EE - EP1856050 B1

Bifenüülühendi kristalsed vormid

LEIUTISE TAUST

TEHNIKAVALDKOND

Leiutis käsitleb bifenüülühendite uudseid kristalseid vorme ja nende solvaate, mis

on eeldatavalt kasulikud kopsuhaiguste ravis. Leiutis käsitleb kristalseid ühendeid 5

sisaldavaid või nendest valmistatud ravimvorme, protsesse ja vaheühendeid

selliste kristalsete ühendite valmistamiseks ja meetodeid selliste ühendite

kasutamiseks kopsuhaiguste ravis.

TEHNIKA TASE

Kaasesitatud USA patendipublikatsioonis nr 2005/0203133, autorid Mammen jt, 10

avalikustatakse uudsed bifenüülühendid, mis on eeldatavalt kasulikud selliste

kopsuhaiguste ravis nagu krooniline obstruktiivne kopsuhaigus (KOK) ja astma.

Eelkõige on selles taotluses täpsemalt kirjeldatud ühendit bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülester, mis on muskariiniretseptori antagonist või 15

millel on antikolinergiline aktiivsus.

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri keemilisele struktuurile vastab

valem I:

20

Valemiga I ühend on nimetatud müügiloleva tarkvara AutoNom (MDL, San

Leandro, Kalifornia) abil.

Kopsuhaiguste või hingamisteede haiguste ravis manustatakse kasulikke

terapeutilisi toimeaineid eelistatavalt hingamisteedesse inhaleerimise teel.

EE - EP1856050 B1 2

Terapeutiliste toimeainete manustamiseks inhaleerimise teel on välja töötatud

mitut tüüpi farmatseutilisi inhalaatoreid, sealhulgas kuivpulberinhalaatorid (DPI),

mõõdetud kogust väljastavad inhalaatorid (MDI) ja nebulisaatorinhalaatorid.

Sellistes seadmetes kasutatavate ravimkoostiste ja segude valmistamisel on

ülimalt soovitav omada terapeutilist toimeainet sellises kristalses vormis, mis ei ole 5

hügroskoopne ega laialivalguv ja millele oleks suhteliselt kõrge

sulamistemperatuur (tavaliselt üle 150 °C), mis võimaldab materjali

mikroniseerimist märkimisväärse lagunemiseta.

Eelnevalt ei ole teatatud valemiga I ühendi ühestki kristallivormist. Seega on

olemas vajadus valemiga I ühendi püsivate mittelaialivalguvate kristalsete vormide 10

järele, millel on vastuvõetav hügroskoopsus ja suhteliselt kõrge

sulamistemperatuur.

LEIUTISE KOKKUVÕTE

Leiutises pakutakse välja bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri 15

(valem I) kristalsed vormid. Kristalne vorm võib olla vaba alus, farmatseutiliselt

vastuvõetav sool, nagu difosfaat-, monosulfaat- või dioksalaatsool või sellise soola

farmatseutiliselt vastuvõetav solvaat.

Üllataval kombel leiti, et leiutisekohased kristalsed vormid ei valgu laiali isegi siis,

kui need alluvad õhuniiskuse toimele. Lisaks on leiutisekohased kristalsed vormid 20

vastuvõetava hügroskoopsuse ja vastuvõetavate sulamistemperatuuridega, mis on

üle 70 °C. Näiteks on difosfaatsoola sulamistemperatuur ligikaudu 150 °C.

Muude kasutusvõimaluste hulgas on valemiga I ühendi kristalsed vormid kasulikud

ravimkoostiste valmistamisel, mis on eeldatavalt kasutatavad kopsuhaiguste ravis.

Seega puudutab leiutise üks aspekt ravimkoostist, mis hõlmab farmatseutiliselt 25

vastuvõetavat kandeainet ja valemiga I ühendi kristalse vormi terapeutiliselt

toimivat kogust.

Leiutise järgmine aspekt puudutab koostiseid, mis hõlmavad valemiga I ühendi

kristalset vormi kombinatsioonis ühe või mitme muu terapeutilise toimeainega.

Seega on ühe teostuse korral leiutis suunatud koostisele, mis hõlmab (a) 30

EE - EP1856050 B1 3

farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet ja valemiga I ühendi kristalse vormi

terapeutiliselt toimivat kogust; ja (b) terapeutiliselt toimivat kogust toimeainet, mis

on valitud steroidse põletikuvastase toimeaine, nagu kortikosteroidi; β2-

adrenergilise retseptori agonisti; fosfodiesteraas-4 inhibiitori või nende

kombinatsiooni hulgast, seejuures on kristalne vorm ja toimeaine seguna või 5

eraldi. Kui toimeaine on eraldi, siis võib sinna kuuluda farmatseutiliselt vastuvõetav

kandeaine. Leiutise järgmine aspekt käsitleb ravimkoostist, mis hõlmab soola

isotoonilist vesilahust, mis sisaldab valemiga I ühendi kristalset vormi; seejuures

on lahuse pH vahemikus 4 kuni 6. Konkreetse teostuse korral on

nebuliseerimiseks kasutatav vesilahus puhverdatud tsitraapuhvriga pH 5 juures. 10

Teise konkreetse teostuse korral sisaldab nebuliseerimiseks kasutatav vesilahus

ligikaudu 0,5 mg/ml bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-

1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri vaba aluse

ekvivalenti.

Ühe teostusena pakutakse leiutises välja ravimi manustamiseks mõeldud vahend, 15

mis hõlmab kuivpulberinhalaatorit, mis sisaldab ravimkoostist farmatseutiliselt

vastuvõetavast kandeainest ja valemiga I ühendi kristalsest vormist.

Valemiga I ühend omab muskariiniretseptori suhtes antagonistlikku toimet. Seega

on valemiga I ühendi kristalsed vormid kasulikud selliste kopsuhaiguste nagu

astma ja krooniline obstruktiivne kopsuhaigus ravis. Seega puudutab leiutise teine 20

aspekt valemiga I ühendi kasutamist kopsuhaiguse ravimeetodis, mis hõlmab

patsiendile valemiga I ühendi kristalse vormi manustamist terapeutiliselt toimivas

koguses. Leiutise järgmine aspekt puudutab valemiga I ühendi kasutamist

patsiendil bronhodilatatsiooni tekitamise meetodis, mis hõlmab patsiendile

valemiga I ühendi kristalse vormi manustamist bronhodilatatsiooni tekitavas 25

koguses. Ühe teostuse korral manustatakse ühendit inhaleerimise teel. Samuti

pakutakse leiutises välja valemiga I ühend patsiendil kroonilise obstruktiivse

kopsuhaiguse või astma ravis, mis hõlmab patsiendile valemiga I ühendi kristalse

vormi manustamist terapeutiliselt toimivas koguses. Leiutise järgmine aspekt on

suunatud valemiga I ühendi kasutamisele imetajal muskariiniretseptori 30

antagoniseerimise meetodis, mis hõlmab imetajale valemiga I ühendi kristalse

vormi manustamist terapeutiliselt toimivas koguses.

EE - EP1856050 B1 4

Leiutis on samuti suunatud protsessile valemiga I ühendi kristalsete vormide

valmistamiseks. Samuti pakutakse leiutises välja protsess valemiga I ühendi

puhastamiseks, mis hõlmab bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

kristalse soola või kristalse vaba aluse saamist. Lisaks on leiutis suunatud siin 5

kirjeldatud protsessidega valmistatavatele toodetele.

Leiutis on samuti suunatud valemiga I ühendi kristalsele vormile mikroniseeritud

kujul; ja ravimkoostistele, mis hõlmavad farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet

ja valemiga I ühendi mikroniseeritud kristalset vormi.

Leiutis on samuti suunatud valemiga I ühendi kristalsele vormile, mis on mõeldud 10

kasutamiseks teraapias ravimina. Lisaks puudutab leiutis valemiga I ühendi

kristalse vormi kasutamist ravimi valmistamiseks, eelkõige kopsuhaiguste ravis

kasutatava ravimi valmistamiseks või imetajatel muskariiniretseptori

antagoniseerimiseks.

JOONISTE LOETELU 15

Leiutise erinevaid aspekte näitlikustatakse viidetega juuresolevatele joonistele.

JOONISEL FIG 1 on kujutatud bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

(valemiga I ühendi) pulber-röntgendifraktogramm (PXRD). JOONISEL FIG 2 on

kujutatud selle kristalse soola korral diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria 20

(DSC) meetodil saadud termogramm. JOONISEL FIG 3 on kujutatud selle kristalse

soola korral termogravimeetria (TGA) meetodil saadud tulemus. JOONISEL FIG 4

on kujutatud selle kristalse soola korral niiskuse dünaamilise sorptsiooni (DMS)

meetodil saadud tulemus. JOONISEL FIG 5 on kujutatud selle kristalse soola

mikrofoto. JOONISTEL FIg 6 ja FIG 7 on kujutatud vastavalt PXRD meetodil 25

saadud difraktogramm ja DSC meetodil saadud termoramm kristalse

difosfaatsoola väiksema stabiilsusega vormi korral. JOONISEL FIG 8 on kujutatud

valemiga I ühendi kristalse monosulfaatsoola korral PXRD meetodil saadud

difraktogramm. Seda kristalset soola on täiendavalt iseloomustatud JOONISEL

EE - EP1856050 B1 5

FIG 9 TGA analüüsi, JOONISEL FIG 10 DSC analüüsi, JOONISEL FIG 11 DMS

analüüsi tulemuste ja JOONISEL FIG 12 mikrofoto abil.

JOONISEL FIG 13 on kujutatud valemiga I ühendi kristalse dioksalaatsoola korral

PXRD meetodil saadud difraktogramm. Seda kristalset soola on täiendavalt

iseloomustatud JOONISEL FIG 14 TGA analüüsi, JOONISEL FIG 15 DSC 5

analüüsi, JOONISEL FIG 16 DMS analüüsi tulemuste ja JOONISEL FIG 17

mikrofoto abil.

JOONISEL FIG 18 on kujutatud valemiga I ühendi kristalse vaba aluse I vormi

korral PXRD meetodil saadud difraktogramm. Seda kristalset vaba alust on

täiendavalt iseloomustatud JOONISEL FIG 9 TGA analüüsi, JOONISEL FIG 20 10

DSC analüüsi, JOONISEL FIG 21 DMS analüüsi tulemuste ja JOONISEL FIG 22

mikrofoto abil.

JOONISEL FIG 23 on kujutatud valemiga I ühendi kristalse vaba aluse II vormi

korral PXRD meetodil saadud difraktogramm. Seda kristalset vaba alust on

täiendavalt iseloomustatud JOONISEL FIG 9 kujutatud TGA analüüsi, JOONISEL 15

FIG 25 DSC analüüsi, JOONISEL FIG kujutatud 26 DMS analüüsi tulemuste abil.

LEIUTISE ÜKSIKASJALIK KIRJELDUS

Leiutises pakutakse välja bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

kristalsed vormid. Kristalne vorm võib olla vaba alus, farmatseutiliselt vastuvõetav 20

sool, nagu difosfaat-, monosulfaat- või dioksalaatsool või sellise soola

farmatseutiliselt vastuvõetav solvaat. Konkreetse teostuse korral on kristalseks

vormiks difosfaatsool.

MÄÄRATLUSED

Leiutisekohaste ühendite, koostiste, meetodite ja protsesside kirjeldamisel on 25

järgmistel terminitel järgmised tähendused, kui ei ole öeldud teisiti.

Termin „solvaat“ tähendab kompleksi või kogumit, mis on moodustunud ühest või

mitmest lahustunud aine, see tähendab valemiga I kristalse ühendi molekulist ja

ühest või mitmest lahusti molekulist. Sellistes solvaatides on tavaliselt lahustunud

EE - EP1856050 B1 6

aine ja lahusti vahel põhimõtteliselt kindel moolsuhe. See termin hõlmab ka

klatraate, sealhulgas veega moodustunud klatraate. Lahustite esindusliku

esindajad on näiteks vesi, metanool, etanool, 2-propanool, äädikhape ja teised

nendetaolised. Kui lahustiks on vesi, siis on moodustunud solvaadiks hüdraat.

