Z. Anal. Chem. 260, 124--126 (1972) �9 by Springer-Verlag 1972

Bestimmung yon Myoglobin durch isoelektrische Fokussierung

G. HEnB~RTZ

Pathologisches Institut der Universit~t Dfisseldorf (Direktor: Prof. Dr. H. Meessen)

Eingegangen am28. Februar 1972

Determination o/Myoglobin by Isoelectric Focusing. The solut ion of myoglobin m a y conta in only 2 ~g/ml ( total vo lume 50 ml). Hi~moglobin does no t interfere, therefore the solut ion has no t to be purif ied before. Medium error is • 40/0 .

Zusammen]assung. Eine Methode zur q u a n t i t a t i v e n Bes t immung yon Myoglobin durch isoelektr ische Fokussie- rung wird angegeben. Die AusgangslSsung k a n n bei e inem Ausgangsvo lumen yon 50 ml min ima l 2 vg/ml Myoglobin en tha l ten . Die zu un te rsuchende LSsung b r a ue h t n ieh t vorgere in ig t zu werden. Der mi t t le re Feh le r l iegt bei ~ 4O/o .

Myoglobin is t als H ~ m o p r o t e i d durch Spekt ro- me t t l e q u a n t i t a t i v zu bes t immen. Muske lex t r ak te en tha l t en jedoch neben Myoglobin immer H~mo- g]obin. Die Spek t r en yon t I s und Myo- globin s ind im s ich tbaren Bereieh wei tgehend gleich. Die Koh lenmonox id -Verb indungen yon H~mog]obin u n d Myoglobin un te rsche iden sich im Bereich 520 bis 600 n m so, dab eine spek t ropho tomet r i s ehe Best im- mnng aus einer LSsung mSglieh i s t (DeDuve [2]). Die Bes t immung yon Myoglobin wird jedoch du tch eine A b t r e n n u n g yon H~moglob in erheb]ich vereinfacht .

L ieg t bei der E lek t rophorese zwisehen K a t h o d e u n d Anode ein p H - G r a d i e n t yon hohen zu n iedr igen W e r t e n vor, so wande rn Pro te ine in die Zonen ihrer i soe lekt r i schen p H - W e r t e (Svensson [3]). Ves te rberg [5, 6] s tud ier te die Trennseh~rfe dieser Methode an gere in ig tem Myoglobin. Zur Charak te r i s ie rung und q u a n t i t a t i v e n Bes t immung is t jedoeh eine Vorreini- gung des Myoglobin n ieh t erforderl ich. Fa rb lose Pro te ine kSnnen weder die W a n d e r u n g zum iso- e lekt r i schen P u n k t noch die Ex t ink t ionsmessung stSren. Hgmoglob in un te r sehe ide t sich im iso- e lek t r i sehen P u n k t sehr yon Myog]ob in und kann dahe r ebenfal ls n ieh t stSren.

Material und Methoden

I m folgenden wird der Arbe i t sgang ftir die Trennung u n d B e s t i m m u n g des Myoglobins der R a t t e beschrie- ben. I n Homogenaten0 die eine wesent l ich andere Myog lob inkonzen t r a t i on haben, wird en tsprechend anders verdfinnt .

Zur Elektrofokussierung wird die 110 ml-S~ule, Gradien- tenmiseher, Perpex-Pumpe, Fraktionssammler Ultrorac | und die Ampholine| (Ampholytgehalt 40~ der Fa. LKB-Produkter Bromma Sehweden, verwendet. Die S~ule wird mit einem thermostatisierten Bad gekfihlt.

Die untere Elektrode (Anode) wird mit der L6sung yon 12 g Saccharose und 0,2 g H2S04 in 14 ml Wasser befiillt. :Die schwere LSsung des Dichtegradienten enth~lt in 34ml Wasser 22,4 g Saccharose und 0,75 ml Ampholyt pH 5--8. Die leichte LSsung enthi~lt das Myoglobin. Hierzu wird 0,5--1 g Muskel in 10 ml Wasser homogenisiert. Das Homo- genat wird zentrifugiert. Der l~iickstand wird erneut mit 10 ml Wasser homogenisiert und zentrifugiert. Der Uber- stand der beiden Zentrifugate wird in einem 25 ml-MeBkolben his zur Marke aufgeffillt. Eine leichte Trfibung der Myo- globinlSsung stSrt nicht. Yon dieser L6sung werden 20 ml in den Gradientenmischer abpipettiert. Die restlichen 5 ml verbleiben fiir eine Proteinbestimmung. Mit einigen Tropfen 0,1~ K3Fe(CN)6-LSsung und 20/0 KCN-LSsung werden die H~moproteide in die Fe(III)-CN-Form umgesetzt. Zu dieser LSsung wird 0,25 ml Ampholyt pH 5--8 gegeben und mit Wasser auf 45 ml aufgeffillt. Nachdem der Gradienten- mischer in die Sgule ausgelaufen ist, wird er mit 5 ml 0,4% Ampholytl6sung (1 ml k~ufliehe LSsung ~- 99 ml Wasser) nachgespfilt. Die LSsung wird in der Sgule fiber den Dichte- gradienten geschichtet. Der obere Elektrodenraum (Kathode) wird mit 1~ NaOIt aufgeffillt. An die S~ule wird eine Span- nungsquelle 400 V 100 mA der Fa. Dr. Bender & Dr. Hobein, Mfinehen, oder 500/1000V 25 mA der Fa. Gebr. Klees, Dfisseldorf, angeschlossen.

