Upload
lethien
View
216
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Wykład II
Wektory plazmidowe
Terapia genowaTerapia genowaGene therapyGene therapy
wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków
Wektorvector
Cząsteczka kwasu nukleinowego, służąca do przenoszenia obcego DNA (transgenu)
Wektory
Plazmidowe Wirusowe
RNA DNA „nagi” DNA
Retrowirusy(w tym lentiwirusy)
AdenowirusyAAV Wirus Herpes
Kompleksy ze związkamikationowymi
Kompleksy z białkami osłonek Wirusowych
Nośnik (Nośnik (vehiclevehicle))
Jon lub związek chemiczny, obdarzony ładunkiem dodatnim, umożliwiający zneutralizowanie ładunku ujemnego kwasu nukleinowego i jego wniknięciedo komórki
- jony Ca2+
- dekstran - liposomy kationowe - polipeptydy- dendrymery
Inne użyteczne terminy Tranformacja Tranformacja bakteriibakterii
Modyfikacja fenotypu bakterii poprzez wprowadzanie genów za pomocą plazmidowego DNA
Transfekcja Transfekcja Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów niewirusowych
Transdukcja Transdukcja
Wprowadzanie genów do komórek eukariotycznych za pomoca wektorów wirusowych
Klonowanie molekularne Klonowanie molekularne
Uzyskiwanie wielu identycznych kopii genów, np. przez powielanie plazmidowego DNA w bakteriach
Terapia genowa
Wzmacniająca Substytucyjna Hamująca
wzmocnienie wprowadzenie hamowanie ekspresji ekspresji genów brakującego genu genów(np. za pomocą
oligonukleotydów antysensowych)
Nowotwory Choroby układu krążenia
Nowotwory Choroby układu krążenia
Choroby dziedziczne(wrodzone błędy metaboliczne,mukowiscydoza,dystrofia mięśniowa )
Terapeutyczne kwasy nukleinowe Terapeutyczne kwasy nukleinowe
DNA RNA
Sekwencje niekodująceGeny(Wektory DNA) Geny
(wektory RNA)Sekwencje niekodujące
Oligonukleotydy Antysensowe
Pułapki oligonukleotydwe rybozymy siRNA
Rodzaje terapii genowej
- somatyczna - komórek linii płciowej
Ekspresja genów w komórkach eukariotycznych wymaga zastosowania odpowiedniego promotora w wektorze plazmidowym
1. Promotor wirusowy 2. Promotor eukariotyczny
- konstytutywne - indukowane
3. Złożone
Geny reporterowe
Gen używany do badania skuteczności transfekcji. Gen reporterowy powinien być łatwy do wykrycia i nie powinien to być gen naturalnie obecny w transfekowanych komórkach.
Geny reporterowe CAT (acetylotransferaza Chloramfenikolu)
Lucyferaza
β-galaktozydaza
Zielone białko fluorescencyjne (GFP)
Wydzielnicza fosfataza alkaliczna (SEAP)
Ludzki hormon wzrostu
β-glukuronidaza
Wykrywanie ekspresji genów Wykrywanie ekspresji genów reporterowych reporterowych
-testy autoradiograficzne - testy kolorymetryczne
- emisja fluorescencji - emisja chemilumienscencji
-Wykrywanie białka: testy ELISA
Tabela. Geny reporterowe
Gen Testy in vitro Zalety Wady Zastosowanie CAT (acetylotransferaza chloramfenikolu)
Chromatografia, Fluorescencja, immunoassay
Minimalna aktywność endogenna w komórkach ssaków
Praco- i czasochłonne Brak testów in vivo; białko ma okres półtrwania 50 godzin
Lucyferaza a) świetlika
Photinus pyralis
b) żebropława – Renilla reniformis (sea pansy)
Bioluminescencja Nieizotopowe, Wysoka czułośc, niska niepecyficzna aktywność Assay in vivo
Krótki okres półtrwania białka, Kosztowny sprzęt
β-galaktozydaza Kolorymetryczna Fluroymetryczna chemilumienscencyjna
Nieizotopowa, Liczne testy, stosowana jako kontrola do mormalizacji tranefkcji innych genów Assay in vivo
Wysoka endogenna ekresja B-galaktozydaza w wielu typach komórek
Wydzielnicza fosfataza alkalicza (SEAP)
Chemiluminescencyjna, Kolorymetryczna
Nieizotopowa , Białko wydzielnicze Bardzo czuła, możliwośc analizy wielu próbek
Brak testów in vivo
Zielone białko fluorescencyjne (GFP)
Fluorescencja Pozwala na badanie ekspresji w żywych komórkach, fluorescencja jest cechą białka – nie są potrzebne żadne dodatkowe substraty
Czułość może być zbyt mała, ale znane sa mutanty
Ludzki hormon wzrostu (HGH)
Radioimunnoassay Białko wydzielnicze, bezpośrednie wykrywanie białka, prosty test
Test radioaktywny, stosunkowo niska czułość, kosztowny
B-glukuronidaza (GUS)
Kolorymetryczna Fluorescencyjna Chemiluminescencyjna
Test in vivo Nieizotopowa, stabilne białko, bardzo wysoka czułość testu chemiluminescencyjnego
