Proteini kristallere büyütme

Max Perutz ve John Kendrew 1959

yılında balina hücrelerinde oksijen

taşınımından sorumlu, küçük bir protein

olan balina miyoglobininin üç boyutlu

yapısı hakkında bir makale yayımladılar.

Bu iki bilim adamı protein yapısının

araştırılması ile ilgili olarak, moleküler

düzeyde oksijen taşıma mekanizmasını

anlamayı istiyorlardı. Araştırmacılar,

proteinin kristallerini büyüttüler ve X

ışını analizi ile kristalin kırınım motifine

bağlı olarak yapısını belirlemeye

çalıştılar.

30 Science in School Issue 11 : Spring 2009

www.scienceinschool.org

Türkçe çeviri: Aslı Giray Kurt, Hikmet Geçkil

İnönü Üniversitesi, Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü

İsviçre Zürih Üniversitesi’nden Beat Blattmann ve Patrick Sticher, protein

kristallografisinin temelini oluşturan bilimi açıklıyor ve bilim adamları tarafından

protein yapılarını belirlemek için kullanılan bir protein kristallerinin büyütülmesi

protokolü sunuyorlar.

Perutz ve Kendrew balina miyoglobin kristalleri ile

kullanışlı kırınım motifini elde edene kadar, daha

önce diğer türlerden bir dizi miyoglobini test

etmişlerdi. Bu öncü çalışma, 1962w1 yılında Kimya

dalında Nobel Ödülü'ne layık görüldü. Ancak 50 yıl

sonra bile, yapısal çalışmalar için protein kristalleri

elde etmek hala önemli bir sorun olarak

durmaktadır.

Proteinler nedir?

Proteinler canlı hücrelerde sulu olmayan

bileşenlerin en büyük grubudur. Hemen her

biyokimyasal reaksiyon, enzim olarak adlandırılan

belirli bir protein gerektirir. Proteinlerin diğer

tipleri mekanik ve yapısal (ör.,bağ dokusundaki

kolajen) veya hücre sinyalini düzenlemede (ör.,

hormon reseptörleri) immün cevap (ör.,

antikorlar) ya da küçük moleküllerin taşınımı (ör.,

iyon kanalları) gibi işlevlere sahiptir. Bu çeşitlilik

oldukça geniştir: sadece insanda 20,000’den fazla

farklı proteinin var olduğu bilinmektedir.

Öğretim aktiviteleri

Protein kristalleri, çapı

milimetreden daha küçük ve

gelişimi zor olan küçük ve

narin nesnelerdir. Oysa

protein kristalleri, X

ışınları ile analiz edilen

yapısal biyolojik çalışmalar

için gereklidir.

www.scienceinschool.org

Bu çeşitliliğe rağmen, tüm proteinler benzer bir yapısal prensibi paylaşırlar. Proteinler amino asit olarak adlandırılan 20 farklı yapıtaşından oluşurlar. Amino asitler birbirlerine kovalent bağlarla bağlanarak düz bir zincir oluştururlar (bkz. aşağıdaki Şekil). Protein zincirinin uzunluğu birkaç düzine amino asitten binlerce amino asite kadar olabilir. Hücrelerde her protein, ona karşılık gelen gelen gen tarafından kodlanır. Proteinin sentezi karmaşık bir moleküler makine olan, protein ve RNA’dan oluşan ribozom tarafından yapılır.

Proteinler kendilerine özgü üç

boyutlu yapılara katlanırlar

Normal koşullar altında amino

asitlerden oluşan lineer zincirler

belli üç boyutlu yapılara

kendiliğinden katlanırlar. Amino

asitlerden oluşan zincirin belli

bölgeleri karakteristik sekonder

yapılı elementler oluştururlar. Bu

elementler arasında en önemlileri

tipik olarak amino asitler arasında

hidrojen bağları ile kurulan α-

heliks ve β- tabakalı yapılardır (bkz.

aşağıdaki Şekil). Proteinin tamamı

böyle çeşitli yapısal elementlerin

oluşturduğu bir üçüncül (tersiyer)

yapıyı oluşturur.

a

b

Yapı, işlevdir: Bir proteinin üç

boyutlu yapısı bize neyi anlatır?

