良好な結果を得るために、サイトカインの濃度が高いことが事前にわかっている、または推測されるサンプルは、以下の方法で希釈してください。

1. Assay Diluentを用いて、テストサンプルを目的の希釈率（1：2、1：10、1：100など）に希釈します。

2. 混合CaptureビーズおよびPE Detection Reagentの入ったアッセイ チューブに加える前に、サンプル希釈液をよく混合します。

Section 9

Human Th1/Th2 Cytokine CBA測定手順

標準液の準備と希釈、およびCaptureビーズの混合が終了したら、これらの試薬とテストサンプルを適切な測定チューブに移し、インキュベーションと解析を行います。フローサイトメーターのキャリブレーションと、サンプルの定量を行うためには、実験ごとにCytokine StandardsとCytokine Setupコントロールを測定する必要があります。Cytokine Standardコントロール アッセイチューブに加える試薬の詳細については、Table 2を参照してください。サイトメーターの設定方法については、Section 10で説明します。

1. 50 µLの混合Captureビーズを適切なアッセイ チューブに加えます。アッセイ チューブに加える前に、混合Captureビーズをよく攪拌してください。

2. 50 µLのHuman Th1/Th2 PE Detection Reagentをアッセイチューブに加えます。

3. 50 µLのTh1/Th2 Cytokine Standard希釈液をコントロールアッセイチューブに加えます。

4. 各テストサンプル50 µLをテストアッセイチューブに加えます。

5. 遮光して、アッセイ チューブを室温で3時間インキュベートします。インキュべーションの間に10.1 -10.3のサイトメーターの設定手順を行います。

6. 1mLのWash Bufferを各アッセイチューブに加え、200 x gで5分間遠心分離します。

7. 各チューブの上清を注意深く除去します。

8. 300 µLのWash Bufferを各測定チューブに加え、ビーズを再浮遊させます。

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9. フローサイトメーターでサンプルの解析を行います。フローサイトメーターでの測定直前に、各試験管を3～5秒よく撹拌してください。

留意：CBAサンプルは実験日に測定してください。サンプル調製後のサンプルの長期保存はバックグラウンドの上昇をきたし、感度を悪くします。

Table 2：標準希釈液およびコントロール測定チューブに加える試薬

チューブ番号 試薬（すべての試薬の量は50 µL）

1（陰性コントロール0 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Assay Diluent

2（20 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：256希釈

3（40 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：128希釈

4（80 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：64希釈

5（156 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：32希釈

6（312 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：16希釈

7（625 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：8希釈

8（1250 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：4希釈

9（2500 pg/mL標準液） 混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards 1：2希釈

10（5000 pg/mL標準液）混合Captureビーズ、PE Detection Reagent、Cytokine Standards "TopStandard"

12

Section 10

サイトメーターの設定、データ取り込みおよび解析

このセクションのサイトメーターの設定は、BD FACScanおよびFACSCaliburフローサイトメーター用です。FACSCompソフトウェアを用いると、簡単にフローサイトメーターを設定できます。CellQuestTMソフトウェアは、サンプルの測定と、後にBD CBAソフトウェアで解析するための、データフォーマットに用います。

10.1 Cytometer Setup Beadsの調製

1. 50 µLのCytometer Setup BeadsをA、B、Cとラベルを付けた3本のサイトメーター設定用チューブに加えます。

2. 50 µLのFITC Positive Control DetectorをチューブBに加えます。

3. 50 µLのPE Positive Control DetectorをチューブCに加えます。

4. チューブA、B、Cを30分間、室温でインキュベートします。遮光してください。

5. 450 µLのWash BufferをチューブAに、400 µLのWash BufferをチューブB、Cに加えます。

6. セクション10.2に進みます。

10.2 FACSCompソフトウェアおよびCaliBRITEビーズを用いた機器の設定

1. 機器を起動します。

2. シース液の流れをチェックします。

3. CaliBRITEビーズのチューブを準備します。

4. FACSCompソフトウェアを起動します。

5. Lyse/No WashモードでFACSCompソフトウェアを実行します。

6. Section10.3に進みます。

留意：CaliBRITE Beadsを使用する場合のFACSCompの操作方法については、FACSCompソフトウェア ユーザーズガイドおよびCaliBRITEビーズの添付文書を参照してください。FACSCompバージョン4.2には、Lyse/No Washアッセイが正常に終了した場合に、BD CBAキャリブレーション ファイルを自動的に保存する機能があります。BD CBAキャリブレーション ファイルには、セクション10.3のステップ3～5で述べられるFSC、SSC、Thresholdの最適設定が保存されます。しかし蛍光パラメータの最適設定は、さらに必要です。（PMTおよびcompensation設定など。