Najczulsze testy wymagają sprzętu
o
CAT katalizuje transfer grup acetylowych z acetylo koenzymu A na chloramfenikol
Enzym prokariotyczny Bialko jest bardzo stabilne (okres półtrwania 50 godzin)
Wykrywanie: Test radioaktywny Rozdział form acetylowanych od nieacetylowanych
za pomocą chromatografii cienkowarstwowej Możliwa ekstrakcja dla oceny ilościowej Dostępne także testy nieizotopowe: ELISA
Geny reporterowe - β-galaktozydaza
-hydroliza β-galaktozydów, najczęściej X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galaktozyd--może być używana (mierzona) w tym samych ekstraktach co lucyferaza i CAT
-testy kolorymetryczne: ONPG (o-nitrofenyl-B-D-galaktopiranozydfluorymetryczne: MUG – 4-methylumbelliferyl-b-D-galaktozydchemiluminescencyjne – 1,2-dioeksyetan
Możliwy test przyżyciowy – substrat di-B-D-galaktopyranozyd –rozkładany przez β-galaktozydazę, produkt wykrywany przez fluorescencję
Lucyferaza
-świetlika Photinus pyralis i żebropława Renilla reniformis-Reakcja bioluminescencyjna wymaga substratu – lucyferyny – ATP, -Jonów magnezu i tlenu. -Emisja światła – szybko wygasa -Lucyferaza ma krótki okres półtrwania – około 3 godzin -- wysoka czułośc
Lucyferaza żebropława – jako substratu używa celenterazyny
Zielone białko fluorescencyjne
-z Aequorea victoria: ekworyna emituje niebieskie światło po związaniu jonów wapnia. Światło to absorbuje białko GFP, emitując równocześnie światłozielone
Ekspresja GFP w innych organizamach powoduje zieloną fluorescencję po pobudzeniu światłem niebieskim lub UV
Transfekcja przejściowa i stabilna
Transfekcja plazmidem zawierającym gen selekcyjny, np. gen oporności na neomycynę. Po transfekcji komórki są hodowane w pożywce zawierającej neomycynę (lub jej analog, jak G418). Komórki, które nie zostały stransfekowaneplazmidem z genem NeoR, nie produkują enzymu rozkładającego G418 i giną. Przeżywają tylko komórki stabilnie stransfekowane plazmidem z genem selekcyjnym.
Selekcja komórek stabilnie transfekowanych
1. Geny opornościa) na antybiotyki aminoglikozydowe – transferaza neomycyny b) hygromycynę – fosfotransferaza hygromycyny B c) puromycynę d) zeocynę (bleomycyna).
Antybiotyki selekcyjne
Antybiotyk Gen oporności Mechanizm
działania
Stężenie
Genetycyna (G418) APH(3’) I , APH(3’)II Blokuje translację w komórkach eukariotycznych, interefrując z podjednostką rybosomu 80S
50 – 1000 µg/ml
Hygromycyna B Hph Wpływ na translokację, zaburzenia wbudowywania aminokwasów
50-1000 µg/ml
Puromycyna Pac Hamuje translację 1-10 µg/ml Zeocyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,5-1000 µg/ml Fleomycyna Sh ble Wiąże się z DNA 0,1-50 µg/ml Blasticydyna S Bcs, BCD Hamuje translację 3-50 µg/ml
Sposoby transfekcji plazmidowego DNA
„nagi DNA” (metody fizyczne) nośniki chemiczne
Biolistyczna(strzelba genowa)iniekcja elektroporacja
mikroiniekcja
makroiniekcja
mała objętość Duża objętość(metoda hydrodynamiczna)
Elektroporacja
1. Siła przyłożonego pola elektrycznego- w większości komórek ssaczych maksymalna wydajność transfekcji
jest uzyskiwana kiedy napięcie wynosi od 250V/cm do 750 V/cm Przeżywa około 20-50% komórek
2. Czas trwania impulsu elektrycznego - 20-100 msec
3. Temperatura 0OC lub pokojowa
4. Skład jonowy środowiska Wydajność jest wielokrotnie wyższa gdy komórki są zawieszane w buforowanych roztworach soli (np.. HEPES) niż w roztworach substancji
niejonowych takich jak manitol czy sacharoza
Makroiniekcja
Wstrzyknięcie nagiego DNA do mięśnia szkieletowego -ekspresja β-galaktozydazy
Transfekcja nagiego DNA
1. Rodzaje komórek
2. Maksimum ekspresji – po 14 dniach w mięśniach3. Utrzymywanie DNA we włóknach mięśniowych – większość
w postaci kolistej; ekspresja nawet do 2 lat4. Regeneracja mięśni umożliwia większą ekspresję5. Promotory – wirusowe lepsze niż tkankowo specyficzne 6. Zależność wydajności transfekcji od wielkości zwierzęcia
Nagi DNA – zastosowania
1. Terapia dystrofii mięśniowej Duchenna; myszy mdx2. Transfer genów białek wydzielniczych, np.. VEGF 3. Zwierzęce modele chorób autoimmunologicznych 4. Szczepionki genowe
VEGF - a major angiogenic growth factor
• VEGF stimulates the formation of new blood vessels, acting as amitogen for endothelial cells.