Termin „I vorm“ vastab kristalsele vabale alusele, mis on valmistatud meetodiga, 5

milles kasutatakse lahustisegus vett inertse lahjendusainena. Termin „II vorm“

vastab kristalsele vabale alusele, mis on valmistatud meetodiga, milles

kasutatakse lahustisegus orgaanilist lahustit inertse lahjendusainena, see

tähendab, et vesi puudub.

Termin “terapeutiliselt toimiv kogus“ tähendab kogust, mis on piisav ravitoime 10

saamiseks manustamise korral ravi vajavale patsiendile. Näiteks on

muskariiniretseptori antagoniseerimiseks vajalik terapeutiliselt toimiv kogus selline

kogus, mille korral saadakse soovitud antagoniseeriv toime. Analoogiliselt on

kopsuhaiguste raviks vajalik terapeutiliselt toimiv kogus selline kogus, mille korral

saadakse soovitud terapeutiline tulemus, milleks võib olla haiguse vältimine, 15

sellest paranemine, selle pärssimine või leevendamine allpool toodud kirjelduse

kohaselt.

Termin „ravimine“ või „ravi“ tähendab siin kasutatuna haiguse või meditsiinilise

seisundi (nagu KOK) ravi või ravimist patsiendil nagu imetaja (eelkõige inimene),

mis hõlmab: 20

(a) haiguse või meditsiinilise seisundi tekke vältimist, see tähendab patsiendi

profülaktilist ravi, kellel eeldatakse riski sellise haiguse või meditsiinilise

seisundi tekkeks või kellel on selleks eelsoodumus;

(b) haiguse või meditsiinilise seisundi vältimist, see tähendab sellise haiguse või 25

meditsiinilise seisundiga patsiendil haiguse või meditsiinilise seisundi

kõrvaldamist või taandumist;

EE - EP1856050 B1 7

(c) haiguse või meditsiinilise seisundi pärssimist, see tähendab sellise haiguse

või meditsiinilise seisundiga patsiendil haiguse või meditsiinilise seisundi

arengu aeglustamist või peatamist;

(d) sellise haiguse või meditsiinilise seisundiga patsiendil haiguse või

meditsiinilise seisundi sümptomite leevendamist. 5

Termin „farmatseutiliselt vastuvõetav“ vastab ainele, mis ei ole bioloogilises või

muus mõttes ebasoovitav. Näiteks termin „farmatseutiliselt vastuvõetav

kandeaine“ vastab ainele, mida või viia koostisesse ja patsiendile manustada, ilma

et seejuures ilmneks soovimatuid bioloogilisi toimeid või kahjulikke

vastastikmõjusid koostises olevate teiste koostisainetega. Sellised farmatseutiliselt 10

vastuvõetavad ained vastavad tavaliselt toksikoloogiliste ja tootmisalaste

katsetega nõutavatele standarditele ja hõlmavad selliseid aineid, mis on

identifitseeritud sobivate inaktiivsete koostisainetena USA Toidu- ja Ravimiameti

poolt.

Termin „üksikannusvorm“ vastab patsiendile annustamiseks sobivaks füüsikaliselt 15

diskreetsele ühikule, see tähendab, et iga ühik sisaldab eelnevalt kindlaksmääratud

koguse leiutisekohast ühendit soovitud terapeutilise toime saamiseks kas eraldi või

kombinatsioonis ühe või mitme täiendava ühikuga. Näiteks võivad sellisteks

üksikannusvormideks olla kapslid, tabletid, pillid ja muud nendetaolised.

SÜNTEES 20

Leiutisekohaseid kristalseid ühendeid saab sünteesida kergesti kättesaadavatest

lähteainetest allpool ja näidetes kirjeldatu kohaselt. On mõistetav, et seal, kus on

toodud protsessi tüüpilised või eelistatavad tingimused (see tähendab

reaktsioonitemperatuurid, ajad, reaktiivide moolsuhted, lahustid, rõhud jne), võib

protsessis kasutada ka teisi tingimusi, kui ei ole öeldud teisiti. Tavaliselt viiakse 25

reaktsioonid läbi sobivas inertses lahjendusaines, mille mittepiiravad näited

hõlmavad metanooli, etanooli, 2-propanooli, isobutanooli, etüülatsetaati,

atsetonitriili, diklorometaani, metüül-tert-butüüleetrit ja teisi nendetaolisi ning

nende segusid, mis sisaldab tavaliselt vett. Pärast ükskõik millise eelneva

reaktsiooni lõppemist võib kristalseid ühendeid eraldada reaktsioonisegust ükskõik 30

EE - EP1856050 B1 8

millise tavaliselt kasutatava meetodiga, nagu sadestamine, kontsentreerimine,

tsentrifuugimine ja teised nendetaolised.

Leiutises kasutatavat bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülestrit võib hõlpsasti valmistada müügilolevatest lähteainetest ja reaktiividest, 5

selleks kasutatakse näidetes kirjeldatud protseduure või protseduure, mida on

kirjeldatud USA patendipublikatsioonis nr 2005/0203133, autorid Mammen jt.

Leiutisekohastes meetodites kirjeldatud moolsuhteid saab kergesti määrata

spetsialistile mitmete teadaolevate meetoditega. Näiteks saab selliseid

moolsuhteid kergesti määrata 1H NMR meetodi abil. Alternatiivselt võib moolsuhte 10

määramiseks kasutada elementanalüüsi ja HPLC meetodeid.

Kristalne difosfaatsool

Leiutisekohane difosfaatsool sisaldab tavaliselt valemiga I ühendi ühe

molaarekvivalendi kohta ligikaudu 1,8 kuni 2,2 molaarekvivalenti fosfaati,

sealhulgas valemiga I ühendi ühe molaarekvivalendi kohta ligikaudu 1,9 kuni 2,1 15

molaarekvivalenti fosfaati.

Tavaliselt võib valemiga I ühendi või selle farmatseutiliselt vastuvõetava solvaadi

kristalset difosfaatsoola valmistada bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

segamisel fosforhappega. Näiteks võib estri segada fosforhappe lahjendatud 20

vesilahusega, et saada amorfne difosfaatsool, mis segatakse seejärel inertse

lahjendusainega.

Amorfse difosfaatsoola valmistamiseks lahustatakse ester tavaliselt fosforhappe

vesilahuses, lahjendatakse veega ja eraldatakse lüofiliseerimisega. Tavaliselt

viiakse see reaktsioon läbi temperatuuride vahemikus 0 kuni 30 °C, näiteks 25

temperatuuril 24 °C. Estri koguse milligrammides ja 1 M fosforhappe mikroliitrite

suhe on ligikaudu vahemikus ligikaudu 1 : 3 kuni 1 : 4, sealhulgas ligikaudu 1 : 3,5.

Seejärel segatakse saadud amorfne difosfaatsool inertse lahjendusainega

koguses ligikaudu 15 mg/ml kuni ligikaudu 25 mg/ml. Tavaliselt viiakse see

EE - EP1856050 B1 9

reaktsioon läbi temperatuuride vahemikus 50 kuni 70 °C, näiteks temperatuuril

60 °C.

Konkreetse teostuse korral lahustatakse 500 mg estrit 5 mL vees ja 1,5 mL 1 M

fosforhappes. pH viiakse ligikaudu väärtuseni 5,3 täiendava 1 M fosforhappe

lisamisega (kokku 2,1 molaarekvivalenti). Läbipaistev lahus filtritakse, 5

külmutatakse ja lüofiliseeritakse kuivaks, et saada amorfne difosfaatsool. Saadud

amorfne difosfaatsool lisatakse segule 2-propanool : atsetonitriil (1 : 1), seejärel

lisatakse vesi. Selle reaktsiooni korral on amorfse difosfaatsoola koguse

milligrammides ja segu 2-propanool : atsetonitriil milliliitrite suhe ligikaudu

vahemikus 2 : 0,9 kuni 2 : 2, sealhulgas ligikaudu 2 : 1. 10

Alternatiivselt võib kristalset difosfaatsoola valmistada estri segamisel ligikaudu

2,0 kuni ligikaudu 2,1 molaarekvivalendi fosforhappega. Tavaliselt viiakse

reaktsioon läbi inertses lahjendusaines temperatuuride vahemikus 40 kuni 60 °C,

näiteks temperatuuril 50 °C. Konkreetse teostuse korral lisatakse ester segule 2-

propanool : atsetonitriil (1 : 1), seejärel lisatakse vesi. Pärast kuumutamist 15

lisatakse fosforhape. Selle reaktsiooni korral on estri koguse grammides ja

fosforhappe milliliitrite suhe ligikaudu vahemikus 5 : 14 kuni 5 : 18, sealhulgas

ligikaudu 5 : 16. Kristalse difosfaatsoola valmistamise mõlema eelmainitud

protsessi korral võib tekkida iseseisev väiksema stabiilsusega difosfaadi kristalne

vorm. JOONISTEL FIG 6 ja FIG 7 on kujutatud selle väiksema stabiilsusega vormi 20

korral vastavalt PXRD meetodil saadud difraktogrammid ja DSC meetodil saadud

termogrammid. Valdav on difosfaadi suurema stabiilsusega kristalne vorm; kuid

kui esineb ka difosfaadi väiksema stabiilsusega vorm, siis saab seda kergesti üle

viia stabiilsemateks kristallideks lahustite segu vee koguse suurendamisega ning

suspensiooni kuumutamisel uuesti 2 kuni 6 tunni jooksul, tavaliselt 2 tunni jooksul 25

temperatuurideni vahemikus ligikaudu 50 °C kuni 70 °C, tavaliselt temperatuurini

60 °C, seejärel segu öö läbi kestva jahutamisega toatemperatuurini koos aeglase

segamisega.

Kristalne monosulfaatsool

Leiutisekohane monosulfaatsool sisaldab tavaliselt valemiga I ühendi ühe 30

molaarekvivalendi kohta ligikaudu 0,8 kuni 1,2 molaarekvivalenti sulfaati,

EE - EP1856050 B1 10

sealhulgas valemiga I ühendi ühe molaarekvivalendi kohta ligikaudu 0,9 kuni 1,1

molaarekvivalenti sulfaati.

Tavaliselt võib valemiga I ühendi või selle farmatseutiliselt vastuvõetava solvaadi

kristalset monosulfaatsoola valmistada bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri 5

segamisel väävelhappega. Näiteks võib estri segada väävelhappe 1 N

vesilahusega, et saada monosulfaatsool, mis segatakse seejärel inertse

lahjendusainega.

Tavaliselt lahustatakse monosulfaatsoola valmistamiseks ester 1: 1 segus

atsetonitriil : vesi, lahjendatakse väävelhappe vesilahusega, lahjendatakse veega 10

ja eraldatakse lüofiliseerimisega. Tavaliselt viiakse see reaktsioon läbi

temperatuuride vahemikus 0 kuni 30 °C, näiteks temperatuuril 24 °C. Estri koguse

milligrammides ja 1 N fosforhappe milliliitrite suhe on ligikaudu vahemikus

325 mg/ml kuni 285 mg/ml , sealhulgas ligikaudu 305 mg/ml. Ühe konkreetse

teostuse korral lahustatakse 442 mg estrit 5 mL segus 1 : 1 atsetonitriil : vesi ja 15

lisatakse aeglaselt 1,45 mL 1 N väävelhapet, kontrollides seejuures pH väärtust.

Seejärel viiakse pH väärtuseni ligikaudu 3,3. Läbipaistev lahus filtritakse,

külmutatakse ja lüofiliseeritakse kuivaks, et saada monosulfaatsool. Seejärel

segatakse saadud monosulfaatsool inertse lahjendusainega koguses ligikaudu

10 mg/ml kuni ligikaudu 20 mg/ml. Ühe teostuse korral viiakse reaktsioon läbi 20

esimesel temperatuuril ja seejärel teisel madalamal temperatuuril, mõlemad

temperatuurid on vahemikus ligikaudu 50 kuni 80 °C, näiteks 60 °C kuni 70 °C.

