Osborne: Bcs~immung des Schwefels in den Proteink(irpern. 25

Angewandt 50rag K 2C0 s . Erhalten 23,5 cc ~N (25°, 756 lnn 0 ;

reducirt auf 0 ° und 760 mm = 20,7 cc;

demnach 20,7 X 0,6522 ~ 13,56 mg CO s Correctionswerth ~ 2,1

15~66 mg CO s Theoretiseh enthalten 50 my K 2C0 s ~ 15,9 << << Die Resultate sind demnach sehr gute.

Best immung des Schwefels in den ProteinkSrpern.

Yon

Thomas 0sborne. 1)

a) B e s t i m m u n g des T o t a l s c h w e f e l g e h a l t e s .

Ungef~hr 10g Natriumperoxyd werden in einem Nickeltiegel in Hydrat verwandelt indem man etwas Wasser zusetzt und so lange tiber einer Alkohollampe erhitzt, his tier Wasseriiberschuss ausgetrieben ist. Nun rtihrt man 1 - - 2 g des Proteins in das Ctwas abgektihlte Hydrat ein und oxydirt, indem man die Temperatur steigert and kleine Mengei~ Natriumperoxyd zusetzt, his die Oxydation vollendet ist, Die gesehmolzene. Masse wird dann in 400 cc Wasser gelSst, die L5sung mit Salzs~ure stark angesiiuert, so lange erhitzt, his der Ueberschuss des Peroxyds zerstSrt und das Chlor ausgetrieben ist, durch reines Papier filtrirt. mit Ammoniak neutral gemacht und ein Ueberschuss yon 4 cc con- centrirter Salzs~ure zngesetzt. Aus der siedenden L6sung wurde die Sehwefels/~ure dadurch gef~llt, class man allm~hlich verdfinnte Chlorbaryum-

l(isung zusetzte. Nachdem die Probe fiber Nacht auf einem Dampftische gestanden hatte, wurde das Baryumsulfat abfiltrirt: gewaschen, gegltiht und gewogen.

b) B e s t i m m u n g des l o s e g e b u n d e n e n S c h w e f e l s . S c h u l z ' s M e t h o d e .

S c h u 1 z's Methode besteht darin, dass man ein Gramm des Proteins mit 5 0 c c einer 30 ~ igen SodalCisung, l g metallisehen Zinkes und

1) Aus: Studies from the research Laboratory of the Connecticut Experi- ment Station: Aus dem Engliscben fiberse~zt und far diese Zeitschrift bearbeitet. yon Dr. V. G r i e s s m a y e r .

26 Osborne: Bestimmung des Schwefels in den t'roteinkiirpern.

etwas essigsaurem Blei mehrere Stunden am Rtickflussktihler erhitzt. Nachdem man die LOsung mit Essigs~ture schwach angesiiuert hat, wird das gebildete Bleisulfid abfiltrirt, mit Wasser gewasehen~ getrocknet und sammt dem Filtrirpapier mit Soda und Kalisalpeter geschmolzen. O s b o r n e sehmolz das Bleisulfid mit Soda und Natriumperoxyd. Die Sehmelze wurde in Wasser gelSst, die LSsung zur Entfernung des Bleis mit Kohlensiiure behandelt, filtrirt, mit einem Uebersehuss yon Salzslture eingedampft, und der Sehwefel als Baryumsulfat auf dem gewOhnliehen

Wege bestimmt.

D r u c k m e t h o d e .

Ein bis fiinf Gramm des Proteins werden in einem Nickeltiegel mit 50 cc einer 50°/oigen SodalOsung, die etwas essigsaures Blei ent- hlilt, gut durchgemiseht, die Mischung in einem Autoklaven zwei bis sieben Stunden lang bei Temperaturen yon 135--165 ° C. erhitzt, wo- bei eine Oxydation dadurch verhtitet wird, dass man den Luftsauerstoff im Autoklaven durch Natriumpyrogallat absorbiren liisst. Das so beim Erhitzen gebildete Bleisulfid wurde abfiltrirt, mi t Wasser gewaschen, getroeknet, mit Soda und ~Tatriumperoxyd gesehmolzen und, da das Vorkommen yon Kiesels~ure durch die Verwendung yon Nickelgef~ssen

ausgesehlossen war, der Schwefel direct aus der angesauerten L(isung tier Schmelze unter den obigen Bedingungen als Baryumsulfat gefStllt.