Belli bir proteinin fonksiyonu onun üç

boyutlu yapısına bağlıdır. Bir protein

sadece katlandığında, proteinin belirli

amino asitleri aktif bölgeyi oluşturacak

şekilde biri birine yeterince yakın

gelirler. Enzimlerde olduğu gibi bu

bölgeler biyokimyasal reaksiyonları

katalizleyebilir veya antikorlarda

olduğu gibi spesifik bir bağlanma

bölgesi oluşturabilirler. Yaşamın temel

süreçlerinin moleküler seviyede nasıl

işlediğini anlamak için bir proteinin

yapısal detaylarının araştırılması büyük

önem taşır: yapısal biyolojinin

araştırma alanı budur. Bugün yapısal

biyolojinin önemli hedeflerinden biri,

büyük makromolekül komplekslerinin

ve zar proteinlerinin etkileşim, yapı ve

işlevlerinin aydınlatılmasıdırw2.

Karmaşıklıkları nedeniyle, bu

proteinlerin deneysel olarak çalışılması

ve yapılarının belirlenmesi son derece

zordur. Bu tür bir işi yapmak her

zaman büyük bir başarı olarak

addedilmiştir. Ancak, bu kompleks

proteinler temel biyolojik süreçlerde

gerekli oldukları için, yapı ve

fonksiyonlarının anlaşılması için

bunlara büyük bir ilgi vardır ve bilim

adamları bunları kristalize etmeyi

denemeye devam etmektedirler.

a. Proteinler düz bir

zincir oluşturmak için

birbirine kovalent

olarak bağlanan amino

asitlerden oluşur.

b. Proteinler, kendi

işlevlerini belirleyen

üç boyutlu bir yapıya

katlanırlar. Amino asit

zincirinin belli

bölgeleri karakteristik

katlanmalar gösterir.

Bu katlanmalara iki

önemli örnek α-

heliksler ve β-

tabakalarıdır.

Resim

, Gab y S

ennhause’n

in

iiizniyleizn

iyle’r izn

iyleU

niversity o

f Zürih

c

30

Resim, Beat Blattmann ve Patrick Sticher’in izniyle

Protein Kristal Yapı

Seçme

Üretim

Saflaştırma

Analiz

Protein

Kristilizasyon Veri eldesi

Yapı çözümlemesi

Arıtım

Doğrulama

Biyolojik bağlam

X- ışını kırınımı ile protein yapı tayini için iş şeması

Proteinler doğrudan gözlem için çok küçüktürler Proteinler, yalnızca birkaç

nanometre ile ölçülen (1 nm = 1x 10-6

mm) küçük yapılardır, Bu parçacıklar

bu boyutları ile 1 mikrometrelik

maksimum çözünürlüğe sahip güçlü

ışık mikroskobu ile bile

gözlemlenemezler (1 mikron = 1x

10-3 mm).

Protein yapılarını 'görünür'

yapmak için üç önemli teknoloji kullanılır:

• Protein kristallerinin X-ışını kırınımı

• Nükleer manyetik rezonans (NMR)

• Elektron kristalografisi

Halka açık biyolojik makro-

moleküllerin veritabanındaw3

bulunan tüm proteinlerin %90’ından

fazlasının yapısı X-ışını kırınımı ile

belirlendiğinden, bu yöntem üzerinde özellikle duracağız.

Kristaller aşırı doygunlukta

olan sulu bir protein

solüsyonu içinde gelişirler.

Kristallendirme, iki fazda

devam eder: çekirdeklenme

ve büyüme.

Çekirdeklenmeden sonra,

düzenli büyük kristallerin

büyümesi için en uygun

koşuların olduğu

“metakararlı zon” olarak

bilinen noktaya ulaşmak

önemlidir. Aşırı doymuş

durumdaki protein

konsantrasyonunu iki

yarışmalı süreçle azaltır: (I)

kristalizasyon, (II) çöktürme.

