IntroducereIntroducere

Conceptul de bibliotecă – colecţie de clone Conceptul de bibliotecă – colecţie de clone ADNADN dintr-o celulă, ţesut sau organismdintr-o celulă, ţesut sau organism

3 categorii de biblioteci3 categorii de biblioteci1.genomice1.genomice → alcătuite din ADN-ul genomic → alcătuite din ADN-ul genomic

total al unui organismtotal al unui organism2.ADNc 2.ADNc → → colecţia de clone obţinute pe colecţia de clone obţinute pe

baza ADN complementarbaza ADN complementar 3. 3. Cromozomiale Cromozomiale → → specifice fiecărui specifice fiecărui

cromozom în partecromozom în parte

1.Biblioteci genomice1.Biblioteci genomice O bibliotecă genomică conţine toate O bibliotecă genomică conţine toate

secvenţele prezente în genomul unui secvenţele prezente în genomul unui organism.organism.

Procedura cuprinde 5 etape: Procedura cuprinde 5 etape:

→ → pregătirea ADN-uluipregătirea ADN-ului

→ → fragmentarea ADN-uluifragmentarea ADN-ului

→ → pregătirea vectoruluipregătirea vectorului

→ → ligaturarea şi introducerea în gazdăligaturarea şi introducerea în gazdă

→ → amplificareaamplificarea

bibliotecă genomică - utilă pentru a găsi o bibliotecă genomică - utilă pentru a găsi o genă de interes prin screening cu sonde genă de interes prin screening cu sonde specifice. specifice.

Bibliotecile genomice se obţin prin 2 tehnici:Bibliotecile genomice se obţin prin 2 tehnici:

1. ADN genomic este digerat complet cu o 1. ADN genomic este digerat complet cu o enzimă de restricţie, iar fragmentele enzimă de restricţie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un vector rezultate sunt clonate fie printr-un vector derivat din bacteriofagul λ, fie într-un derivat din bacteriofagul λ, fie într-un vector cosmidic. vector cosmidic.

Cosmidele - vectori hibrizi ce cCosmidele - vectori hibrizi ce coonţin ADN nţin ADN plasmidial şi situsul cos din genomul fagului λ.plasmidial şi situsul cos din genomul fagului λ.

Prezentând secvenţa din plasmidul EcoRI şi Prezentând secvenţa din plasmidul EcoRI şi gena de rezistenţăla ampicilină (Ampr), gena de rezistenţăla ampicilină (Ampr), cosmidele se pot replica şi mentine în celula cosmidele se pot replica şi mentine în celula bacteriană în forma plasmidială şi permit bacteriană în forma plasmidială şi permit selecţia transformanţilor pe mediu cu ampicilinăselecţia transformanţilor pe mediu cu ampicilină

2. O altă cale este digestia parţială cu ER, care 2. O altă cale este digestia parţială cu ER, care recunosc secvenţe de 4 pb. Prin digestie recunosc secvenţe de 4 pb. Prin digestie parţială doar o parte din SR este tăiată de ER.parţială doar o parte din SR este tăiată de ER.

2.Biblioteci de ADNc2.Biblioteci de ADNc

Colecţia de clone obţinute pe baza ADN complementar Colecţia de clone obţinute pe baza ADN complementar se numeşte bibliotecă ADNc.se numeşte bibliotecă ADNc.

Din bibliotecile de ADNc se produc copii ADN din secvenţe Din bibliotecile de ADNc se produc copii ADN din secvenţe ARN (ARNm) care apoi se cloneazăARN (ARNm) care apoi se clonează

Extrem de utile: nu reprezintă doar colectarea de Extrem de utile: nu reprezintă doar colectarea de secvenţe exprimate, ci şi pe acele secvenţe de după secvenţe exprimate, ci şi pe acele secvenţe de după orice modificare post-transcripţionalăorice modificare post-transcripţională

Secvenţierea parţială a unei colecţii mari de ADNc , Secvenţierea parţială a unei colecţii mari de ADNc , depunerea într-o bază de date - etape de caracterizare a depunerea într-o bază de date - etape de caracterizare a genomului unui organismgenomului unui organism

Fiind sintetizat pe matriţa moleculelor de ARNm, Fiind sintetizat pe matriţa moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor aflate în ADNc va corespunde numai genelor aflate în stare de activitate transcripţională, reproducând stare de activitate transcripţională, reproducând doar genele funcţionale specifice celulei doar genele funcţionale specifice celulei respective.respective.

ADNc este clonat în vectori plasmidici sau în ADNc este clonat în vectori plasmidici sau în vectori derivaţi din bacteriofagul λ.vectori derivaţi din bacteriofagul λ.