B e s t i m m u n g des g e s a m m t e n und des l o s e g e b u n d e n e n S c h w e f e l s in v e r s c h i e d e n e n P r o t e i n e n .

¥on den in diesem Kapitel behandelten vielen ProteInsubstanzen: welche zumeist yon O s b o r n e und seinen Mitarbeitern dargestellt worden sind, soll nur das Edestin im Detail vorgefahrt werden, well hierbei alle wichtigen Fragen zur Besprechung gelangen. Beziiglich der Provenienz der einzelnen bier vorgeftihrten Proteine vergleiche man: 1) die Proteide der Getreidearten, Htilsenfriichte und Oelsamen yon Dr. V i c t o r G r i e s s m a y e r , Heidelberg 1897; 2) die Zeitsehrift far das landwirthschaftliche Versuchswesen in Oesterreich, 1.--3. Jahrgang {1898--1900).

E d e s t i n .

Dies Protein findet sich in den Samen yon Hanf, Flachs, Melonen, Ktirbis und Ricinus vor. Da es sich rasch in okta~drischen Krystallen

Osbollae: Bestimmung des Schwefels in den Prote'ink~l~pern. 27

ausscheidet, wenn seine Kochsalzl6sungen dialysirt oder abgekiihlt werden,

so kiinnen leicht relativ reine Pr/iparate davon dargestellt werden.

Die folgenden Bestimmungen wurden mit 24 versehiedenen krystallisirten Pr~paraten aus Hanfsamen gemacht.

T a b e l l e I.

P r o c e n t g e h a l t an G e s a m m t s c h w e f e l in E d e s t i n - p r ~ p a r a t e n a u s H a n f s a m e n .

I II I I I i IV V VI VII

0,931 0,93'4 0,980 i 0,895 0,983 0,960 0,9'44: 0,949 0,924 0,938 ! - - 0,963 - - 0,9,41 0,910 0,937 -- i . . . . . .

T

VIII IX X ~ XI XII XIII XIV

0,990 0,990 0,997 0,943 0,874 0,864 0,900 0,972 - - 0,987 ] - - 0,900 0,866 - - 0,963 - - - - , . . . .

x v i XVli i! XVlIi XlX xx I xxi t r

XV

0,902 0,893 0,934 0,941 0,964: 0,939 0,932

Der Durchschnitt dieser Zahlen ist 0,936 °/o. Es ist also mSglich, den Gesammtschwefelgehalt mit erheblicher Genauigkeit zu bestimmen, uber es ist auch klar, dass diese verschiedenen Pr/~parate nicht genau denselben Schwefelgehalt aufweisen. Wie schon frtiher gezeigt, besteht das krystallisirte Edestin aus einer Mischung des basischen Prote~n- moleefils mit S/iuren, deren l~atur yon dem Charakter und der Menge der zur Zeit der F~tllung des Edestins gegenw/~rtigen Salze abh~ingt. Wenn Pritparat XXII I , das aus Ammonsulfatl6sung auskrystallisirt war, in Wasser suspendirt and gegen PhenolphtaleYn mit Kalilauge neutral gemacht worden war, blieb das Edestin ungel6st und wurde darch Filtration vom Wasser getrennt, in dem sich eine Menge yon Katiumsulfat vorfand, entsprechend dem Betrage der neutralisirten S~ture.

28 Osborne: Bestimmung des Schwefels in den ProteinkSrpern.

Dieses und ein an dares ~tlmlieh dargestelltes Pri~parat enthielten folgende 5Iengen Gesammtschwefel :