Section10.3のステップ6～8参照。）

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10.3 Cytometer Setup Beadsを用いた機器の設定

1. CellQuestソフトウェアを起動し、Template for Instrument Setupを開きます。

留意：CBA instrument setup templateはBD CBAソフトウェアに含まれています。BD CBAソフトウェアをユーザーガイドの手順にしたがってインストールしてください。CBA instrumentsetup templateは、BD CBAソフトウェア version 1.1以上の場合、FACStation HD：BDApplications内にあります。CBA instrument setup templateはCellQuest Version 3.2で作られています。また、マイクロソフトOSがインストールされているコンピュータではこのファイルはインストールされません。これらの理由によりファイルをご使用になれない場合はホット

ラインまでご連絡ください。

2. Acquisitionモードで機器を設定します。

留意：BD CBAソフトウェアは、FSC、SSC、FL1、FL2、FL3の5つのパラメータでデータを評価します。その他の検出器はオフにしてください。

3. SSC（側方散乱光）およびFSC（前方散乱光）をLogモードに設定します。

4. SSC PMTの電圧を、FACSCompが設定した値から100減らします。

5. ThresholdをFSCパラメータ650に設定します。

6. Cytometer Setup BeadsチューブAをサイトメーターに取り付けます。

留意：機器調整中はPause、およびRestartを頻繁に使用してください。こうすることにより、機器調整値を変更後のMedian値をリセットすることができます。

14

単一のビーズの集団がゲートR1の中に収まるように、ゲートを移動します（Figure 3a）。

上の方のFL3蛍光強度の強いビーズ集団（R2）の蛍光強度のMedianが約5000になるようにFL3

PMTを調整します（Figure 3b）。必要であれば、ゲートR3の位置を調整し、暗いFL3ビーズ集団が、ゲートR3内に収まるようにします（Figure 3b）。ゲートR2は動かさないでください。

FL1のMedianが約2.0～2.5になるようにFL1 PMTを調整します（Figure 3b）。

FL2のMedianが約2.0～2.5になるようにFL2 PMTを調整します（Figure 3c）。

FL1-H

100 101 102 103 104

FL3-

H

100

101

102

103

104

R2

R3

Figure 3b

Bright Beads (R2) Median: 5139.70

FL1 (Median) Median: 2.53

FSC-H

100 101 102 103 104

SSC

-H

100

101

102

103

104

R1

Figure 3a

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Cytometer Setup BeadsチューブBをサイトメーターに取り付け、FL2-％FL1のcompensationを調整します。

必要であれば、ゲートR5の位置を調整し、明るいFL1ビーズ集団がゲートR5に収まるようにします（Figure 3d）。FL2-％FL1コントロールを用いて、R5のMedianをR4のMedianと等しくなるように調整します（Figure 3d）。

Cytometer Setup BeadsチューブCをサイトメーターに取り付け、FL1-％FL2およびFL3-％FL2のcompensationを調整します。

FL1-H

100 101 102 103 104

FL2-

H

100

101

102

103

104

R4

R5

Figure 3d

(R4) Median: 2.94 (R5) Median: 3.75

FL2-H

100 101 102 103 104

FL3-

H

100

101

102

103

104

Figure 3c

FL2 (Median) Median: 2.21

16

必要であれば、ゲートR7の位置を調整し、明るいFL2ビーズ集団がゲートR7に収まるようにします（Figure 3e）。FL1-％FL2コントロールを用いて、R7のMedianをR6のMedianと等しくなるように調整します（Figure 3e）。

必要であれば、ゲートR9の位置を調整し、明るいFL2ビーズ集団がゲートR9に収まるようにします（Figure 3f）。FL3-％FL2コントロールを用いて、R9のMedianをR8のMedianと等しくなるように調整します（Figure 3f）。