Der Verlauf der Trennung ist sehr gut optisch kontrollier- bar. Naeh der Trennung wird die untere Elektrode verschlos- sen, der Sguleninhalt wird mit der Perpex-Pumpe dureh ein Spektralphotometer und eine pH-~eBkette gesaugt. (Spek- tralphotometer Beckman DB der Fa. Beckman Instr., Mfinchen. pH-h/[egkette 401-M7-NS der Fa. Dr. W. Ingold, Frankfurt. ptt-Meginstrument pI-I 34 der Fa. Knick, Berlin.) Die prozentuale DurchlEssigkeit und der pH-Wert werden yon einem 2-Kanal-Punktdrucker der Fa. Joens, Diisseldorf, auf-

G. Herbertz: Bestimmung yon ~[yoglobin durch isoelektrische Fokussierung 125

gezeichnet. Um Verluste beim Auspuml0en zu vermeiden, ist die Pumpe so an den Fraktionssammler geschalte~, dab sie, wghrend die Fraktionen wechseln, steht. Die zu einer Myo- g]obinzone gehSrenden Fraktionen werden in einen 25 ml- Mel3kolben gefiillt, die Reagensgl~ser mit Wasser nach- gespiilt, 1 Tr. 2% KCN-LSsung zugesetzt, dann wird bis zur Marke aufgefiillt. Falls in dieser LSsung Eiweil3flocken vor- handen sind, wird dureh ein Papierfilter filtriert. In einem Spektralphotometer PMQ II der Fa. Zeiss, 0berkoehen, wird die Extinktion dieser LSsung bei 423 nm gemessen. Fiir die Berechnung des Mb-Gehaltes wird der Extinktionskoeffizient 111,5 em2/FMol yon Myoglobin Fe(III)CN des Schafs nach Bezns [1] verwendet. Das Molgewieht wird zu 17500 angenommen. Werden yon einer Art viele Myoglobin- bestimmungen durehgefiihrt, so ist zur Auffindung der Myo- globinzone die prgzise Messung der pH- und Durehl~.ssigkeits- kurve naeh einigen anf~nglichen Bestimmungen nicht mehr erforderlieh.

Ergebnisse

Nach dem oben angegebenen Verfahren wurden quantitative Bestimmungen yon mensehlichem Myo- globin und yon Myoglobin der Wistar-Ratte gemaeht. Bei mensehliehem Myoglobin geniigen 30 h bei 500 V fiir eine seharfe Auftrennung der H/~moproteide. Myoglobin der Ratte wandert im elektrisehen Feld ]angsamer, die Trennung ist erst nach 72 h beendet.

Die Naehweisgrenze _x wurde &us 6 Leerwerten naeh der Formel _x = 3 s • 2 erreehnet. (s Standard- abweiehung; 2 mittlerer Leerwert.) Bei den Leer- werten wurde dest. Wasser anstelle der Myoglobin- 16sung verwendet, x errechnet sieh zu 4,7 nMol. Bei einem maximalen Volumen der Ausgangsl6sung yon 50 ml liegt die Naehweisgrenze bei einer Konzentra- tion yon 10 .7 Mol/1 Myoglobin in der Ausgangsl6sung. Das entsprieht 1,75 ~g/ml oder aufgerundet 2 ~g/ml.

Zur Uberpr/ifung der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse wurden aus einer Myoglobinl6sung (Ratte) 6 Bestimmungen durehgeffihrt. Der Mittelwert war 9,94 FMol, der mittlere Fehler 0,372 ~Mol = 3,70/0.