XXII XXIII

1~125 °/o 1,084 °/o 1,110 <, 1,103 <,

Die Aeidit~tt diesar Pr~par~te gegen Phenolphtale~n war gleiet~ einem Gehalt an Sehwefelsaure entsprechend dam 8chwefelfibersehusse in denselben fiber dan Durehschnittsgehalt der Pr~tlaarate I - - X X L welch' letztere alle aus KoehsalzlSsungen dargestellt worden waren. Diese letzteren, in obiger Weise neutra!isirt, lieferten haupts~tehlich Chlorkalium, aber zusammen mit diesem Chlorid wurde immer aual~ eine geringe Menge Sulfat aufgefunden. Die Differenzen im Sehwefel- gehalt der Prttparate I - - X X I sind hiermit erkliirt. Dieser Uebersahuss an 8ehwefel ist daher nicht als zum Prote~nmolecfil gehOrig anzusehen. Der Betrag an diesem Schwefel ist nicht gross, da die Gesammtaeiditiit der Pr~parate in keinem Fal]e 1,2 cc einer 1/loNormallSsung per Gramm t~berstieg, was einer Sehwefels~turemenge mit einem Sehwefelgehalte gleich 0,19 °/o Prote~n entspriaht.

Ein solcher 8chwefeliiberschuss ergibt sieh aus den Priiparatml XXII und XXIII, in welchen durch die Analyse festgestellt wurde, dass die Aciditi~t yon Schwefelstture herrilhre.

Um den wirklichan Sehwefelgeha]t zu finden, der dem Edestin- moleefil zukommt, bestimmta 0 s b o r n a den Gesammtschwefel in einem sehr reinen und vollst~tndig neutralen Priiparate, alas man erhielt, in- dem man Edestinehlorid mehrmals umkrystullisirte, seine LSsung gegea Phenolphtalein neutralisirte und wieder umkrystallisirte. Zwei Schwefel- bestimmungen in diesem Pri~parate gaben 0,880 und 0,887%. Der Durchsahnitt aus diesen Ziffern: 0,884 liefert unfraglich genau den

\

Gasammtschwefalgehalt des Edestinmoleciils.

Mit diesem Resultate stimmen manahe frtiheren fiberein, namentlich IV, XII, XIII, X!V, XV und XVI, welehe alle entweder aus Priiparaten stammten, die haupts~chliah aus Bichlorid bestanden, ltislich in reinem Wasser und die bei der Neutralisation ainen ~tusserst geringen Sulfat- geha!t aufwiesen, oder aus solchen Priiparaten, die gegen Phenolphtule~n neutral gcmacht worden waren.

Osborne: Bestimmung des Schwefels in den ProteXnkCirpern. :2,99

T a b e l l e II. P r o e e n t g e h u l t an l o s e g e b u n d e n e m S c h w e f e l im E d e s t i m

a) 1 g g e k o c h t mi t 30° /o iger N a t r o n l a , uge Zn und Pb (C2H~O~) 2

71/~ S t u n c l e n E

VIII X[ XVI I XVII XXIII XX

0,282 0,376 0,263 0,286

- - i 0,277

b) l g i m A u t o k l a '

0,355 0,309 0,297 0,348 0,321 I 0,303 - - 0,302 0,277 1 . . . .

~en e r h i t z t m i t 30° /o ige r N a t r o n l a u g e und Pb (C2H302) ~

Be i 135o

2 Stunden 3 Stunden

VIII XXIII VIII 1 XVI

0,366 0,297

0,307 I

0,276 i 0,275 1

- - 0,265

XXIII

0,31~ 0,300 0,297 0,240

71]~ Stunden 5 g bei 165o

XXIV XXV

0,339 0,363 0,344: 0,347

- - 0 , 3 ~ : 0

- - 0,337

Yon den mit 1 g Edestin angestellten Bestimmungen sind vier so

hoch wie die mit 5 g bei der h5heren Temperatur; der Durchschnitt yon allen ist jedoch entschieden niedriger.

Da die mit 5 g Edestin bei hSherer Temperatur erhaltenen Resultate wahrscheinlich die genaueren sind~ so mag deren Durchschnitt: 0,346 °/o als der genaueste Repriisentant des lose gebundenen Schwefels erachtet werden~ der aus Edestin in Form yon Bleisulfid gewonnen werden kann.

T a b e l l e III. V e r h i ~ l t n i s s des l o s e g e b u n d e n e n S c h w e f e l s

z u m G e s a m m t s e h w e f e l .