FL2-％FL3を0.1に設定します。最適化した機器設定を保存し、印刷します。

FL2-H

100 101 102 103 104

FL3-

H

100

101

102

103

104

R8

R9

Figure 3f

(R8) Median: 27.88 (R9) Median: 28.13

FL2-H

100 101 102 103 104FL

1-H

100

101

102

103

104

R6

R7

Figure 3e

(R6) Median: 2.81 (R7) Median: 3.08

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10.4 データの取り込み

1. BD CBAソフトウェアの取り込み用テンプレートを開きます。

留意：取り込み用テンプレートはFACStation HD：BD Applications：BD CBA Folder：Sample Files：Mouse Isotyping Files：Instrument set upフォルダ内にあります。名称は"Isotype Kit AcquireTemplate"です。Isotype Kit Acquire TemplateはCellQuest Version 3.2で作られています。また、マイクロソフト OSがインストールされているコンピュータではこのファイルはインストールされません。これらの理由によりファイルをご使用になれない場合はホットラインまでご連絡くだ

さい。

2. Acquisitionモードに設定し、セクション10.3で最適化した機器設定を呼び出します。

3. Acquisition & Storageウィンドウで、Resolutionを1024に設定します。

4. カウントするイベント数をR1 gated events=1800に設定します。（これは、サンプルファイルに含まれる各Capture Beadのイベント数が約300になるようするためです。）

5. 保存するイベント数を"all events"に設定します。取り込むすべてのイベントを保存するようにすると、ゲートの設定がうまくできていない場合でも、取り込むべきイベントを失わずに済みます。

6. Set upにチェックが入った状態で、チューブ#1を測定し、FSC vs SSCドットプロットで、単一のビーズ集団の回りにR1ゲートを設定します。（Figure 3a）

7. サンプルを取り込む準備が完了しました。

8. サンプル流量を"HIGH"に設定して、サンプルの取り込みを開始します。

留意：リコンビナント スタンダード チューブを測定する前に、陰性コントロール（0 pg/mL 標準液）のチューブを測定します。また、テスト サンプル チューブを測定する前に、コントロール アッセイ

チューブを測定します。測定は、Section9のTable 2の順番で行います。

BD CBAソフトウェアによるデータファイルの解析を簡単にし、混乱を避けるために、ファイル名にはアッセイ チューブ番号と対応した数値を接尾辞として付けます（0 pg/mLのチューブ#1は

KT032598.001とするなど）。ファイル名は1文字以上の英数字でなければなりません。

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Figure 4：Acquisition template example

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10.5 サンプル データの解析

BD CBAデータの解析は、BD CBAソフトウェアを用いて行います。ソフトウェアのユーザーズガイドに従って、ソフトウェアをインストールしてください。

1. 実験したFACSファイル データを、BD CBAソフトウェアのインストールされているコンピュータに移動します。

2. 新規フォルダを2つ作成し、それぞれ"Standards"と"Samples"とします。

3. データファイルを対応するフォルダに移動します。

留意：コントロール チューブ番号1～10（PE Detection Regentのみと希釈標準液）のファイルのみを

"Standards"ファイルフォルダに移動します。その他のサンプルは"Samples"ファイルフォルダに移動してください。

BD CBAソフトウェアユーザーズガイドに示された解析手順に従います。

留意：実験に使用した希釈標準液の濃度を入力するときは、検体の名前が必要です。Human Th1/Th2 Cytokine CBAの場合、Analyte 1はINF-γ、Analyte 2はTNF-α、Analyte 3はIL-10、

Analyte 4はIL-5、Analyte 5はIL-4、Analyte 6はIL-2になります。

20

Section 11

典型的なデータ例

Figure 5：CellQuest data examples for standards and detectors alone

Negative Control

Standards 5000 pg/ml

Standards 80 pg/ml

Standards 625 pg/ml

A. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

C. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

D. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

B. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

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Figure 6：BD CBA Software example of standard curves

IL-4

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

IFN-gamma

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

IL-5IL-10

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

IL-2

TNF-alpha

1

1 0

100

1000

10000

1 1 0 100 1000 10000

Concentration (pg/ml)