Bei der Elektrofokussierung zeigen sieh mehrere Myoglobin- und Hi~moglobinzonen, die durch ihre isoelektrisehen Punkte untersehieden sind. Ob diese Untersehiede auf untersehiedliehen Aminos/~ure- sequenzen beruhen oder nur dureh eine vergnderte Terti/~rstruktur zu erkl/~ren sind, wurde nieht unter- sueht. Die Messung der isoelektrisehen Punkte bei 10~ ergab die folgenden Werte:

5iyoglobin des Mensehen Fe(III)CN ioH 5,97 • 0,03 n 4 Nyoglobin des Mensehen Fe(III)CN pH 6,55 • 0,01 n 6 Myoglobin der Ratte Fe(III)CN pH 5,50 ~: 0,06 n 4 Myoglobin der Ratte Fe(III)CN pH 6,37 -L 0,03 n 8 H~moglobindes3/iensehenFe(III)CN pH 7,01 ~ 0,01 n 9 HbA 2 desMenschenFe(III)CN pit 7,49 --L 0,05 n 5 Hgmoglobinderl~atte Fe(III)CN pI-I 6,82 • 0,01 n 3 H~moglobinderl~atte Fe(III)CN pH 6,96 ~ 0,02 n 4 ttgmoglobindergatte Fe(III)CN pH 7,10 ~ 0,01 n 4 I-Igmoglobindertlatte Fe(III)CN 10H 7,30 ~ 0,02 n 4 Hgmoglobindergatte Fe(III)CN pH 7,56 ~: 0,03 n 4

Der Myoglobingehal~ des Psoas des Menschen wurde an 6 Proben untersucht.

Einzelwerte in Milligramm Mb/Gramm Organ 2,28, 4,15, 2,75, 3,66, 4,38, 3,47.

Mitteiwert 3,45; Standardabweichung 0,81.

In einem Fall von Dermatomyositis wurde in der Psoasmuskulatur, in der yon Borchard [4] ein massi- ver Untergang yon ~uskelzellen beobachtet wurde, ein Myoglobingehalt yon nur 0,83 mg/g gefunden.

In einem Fall yon Myoglobinurie, hervorgerufen durch Unterkiihlung der Extremit~ten, wurde die Methode zum Myoglobinnachweis im Urin benutzt. Im Urin tritt im Gegensatz zu Muskelhomogenaten nur Myoglobin auf. Hi~moglobin wurde nieht beobachtet.

Diskussion Die isoelektrische Fokussierung ermSglicht eine quantitative Bestimmung des Myoglobins ohne Vor- reinigung der zu untersuehenden L6sung. Wenn man

4

+ 3

0 -%T

10C Mb pH Bereich pH 5-6,4

1 2 3

- 0

Mb pH 6-7,4

4

Abb. 1. Chromoproteide im Urin (Myoglobinurie) und pI-I-Kurve der Transmission und des pH-Wertes

126 Z. Anal. Chem., Band 260, Heft 2 (1972}

den isoelektrisehen P u n k t yon Myoglobin einer noeh n ieht un te r sueh ten Species sucht, muir m a n zun/~chst aus einer Blutprobe die i .P . -Werte der H~moglobine best immen. D a n n k a n n m a n in Muskelhomogenat die Lage der Myoglobinzonen ermit teln.

Bei der isoelektrisehen Fokussierung t r i t t eine starke Konzen t r i e rung auf. Die Nachweisgrenze liegt daher bei einer Konzen t r a t i on yon 2 ~zg/ml. Anwendungsm6gl ichkei ten in der kl inisehen Chemic

sind Myoglobinbes t immungen in Serum oder Ur in naeh Unte rgang yon Muskelzellen.

Literatur 1. Bezns M. : Acta Chem. Scand. 2, 333--342 (1948). 2. De Duve, C. : Acta Chem. Scand. 2, 264--289 (1948). 3. Svensson, H.: Acta Chem. Scand. 15, 325--341 (1961). 4. Yeltmann, G., Borchhard, F., Grabensee, B. : In Vor-

bereitung. 5. Vesterberg, 0.: Acta Chem. Scand. 21, 206--216 (1967). 6. -- Svensson, H.: Acta Chem. Scand. 20, 820--834 (1966)~

Dr. G. Herbertz Patholog. Institut der Universitiit D-4000 Dfisseldorf, Moorenstr. 5 Deutschland

Kurze Mitteilungen

1-(2',4'-Dinitrobenzol)-2-acetylhydrazin als neuer Indicator fiir die komplexomctrische und spektrophotometrische Bestimmung yon Kupfer 1- (2',4~-Dinitrobenzene)-2-acetylhydrazine as a New Indicator for the Complexometric and Spectrophotometric Determination of Copper

L~SZL6 L~GIa~DI

Nitrok6mia, Ffizfbgy~rtelep, Ungarn

Eingegangen am 14. M~rz 1972

E in neues ]~henylhydrazinderivat , 1-(2' ,4 '-Dinitro- benzol)-2-acetylhydrazin (DBAH), wird fiir die kom- plcxometrische und spektrophotometr ische Bestim-

m u n g von Kupfer vorgeschlagen.