Konkreetse teostuse korral lisatakse monosulfaatsool segule 2-

propanool : atsetonitriil (10 : 1). Selle reaktsiooni korral on monosulfaatsoola

koguse milligrammides ja segu 2-propanool : atsetonitriil milliliitrite suhe ligikaudu 25

vahemikus 15 : 3 kuni 15 : 0,8, sealhulgas ligikaudu 15 : 1.

Teise teostuse korral viiakse see reaktsioon läbi esimesel temperatuuril ja seejärel

kahe madalamal temperatuuril oleva tsüklina. Esimene temperatuur on vahemikus

ligikaudu 50 kuni 80 °C, näiteks ligikaudu 70 °C. Esimese madalama

temperatuuritsükli korral on vahemik ligikaudu 60 °C kuni 30 °C. Teise madalama 30

temperatuuritsükli korral on vahemik ligikaudu 40 °C kuni 30 °C. Konkreetse

teostuse korral lisatakse monosulfaatsool segule 2-propanool : atsetonitriil (10 : 1).

EE - EP1856050 B1 11

Selle reaktsiooni korral on monosulfaatsoola koguse milligrammides ja segu 2-

propanool : atsetonitriil milliliitrite suhe ligikaudu vahemikus 161 : 7 kuni 161 : 11,

sealhulgas ligikaudu 161 : 9.

Kristalne dioksalaatsool

Leiutisekohane dioksalaatsool sisaldab tavaliselt valemiga I ühendi ühe 5

molaarekvivalendi kohta ligikaudu 1,8 kuni 2,2 molaarekvivalenti oksalaati,

sealhulgas valemiga I ühendi ühe molaarekvivalendi kohta ligikaudu 1,9 kuni 2,1

molaarekvivalenti oksalaati.

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalset dioksalaatsoola või 10

selle farmatseutiliselt vastuvõetavat solvaati võib valmistada bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri segamisel oksaalhappega. Näiteks võib

estri segada oksaalhappe 1 M vesilahusega, et saada dioksalaatsool, mis

segatakse seejärel inertse lahjendusainega. 15

Tavaliselt lahustatakse dioksalaatsoola valmistamiseks ester 1: 1 segus

atsetonitriil : vesi, lahjendatakse oksaalhappe vesilahusega, lahjendatakse veega

ja eraldatakse lüofiliseerimisega. Tavaliselt viiakse see reaktsioon läbi

temperatuuride vahemikus 0 kuni 30 °C, näiteks temperatuuril 24 °C. Estri koguse

milligrammides ja oksaalhappe 1 M vesilahuse milliliitrite suhe on ligikaudu 20

vahemikus 320 mg/ml kuni 280 mg/ml , sealhulgas ligikaudu 300 mg/ml. Ühe

konkreetse teostuse korral lahustatakse 510 mg estrit 5 mL segus 1 : 1

atsetonitriil : vesi ja lisatakse aeglaselt 1,7 ml oksaalhappe 1 M vesilahust,

kontrollides seejuures pH väärtust. pH viiakse väärtuseni ligikaudu 3,0.

Läbipaistev lahus filtritakse, külmutatakse ja lüofiliseeritakse kuivaks, et saada 25

dioksalaatsool.

Ühe teostuse korral segatakse saadud dioksalaatsool tavaliselt inertse

lahjendusainega koguses ligikaudu 5 mg/ml kuni ligikaudu 15 mg/ml. Tavaliselt

viiakse see reaktsioon läbi temperatuuride vahemikus ligikaudu 50 kuni 70 °C,

näiteks temperatuuril 60 °C. Konkreetse teostuse korral lisatakse dioksalaatsool 30

EE - EP1856050 B1 12

segule 2-propanool : vesi (94 : 6). Selle reaktsiooni korral on dioksalaatsoola

koguse milligrammides ja segu 2-propanool : vesi milliliitrite suhe ligikaudu

vahemikus 10 : 0,8 kuni ligikaudu 10 : 3. Kristalset dioksalaatsoola võib valmistada

estri kristalse dioksalaatsoola (sünteesitud eespool toodud kirjelduse kohaselt)

saamise, estri dioksalaatsoola saamise estri ja oksaalhappe segamisel ning soola 5

lahustamisega inertses lahjendusaines lahuse saamise ja lahusele idukristalli

lisamisega.

Ühe teostuse korral segatakse dioksalaatsool tavaliselt inertse lahjendusainega

koguses ligikaudu 5 mg/ml kuni ligikaudu 15 mg/ml. Tavaliselt viiakse see

reaktsioon läbi esimesel temperatuuril vahemikus ligikaudu 50 kuni 70 °C, näiteks 10

60 °C. Seejärel jahutatakse segu teise temperatuurini vahemikus ligikaudu 3 kuni

10 °C, näiteks 4 °C. Seejärel lisatakse estri kristalse dioksalaatsoola idukristall.

Konkreetse teostuse korral lisatakse dioksalaatsool segule 2-propanool : vesi

(94 : 6). Selle reaktsiooni korral on dioksalaatsoola koguse milligrammides ja segu

2-propanool : vesi milliliitrite suhe ligikaudu vahemikus 150 : 10 kuni 150 : 16, 15

sealhulgas ligikaudu 150 : 13.

Kristalne vaba alus.

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalset vaba alust või selle

farmatseutiliselt vastuvõetavat solvaati võib valmistada bifenüül-2-20

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri segamisel inertse lahjendusainega.

Kristalse vaba aluse ühe vormi (vormi I) valmistamiseks segatakse ester tavaliselt

koguses ligikaudu 5 mg/ml kuni ligikaudu 15 mg/ml inertse lahjendusainega.

Tavaliselt viiakse see reaktsioon läbi temperatuuride vahemikus ligikaudu 20 kuni 25

30 °C, näiteks temperatuuril 25 °C. Konkreetse teostuse korral lisatakse ester

segule vesi : atsetonitriil (1 : 1). Selle reaktsiooni korral on estri koguse

milligrammides ja segu vesi : atsetonitriil milliliitrite suhe ligikaudu vahemikus

100 : 0,3 kuni 100 : 1, sealhulgas ligikaudu 100 : 0,5. Alternatiivselt võib

reaktsiooni läbi viia esimesel temperatuuril vahemikus ligikaudu 20 kuni 30 °C, 30

EE - EP1856050 B1 13

näiteks temperatuuril ligikaudu 25 °C, ja seejärel jahutada teise temperatuurini

vahemikus ligikaudu 3 kuni 10 °C, näiteks temperatuurini 4 °C.

Samuti võib kristalset vaba alust valmistada kristalse vaba aluse (sünteesitud

eespool toodud kirjelduse kohaselt) saamise, kristalse vaba aluse saamise estri ja

inertse lahjendusaine segamisel ja saadud kristalse estri lahustamisega lahuse 5

saamise ja lahusele idukristalli lisamisega. Ühe teostuse korral segatakse ester

tavaliselt inertse lahjendusainega koguses ligikaudu 5 mg/mL kuni ligikaudu

15 mg/mL.

Tavaliselt viiakse see reaktsioon läbi esimesel temperatuuril vahemikus ligikaudu

50 kuni 70 °C, näiteks 60 °C. Seejärel jahutatakse segu teise temperatuurini 10

vahemikus ligikaudu 3 kuni 10 °C, näiteks 4 °C. Seejärel lisatakse estri kristalse

vaba aluse idukristall, millele järgneb mitu kuumutus-jahutustsüklit. Esimene

kuumutustsükkel toimub näiteks temperatuurivahemikus ligikaudu 30 kuni 40 °C ja

seejärel kuni ligikaudu 50 °C, millele järgneb jahutamine toatemperatuurini. Teine,

kolmas ja neljas kuumutustsükkel hõlmavad proovi kuumutamist temperatuurini 15

vahemikus ligikaudu 50 kuni 70 °C, näiteks ligikaudu 60 °C, millele järgneb

jahutamine toatemperatuurini. Konkreetse teostuse korral lisatakse ester segule

vesi : atsetonitriil (1 : 1), millele järgneb vee ja täiendava atsetonitriili lisamine.

Selle reaktsiooni korral on estri koguse milligrammides ning atsetonitriili ja vee

milliliitrite suhe ligikaudu vahemikus 230 : 0,1 kuni ligikaudu 230 : 0,5, sealhulgas 20

ligikaudu 230 : 0,2.

Kristalse vaba aluse teise vormi (vormi II) valmistamiseks segatakse ester

tavaliselt koguses ligikaudu 200 mg/mL kuni ligikaudu 100 mg/mL inertse

lahjendusainega. Tavaliselt viiakse see reaktsioon läbi temperatuuride vahemikus

ligikaudu 20 kuni 30 °C, näiteks ligikaudu 25 °C. Eelkõige sobiv inertne 25

lahjendusaine on atsetonitriili ja metüül-tert-butüüleetri kombinatsioon. Konkreetse

teostuse korral lisatakse bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülester atsetonitriilile, sellele järgneb metüül-tert-butüüleetri ja täiendava

atsetonitriili lisamine. Selle reaktsiooni korral on estri koguse milligrammides ning 30

segu atsetonitriil : metüül-tert-butüüleetri (lahus 1 : 2) milliliitrite suhe ligikaudu

vahemikus 200 mg/mL kuni ligikaudu 100 mg/mL, sealhulgas ligikaudu 70 : 0,45.

EE - EP1856050 B1 14

KRISTALSED OMADUSED

Muude eeliste hulgas leiti, et valemiga I ühendi saamine kristalsel kujul on kasulik

valemiga I ühendi puhastamisel. Näiteks: kristalse difosfaatsoola puhtus on üle

96%, tavaliselt üle 98%.

Nagu pulber-röntgendifraktomeetria (PXRD) korral on hästi teada, olenevad 5

pulber-röntgendifraktogrammidel piikide suhtelised kõrgused reast teguritest, mis

on seotud proovi valmistamise ja seadme geomeetrilistest parameetritest, samal

ajal on piikide asukohad suhteliselt tundetud eksperimendi üksikasjade suhtes.

Seega iseloomustatakse ühe teostuse korral leiutisekohaseid kristalseid ühendeid

pulber-röntgendifraktogrammide kaudu teatavate piikide asukohtade abil. 10

Ühe teostuse korral iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset difosfaatsoola

PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus esineb kaks või enam

difraktsioonipiiki 2Θ väärtustel, mis on valitud 6,4 ±0,2, 7,6 ±0,2, 8,6 ±0,2,

13,7 ±0,2, 15,0 ±0,2, 19,4 ±0,2, 21,6 ±0,2, 22,1 ±0,2, 22,9 ±0,2, ja 23,7 ±0,2

hulgast. Ühe konkreetse teostuse korral iseloomustatakse seda kristalset vormi 15

PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus difraktsioonipiigid on 2Θ

väärtustel 15,0 ±0,2, 19,4 ±0,2, 21,6 ±0,2 ja 23,7 ±0.2. Teise teostuse korral

iseloomustatakse kristalset difosfaatsoola PXRD meetodil saadud

röntgenogrammide abil, kus piikide asendid vastavad põhimõtteliselt JOONISEL

FIG 1 kujutatule. Pange tähele erinevusi PXRD meetodil saadud röntgenogrammi 20

JOONISEL FIG 1 ja JOONISEL FIG 6 kujutatud väiksema stabiilsusega

difosfaatsoola korral PXRD meetodil saadud röntgenogrammi vahel.