Verb al~niss :Lose des lose

Gesammt ge, gebundenen S c h w e f e l s z u m

Prote:~n schwefel bundener Gesamm~ Schwefel s c h w e f e l i n

Procenten

Serumalbumin . . . i 1,930 Oxyh~moglobin (Hund) 0.568 Seroglobulin (Pferd) : 11110 Gliadin . . . . . . 1,027

1,280 0,335 o,~30 0,619

57 / ~ 6O P

30 Osborne: Bestimmung des Schwefels in den Prote'inkSrpern.

Protein

Oxyh~moglobin (Pferd) Vignin . . . . . . Amandin . . . . . Globin . . . . . . GlyeinJn . . . . . Vieilin . . . . . . Legumin . . . . . Edes~in . . . . . . Ze~n . . . . . . . Ovovitellin . . . . . Fibrin . . . . . . Excelsin . . . . . 0valbumin . . . . . Pbaseolin . . . . . Casein . . . . . .

~ o s e

Gesammt- ge- sehwefel bundener

/ Schwefel

Verh~iltniss des lose

gebundenen Sehwefels zum

Gesammt- schwefel in Proeen~en

0,380 0,426 0,4:29 0,420 0,710 0,200 0,385 0,880 0,600 1,028 1,100 1,086 1,616 0,312 0,800

0,190 50 0,214 50 0,217 50 0,200 48 0,320 46 0,092 46 0,165 41 0,346 40 0,212 35 0,348 34 0,380 34 0,350 32 0,491 30 0,072 23 0,101 13

1/2

1/s

Wenn wir vom Phaseolin und Casein far jetzt absehen, so kSnnte

man annehmen, dass das Prote~nmolectil entweder 2 oder 3 Atome

Schwefel enthiilt. Eine solche Annahme setzt aber voraus, dass in den

meisten Fiillen die Gesammtheit des lose gebundenen Schwefels unter

den Bedingungen unserer ¥ersuche in Bleisulfid umgewandelt werden

kann. Die mit Edestin erhaltenen Resultate zeigen aber deutlich, dass

die eine Hiilfte seines Schwefels nicht so abgespalten werden kann,

denn die hSchsten Werthe, die man erhielt, erreichten nicht die H~tlfte

des Gesammtschwefels; ja die meisten erreichten kaum ein Drittel

desselben. Wenn dies fttr Edestin richtig ist, so mag es auch ftir

manche anderen Prote~ne gelten. Wir mtissen daher sehen, ob die

Menge des lose gebundenen Schwefels mit einer bestimmten Menge yon

Schwefelatomen ttbereinstimmt oder nicht, wie sie in Tabelle V ver-

zeichnet ist.

In der n~tchsten Tabelle IV sind die Prote~ne nach ihrem Schwefel-

gehalte geordnet. Der Gehalt an lose gebundenem Schwefel bei diesen

Proteinen, die in dieser Tabelle mit einem Atom solchen Schwefels

auftreten, stimmt fast genau mit dem berechneten. Bei denen, die mit

einer grSsseren Anzahl yon Atomen locker gebundenen Schwefels auf-

traten, zeigt die Mehrzahl einen Mindergehalt gegeniiber dem berechneten.

Osborne: Bes~immung des Schwefels in den ProteinkSrperm 31

T a b e l l e IV.

A t o m e y o n f e s t u n d l o c k e r g e b u n d e n e m S e h w e f e l .

Protein

Legnmin Oxyhi~moglobin (Pferd) Globin (Pferd) Vignin . . . . . . Amandin . . . . . . Oxyhiim oglobia (HUM) Ze~n . . . . . . . Glycini~ . . . . . Horde'in . . . . . . Edesfin . . . . . . Gliadin . . . . . . Ovovitellin Excelsin . . . . . Seroglobulin (Pferd) Fibrin . . . . . . Ovalbumin . . . . Seralbumin (Pferd) .

0,385 1 0,390 1 0,420 1 0,426 1 0,429 1 0,568 1 0,600 2 0,710 2 0,8~7 2 0.880 2 1,027 2 1,028 3 1,086 3