22

BD Cytometric Bead Array Analysis

Figure 7：BD CBA Software example of sample results

IFN-gamma TNF-alpha

Dllut FactorFllename SampleID Acq Date FL2 MFI

Tube pg/ml

Sample pg/ml FL2 MFI

Tube pg/ml

Sample pg/ml

081500Katy.017 110 supe,8/9/00,neat 15-Aug-00 716.9 >5000 3337.6 >500011

081500Katy.018 110 supe,8/9/00,neat 15-Aug-00 736.5 >5000 3278.1 >500012

081500Katy.019 110 supe,8/9/00,1/4 15-Aug-00 1263.5 >5000 1065.0 3200.3 12801.443

081500Katy.020 110 supe,8/9/00,1/4 15-Aug-00 1263.5 >5000 1263.5 3863.6 15454.444

081500Katy.021 110 supe,8/9/00,1/16 15-Aug-00 813.1 >5000 250.3 687.4 10998.1

14424.5

165

081500Katy.022 110 supe,8/9/00,1/16 15-Aug-00 881.7 >5000 324.9 901.5166

11697.6081500Katy.023 110 supe,8/9/00,1/64 15-Aug-00 271.4 4880.9 312380.6 69.2 182.8647

12482.7081500Katy.024 110 supe,8/9/00,1/64 15-Aug-00 283.9 5082.7 325295.8 73.7 195.0648

11748.2081500Katy.025 110 supe,8/9/00,1/256 15-Aug-00 66.1 1442.1 369173.8 18.8 45.92569

10316.0081500Katy.026 110 supe,8/9/00,1/256 15-Aug-00 65.5 1431.1 366356.1 16.7 40.325610

11

12

13

14

15

Results 8/24/00

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Section 12

性能

Human Th1/Th2 Cytokine CBAアッセイは、感度、添加物の回収率、直線性、特異性、アッセイ内およびアッセイ間の精度などの性能を厳密に試験されています。

12.1 感度

サイトカインのスタンダードカーブの範囲によって、Human Th1/Th2 Cytokine CBAを用いて定量できる最小および最大濃度が決まります（20 pg/mL～5000 pg/mLなど）。4パラメータカーブ フィットオプションを使用すると、サンプルの蛍光強度が標準カーブの範囲外にある値を推定することができます。どの計算方法を用いてテスト サンプルの値を求めるかは、研究者が決定します。Human

Th1/Th2 Cytokine CBAを用いたサイトカインの感度は、陰性コントロール（0 pg/mL）を20回繰り返して測定したときの蛍光Median + 2SDに対応する濃度で決められます。

サイトカイン Median Standard Assay SensitivityFluorescence Deviation （pg/mL）

IL-2 3.3 0.2 2.6

IL-4 2.3 0.2 2.6

IL-5 2.6 0.2 2.4

IL-10 2.4 0.2 2.8

TNF-α 2.0 0.2 2.8

IFN-γ 2.1 0.3 7.1

12.2 回収率

各サイトカイン蛋白を、測定範囲内の3種類の異なった濃度で、3つのMatrixに添加しました。この実験で使用されるMatrixは、サイトカイン蛋白の添加前には希釈されていません。この実験で使用される血漿サンプルは、EDTAで処理されています。結果を、Standard Diluentに添加されたサイトカインの濃度と比較しました。

24

12.2 回収率：Cytokine Matrix Standard spike concentration（pg/mL） Observed in given matrix（pg/mL） ％ Recovery