Ühe teostuse korral iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset

monosulfaatsoola PXRD meetodil saadud röntgenogrammi abil, kus esineb kaks

või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtustel, mis on valitud 7,7 ±0,2, 8,4 ±0,2, 25

8,8 ±0,2, 12,6 ±0,2, 13,7 ±0,2, 14,1 ±0,2, 15,3 ±0,2, 16,0 ±0,2, 19,7 ±0,2,

20,6 ±0,2, 23,0 ±0,2 ja 24,4 ±0,2 hulgast. Ühe konkreetse teostuse korral

iseloomustatakse seda kristalset vormi PXRD meetodil saadud röntgenogrammide

abil, kus difraktsioonipiigid on 2Θ väärtustel 12,6 ±0.2, 19,7 ±0.2, 23,0 ±0.2, ja

24,4 ±0,2. Järgmise teostuse korral iseloomustatakse kristalset monosulfaatsoola 30

EE - EP1856050 B1 15

PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus piikide asukohad vastavad

põhimõtteliselt JOONISEL FIG 8 kujutatud piikidele.

Ühe teostuse korral iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset dioksalaatsoola

PXRD meetodil saadud röntgenogrammi abil, kus esineb kaks või enam

difraktsioonipiiki 2Θ väärtustel, mis on valitud 7,7 ±0,2, 8,7 ±0,2, 13,5 ±0,2, 5

14,0 ±0,2, 14,8 ±0,2, 15,4 ±0,2, 15,8 ±0,2, 19,4 ±0,2, 22,9 ±0,2, 23,3 ±0,2 ja

24,6 ±0,2 hulgast. Ühe konkreetse teostuse korral iseloomustatakse seda

kristalset vormi PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, millel on

difraktsioonipiigid 2Θ väärtustel 8,7 ±0.2, 14,0 ±0.2, 19,4 ±0.2, ja 22,9 ±0,2.

Järgmise teostuse korral iseloomustatakse kristalset dioksalaatsoola PXRD 10

meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus piikide asukohad vastavad

põhimõtteliselt JOONISEL FIG 13 kujutatud piikidele.

Ühe teostuse korral iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset vaba alust

(vorm I) PXRD meetodil saadud röntgenogrammi abil, kus esineb kaks või enam

difraktsioonipiiki 2Θ väärtustel, mis on valitud 4,7 ±0,2, 9,6 ±0,2, 12,7 ±0,2, 15

13,7 ±0,2, 16,7 ±0,2, 17,4 ±0,2, 18,5 ±0,2, 19,4 ±0,2, 20,8 ±0,2, 21,4 ±0,2,

24,2 ±0,2 ja 25,6 ±0,2 hulgast. Ühe konkreetse teostuse korral iseloomustatakse

seda kristalset vormi PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, millel on

difraktsioonipiigid 2Θ väärtustel 4,7 ±0.2, 18,5 ±0.2, 20,8 ±0.2, ja 25,6 ±0,2.

Järgmise teostuse korral iseloomustatakse kristalset vaba alust (vorm I) PXRD 20

meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus piikide asukohad vastavad

põhimõtteliselt JOONISEL FIG 18 kujutatud piikidele.

Ühe teostuse korral iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset vaba alust

(vorm II) PXRD meetodil saadud röntgenogrammi abil, kus esineb kaks või enam

difraktsioonipiiki 2Θ väärtustel, mis on valitud 4,6 ±0,2, 9,3 ±0,2, 12,9 ±0,2, 25

13,6 ±0,2, 14,0 ±0,2, 14,6 ±0,2, 16,5 ±0,2, 18,6 ±0,2, 19,1 ±0,2, 20,9 ±0,2,

22,1 ±0,2, 22,7 ±0,2 ja 25,6 ±0,2 hulgast. Ühe konkreetse teostuse korral

iseloomustatakse seda kristalset vormi PXRD meetodil saadud röntgenogrammide

abil, millel on difraktsioonipiigid 2Θ väärtustel 4,6 ±0.2, 18,6 ±0.2, 22,1 ±0.2, ja

22,7 ±0,2. Järgmise teostuse korral iseloomustatakse kristalset vaba alust (vorm 30

II) PXRD meetodil saadud röntgenogrammide abil, kus piikide asukohad vastavad

põhimõtteliselt JOONISEL FIG 23 kujutatud piikidele.

EE - EP1856050 B1 16

Veel ühe järgmise teostuse korral iseloomustatakse valemiga I kristalseid

ühendeid diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria (DSC) meetodil saadud

termogrammide abil. Seega iseloomustavad valemiga I ühendi kristalset

difosfaatsoola JOONISEL FIG 2 kujutatud DSC meetodil saadud termogrammid,

kus ilmneb endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril 154,5 °C. Pange 5

tähele erinevusi JOONISEL FIG 2 kujutatud DSC meetodil saadud

termogrammide ja väiksema stabiilsusega difosfaatsoola korral JOONISEL FIG 7

kujutatud DSC meetodil saadud termogrammide vahel. Stabiilse difosfaatsoola

korral DSC meetodil saadud termogrammidel (JOONIS FIG 2) on näha tüüpiline

madalatemperatuuriline üleminek, millele järgneb suhteliselt terav piik 10

temperatuuril 154,5 °C. Teiselt poolt, ebastabiilse kristalse difosfaatsoola korral

DSC meetodil saadud termogrammidel (JOONIS FIG 7) on näha selge kühm enne

palju väiksemat sulamisele vastavat üleminekupiirkonda temperatuuril 150,3 °C.

Analoogiliselt iseloomustatakse valemiga I ühendi kristalset monosulfaatsoola

JOONISEL FIG 10 kujutatud DSC meetodil saadud termogrammide abil, kus 15

ilmneb endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril 76,5 °C; kristalset

dioksalaatsoola iseloomustatakse JOONISEL FIG 15 kujutatud DSC meetodil

saadud termogrammide abil, kus ilmneb endotermilise soojusvoo maksimum

temperatuuril 73,7 °C; kristalset vaba alust (vorm I) iseloomustatakse JOONISEL

FIG 19 kujutatud DSC meetodil saadud termogrammide abil, kus ilmneb 20

endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril 102,7 °C ja kristalset vaba alust

(vorm II) iseloomustatakse JOONISEL FIG 24 kujutatud DSC meetodil saadud

termogrammide abil, kus ilmneb endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril

98,6 °C, mis on kujutatud .

On näidatud, et leiutisekohastel kristalsetel ühenditel on olemas pöörduv 25

sorptsiooni-/desorptsiooniprofiil ja neil on vastuvõetava mõõduka tasemega

hügroskoopsus. valemiga I ühendi kristalse difosfaatsoola korral ilmneb hoidmisel

90% suhtelise niiskuse käes massi juurdekasv alla 2%; kristalse monosulfaatsoola

korral ilmneb hoidmisel 90% suhtelise niiskuse käes massi juurdekasv alla 4%;

kristalse dioksalaatsoola korral ilmneb hoidmisel 90% suhtelise niiskuse käes 30

massi juurdekasv alla 3%; kristalse vaba aluse (vorm I) korral ilmneb hoidmisel

90% suhtelise niiskuse käes massi juurdekasv alla 6%; ja kristalse vaba aluse

EE - EP1856050 B1 17

(vorm II) korral ilmneb hoidmisel 90% suhtelise niiskuse käes massi juurdekasv

alla 4%.

Lisaks leiti, et leiutisekohased kristalsed ühendid on stabiilsed kõrgemate

temperatuuride ja suurema niiskusesisalduse tingimustes. Näiteks pärast

kuuajalist hoidmist temperatuuril 40 °C ja 75% suhtelise niiskuse tingimustes ei 5

tuvastatud kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) meetodil tehtud analüüsil

leiutisekohaste kristalsete ühendite mingit keemilist lagunemist (see tähendab,

lagunemine oli alla 0,5%).

Neid leiutisekohaste kristalsete ühendite omadusi näitlikustatakse täiendavalt

alltoodud näidetes. 10

RAVIMKOOSTISED JA VALMISTISED

Valemiga I kristalset ühendit manustatakse patsiendile tavaliselt ravimkoostise või

valmistise kujul. Selliseid ravimkoostiseid või patsiendile manustada ükskõik

millise vastuvõetava manustamistee kaudu, mittepiiravateks näideteks on

inhaleerimine, suukaudne, ninakaudne, toopiline (sealhulgas transdermaalne) ja 15

parenteraalne manustamisviis. Siiski on spetsialistile mõistetav, et kui

leiutisekohane kristalne sool on viidud valmistise koostisesse, siis ei pruugi see

enam olla kristalsel kujul, see tähendab, et sool võib olla lahustatud sobivas

kandeaines.

Seega on leiutise üks teostus suunatud ravimkoostisele, mis hõlmab 20

farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet või abiainet ja kristalset bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat

solvaati. Ravimkoostis võib soovi korral sisaldada muid terapeutilisi toimeaineid

ja/või valmistamiseks vajalikke aineid. 25

Leiutisekohased ravimkoostised sisaldavad toimeainena tavaliselt terapeutiliselt

toimivas koguses kristalset bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülestrit või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat solvaati. Tavaliselt sisaldab selline

ravimkoostis toimeainet vahemikus 0,01 kuni 95 massiprotsenti, sealhulgas 30

EE - EP1856050 B1 18

vahemikus 0,01 kuni 30 massiprotsenti, näiteks vahemikus 0,01 kuni 10

massiprotsenti.

Leiutisekohastes ravimkoostistes võib kasutada ükskõik millist tavaliselt

kasutatavat kandeainet või abiainet. Konkreetse kandeaine või abiaine või

kandeainete või abiainete kombinatsiooni valik oleneb manustamisviisist, mida 5

kasutatakse konkreetse patsiendi või meditsiinilise seisundi või haiguse raviks.

Selles suhtes kuulub sobiva ravimkoostise valmistamine konkreetse

manustamisviisi jaoks kindlasti farmaatsiaspetsialisti teadmiste hulka. Lisaks on

selliste koostiste koostisained kaubanduslikult saadaval näiteks ettevõttest Sigma,

P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178. Täiendava näitlikustamise huvides on 10

valmististe saamise tavalisi meetodeid kirjeldatud raamatutes Remington: The

Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Lippincott Williams & White,

Baltimore, Maryland (2000); ja H. C. Ansel jt, Pharmaceutical Dosage Forms and

Drug Delivery Systems, 7th Edition, Lippincott Williams & White, Baltimore,

Maryland (1999). 15

Farmatseutiliselt vastuvõetavateks kandeaineteks sobivate ainete esinduslikud

mittepiiravad näited on järgmised: sahhariidid nagu laktoos, glükoos ja sahharoos;

tärklised nagu maisitärklis ja kartulitärklis; tselluloos ja selle derivaadid, nagu

naatriumkarboksümetüültselluloos, etüültselluloos ja tselluloosatsetaat; pulbriline

tragakant; linnased; želatiin; talk; abiained, nagu kookosvõi ja suposiitides 20

kasutatavad vahad; õlid, nagu maapähkliõli, puuvillaseemneõli, värvisaflooriõli,

seesamiõli, oliiviõli, maisiõli ja sojaõli; glükoolid, nagu propüleenglükool; polüoolid,

nagu glütserool, sorbitool, mannitool ja polüetüleenglükool; estrid, nagu

etüüloleaat ja etüüllauraat; agar, puhverdavad ained, nagu magneesiumhüdroksiid

ja alumiiniumhüdroksiid; alghape; pürogeenivaba vesi; isotooniline soolalahus; 25

Ringeri lahus; etüülalkohol; fosfaatpuhvri lahused; kokkusurutud propellentgaasid,

nagu fluoroklorosüsinikud ja fluorosüsivesinikud ning muud ravimkoostistes

mittetoksilised kasutatavad kokkusobivad ained.

Leiutisekohaseid ravimkoostiseid valmistatakse tavaliselt leiutisekohase ühendi

hoolikal ja homogeensel segamisel farmatseutiliselt vastuvõetava kandeaine ning 30

ühe või mitme valikulise abiainega. Seejärel võib vajaduse või soovi korral saadud

homogeensel segamisel saadud segust valmistada tablette, pille või panna see

EE - EP1856050 B1 19

mahutitesse, padrunitesse, dosaatoritesse ja muudesse sellesarnastesse tavaliste

protseduuride ja seadmete abil.