1,110 i 2 1,100 3 1,616 5 1,930 2

1

1 1 1' 1

2 1

2 2 2 3 2 2 3 2 3 7

[

0,165 i 0,193 0,190 i 0,195 0,200 I 0,210 0,214,:0,213 0,217!0,213 0,335 0,379 0,212 0,200 0,320 0,355 0,3480,423 0,3470,44O 0,619 0,629 0,348 0,410 0,350 0,430 0,630 0.666 0,380 0,440 0,491 0,609 1,280 1,498

m~.( , 4

f

J-- 0 o28 81 /-0:005 97 [-- 0,010 95 l+ 0 0 0 1 1 0 0 + o,oo41 lO4

[-- 0,037 88 I-~- 0,012 106 i 0,035 90 i-- -- 0,073 ~ 83 - - 0,093 79 - - 0,010 99 !-- 0,062 83 I-- 0,080 I I-o,o36 i 81 i-- 00608695

i= o,11s! 81 -o,218, 85

Bevor eine Entseheidung tiber die Menge des locker gebundenen Schwefels getroffen werden kann, der in den Molecfilen dieser ver- schiedenenProteink6rper enthalten ist, ist es nothwendig, zu wissen, ob aller solcher Sehwefel unter den Bedingungen obiger Versuche als Bleir sulfid erhalten werden kann. Alle Forscher, die sich mit tier Be- stimmung des locker gebundenen Schwefels bescMftigt haben, betonten die Aehnlichkeit im Verhalten dieser Substanzen mit dem des Cystins unter ~thnlichen Umst~nden; abet erst N 6 r n er hat das Cystin selbst unter den Producten des Abbaues der Prote~nkOrper entdeekt. So land er im Harn 6~8°/o, in der Eischale 6°/o ~ im Menschenhaar 12,6°/o und im Serumalbumin fiber 1 0/0 Cystin.

E m b d e n hat diese Angaben best~tigt~ nur land er in obigen Proteinen Cystein und betraehtet daher letzteres far das erste Zer-

,32 Osborne: Bestimmung des Schwefels in den ProteXnk6rpern.

setzungsproduct und Cystin erst far ein secund~tres Product. Hieraus kann man mit Wahrscheinlickeit entnehmen, dass ein Theil des locker gebundenen Schwefels vieler Prote~nkOrper einem Cystein- oder Cystincomplex angehOrt.

Wenn aber dem so ist, so massen die quantitativen Bestimmungen

des locker gebundenen Schwefels zu gering ausfallen, da es bekannt ist, dass nur ein Theil des Sehwefels yon Cystin and Cystein durch

Sieden mit LOsungen yon Soda und Bleiacetat in Bleisulfid verwandelt werden kann. Es m5ehte demgemi~ss scheinen, dass wir yon den meisten Prote~nen, und zumal yon den schwefelreichen, den locker gebundenen

Schwefel gar nicht vollst~ndig gowinnen kOnnen. Ein Blick auf Tabelle ¥ zeigt jedoch, dass - - drei Ausnahmen ab-

gerechnet - - der locker gebundene Sehwefel, den man yon solchen Prote~nen

erhielt, welche mehr wie 0,43 °/o Schwefel enthalten, 79--900/o des berechneten bildete, w~hrend der Gehal L den man yon solcheu erhielt, (tie weniger wie 0,43 °/o Schwefel enthalten, mit dem berechneten inner- halb der Grenzen der Genauigkeit der Analyse abereinstimmte. ~Nur bei solchen Prote~nen der Tabelle, welche mehr wie ein Atom locker gebnndenen Schwefel zu enthalten scheinen, ist die gefundene Menge erheblich geringer wie die berechnete.

Diese Thatsachen finden eine Erkl~trung in MOrn e r ' s Entdeckung

yon zwei schwefelhaltigen Gruppen, welche beide beim Behandeln mit alkalisehen Bleil5sungen Bleisulfid liefern. Es ist wohl mOglich, dass Cystin oder Cyste~n nur yon solchen Prote~nen ein Bestandtheil sind,

die verhiiltnissm~ssig reich an Schwefel sind, so dass yon diesen nut ein Theil des zu diesen Gruppen gehOrigen Schwefels als Sulfid erhaiten werden kann, w~hrend yon den anderen, die nur den zweiten von M 5 rn e r beobachteten Complex enthalten, aller Schwefel erhalten werden kann. Der bei dem Edestin thatsachlich gefundene Gehalt an locker gebundenem SchwefeI stimmt wohl mit einer solchen Annahme, denn wenn 1 Atom des Schwefels einem Complex angehOrt, der allen seinen Schwefel als Sulfid hergibt, so wiirden wir aus dieser Quelle 0,22 °/o erhalten, und wenn ein auderes Atom dem Cystein (Em b d e n land im Edestin Cystein) an- geh(irt, das nach S c h u 1 z ungefiihr die H~tlfte seines Schwefels als Sulfid abgibt, so warden wir aus diesem ungef~thr 0,11°/o erhalten, in Summa also 0,33 °/o , was gentigend mit dem gefundenen 0,347 °/o tibereinstimmt.