Experimenteller Teil

Herstellung von DBAH. 0,4 g 2,4-Dinitrophenalhydrazin in 1 ml Essigs~ureanhydrid unter Erwiirmen 16sen, abkiihien, den Niederschlag filtrieren, mit Wasser spiilen. Ausbeute 0,32 g. Aus J(thanol kristallisieren, FP 200~ DBAtI titano- metrisch bestimmen~ in 0,024~ (t0y a M), 0,24~ und 0,10/0iger - i~thanoliseher L6sung benutzen. DBAH-Na. 0,024 g DBAII in 99,7 ml Athanol 16sen und 0,3 ml N Natriumhydroxid zuffigen.

Herstellung des Kup/er-DBAH-Komplexes in LSsung. Zu 2 ml 10 -3 M Cu(II)-SOa-L6sung 7,7 ml Wasser, 0,2 ml 0,240/0ige DBAH-L6sung nnd 0,1 ml 0,1 N Natriumhydroxid zusetzen. Man erhilt eine grfin gef~rbte L6sung, deren Absorptionsmaximum bei 600 nm liegt. Der Komplex ]6st sich gut in Wasser, Jkthanol, nicht aber in Chloroform.

Komplexometrische Bestimmung von Kup]er mit .~DTA gegen DBAH. Zu 0,1--0,2 m-~quiv. Kupfer (Cu + oder Cu e+) 3 ml Pufferl6sung (8 g NH~C1 und 110 ml konz. Ammoniak mit Wasser zu 1 1 16sen) und 0,1~ DBI-IA-Indicator-

16sung bis zur stark grfinen Fiirbung zusetzen. Dann mit 0,0t IV[ •DTA-L6sung bis zum Umschlag von grfin naeh br~tunlich-orange titrieren. Der relative Fehler der Bestim- mung betr~gt -4- 0,15~

Nachweis yon Kup/er mit DBAH. Auf einem Uhrglas 0,2 ml 0,024~ DBAH-L6sung, 1 Tropfen 10-aM Natrium- hydroxid und 1 Tropfen Untersuchungsl6sung zusammen- geben. Die orange Firbung des Indicators geht in Anwesen- heit von Kupfer in griin fiber (bis zu 1 ~g). Bei 1--0,1 ~zg Cu 2+ verblaBt die F~rbung yon DBAH. Die Nachweisgrenze be- tr/igt 0,1 ~g Cu e+.

Spektrophotometrische Bestimmung von Kup/er(II)-acetat. Zu 1 ml 0,024~ DBAH-L6sung 0,7ml Kupfer(II)- aeetat und 2,5 ml 96~ )i_thanol zusetzen. Die Extink- tion bei 600 nm messen. Mit Kupfer(II)-acetat eine EicMmrve aufnehmen. Megbereich 1--50 ~zg Cu e+.

Spektrophotometrische Bestimmung von Kup/er(II)-sul/at. Zu 2 ml 0,024~ DBHA-Na-L6sung 2 ml Untersuchungs- 16sung und 6 ml Wasser zusetzen. Die Extinktion bei 600 nm gegen DBAH-Na messen, Mit Kupfer(II)-sulfat eine Eich- kurve aufnehmen. ~et~bereich ~10--100 ~g Cu e+.

Bestimmung des Wassergehalts von Athanol mit DBAH- Kup]e@omplex. Zu 2 ml 10 -a M Kupfer(II)-acetat 0,2 ml 0,24~ DBAH-L6sung und 7,8 ml Untersuchungsl6sung zusetzen. Die Extinktion bei 600 nm messen. Mit L6sungen bekannten Wassergehalts eine Eichkurve aufnehmen.

Diskussion

D B A H ist eine Indicators~ure, die in alkalischem Milieu Pro tonen abgiht (Farbwechsel gelb-orange) und mi t Cu 2+ einen grfinen Komplex bildet. Die

Absorpt ionskurve yon D B A H weist bei p H 7,0--8,2 ein Maximum bei 360 n m auf, das bei h6hcren pH- Wer ten zu gr6Bercn Wellenli~ngen versehoben wird ( 4 4 0 n m bei pI~[ 10--11,4). Die Gleichgewichts- kons tan te wurde aus dem Absorp t ionsspekt rum

berechnet :

EL -- E lg K = lg ~ Z EHH~ -~ p H = 9,37.