Ühe teostuse korral on leiutisekohased ravimkoostised sobivad manustamiseks

inhaleerimise teel. Inhaleerimiseks sobivad ravimkoostised on tavaliselt aerosooli

või pulbri kujul. Selliseid koostiseid manustatakse tavaliselt hästi tuntud 5

manustamisvahendite, nagu nebulisaatorinhalaatori, mõõdetud annust väljastava

inhalaatori (MDI), kuivpulberinhalaatori (DPI) või analoogilise manustamisvahendi

abil.

Leiutise spetsiifilise teostuse korral manustatakse toimeainet sisaldav ravimkoostis

inhaleerimisel nebulisaatorinhalaatori abil. Sellised nebulisaatorid tekitavad 10

tavaliselt suure kiirusega liikuva õhujoa, mis pihustab toimeainet sisaldava

ravimkoostise uduks, mis kandub patsiendi hingamisteedesse. Seega on

toimeaine nebulisaatorinhalaatoris kasutamise korral tavaliselt lahustatud sobivas

kandeaines, et saada lahus. Sobivad nebulisaatorid on kaubanduslikult saadaval

näiteks ettevõttest PARI GmbH (Starnberg, Saksamaa). Ülejäänud nebulisaatorid 15

hõlmavad seadet Respimat (Boehringer Ingelheim) ja neid, mida on kirjeldatud

näiteks USA patendis nr 6 123 068, Lloyd jt ja patendidokumendis WO 97/12687

(Eicher jt), milles avalikustatu on siia lisatud täies mahus viidetena.

Nebulisaatorinhalaatoris kasutamiseks mõeldud esinduslik ravimkoostis hõlmab

vesilahust, mis sisaldab valemiga I kristalset ühendit või selle farmatseutiliselt 20

vastuvõetavat soola koguses vahemikus 0,05 µg/ml kuni 10 µg/ml. Ühe teostuse

korral on vesipõhine valmistis isotooniline. Ühe teostuse korral on vesipõhise

valmistise pH vahemikus 4 kuni 6. Konkreetse teostuse korral on vesipõhine

valmistis puhverdatud tsitraatpuhvriga pH väärtuse 5 juures. Järgmise konkreetse

teostuse korral sisaldab vesipõhine valmistis bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-25

(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülestrit koguses vahemikus 0,1 mg/ml kuni 1,0 mg/ml vaba aluse ekvivalendina.

Leiutise järgmise spetsiifilise teostuse korral manustatakse toimeainet sisaldav

ravimkoostis inhaleerimisel DPI abil. Sellised DPI-d manustavad toimeainet vabalt

voolava pulbrina, mis dispergeeritakse patsiendi sissehingatavasse õhuvoolu. 30

Vabalt voolava pulbri saamiseks segatakse toimeaine tavaliselt sobiva abiaine,

EE - EP1856050 B1 20

nagu laktoosi või tärklisega. Mikroniseerimine on tavaline meetod kristallide

suuruse vähendamiseks mõõtmeteni, mis sobivad kopsudesse viimiseks.

Tavaliselt toimeaine mikroniseeritakse ja segatakse sobiva kandeainega, et saada

sissehingamiseks sobiva suurusega mikroniseeritud osakeste suspensioon,

seejuures tähendab „mikroniseeritud osakesed“ või „mikroniseeritud vorm“ seda, 5

et vähemalt 90% osakeste läbimõõt on alla 10 µm. Samuti võib kasutada muid

meetodeid osakeste suuruse vähendamiseks, nagu peenjahvatamine,

peenestamine, purustamine, jahvatamine, sõelumine, tritureerimine, pulbristamine

ja nii edasi, mida tehakse seni, kuni saadakse soovitud suurusega osakesed.

DPI-s kasutamiseks mõeldud esinduslik ravimkoostis hõlmab kuiva laktoosi, mille 10

osakeste suurus on vahemikus 1 µm kuni 100 µm ja valemiga I kristalse ühendi

või selle farmatseutiliselt vastuvõetava solvaadi mikroniseeritud osakesi. Sellist

kuiva pulbri kujul olevat valmistist võib saada näiteks laktoosile toimeaine

lisamisega ja seejärel komponentide kuivalt segamisel. Alternatiivselt võib soovi

korral toimeainet kasutada ilma abiaineta. Seejärel viiakse ravimkoostis tavaliselt 15

kuiva pulbri dosaatorisse või inhalaatori padrunisse või kapslitesse, et seda

kasutada kuiva pulbri manustamisvahendis.

DPI tüüpi manustamisvahendite näited hõlmavad seadet Diskhaler

GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC; vaadake näiteks USA patenti nr

5 035 237, autorid Newell jt); Diskus (GlaxoSmithKline; vaadake näiteks USA 20

patenti nr 6 378 519, autorid Davies jt); Turbuhaler (AstraZeneca, Wilmington, DE;

vaadake näiteks USA patenti nr 4 524 769, autor Wetterlin); Rotahaler

(GlaxoSmithKline; vaadake näiteks USA patenti nr 4 353 365 autorid Hallworth jt)

ja Handihaler (Boehringer Ingelheim). Sobivate DPI tüüpi seadmete järgmisi näited

on kirjeldatud USA patentides nr 5 415 162, autorid Casper jt, 5 239 993, autor 25

Evans ja 5 715 810, autorid Armstrong jt ja nendes toodud viidetes. Ülalmainitud

patentides avalikustatu on siia lisatud täies mahus viidetena.

Leiutise veel ühe spetsiifilise teostuse korral manustatakse toimeainet sisaldav

ravimkoostis inhaleerimisel MDI abil, mis väljastab tavaliselt mõõdetud koguse

toimeainet või selle farmatseutiliselt vastuvõetavat soola või solvaati või 30

stereoisomeeri kokkusurutud propellentgaasi abil. Seega hõlmab MDI abil

manustatav ravimkoostis tavaliselt toimeaine lahust või suspensiooni veeldatud

EE - EP1856050 B1 21

propellendis. Kasutada võib ükskõik millist veeldatud propellenti, sealhulgas

fluoroklorosüsinikke, nagu CCl3F, ja fluorosüsivesinikke (HFA-d), nagu 1,1,12-

tetrafluoroetaan (HFA 134a) ja 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoro-n-propaan (HFA 227).

Tingituna murest selle üle, et fluoroklorosüsinikud mõjutavad osoonikihti, on

tavaliselt eelistatavad HFA-sid sisaldava valmistised. HFA-valmististe täiendavad 5

valikulised komponendid hõlmavad kaaslahusteid, nagu etanool või pentaan, ja

pindaktiivseid aineid, nagu sorbitaantrioleaat, olehape, letsitiin ja glütserool.

Vaadake näiteks USA patenti nr 5 225 183, autorid Purewal jt, patendidokumente

EP 0717987 A2 (Minnesota Mining and Manufacturing Company) ja WO 92/22286

(Minnesota Mining and Manufacturing Company), milles avalikustatu on siia 10

lisatud täies mahus viidetena.

Mõõdetud kogust väljastavas inhalaatoris kasutamiseks mõeldud esinduslik

ravimkoostis hõlmab 0,01 kuni 5 massiprotsenti valemiga I kristalset ühendit või

selle farmatseutiliselt vastuvõetavat solvaati; 0 kuni 20 massiprotsenti etanooli ja 0

kuni 5 massiprotsenti pindaktiivset ainet; ülejäänud osa on HFA propellent. 15

Sellised koostised valmistatakse tavaliselt külmutatud või surve all oleva

fluorosüsivesiniku lisamisel mahutisse, milles on toimeaine, etanool (kui seda

kasutatakse) ja pindaktiivne aine (kui seda kasutatakse). Suspensiooni saamiseks

mikroniseeritakse toimeaine ja lisatakse seejärel propellendile. Seejärel viiakse

valmistis aerosoolmahutisse, mis moodustab osa mõõdetud kogust väljastavast 20

inhalaatorist. Spetsiaalselt koos HFA tüüpi propellentidega kasutatavaid mõõdetud

kogust väljastavate inhalaatorseadmete näiteid on kirjeldatud USA patentides nr

6 006 745, autor Marecki jt ja 6 143 277, autorid Ashurst jt. Alternatiivselt võib

suspensioonvalmistist valmistada toimeaine mikroniseeritud osakestele

pindaktiivse aine kattekihi pealekandmisel pihustuskuivatuse teel. Vaadake 25

näiteks patendidokumente WO 99/53901 (Glaxo Group Ltd.) ja WO 00/61108

(Glaxo Group Ltd.). Ülalmainitud patentides avalikustatu on siia lisatud täies

mahus viidetena.

Sissehingatavate osakeste valmistamisprotsesside ja inhaleerimisega

annustatavate valmististe ja selleks sobivate vahendite täiendavaid näiteid 30

vaadake USA patentidest nr 6 268 533, autorid Gao jt, 5 983 956, autor Trofast;

5 874 063, autorid Briggner jt ja 6 221 398, autorid Jakupovic jt; ja

EE - EP1856050 B1 22

patendidokumentidest WO 99/55319 (Glaxo Group Ltd.) ja WO 00/30614

(AstraZeneca AB); milles avalikustatu on siia lisatud täies mahus viidetena.

Järgmise teostuse korral on leiutisekohased ravimkoostised sobivad suukaudseks

manustamiseks. Suukaudseks manustamiseks sobivad ravimkoostised võivad olla

kapslite, tablettide, pillide, närimistablettide, kotikeste, dražeede, pulbrite, 5

graanulite kujul; või vees või mittevesivedelikus olevate lahuste või

suspensioonide kujul; või õli-vees või vesi-õlis tüüpi vedela emulsiooni kujul; või

eliksiiri või siirupi kujul ja nii edasi; kõik need sisaldavad toimeainena eelnevalt

kindlaksmääratud koguse leiutisekohast soola. Ravimkoostised võivad olla

pakendatud üksikannusvormina. 10

Tahke suukaudseks manustamiseks mõeldud annustamisvormi (see tähendab

kapslite, tablettide, pillide ja muude sellesarnaste) korral hõlmab leiutisekohane

ravimkoostis tavaliselt toimeainena leiutisekohast kristalset ühendit ja üht või mitut

farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet, nagu naatriumtsitraat või

kaltsiumvesinikfosfaat. Valikuliselt või alternatiivselt võivad sellised 15

annustamisvormid samuti hõlmata: täiteaineid või mahuaineid, nagu tärklised,

laktoos, sahharoos, glükoos, mannitool ja/või ränihape; sideaineid, nagu

karboksümetüültselluloos, alginaadid, želatiin, polüvinüülpürrolidoon, sahharoos

ja/või kummiaraabik; niiskusesäilitajaid, nagu glütserool; desintegreerivaid aineid,

nagu agar-agar, kaltsiumkarbonaat, kartuli- või tapiokitärklis, alghape, teatavad 20

silikaadid ja/või naatriumkarbonaat; lahustumist aeglustavaid aineid, nagu parafiin;

imendumise kiirendajaid nagu kvaternaarsed ammooniumiühendid; märgumist

soodustavaid aineid, nagu tsetüülakohol ja/või glütseroolmonostearaat;

absorbente, nagu kaoliin ja/või bentoniitsavi; libiaineid, nagu talk, kaltsiumstearaat,

magneesiumstearaat, tahked polüetüleenglükoolid, naatriumlaurüülsulfaat ja/või 25

nende segud; värvaineid ja puhverdavaid aineid.