Schliesslich muss auch noeh alas C a s e i n in Betracht gezogen werden, das sieh yon allen untersuchten Prote~nen dadurch unterscheidet, d~ss uur ~/s seines Gesammtschwefels als Sulfid erhalten werden konnte.

Osborne: Bestimmung des Schwefels in den ProteinkSrperm 35

Wenn der Complex, welcher diesen Sehwefel enthilt, all seinen Schwefel

als Sulfid liefert, so kann das ~oleculargewicht des CaseYns nicht

:geringer sein wie 30,000; wenn es jedoch nur einen Theft seines Schwefels als Sulfid abgibt, so zeigt es einen scharfen Gegensatz zu den

anderen Proteinen, die nur wenig locker gebundenen Schwefel efithalten, ,denn diese liefern fast genau die H~ilfte ihres Gesammtschwefels als Sulfid, zum Beweise, dass aller Schwefel dieses schwefelhaltigen Complexes in

Bleisulfid umgewanclelt wurde. Von allen untersuchten Proteinen liefert alas Casein bei weitem die geringste Menge locker gebundenen Schwefels.

V e r h ' ; ~ l t n i s s des G e s a m m t s c h w e f e l s z u m P r o t e ~ n m o t e e f i l .

Wie aus den Zahlen t~ber den Gesammtschwefelgehalt hervorgeht,

enthMten alle gepraften Prote~ne, mit Ausnahme yon Vicilin, Phaseolin und Conglutin, eine constante Menge Schwefel. Diese Prote~ne, welche in Krystallen erhMten werden kSnnen und demnach ganz rein sind, zeigen eine solche Gleichm~ssigkeit im Schwefe]gehalte, dass man nicht daran zweifeln kann, dass derselbe einen bestimmten Bestandtheil ihres Molectfls ausmacht. Berechnen wit nun die einfachsten empirischen

Formelu far diese Proteine, sowie far einige andere Proteine thierischer Herkunft, und multiplieiren wir die so erhMtenen Ziffern mit solch einer ganzen Zahl, dass man ein Moleculargewicht yon nahezu 15,000 erh~tlt,

so bekommt man die Formeln yon Tabelle V. Solche Formeln haben natarlich n u r einen Annihernngswerth. Kohlenstoff und St',ckstoff kSnnen" mit genagender Genauigkeit bestimmt werden, aber ein kleiner Irrthum in der Sehwefelbestimmung fiihrt zu grossen Unterschieden in den Formeln. Ein Irrthum yon 1 0 % des Gesammtschwefels ft~hrt zu einem Irrthum yon 65 Atomen Kohlenstoff und 20 Atomen Sticl;stoff.

Die Ziffern fi~r den Gesammtschwefel zeigen~ dass der Durchschnitts- gehalt far jedes Protein innerhalb 0,06O/o yon dem thats~chlich vor- handenen liegt. Bei Prote[nen mit mehr wie 0~6°/o Schwefel nimmt tier wahrscheinliehe Irrthum in den Formeln ab, so dass er far solche,

welche 0,8°/o Schwefel enthalten, nnr mehr 30 Atome Kohlenstoff und 10 Stickstoff und far ein Protein, alas wie das Ovalbumin 1,6°/o Sehwefel enth~lt; nur mehr 15 Atome Kohlenstoff und 5 Atome Stick- stoff betr~gt. Ob die Proteine thatsSchlich ~ihnliehe ~Ioleculargewichte enthalten, muss einer kanftigen Untersuchung vorbehalten bleiben, mittler- weile verdienen die in der Tabelle angegebenen Formeln Beachtung, da sie Beziehungen hervorkehren, die anderw~rts nieht zu Tage treten.

F r e s e n i t l s , Zeit~ch~.ift f. a, rialy~. Chemle. XLL Jahrgang. !, He:a. 3

34 Osborne: Bestimmuug des Schwefels in den ProteXnkSrpern.

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