• Insuffcient vascularization leads to heart or peripheral muscleischemia and is an inherent feature of cardiovascular diseases.
•Gene therapy with VEGF has been considered as a way to stimulate angiogenesis and ameliorate the effect of ischemia
•It has been also assumed that gene delivery with relatively weakplasmid vectors will be more safe, producing small amounts of therapeutically effective VEGF, but will not exert the side effects, which may be expected with strong vectors
Uzyskanie plazmidowych wektorów ekspresyjnych z genem czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF)
1. Uzyskanie plazmidów (nie-ekspresyjnych) z cDNA izoform ludzkiego genu VEGF165 oraz VEGF121 2. Uzyskanie dużych ilości plazmidu pGEM-VEGF. Wycięcie cDNA za pomocą enzymu BamH13. Przecięcie za pomocą enzymu BamHI plazmidu pSG5 (Stratagene) (plazmid posiada gen oporności na
ampicilinę). 4. Wklonowanie sekwencji cDNA VEGF do plazmidu VEGF.5. Transformacja bakterii kompetentnych plazmidem („mieszaniną ligacyjną”) 6. Selekcja bakterii na agarze zawierającym amipicilinę 7. Namnożenie w bulionie pojedynczych klonów bakterii wyrosłych na agarze 8. Izolacja plazmidowego DNA 9. Sprawdzenie plazmidowego DNA za pomocą trawienia enzymem retsrykcyjnym BamHI10. Transfekcja uzyskanych plazmidów pSG5VEGF165 oraz pSG5VEGF121 do komórek mięśni gładkich
szczura przy pomocy liposomów.11. Zbadanie produkcji VEGF: test ELISA, barwienie immunohistochemiczne 12. Doświadczenia na zwierzętach.
VEGF VEGF genegene transfer transfer in vitro in vitro • pSG5VEGF165 plasmid (contains human VEGF165 cDNA driven by weak viral SV40 promoter)• transfection in vitro to rat VSMC results in generation of large amounts of human VEGF despite low transfection efficiency, typical for these cells; released VEGF is biologicaly
active and enhances proliferation of endothelial cells
β-gal expressionVEGF production by transfected cells
0
1
2
3
Control βgal
hum
anV
EG
F ng
/ml m
ediu
m
VEGF48 h
VEGF72 h
VEGF expression
Jozkowicz et al., Clin Chim Acta, 1999: 288:1-19Dulak et al, Vasc Med, 2000;5:33-40
Injection of naked humanInjection of naked human VEGF DNA VEGF DNA into rabbit ischemic into rabbit ischemic skeletal muscle results in expression of human transgene skeletal muscle results in expression of human transgene
andand protein protein releaserelease
Human VEGF protein in the blood of transfected rabbits
rabbit VEGF165
rabbit VEGF121
human VEGF165
pSG5VEGF165
0
2
4
6
8
10
VEG
F pg
/ml
RT-PCR - adductor muscle
β-gal pSG5VEGF165Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
NakedNaked VEGF VEGF genegene transfer transfer increases the number of microvesselsincreases the number of microvesselsin the ischemic rabbit skeletal musclesin the ischemic rabbit skeletal muscles
alkaline phosphatase-positive microvessels in muscle
transfected with control plasmid
microvessels in muscle transfected withVEGF plasmid
Ves
sels
/mm
0
100
200
2β−gal
transfected VEGF
transfected
300
p<0.01
Dulak et al, Eur Surg 2002:34:105-110
Nośniki chemiczne plazmidowego DNA
Jony Ca2+
DEAE-dekstran Związki wielkocząsteczkowe
Lipidy i lipsomy
Polipeptydy Polimery dendrymery