Leiutisekohased ravimkoostised võivad samuti sisaldada toimeaine vabanemist

kontrollivaid aineid, märgumist soodustavaid aineid, katteaineid, magusaineid,

lõhna- ja maitseaineid, säilitusaineid ja antioksüdante. Farmatseutiliselt

vastuvõetavad antioksüdandid hõlmavad: vees lahustuvaid antioksüdante, nagu 30

askorbiinhape, tsüsteiinvesinikkloriid, naatriumvesiniksulfaat,

naatriumoksotetraoksodisulfaat, naatriumsulfiid ja teised nendetaolised; õlis

EE - EP1856050 B1 23

lahustuvaid antioksüdante, nagu askorbüülpalmitaat, butüülhüdroksüanisooli

(BHA), butüülhüdroksütolueeni (BHT), letsitiini, propüülgallaati, alfa-tokoferooli ja

teisi nendetaolisi; metallioone kelaativaid ühendeid, nagu sidrunhape,

etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA), sorbitool, viinhape, fosforhape ja teised

nendetaolised. Tablettide, kapslite, pillide ja teiste nendetaoliste katteained 5

hõlmavad selliseid ühendeid, mida kasutatakse soolestikus lahustuva kattekihi

saamiseks, nagu tselluloosatsetaatftalaat (CAP), polüvinüülatsetaatftalaat (PVAP),

hüdroksüpropüülmetüültselluloosftalaat, metakrüülhappe ja metakrüülhappeestri

kopolümeerid, tselluloosatsetaattrimellitaat (CAT), karboksümetüületüültselluloos

(CMEC), hüdroksüpropüülmetüültselluloosatsetaatsuktsinaat (HPMCAS) ja teised 10

nendetaolised.

Soovi korral võib leiutisekohaseid ravimkoostiseid valmistada nii, et on tagatud

toimeaine aeglane või kontrollitud vabanemine, milleks kasutatakse näiteks

erinevas koguses hüdroksüpropüültselluloosi või muid polümeerseid maatrikseid,

liposoome ja/või mikrosfääre. 15

Lisaks võivad leiutisekohased ravimkoostised sisaldada avalikuliselt

läbipaistmatuks muutvaid aineid ja neid valmistada nii, et toimeaine vabaneb

üksnes või eelistatavalt mao-soolkonna teatavas osas, valikuliselt hilistumisega.

Sisestamiseks kasutatavate koostiste näited hõlmavad polümeerseid aineid ja

vahasid. Toimeaine võib sobivuse korral olla ka mikrokapseldatud kujul ühte või 20

mitmesse eespool kirjeldatud abiainesse.

Suukaudseks manustamiseks sobivad vedelad annustamisvormid hõlmavad

näidetena farmatseutiliselt vastuvõetavaid emulsioone, mikroemulsioone,

lahuseid, suspensioone, siirupeid ja eliksiire. Sellised vedelad annustamisvormid

hõlmavad tavaliselt toimeainet ja inertset lahjendusainet, nagu vesi või muud 25

lahustid, solubiliseerivaid aineid ja emulgaatoreid, nagu etüülakohol,

isopropüülalkohol, etüülakarbonaat, etüülatsetaat, bensüülalkohol,

bensüülbensoaat, propüleenglükool, 1,3-butüleenglükool, olid (eelkõige

puuvillaseemne, maapähkli-, maisiõli, idudest saadav õli, oliivi-, riitsinus- ja

seesamiõli), glütserool, tetrahüdrofurüülalkohol, polüetüleenglükoolid ja sorbitaani 30

estrid rasvhapetega ja nende segud. Suspensioonid võivad lisaks toimeainele

sisaldada suspendeerivaid aineid, nagu etoksüülitud isostearüülakoholid,

EE - EP1856050 B1 24

polüoksüetüleensorbitool ja sorbitaanestrid, mikrokristalne tselluloos,

alumiiniummetahüdroksiid, bentoniit, agar-agar ja tragakant ja nende segud.

Leiutisekohaseid kristalseid ühendeid võib manustada ka transdermaalselt tuntud

transdermaalsete manustamissüsteemide ja abiainete abil. Näiteks võib

leiutisekohast ühendit segada sissetungimist soodustava ainega, nagu 5

propüleenglükool, polüetüleenglükoolmonolauraat, asatsükloalkaan-2-oonid ja

teised nendetaolised ning viia plaastri muu manustamissüsteemi koostisesse.

Sellistes transdermaalsetes koostises võib soovi korral kasutada täiendavad

abiained, sealhulgas tarretusaineid, emulgaatoreid ja puhvreid.

Leiutisekohaseid kristalseid ühendeid võib samuti manustada koos teiste 10

terapeutiliste toimeainetega. Kombinatsioonravi hõlmab leiutisekohase ühendi

kasutamist koos ühe või mitme sekundaarse toimeainega kas valmistatuna koos

(see tähendab koos pakendatuna ühes valmistises) või eraldi valmistatuna ( see

tähendab pakendatuna eraldi üksikannusvormide kujul). Meetodid mitut toimeainet

ühes valmistises ei eraldi üksikannustes oleval kujul valmististe saamiseks on 15

tehnika tasemes tuntud.

Täiendavat terapeutilist toimeainet /täiendavaid terapeutilisi toimeained võib valida

muude bronhodilataatorite (näiteks PDE3 inhibiitorite, adenosiin 2b modulaatorite

ja β2-adrenergilise retseptori agonistide); põletikuvastaste toimeainete (näiteks

steroidsete põletikuvastaste toimeainete nagu kortikosteroidid; mittesteroidsete 20

põletikuvastaste toimeainete (MPR) ja PDE4 inhibiitorite), muude

muskariiniretseptori antagonistide (näiteks antikolinergiliste toimeainete);

nakkusvastaste toimeainete (näiteks grampositiivsete ja gramnegatiivsete

antibiootikumide või viirusevastaste toimeainete); antihistamiinikumide; proteaasi

inhibiitorite ja aferentblokaatorite (näiteks D2 agonistide ja neurokiini 25

modulaatorite) hulgast.

Leiutise üks konkreetne teostus on suunatud koostisele, mis hõlmab (a)

farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet ja valemiga I ühendi kristalse vormi

terapeutiliselt toimivat kogust; ja (b) farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet ja

terapeutiliselt toimivat kogust toimeainet, mis on valitud steroidse põletikuvastase 30

toimeaine nagu kortikosteroidi; β2-adrenergilise retseptori agonisti;

EE - EP1856050 B1 25

fosfodiesteraas-4 inhibiitori või nende kombinatsiooni hulgast, seejuures on

valemiga I ühend ja toimeaine seguna või eraldi. Järgmise teostuse korral on (b)

farmatseutiliselt vastuvõetav kandeaine ning β2-adrenergilise retseptori agonisti ja

steroidse põletikuvastase toimeaine terapeutiliselt toimiv kogus. Sekundaarseid

toimeaineid võib kasutada farmatseutiliselt vastuvõetavate soolade või solvaatide 5

kujul ja sobivuse korral optiliselt puhaste stereoisomeeridena.

Esinduslikud β2-retseptori agonistid, mida võib kasutada kombinatsioonis

leiutisekohaste ühenditega, hõlmavad mittepiiravalt salmeterooli, salbutamooli,

formoterooli, salmefamooli, fenoterooli, terbutaliini, albuterooli, isoetariini,

metaproterenooli, bitolterooli, pirbuterooli, levalbuterooli ja teisi nendetaolisi või 10

nende farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli. Muud β2-adrenergilise retseptori

agonistid, mida võib kasutada, hõlmavad mittepiiravalt 3-(4-{[6-({(2R)-2-hüdroksü-

2-[4-hüdroksü-3-

(hüdroksümetüül)fenüül]etüül}amino)heksüül]oksü}butüül)benseensulfonamiidi

and 3-(-3-{[7-{(7-({(2R)-2-hüdroksü-2-[4-hüdroksü-3-(hüdroksümetüül)fenüül]-15

etüül}amino)heptüül]oksü}propüül)benseensulfonamiidi ja sellega lähedasi

ühendeid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 02/066422 (Glaxo Group

Ltd.); 3-[3-(4-{[6-([(2R)-2-hüdroksü-2-[4-hüdroksü-3-(hüdroksümetüül)fenüül]-

etüül}amino)heksüül]oksü}butüül)fenüül]imidasolidiin-2,4-diooni ja sellega lähedasi

ühendeid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 02/070490 (Glaxo Group 20

Ltd.); 3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formüülamino)-4-hüdroksüfenüül]-2-hüdroksüetüül}-

amino)heksüül]oksü}butüül)benseensulfonamiidi, 3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-

(formüülamino)-4-hüdroksüfenüül]-2-hüdroksüetüül}amino)heksüül]oksü}butüül)-

benseensulfonamiidi, 3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formüülamino)-4-hüdroksüfenüül]-2-

hüdroksüetüül}amino)heksüül]oksü} butüül)-benseensulfonamiidi, N-(tert-butüül)-25

3-(4-{[6-({(2R)-2-[3-(formüülamino)-4-hüdroksüfenüül]-2-hüdroksüetüül}amino)-

heksüül]-oksü}butüül)benseensulfonamiidi, N-(tert-butüül)-3-(4-{[6-({(2S)-2-[3-

(formüülamino)-4-hüdroksüfenüül]-2-hüdroksüetüül}amino)heksüül]oksü}butüül)-

benseensulfonamiidi, N-(tert-butüül)-3-(4-{[6-({(2R/S)-2-[3-(formüülamino)-4-

hüdroksüfenüül]-2-hüdroksüetüül}amino)heksüül]-oksü}butüül)benseen-30

sulfonamiidi ja sellega lähedasi ühendeid, mida on kirjeldatud patendidokumendis

WO 02/076933 (Glaxo Group Ltd.); 4-{(1R)-2-[(6-{2-[(2,6-diklorobensüül)-

oksü]etoksü}heksüül)amino]-1-hüdroksüetüül}-2-(hüdroksümetüül)fenooli ja

EE - EP1856050 B1 26

sellega lähedasi ühendeid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO 03/024439

(Glaxo Group Ltd.); N-{2-[4-((R)-2-hüdroksü-2-fenüületüülamino)fenüül]etüül}-(R)-

2-hüdroksü-2-(3-formamido-4-hüdroksüfenüül)etüülamiini ja sellega lähedasi

ühendeid, mida on kirjeldatud USA patendis nr 6 576 793, autorid Moran jt; N-{2-

[4-(3-fenüül-4-metoksüfenüül)aminofenüül]etüül}-(R)-2-hüdroksü-2-(8-hüdroksü-5

2(1H)-kinolinoon-5-üül)etüülamiini ja sellega lähedasi ühendeid, mida on

kirjeldatud USA patendis nr 6 653 323, autorid Moran jt; ja nende farmatseutiliselt

vastuvõetavaid sooli. Konkreetse teostuse korral on β2-adrenoretseptori agonist

kristalne N-{2-[4-((R)-2-hüdroksü-2-fenüületüülamino)fenüül]etüül}-(R)-2-hüdroksü-

2-(3-formamido-4-hüdroksüfenüül)etüülamiini monovesinikkloriidsool. Kasutamise 10

korral on β2-adrenoretseptori agonist ravimkoostises terapeutiliselt toimivas

koguses. Tavaliselt on β2-adrenoretseptori agonist koguses, millest piisab, et

saada annusega kogus vahemikus 0,05 µg kuni 500 µg. Ülalmainitud patentides

avalikustatu on siia lisatud täies mahus viidetena.

Steroidsete põletikuvastaste toimeainete, mida võib kasutada kombinatsioonis 15

leiutisekohaste kristalsete ühenditega, esinduslikud näited hõlmavad mittepiiravalt

metüülprednisolooni, prednisolooni, deksametasooni, flutikasoonpropionaati, 6α,9α-

difluoro-17α-[(2-furanüülkarbonüül)oksü]-11β-hüdroksü-16α-metüül-3-

oksoandrosta-1,4-dieen-17β-karbotiokarboksüülhappe S-fluorometüülestrit, 6α,9α-

difluoro-11β-hüdroksü-16α-metüül-3-okso-17α-propionüüloksüandrosta-1,4-20

dieene17β-karbotiokarboksüülhappe S-(2-oksotetrahüdrofuraan-3S-üül)estrit,

beklometasooni estreid (näiteks 17-propionaatester või 17,21-dipropionaatester),

budesoniidi, flunisoliidi, mometasooni esterid (näiteks furoaatester),

triamtsinoloonatsetoniidi, rofleponiidi, tsiklesoniidi, butiksokortpropionaati, RPR-

106541, ST-126 ja teise nendetaolisi või nende farmatseutiliselt vastuvõetavaid 25

sooli. Kasutamise korral on steroidne põletikuvastane toimeaine ravimkoostises

terapeutiliselt toimivas koguses. Tavaliselt on steroidne põletikuvastane toimeaine

koguses, millest piisab, et saada annusega kogus vahemikus 0,05 µg kuni 500 µg.