Spre deosebire de fragmentele obţinute prin Spre deosebire de fragmentele obţinute prin digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posedă digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posedă capete adezive, de aceea pentru introducerea capete adezive, de aceea pentru introducerea în vector, la moleculele de ADNc se adaugă în vector, la moleculele de ADNc se adaugă adaptori care conţin capete adezive. adaptori care conţin capete adezive.

Alegerea vectorului Alegerea vectorului λλ Niciunul din vectorii derivaţi din fagul λ nu este Niciunul din vectorii derivaţi din fagul λ nu este

adecvat pentru toate experimentele de clonare adecvat pentru toate experimentele de clonare molecularămoleculară

Este necesară alegerea vectorului cel mai Este necesară alegerea vectorului cel mai adecvat scopului urmăritadecvat scopului urmărit

Trebuie luaţi în considerare 3 factori:Trebuie luaţi în considerare 3 factori:→ → enzima (enzimele) de restricţie folositeenzima (enzimele) de restricţie folosite→→dimensiunea fragmentului de ADN ce va fi dimensiunea fragmentului de ADN ce va fi

clonatclonat→→dacă vectorul va fi folosit şi pentru exprimarea dacă vectorul va fi folosit şi pentru exprimarea

ADN în E.coliADN în E.coli

3.Biblioteci cromozomiale3.Biblioteci cromozomiale

Dimensiunea genomului uman este atât de Dimensiunea genomului uman este atât de mare, încât sunt necesare mii de clone mare, încât sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta întregul genom. pentru a reprezenta întregul genom.

→→pentru om sunt necesare 24 de biblioteci pentru om sunt necesare 24 de biblioteci diferite diferite

→→dacă o genă este localizată pe un dacă o genă este localizată pe un cromozom cunoscut cu metode genetice, cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitată la biblioteca acelui cercetarea va fi limitată la biblioteca acelui cromozom.cromozom.

→→izolarea cromozomilor este posibilă izolarea cromozomilor este posibilă datorită dimensiunii şi morfologiei diferite datorită dimensiunii şi morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separaţi cu ale cromozomilor, care pot fi separaţi cu ajutorul citometriei în flux. ajutorul citometriei în flux.

→→ în prezent în prezent sunt disponibile biblioteci sunt disponibile biblioteci preparate din toţi cromozomii umani.preparate din toţi cromozomii umani.

Sortarea cromozomilorSortarea cromozomilor→ → gena de interes poate fi cartografiată la un gena de interes poate fi cartografiată la un

cromozom particularcromozom particular

→ → separarea cromozomilor – PFGE(pulsed field separarea cromozomilor – PFGE(pulsed field gel electrophoresis), dar pentru clonare se gel electrophoresis), dar pentru clonare se utilizează aparatul cu fluorescenţautilizează aparatul cu fluorescenţa

→→cromozomii trebuie să fie în metafazacromozomii trebuie să fie în metafaza→→sunt izolaţi, apoi coloraţi cu EtBr şi conduşi sunt izolaţi, apoi coloraţi cu EtBr şi conduşi

printr-un câmp electric la un fascicul laser care printr-un câmp electric la un fascicul laser care duce apoi la fluorescenţăduce apoi la fluorescenţă

→ → cantitatea de fluorescenţă se măsoară cantitatea de fluorescenţă se măsoară cu un detector iar filtrul utilizat identifică cu un detector iar filtrul utilizat identifică cromozomii particularicromozomii particulari

→ → aplicarea unui câmp electric între plăcile aplicarea unui câmp electric între plăcile de deflecţie prin care cromozomii vor de deflecţie prin care cromozomii vor trece, permite devierea şi colectarea lortrece, permite devierea şi colectarea lor

→ → după colectarea unei cantităţi suficiente, după colectarea unei cantităţi suficiente, pot fi deproteinizaţi şi utilizaţi pentru pot fi deproteinizaţi şi utilizaţi pentru prepararea bibliotecilor cromozomialeprepararea bibliotecilor cromozomiale

Microdisecţia Microdisecţia

- dacă o genă a fost cartografiată la un dacă o genă a fost cartografiată la un cromozom particular, se utilizează cromozom particular, se utilizează microdisectia pentru a obţine materialul microdisectia pentru a obţine materialul corespunzătorcorespunzător

- cromozomii coloraţi sunt examinaţi la cromozomii coloraţi sunt examinaţi la microscop si sunt mutaţi cu ajutorul unui microscop si sunt mutaţi cu ajutorul unui micromanipulatormicromanipulator

- materialul este apoi colectat în pipete şi materialul este apoi colectat în pipete şi utlizat pentru clonări ulterioareutlizat pentru clonări ulterioare