II

32 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org

Öğrenme aktiviteleri

1.0l

rezervuar çözeltisi

1.0l

protein çözeltisi Şeffaf mühürleme bantı

Damla oturağı

0.5 ml rezervuar çözletisi

Buhar difüzyon yöntemi protein kristallerinin büyümesinde en sık kullanılan yöntemdir: a. Bir kristalizasyon

solüsyonunun küçük bir miktarı küçük bir rezervuar içine konur.

b. Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası, haznede bulunan damlanın üzerine pipetlenir.

c. Kristalizasyon işlemlini başlatmak için hazne kapatılır (mühürlenir)

Kristallografinin tarihi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve yapısı çözülene kadar bir laboratuvardan başka bir laboratuvara bir proteinin yolculuğunu öğrenmek için Dominique Cornuéjol’nun bu sayıdaki makalesine bakınız (Sayfa 70-76). Proteinlerin kristalleşmesi oldukça hünerli bir iştir, çünkü her yeni proteini kristalize edecek uygun koşulları belirlemek zor olup hatta bazen imkansızdır. Böylece tekrarlanabilir kristal kalitesini sağlamak için (yani, aynı derecede iyi kristallerin tekrar büyütülmesi) bilim adamları kontrollü deneyler kurarlar. Protein kristalografisi içinde en sık kullanılan yöntem buhar difüzyon yöntemidir (bkz. Şekil): bu yöntemde, bir kristalizasyon solüsyonunun küçük bir miktarı rezervuarın kristalizasyon haznesine eklenir.

Protein solüsyonu ve kristalizasyon solüsyonunun bir damlası bu haznenin merkezinde bulunan bir damlanın üzerine pipetlenir. Tüm solüsyonlar ekledikten sonra

buharlaşmayı önlemek için hazne

mühürlenir. Kristalizasyon

solüsyonunda tuz iyonlarının

konsantrasyonu haznenin merkezinde

bulunan damladakinden daha yüksek

olduğu için, gaz fazında buhar

difüzyonu ile çözücü (solvent)

moleküller protein damlasından

rezervuara doğru hareket ederler. Bu

işlem sırasında, damladaki proteinin

çözünürlüğü azalır. Sonunda aşırı

doymuş hale gelen protein solüsyonu

termodinamik olarak kararsız

durumdur. Bu durum, damladaki

proteinin bir kısmının sonuçta daha

büyük kristallerle büyümesini

sağlayan kristal çekirdeği

oluşturmasına (bkz. Resim) veya X

ışını analizinde kullanışsız amorf bir

proteini çökeltisine neden olur.

Kristalizasyon ve çöktürme birbiriyle

yarış halinde olan süreçlerdir. Bu

yüzden istenem kristalizasyonla

sonuçlanacak optimal koşulları tespit

etmek son derece önemlidir.

www.scienceinschool.org Science in School Issue 11 : Spring 2009 33

her

‘in iz

niyl

e S

tic

k

atric

P

ve

B

lattm

ann

B

eat

R

esim

,

3.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 0.9

M) 6.0 ml DI-su

5.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 1.5

M) 4.0 ml DI-su

Sınıfta lizozim kristalleri

Bu pratik etkinlikte öğrenciler bir protein için optimal kristalizasyon

koşullarını belirleyerek X ışını kristalografisi hakkında daha fazla

bilgi edinirler.Öğrenciler pH ve tuz konsantrasyonunun bir

fonksiyonu olarak lizozim kristallerinin oluşumunu araştırırlar.

Lizozim

Lizozim, bakteriyel hücre duvarına hasar veren anti-bakteriyel

enzimlerin ailesine ait bir proteindir. İnsanlarda gözyaşı, tükürük

ve mukus gibi bir dizi salgıda bol miktarda bulunmaktadır.