Koostise näiteks on valemiga I ühendi kristalne vorm või selle solvaat, mida

manustatakse koos salmeterooli kui β2-adrenergilise retseptori agonisti ja 30

flutikasoonpropionaadi kui steroidse põletikuvastase toimeainega. Koostise

järgmiseks näiteks on valemiga I ühendi kristalne vorm või selle solvaat, mida

EE - EP1856050 B1 27

manustatakse koos kristalse N-{2-[4-((R)-2-hüdroksü-2-fenüületüülamino)-

fenüül]etüül}-(R)-2-hüdroksü-2-(3-formamido-4-hüdroksüfenüül)-etüülamiini

monovesinikkloriidsoola kui β2-adrenergilise retseptori agonisti ja 6α,9α-difluoro-

17α-[(2-furanüülkarbonüül)oksü]-11β-hüdroksü-16α-metüül-3-oksoandrosta-1,4-

dieen-17β-karbotiokarboksüülhappe S-fluorometüülestri kui steroidse 5

põletikuvastase toimeainega. nagu eespool mainitud, võivad need toimeained olla

segus või eraldi.

Teised sobivad kombinatsioonid hõlmavad näiteks muid põletikuvastaseid

toimeaineid, näiteks MPR-e (näiteks naatriumkromoglükaati, nedokromiilnaatriumi

ja fosfodiesteraasi (PDE) inhibiitoreid, nagu teofülliin, PDE4 inhibiitoreid ja 10

PDE3/PDE4 segainhibiitoreid); leukotrieeni antagoniste (näiteks monteleukasti);

leukotrieeni sünteesi inhibiitoreid; beeta-2-integriini antagoniste ja

adenosiiniretseptori agoniste või antagoniste (näiteks adenosiin-2a antagoniste);

tsütokiini antagoniste (näiteks kemokiini antagoniste nagu interleukiini antikeha

(αIL antikeha), spetsiifiliselt ravi αIL4, αIL3 abil või nende kombinatsiooni); või 15

tsütokiini sünteesi inhibiitoreid.

Fosfodiesteraas-4-4 (PDE4) inhibiitorite või PDE3/PDE4 segainhibiitorite

esinduslikud näited, mida saab kasutada kombinatsioonis leiutisekohaste

kristalsete ühenditega, hõlmavad mittepiiravalt cis-4-tsüano-4-(3-

tsüklopentüüloksü-4-metoksüfenüül)tsükloheksaan-1-karboksüülhapet, 2-20

karbometoksü-4-tsüano-4-(3-tsüklopropüülmetoksü-4-difluorometoksüfenüül)-

tsükloheksaan-1-ooni; cis-[4-tsüano-4-(3’-tsüklopropüülmetoksü-4-difluoro-

metoksüfenüül)tsükloheksaan-1-ooli]; cis-4-tsüano-4-[3-(tsüklopentüüloksü)-4-

metoksüfenüül]tsükloheksaan-1-karboksüülhapet ja teisi nendetaolisi või nende

farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli. Muud esinduslikud PDE4 või PDE4/PDE3 25

segainhibiitorid hõlmavad AWD-12-281 (elbioon); NCS-613 (IN-SERM); D-4418

(Chiroscience and Schering-Plough); CI-1018 või PD-168787 (Pfizer);

bensodioksoolühendeid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO99/16766

(Kyowa Hakko); K-34 (Kyowa Hakko); V-11294A (Napp); roflumilast (Byk-Gulden);

ftalasinoonühendid, mida on kirjeldatud patendidokumendis WO99/47505 (Byk-30

Gulden); pumafentriin (Byk-Gulden, nüüd Altana); arofülliin (Almirall-Prodesfarma);

VM554/UM565 (Vernalis); T-440 (Tanabe Seiyaku); ja T2585 (Tanabe Seiyaku).

EE - EP1856050 B1 28

Muskariini esinduslikud antagonistid, mida saab kasutada kombinatsioonis

leiutisekohaste kristalsete ühenditega, hõlmavad mittepiiravalt atropiini,

atropiinsulfaati, atropiinoksiidi, metüülatropiinnitraati, homatropiinvesinikbromiid,

hüostsüamiin(d, l)vesinikbromiidi, skopolamiinvesinikbromiidi, ipatroopiumbromiidi,

oksitroopiumbromiidi, tiotroopiumbromiidi, metanteliini, propanteliinbromiidi, 5

anisotropiinmetüülbromiidi, klidiiniumbromiidi, kopürrolaati (robinuul),

isopropamiidjodiidi, mepensolaatbromiidi, tridiheksetüülkloriidi (patiloon),

heksotsükliummetüülsulfaati, tsüklopentolaatvesinikkloriidi, tropikamiidi,

triheksüfenidüülvesinikkloriidi, pirensepiini, telensepiini, AF-DX 116 ja

metoktramiini ja teisi nendetaolisi või nende farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli, 10

või loetelus sooladena esinevate ühendite jaoks alternatiivselt nende

alternatiivseid farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli.

Antihistamiinikumide (see tähendab H1-retseptori antagonistide) esinduslikud

näited, mida saab kasutada kombinatsioonis leiutisekohaste kristalsete

ühenditega, hõlmavad mittepiiravalt etanoolamiine, nagu karbinoksamiinmaleaati, 15

klemastiinfumaraati, difenüülhüdramiinvesinikkloriidi ja dimenhüdrinaati;

etüleendiamiine, nagu pürilamiinmaleaati, tripelennamiinvesinikkloriidi ja

tripelennamiintsitraati; alküülamiine, nagu kloorfeniramiin ja akrivastiin; piperasiine

nagu hüdroksüsiinvesinikkloriid, hüdroksüsiinpamoaat, tsüklisiinvesinikkloriid,

tsüklisiinlaktaat, meklisiinvesinikkloriid ja tsetirisiinvesinikkloriid; piperidiine, nagu 20

astemisool, levokabastiinvesinikkloriid, loratadiin või selle deskarboetoksü-

analoog, terfenadiin- ja feksofenadiinvesinikkloriid; aselastiin vesinikkloriidi ja teisi

nendetaolisi või nende farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli, või loetelus

sooladena esinevate ühendite jaoks alternatiivselt nende alternatiivseid

farmatseutiliselt vastuvõetavaid sooli. 25

Kui ei ole öeldud teisiti, siis on leiutisekohase kristalse ühendiga koos

manustatavate muude terapeutiliste toimeainete sobivate annuste näited

vahemikus ligikaudu 0,05 µg päevas kuni 100 µg päevas.

Järgmised valmistised näitlikustavad nii esinduslikke leiutisekohaseid

ravimkoostiseid kui ka näitlikke valmistamismeetodeid. Leiutisekohase kristalse 30

ühendiga (primaarse toimeainega) võib soovi korral segada üht või mitut

sekundaarset toimeainet. Alternatiivselt võib sekundaarset toimeainet (võivad

EE - EP1856050 B1 29

sekundaarsed toimeained) olla valmistatud eraldi ja manustada koos primaarse

toimeainega kas samaaegselt või järjestikuliselt. Näiteks võib ühe teostuse korral

valmistada kuivpulbervalmistist, mis sisaldab nii leiutisekohast kristalset ühendit

kui ka üht või mitut sekundaarset toimeainet. Teise teostuse korral valmistatakse

üks valmistis, mis sisaldab leiutisekohast kristalset ühendit ja eraldi valmistatakse 5

valmistis(ed), mis sisaldab sekundaarset toimeainet (sisaldavad sekundaarseid

toimeaineid). Selliseid kuivpulbervalmistisi võib seejärel pakendada eraldi

mullpakenditesse ja manustada ühe DPI seadme abil.

Inhaleerimise teel manustatava kuivpulbervalmististe näidis

0,2 mg leiutisekohast kristalset ühendit mikroniseeritakse ja segatakse seejärel 10

25 mg laktoosiga. Seejärel pannakse valmissegatud segu želatiinist

inhaleerimispadrunisse. Padruni sisu manustatakse pulberinhalaatori abil.

Kuivpulberinhalaatori abil manustatava kuivpulbervalmististe näidis

Valmistatakse kuiv pulber, milles on leiutisekohase mikroniseeritud kristalse

ühendi (toimeaine) ja laktoosi suhe 1 : 200. Pulber pakendatakse 15

kuivpulberinhalaatorisse, mis on võimeline väljastama annuseid, mis sisaldavad

ligikaudu 10 µg ja 100 µg toimeainet.

Mõõdetud annust väljastava inhalaatoriga manustatavate valmististe näited

Suspensioon, mis sisaldab 5 massiprotsenti leiutisekohast kristalset ühendit

(toimeainet) ja 0,1 massiprotsenti letsitiini, valmistatakse 10 g toimeaine alla 20

10 µm suurusega mikroniseeritud osakeste dispergeerimisel lahuses, mis saadi

0,2 g letsitiini lahustamisel 200 mL demineraliseeritud vees. Suspensioon

pihustuskuivatatakse ja saadud aine mikroniseeritakse osakesteks, mille keskmine

läbimõõt on alla 1,5 µm. Osakestega täidetakse padrunid, milles on rõhu all olev

1,1,1,2-tetrafluoroetaan 25

Alternatiivselt valmistatakse suspensioon, mis sisaldab 5 massiprotsenti

toimeainet, 0,5 massiprotsenti letsitiini ja 0,5 massiprotsenti trehaloosi, 5 g

toimeaine alla 10 µm suurusega mikroniseeritud osakeste dispergeerimisel

kolloidlahuses, mis saadi 0,5 g trehaloosi ja 0,5 g letsitiini lahustamisel 100 mL

EE - EP1856050 B1 30

demineraliseeritud vees. Suspensioon pihustuskuivatatakse ja saadud aine

mikroniseeritakse osakesteks, mille keskmine läbimõõt on alla 1,5 µm.

Osakestega täidetakse mahutid, milles on rõhu all olev 1,1,1,2-tetrafluoroetaan

Nebulisaatoriga manustatava vesiaerosoolvalmistise näide

Ravimkoostis valmistatakse 0,5 mg leiutisekohase kristalse ühendi (toimeaine) 5

lahustamisel 1 mL naatriumkloriidi 0,9% lahuses, mis on hapestatud

sidrunhappega. Segu segatakse ja töödeldakse ultraheliga kuni toimeaine täieliku

lahustumiseni. Lahuse pH viiakse vahemikku 3 kuni 8 (tavaliselt ligikaudu 5-ni)

NaOH aeglase lisamisega.

Suukaudseks manustamiseks mõeldud kõvade želatiinkapslite kujul oleva 10

valmistise näide

Segatakse hoolikalt järgmised koostisained ja seejärel täidetakse sellega kõvad

želatiinkapslid: 250 mg leiutisekohast kristalset ühendit, 200 mg laktoosi

(pihustuskuivatatud) ja 10 mg magneesiumstearaati, et saada kapsli kohta 460 mg

koostist. 15

Suukaudseks manustamiseks mõeldud suspensioonvalmistise näide

Et saada suspensioon, mis sisaldab 100 mg toimeainet 10 mL suspensioonis,

segatakse järgmised koostisained:

Koostisained Kogus

Leiutisekohane kristalne ühend 1,0 g

Fumaarhape 0,5 g

Naatriumkloriid 2,0 g

Metüülparabeen 0,15 g

Propüülparabeen 0,05 g

Granuleeritud suhkur 25,5 g

Sorbitool (70% lahus) 12,85 g

Veegum K (Vanderbilt Co.) 1,0 g

Lõhna- ja maitseaine 0,035 mL

Värvained 0,5 mg

Destilleeritud vesi q.s. kuni 100 mL

EE - EP1856050 B1 31

Süstitava valmistise näide

Segatakse järgmised koostisained ja segu pH viiakse 0,5 N HCl või 0,5 N NaOH

abil väärtuseni 4 ±0,5.