IL-2 Pooled Donor Sera 2500 1958 78％（n＝5） 625 406 65％

80 49 62％IL-2 Pooled Donor Plasma 2500 1656 78％

（n＝5） 625 427 68％80 54 67％

IL-2 Cell culture supernatant 2500 2605 104％625 659 106％80 86 107％

IL-4 Pooled Donor Sera 2500 2158 86％（n＝5） 625 527 84％

80 71 89％IL-4 Pooled Donor Plasma 2500 2197 88％

（n＝5） 625 512 82％80 63 79％

IL-4 Cell culture supernatant 2500 2452 98％625 575 92％80 81 102％

IL-5 Pooled Donor Sera 2500 1748 70％（n＝5） 625 430 69％

80 58 72％IL-5 Pooled Donor Plasma 2500 1710 68％

（n＝5） 625 380 61％80 54 67％

IL-5 Cell culture supernatant 2500 2622 105％625 625 102％80 85 106％

IL-10 Pooled Donor Sera 2500 2044 82％（n＝5） 625 494 79％

80 62 81％IL-10 Pooled Donor Plasma 2500 2034 81％

（n＝5） 625 445 71％80 62 78％

IL-10 Cell culture supernatant 2500 2680 107％625 640 103％80 88 110％

TNF-α Pooled Donor Sera 2500 1846 74％（n＝5） 625 447 72％

80 59 73％TNF-α Pooled Donor Plasma 2500 1731 69％

（n＝5） 625 407 65％80 54 67％

TNF-α Cell culture supernatant 2500 2856 114％625 669 107％80 91 113％

IFN-γ Pooled Donor Sera 2500 1748 70％（n＝5） 625 479 77％

80 73 91％IFN-γ Pooled Donor Plasma 2500 1813 73％

（n＝5） 625 458 73％80 66 83％

IFN-γ Cell culture supernatant 2500 2446 98％625 628 101％80 84 105％

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12.3 直線性

以下のMatrixにIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γを添加し、Assay Diluentで段階希釈しました。実験は2回行いました。

Matrix Dilution Observed IL-2（pg/mL） Observed IL-4（pg/mL） Observed IL-5（pg/mL）Pooled Donor Sera Neat 3254 4079 3520（n=5） 1：2 1747 2292 2083

1：4 863 1185 11501：8 388 600 529

1：16 187 277 2751：64 48 70 61

1：256 12 19 17Slope 1.01 1.02 1.02

Pooled Donor Plasma Neat 3785 4320 3750（n=5） 1：2 1934 2345 2047

1：4 919 1181 11391：8 433 608 541

1：16 208 273 2761：64 53 67 68

1：256 13 20 17Slope 1.01 1.01 1.01

Cell Culture Medium Neat 4578 4546 49341：2 2345 2409 25091：4 1176 1105 12161：8 561 605 614

1：16 278 281 3051：64 70 77 72

1：256 17 20 18Slope 1.01 1.01 1.00

Matrix Dilution Observed IL-10（pg/mL） Observed TNF-α（pg/mL） Observed IFN-γ（pg/mL）Pooled Donor Sera Neat 3883 3502 3030（n=5） 1：2 2094 1971 1607

1：4 1014 1054 8921：8 513 534 441

1：16 244 270 2271：64 61 67 55

1：256 17 18 20Slope 1.01 1.01 1.00

Pooled Donor Plasma Neat 4245 3561 2743（n=5） 1：2 2118 2061 1580

1：4 1032 1085 8411：8 532 554 407

1：16 251 285 2091：64 68 75 50

1：256 17 18 18Slope 1.00 1.01 1.02

Cell Culture Medium Neat 4851 5500 40741：2 2570 2762 21421：4 1165 1222 10391：8 610 613 506

1：16 301 311 2631：64 80 78 57

1：256 18 19 22Slope 1.01 1.00 1.01

26

12.4 特異性

Human Th1/Th2 Cytokine CBAアッセイで使用される抗体は、ヒトのサイトカインとの反応性を検査されています。1種類のリコンビナントサイトカイン蛋白のみを含むサンプルの解析で、交差反応や、その他のCapture Bead集団中にサイトカインのバックグラウンドが検出されることはありませんでした。

Figure 8：CellQuest data for detection of individual cytokines

A. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-HB. 10

4

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

C. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

D. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

E. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

F. 104

104

103

103

102

102

101

101

100

100

FL2-H

FL3

-H

Human IL-2 Human IL-4

Human IL-5 Human IL-10

Human TNF-α Human IFN-γ

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12.5 精度

アッセイ内： 3種類の濃度のIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γを、それぞれ10回繰り返して測定しました。

Cytokine IL-2 IL-4

71 534 2160 85 592 2488

SD 1 23 74 3 25 108

％ CV 2％ 4％ 3％ 4％ 4％ 4％

Cytokine IL-5 IL-10

78 587 2456 82 592 2486

SD 2 29 150 2 15 86

％ CV 3％ 5％ 6％ 2％ 2％ 3％

Cytokine TNF-α IFN-γ

81 592 2504 78 528 2194

SD 2 22 126 3 21 65

％ CV 3％ 4％ 5％ 4％ 4％ 3％

Actual MeanConc.（pg/mL）:

Actual MeanConc.（pg/mL）:

Actual MeanConc.（pg/mL）:

28

アッセイ間：3種類の濃度のIL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γを、それぞれ別のオペレータで4回実験を行いました。

Cytokine IL-2 IL-4

8 8 8 8 8 8

77 627 2509 74 601 2553

SD 7 29 247 5 40 147

％ CV 9％ 5％ 10％ 7％ 7％ 6％

Cytokine IL-5 IL-10

8 8 8 8 8 8

80 615 2560 81 631 2556

SD 4 39 165 5 45 189

％ CV 5％ 6％ 6％ 6％ 7％ 7％

Cytokine TNF-α IFN-γ

8 8 8 8 8 8

79 627 2564 69 610 2518

SD 4 31 131 6 40 139

％ CV 5％ 5％ 5％ 9％ 7％ 6％

留意：繰り返し回数は、各濃度の蛋白のアッセイチューブの合計数を表しています。

Number ofReplicates:Actual MeanConc.（pg/mL）:

Number ofReplicates:Actual MeanConc.（pg/mL）:

Number ofReplicates:Actual MeanConc.（pg/mL）:

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Section 13

トラブルシューティング

問題 解決策

サンプル間で結果が変動する。 ピペッティング前にCapture Beadをよく攪拌してください。ビーズが凝集している場合があります。

サンプル中のビーズ数が少ない。 洗浄中にビーズを吸引しないでください。必要量より多いビーズを洗浄したり、再浮遊したりしないでください。

バックグラウンドが高い。 さまざまなサンプル希釈率を試してください。サンプルが濃すぎる可能性があります。非特異性結合によるバックグランドをなくすため、洗浄回数を増やし、過剰なHuman Th1/Th2 PE Detection Reagentを取り除きます。

サンプル中の蛋白検出量が少ない、 サンプルが薄すぎる可能性があります。さまざまなサンプル希釈率を試してください。または無い。

観測されるビーズの集団が6つより Capture Beadを取り出す前に、ビーズのバイアルをよく攪拌し、アッセイ チューブ少ない。 にはそれぞれのビーズを同量加えるようにしてください。Capture Beadを混合したまたは、分散が不均一である。 ら、よく攪拌し、溶液中に均等に分布するようにしてください。

サンプル取り込み中にデブリが FSCのThresholdを高くするか、サンプルの希釈率を高くします。見られる（FSC/SSC）。 Cytometer Setup Beadsを用いて、機器設定の最適化をしてください。

取り込み時に、ビーズの集団の このような状態は、サンプルのサイトカイン含有量が非常に高いときに起こる場合が蛍光（FL3）が重なる。 あります。Cytometer Setup Beadsを用いて、機器設定の最適化をしてください。

標準アッセイチューブの蛍光 すべての内容物が正しく調製され、保存されているかを確認します。実験ごとに新し強度が低い。または標準カーブが い標準液を使用し、標準液調製後12時間が経過したものは使用しないでください。うまく作成できない。 また、インキュベーション時間が充分な長さであることを確認してください。

すべてのサンプルが陽性か、高い サンプルをさらに希釈してください。サンプル濃度が高い可能性があります。標準液の平均蛍光値よりも高くなる。

バイオハザードサンプル フローサイトメーターで測定する前に、1％パラホルムアルデヒドでサンプルを処理する方法がありますが、これにより、測定性能に影響を与えることが考えられ、測定者による事前評価が必要です。

留意：性能を十分に引き出すには、フローサイトメーターでの測定直前にサンプルをよく攪拌してくだ

さい。

留意：Human Th1/Th2 Cytokine CBAアッセイを用いて、ヒト以外の霊長類ではカニクイザルの活性化した細胞から産生されるIL-4、IL-5、TNF-α、およびINF-γを検出することができますが、カニクイザル モデルでのサイトカインの定量測定については、このキットで評価されておらず、結果

も多様です。

30

Section14

参考文献

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8. Lund-Johansen, F., K. Davis, J. Bishop and R. de W. Malefyt. 2000. Flow cytometric analysis ofimmunoprecipitates: High-throughput analysis of protein phosphorylation and protein-protein interactions.Cytometry 39:250-259.

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