Lizozimin büyük bir miktarlarda tavuk yumurtası akında da

bulunabilir.

Malzeme ve materyal

Sınıf başına bir veya iki Cryschem™

kristalizasyon tabağı (Hampton Araştırma)

Kristal berraklığında sızdırmayan bant (5 cm)

(Hampton Araştırma)

1 ml ve 1 μl‟lik pipetler

Kristalleri gözlemlemek için bir mikroskop

20 °C‟de depolama kabini

Kimyasallar

Lizozim (Sigma-Aldrich Ürün # 62971, BioChemika derecesinde) – lizozimi farklı bir kaynaktan da kullanılabilir. Ancak, bu protokol için başarılı bir şekilde test edildiğiiçin yukarıdaki marka tavsiye edilir).

Sodyum klorür (NaCl) (süpermarketteki sofra tuzu da aynı işi görür)

Sitrik asit

Sodyum asetat

Sodyum fosfat, tek bazlı

Sodyum hidroksit çözeltisi

Glasiyel asetik asit

Deiyonize su (DI-su)

Stok çözeltiler

Aşağıdaki sulu stok solüsyonları öğretmen tarafından önceden

hazırlanmış olmalıdır:

Su içinde hazırlanmış 50 mg / ml lizozim stok solüsyonu

3 M sodyum klorür (100 ml DI-suda 17.53 g NaCl çözünür).

1 M sodyum sitrat, pH 3.5 (100 ml DI-suda 19.24 g sitrik asit

çözünür ve sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 3.5‟e ayarlanır).

1 M sodyum asetat, pH 4.5 (100 ml DI-suda 13.6 g sodyum

asetat çözünür ve glasiyel asetik asit ile pH 4.5‟e ayarlanır)

1 M sodyum asetat, pH 5.5 (100 ml DI-suda 13.6 g sodyum

asetat çözünür ve glasiyel asetik asit ile pH 5.5‟e ayarlanır)

1 M sodyum fosfat, pH 6.5 (100 ml DI-suda 15.6 g sodyum

fosfat çözünür ve sodyum hidroksit çözeltisi ile pH 6.5‟e

ayarlanır).

1

2.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 0.6 M) 7.0 ml DI-su

2 3 4 5 6

4.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons.. 1.2 M) 5.0 ml DI-su

6.0 ml, 3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 1.8 M)

3.0 ml DI-su

7.0 ml,3M NaCl stok solüsyonu (son kons. 2.1 M) 2.0 ml DI-su

1.0 ml sodyum sitrat

(son kons. 0.1 M), pH 3.5

pH 41.0 ml sodyum asetat

(son kons. 0.1 M), pH 4.5

1.0 ml sodyum asetat

(son kons. 0.1 M), pH 5.5

1.0 ml sodyum fosfat

(son kons. 0.1 M), pH 6.5

A A1 A2 A3 A4 A5 A6

B B1 B2 B3 B4 B5 B6

C

D

C1 C2 C3 C4 C5 C6

D1 D2 D3 D4 D5 D6

NaCl son konsantrasyonu 0.6 M‟dan 2.1 M‟a artar

Kristal büyütme deneyi için pipetleme şeması

34 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org

pH

artar 3.5‟ten 6.5‟e

AK

TİV

İTE

Sİ

SIN

IF

Öğrenme aktiviteleri

X ışını ile kristalleriniz ölçüldü mü? Sınıfınız protein kristallerini başarıyla büyüttü ise Dr Patrick Sticher

sticher@bioc.uzh.ch adresinden sizinle iletişim kurmaktan memnun

olacaktır. İsviçre NCCR (Araştırmada Yeterlilik Ulusal Merkezi) Yapısal

Biologyw2 bu protokolü kullanarak protein kristallerini başarıyla büyüten ilk

10 okulun için bir X-ışını kırınımı görüntüsü üretmeyi teklif etmiştir. X-ışını

ölçümleri hem doğrudan okul örneklerinden veya postalama bir sorun ise

sınıfınız tarafından belirlenen optimize kristalizasyon şartları kullanılarak

büyütülen kristaller üzerinde yapılabilir. Bilim adamları da kırınım

görüntüleri ile birlikte, bu bilgilerin proteinin gerçek yapısını elde etmek için

gelecekte nasıl kullanılacağı konusunda bilgi verirler ve gerekirse bir

sertifika verirler.

Kristal büyütme deneyi

1. Kristalizasyon deneyleri için stok solüsyonlarından, tabloya

göre 24 rezervuar çözeltisi hazırla. Öğrenciler küçük gruplar

halinde ayrılabilir ve her bir grup bu 24 farklı çözeltinin birkaçını

hazırlar. Tüm gruplar aynı stok çözeltilerini kullanabilir.

2. Referans olarak tabloyu kullanarak, bir Cryschem ™ tabağının

24 rezervuarlık kuyusunun her birinin içine, ona karşılık gelen

rezervuar çözeltisinden 0.5 ml pipetlenir. Tablo, her bir şartı

özetler ve plaka üzerindeki kuyuların pozisyonunu gösterir.

3. Rezarvuar solüsyonundan 1 μl kristalizasyon kabında bulunan

her damlanın üzerine ilave ediniz (yukarıdaki şekilde „b‟).

4. Her rezervuar solüsyon damlasının 1 μl‟ sine lizozim stok

solüsyonundan 1 μl ekleyin (yukarıdaki şekilde 'b' için).

5. Protein solüsyon damlasını ekledikten sonra buharlaşmayı

önlemek için hemen şeffaf sızdırmaz bant ile kristalizasyon

damarını kapatın (yukarıdaki şekilde “c”).

6. Plakayı 20 ° C‟de sakla. Bazı kuyularda kristaller hemen

büyümeye başlar ve 1-2 saat aralıklarla büyüme doğrudan

mikroskop altında görülebilir. Plakalar son analiz için, sonraki

derste kadar saklanabilir. Yaklaşık 1-2 hafta sonra kristal, nihai

boyutuna büyümüş olacaktır. “A” işaretli plaka bir yıl kadar

hatta bazen daha uzun devam edecektir.

7. Lizozim kristallerinin sayısı, büyüklüğü ve dağılımı analiz edilir.

Kristaller, çıplak gözle görülemeyecek kadar cok küçük olabilir.

Bu nedenle iyi bir büyüteç yada mikroskop çok daha yararlı

olacaktır.

8. 24 rezervuar sonucunun karşılaştırılmasıyla kristalizasyon için

uygun koşullar belirlenir.

Bilim adamları ile sohbet edin Öğrenciler, kendi deneylerini yaptıktan sonra Skypew4 aracılığıyla bilim

adamları ile, çevrimiçi sohbet edebilirler. Randevu almak için, Patrick

Sticher (sticher@bioc.uzh.ch) e-posta adresinden” proteincrystallography”

Skype hesabını kullanarak onunla sohbet edebilirsiniz.

www.scienceinschool.org Science in School Issue 11 : Spring 2009 35

Ek öğretim materyali indiriniz

Bir seri powerpoint sunum, resim ve daha fazla

deney çevirimiçiw5

mevcuttur.

Malzeme tedarikçileri

Aşağıdaki tedarikçilerw6

gerekli malzemeleri ve

kimyasalları sağlar:

Hampton Research: •

Cryschem ™ 24-1 SBS plaka, Cat.

No HR1-002 (Bu tür plaka

kullanmanızı öneririz. Bir plakanın

maliyeti yaklaşık olarak 3$

Amerikan doları).

Kristal Şeffaflıkta Sızdırmaz Bant (5

cm), Cat. No HR4-51

Gilson Inc:

1 ml ve 1 l manual pipetler

Sigma Aldrich:

Lizozim, Ürün #62971

Sodyum klorür, Ürün #71380

Sitrik asit, Ürün #27488

Sodyum asetat, Ürün #71190

Sodyum fosfat, monobazik,

Ürün #71502

Referanslar

Cornuéjols D (2009) Biological

crystals: at the interface between

physics, chemistry and biology.

Science in School 11: 70-76.

www.scienceinschool.org/2009/

issue11/crystallography

Web referansları

w1 - w1 – Kimya dalında 1962 Nobel ödüllü

sahipleri ve onların öncü çalışmaları hakkında

ek bilgi, Nobel Ödülü Komitesi web sitesinde

bulunabilir:

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/la

ureates/1962/

w2 - İsviçre Araştırmada Mükemmeliyet

Ulusal Merkezi (NCCR) Yapısal Biyoloji, zar

proteinleri ve supra-moleküler komplekslerinin

yapı-işlev ilişkilerinin aydınlatılmasına

kendilerini adamış bilim adamlarının

oluşturduğu bir topluluktur:

www.structuralbiology.uzh.ch

Seçilmiş araştırma sonuçlarına buradan

ulaşabilirsiniz:

www.structuralbiology.uzh.ch/research004.asp

w3 - Biyolojik makromoleküllerin yapıları

(proteinler ve nükleik asitlerin) Protein Veri

Bankasında (PDB) mevcuttur. Web sitesi

ilginç öğretim kaynakları sunmaktadır:

www.pdb.org

Protein bilgileri için diğer değerli bir kaynak:

www.proteopedia.org

w4 - Skype yüklemek ve kaydetmek için, bkz.:

www.skype.com

w5 - Ek ders kaynaklarına şu adresten

ulaşabilirsiniz:

www.structuralbiology.uzh.ch/ teacher

Login: crystallization,

Password: xraybeam2008

Bu site düzenli olarak güncellenecektir.

w6 - malzeme tedarikçilerinin web siteleri

aşağıdaki gibidir:

Hampton Araştırma:

www.Hamptonresearch.com

Gilson Inc.: www.gilson.com

Sigma-Aldrich: www.sigmaaldrich.com

Bu makale, X-ışını kırınımı ile protein

kristalleri çalışma için iyi bir giriş

niteliğindedir. Bu anlamda, biyoloji,

fizik, kimya gibi - üç bilim için ilginç

bir egzersiz sunmakta ve üç bilim

arasındaki bağları göstermektedir.

Küçük şeylere nasıl bakıldığını ve

neden bu seviyedeki şeyleri

çalışmaya gerek duyulduğunu

tartışmaktadır. Makalede ayrıca

analitik bir araç olarak kırınım

kullanımının farkında olmayan

öğretmenler için iyi bir okuma zemini

sağlar.

Pratik deneyi kurmak ve

sonuçları elde etmek biraz zaman

alacak gibi görünüyor, fakat

sonuçların bir üniversitede

değerlendirilecek olması, diğer pratik

çalışmalarımıza farklı bir boyut

kazandırıyor.

Mark Robertson, UK

Kaynaklar

Abad-Zapatero C (2002) Crystals and

Life: A Personal Journey. La Jolla, CA,

USA: International University Line.

ISBN: 978-0972077408

Daha genç öğrencilere protein olmayan

kristalleri büyütmek için önerilen bazı

protokoller:

www.msm.cam.ac.uk/

phase-trans/2002/crystal/a.html

www.waynesthisandthat.com/

crystals.htm

http://chemistry.about.com/od/

growingcrystals/

Growing_Crystals.htm

Beat Blattmann NCCR Yapısal Biyoloji’de

yüksek verimlilik kristalizasyon tesisinden

sorumlu bir kimyagerdir. Bu sistem her gün

5000 kristalizasyon şartı için test imkânı sağlar.

Patrick Sticher mikrobiyoloji alanında doktora

yapmış olup NCCR’nin bilim yetkilisidir ve

eğitim, teknoloji transferi ve program

koordinasyonunundan sorumludur..

36 Science in School Issue 11 : Spring 2009 www.scienceinschool.org

GÖ

RÜ

Ş