Koostisained Kogus

Leiutisekohane kristalne ühend 0,2 g

Naatriumatsetaatpuhvri lahus (0,4 M) 2,0 mL

HCl (0,5 N) või NaOH (0,5 N) q.s. kuni pH 4

Vesi (destilleeritud, steriilne) q.s. kuni 20 mL

KASULIKKUS

Valemiga I ühendil on muskariiniretseptorile antagonistlik toime ja seetõttu on 5

eeldatav, et valemiga I ühendi kristalne vorm on kasulik muskariiniretseptoriga

vahendatud meditsiiniliste seisundite ravis, see tähendab selliste meditsiiniliste

seisundite ravis, mida saab leevendada ravimisel muskariiniretseptori

antagonistiga. Sellised meditsiinilised seisundid hõlmavad näiteks kopsudega

seonduvaid häireid või haigusi, sealhulgas selliseid, mis seonduvad 10

hingamisteede pöörduva obstruktsiooniga, nagu krooniline obstruktiivne

kopsuhaigus (näiteks krooniline ja kapillaarbronhiit ja kopsuemfüseem), astma,

kopsufibroos, allergiline riniit, rinorröa ja teised nendetaolised. Muud

meditsiinilised seisundid, mida saab ravida muskariiniretseptori antagonistidega,

on kuse-suguteede haigused, nagu kusepõie hüperaktiivsus või kuseväljutaja 15

hüperaktiivsus ja sellega kaasnevad sümptomid; mao-soolkonna haigused, nagu

ärritunud soole sündroom, divertikulaarsed haigused, akalaasia, mao-soolkonna

hüperliikuvusega seonduvad haigused ja diarröa; südamerütmi häired, nagu

siinusbradükardia; Parkinsoni tõbi, kognitiivsed haigused, nagu Alzheimeri tõbi;

dismenorröa ja teised nendetaolised. 20

Seega on leiutise üks teostus suunatud meetodile kopsuhaiguste raviks, meetod

hõlmab patsiendile terapeutiliselt toimiva koguse kristalse bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri või selle farmatseutiliselt vastuvõetava

solvaadi manustamist. Kopsuhaiguste ravis kasutamisel manustatakse 25

leiutisekohast kristalset ühendit tavaliselt päevas mitme annuse, ühekordse

EE - EP1856050 B1 32

päevase annuse või nädalas ühe annuse inhaleerimise teel. Tavaliselt on

kopsuhaiguse ravimisel annus vahemikus ligikaudu 10 µg päevas kuni 200 µg

päevas.

Inhaleerimise teel manustatuna avaldavad leiutisekohased kristalsed ühendid

tavaliselt bronhe laiendavat toimet. Seega on leiutise järgmine teostus suunatud 5

meetodile patsiendi bronhide laiendamiseks, meetod hõlmab patsiendile bronhe

laiendava koguse kristalse bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

või selle farmatseutiliselt vastuvõetava solvaadi manustamist. Tavaliselt on

bronhide laiendamiseks vajalik terapeutiliselt toimiv annus vahemikus ligikaudu 10

10 µg päevas kuni 200 µg päevas.

Üks teostuse korral on leiutis suunatud meetodile kroonilise obstruktiivse

kopsuhaiguse või astma raviks, meetod hõlmab patsiendile terapeutiliselt toimiva

koguse kristalse bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri või selle farmatseu-15

tiliselt vastuvõetava solvaadi manustamist. KOK-i või astma ravimisel

manustatakse leiutisekohast soola tavaliselt päevas mitme annuse või ühekordse

päevase annuse inhaleerimise teel. Tavaliselt on KOK-i või astma ravimisel annus

vahemikus ligikaudu 10 µg päevas kuni 200 µg päevas. Siin kasutatuna hõlmab

KOK kroonilist obstruktiivset bronhiiti ja emfüseemi (vaadake näiteks Bames, 20

Chronic Obstructive Pulmonary Disease, N. Engl. J. Med. 343: 269–78 (2000)).

Kopsuhaiguste ravimisel manustatakse leiutisekohast kristalset ühendit valikuliselt

kombinatsioonis muude terapeutiliste toimiainetega. Seega hõlmavad

ravimkoostised ja meetodid konkreetse teostuse korral täiendavalt terapeutiliselt

toimivas koguses β2-adrenoretseptori agonisti, kortikosteroidi, mittesteroidset 25

põletikuvastast toimeainet või nende kombinatsiooni.

Järgmise teostuse korral kasutatakse leiutisekohaseid kristalseid ühendeid

muskariiniretseptori antagoniseerimiseks bioloogilistes süsteemides ja imetajates,

eelkõige sellistes nagu hiired, rotid, merisead, küülikud, koerad, sead, inimesed ja

nii edasi. Selle teostuse korral manustatakse valemiga I kristalse ühendi 30

terapeutiliselt toimiv kogus imetajale. Soovi korral saab seejärel määrata

EE - EP1856050 B1 33

muskariiniretseptori antagoniseerivat toimet määrata tavaliselt kasutatavate

protseduuride ja seadmete abil.

Leiutisekohaste kristalsete ühendite omadusi ja kasulikkust saab näidata

spetsialistile hästi tuntud erinevate in vitro ja in vivo katsete abil. Näiteks on

esinduslikke katseid kirjeldatud üksikasjalikult järgnevates näidetes. 5

NÄITED

Järgnevad valmistamisviisid ja näited on toodud leiutise spetsiifiliste teostuste

näitlikustamiseks. Siiski ei ole need spetsiifilised näited mõeldud leiutist mingil

moel piiravatena, kui seda ei ole konkreetselt öeldud. Järgmistel lühenditel on

alltoodud tähendused, kui seda ei ole öeldud teisiti ja kõik muud siin kasutatud 10

määratlemata lühendid on standardse tähendusega:

AC adenülüülrsüklaas

ACh atsetüülkoliin

ACN atsetonitriil

BSA veiseseerumi albumiin

cAMP 3’-5’-tsükliline adenosiinmonofosfaat

CHO hiina hamstri munasarjarakk

cM5 šimpansi kloonitud M5 retseptor

DCM diklorometaan (see tähendab metüleenkloriid)

DIPEA N,N-diisopropüületüülamiin

dPBS fosfaatpuhverdatud Dulbecco soolalahus

DMSO dimetüülsulfoksiid

EDC 1-etüül-3-(3-dimetüülaminopropüül)karbodiimiid

EDTA etüleendiamiintetraäädikhape

FBS veiselooteseerum

FLIPR fluoromeetrilise plaadi lugeja

HBSS Hank’i puhverdatud soolalahus

HEPES 4-(2-hüdroksüetüül)-1-piperasiinetaansulfoonhape

hM1 inimese kloonitud M1 retseptor

hM2 inimese kloonitud M2 retseptor

hM3 inimese kloonitud M3 retseptor

EE - EP1856050 B1 34

hM4 inimese kloonitud M4 retseptor

hM5 inimese kloonitud M5 retseptor

HOBT N-hüdroksübensotriasool

HPLC kõrgsurvevedelikkromatograafia

IPA 2-propanool

MCh metüükoliin

MTBE metüül-tert-butüüleeter

TFA trifluoroäädikhape

Kõik muud siin kasutatud ja määratlemata lühendid on standardse üldtunnustatud

tähendusega. Kui ei ole öeldud teisiti, siis on reaktiivid, lähteained ja lahustid

ostetud kaubatarnijatelt (nagu Sigma-Aldrich, Fluka ja teised nendetaolised) ja

neid kasutati täiendava puhastamiseta.

Kui ei ole öeldud teisiti, siis kasutati analüüsiks HPLC meetodil seadet Agilent 5

(Palo Alto, CA) Series 1100 koos kolonniga a Zorbax Bonus RP 2,1 x 50 mm

(Agilent), osakeste suurusega 3,5 mikromeetrit. Detekteerimine toimus UV-

kiirgusega lainepikkusel 214 nm. Kasutatavad liikuvad faasid olid järgmised

(mahuprotsentides): A oli ACN (2%), vesi (98%) ja TFA (0,1 %); ja B oli atsetonitriil

(90%), vesi (10%) ja TFA (0,1%). HPLC 10–70 andmed saadi voolutuskiiruse 0,5 10

mL/minut B kasutamisel 6 minuti jooksul gradiendiga 10 kuni 70% (ülejäänu oli A).

Analoogiliselt saadi HPLC 5–35 ja HPLC 10–90 andmed 6 minuti jooksul B

gradiendiga 5 kuni 35% või 10 kuni 90% B.

Vedelikkromatograafia-massispektromeetria (LCMS) andmed saadi seadmega

Applied Biosystems (Foster City, CA) Model API-150EX. LCMS 10–90 andmed 15

saadi B kasutamisel 5 minuti jooksul mobiilse faasina 10 kuni 90% gradiendiga

VALMISTAMISVIIS 1

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe piperidiin-4-üülester

Bifenüül-2-isotsüanaadi (97,5 g, 521 mmol) ja 4-hüdroksü-N-bensüülpiperidiini

(105 g, 549 mmol) segu kuumutati 12 tundi temperatuuril 70 °C. Seejärel jahutati 20

reaktsioonisegu temperatuurini 50 °C ja lisati etanool (1 L) ja seejärel aeglaselt

6 M HCl (191 mL). Seejärel jahutati saadud segu toatemperatuurini ja lisati

EE - EP1856050 B1 35

ammooniumformiaat (98,5 g, 1,56 mol) ja läbi lahuse juhiti 20 min jooksul

intensiivselt gaasilist lämmastikku. Seejärel lisati palladeeritud süsi (20 g, 10

massiprotsenti kuivainena) ja reaktsioonisegu kuumutati 12 tundi temperatuuril

40 °C ja seejärel filtriti läbi tseliitpadruni. Seejärel eemaldati lahusti vähendatud

rõhu all ja puhastamata jäägile lisati 1 M HCl (40 mL). Segu pH viidi 10 N NaOH 5

abil väärtuseni pH 12. Vesikihti ekstraheeriti etüülatsetaadiga (2 x 150 mL) ja

orgaaniline kiht kuivatati (magneesiumsulfaat), filtriti ja lahusti eemaldati

vähendatud rõhu all, et saada 155 g lõppvaheühendit (saagis 100%). HPLC (10–

70) Rt = 2,52; m/z: [M+H+] arvut. C18H20N2O2 jaoks 297,15; leitud 297,3.

VALMISTAMISVIIS 2 10

N-bensüül-N-metüülaminoatseetaldehüüd

Kolmekaelalisse 2 L mahuga kolbi lisati N-bensüül-N-metüületanoolamiin (30,5 g,

0,182 mol), DCM (0,5 L), DIPEA (95 mL, 0,546 mol) ja DMSO (41 mL, 0,728 mol).

Jäävannil jahutati segu temperatuurini ligikaudu –10 °C ja viieminutiliste

intervallidega lisati 4 portsjonit kompleks vääveltrioksiid-püridiin (87 g, 0,546 mol). 15

Reaktsioonisegu segati 2 tundi temperatuuril –10 °C. Enne jäävanni eemaldamist

peatati reaktsioon segus vee (0,5 L) lisamisega. Vesikiht eraldati ja orgaanilist kihti

pesti vee (0,5 L) ja soolalahusega (0,5 L) ja kuivatati seejärel

magneesiumsulfaadiga ning filtriti, et saada lõppühend, mida kasutati täiendava

puhastamiseta. 20

VALMISTAMISVIIS 3

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-[2-/bensüülmetüülamino)etüül]piperidiin-4-üülester

2 L mahuga kolbi, mis sisaldas valmistamisviisi 2 saadust DCM-is (0,5 L), lisati

valmistamisviisi 1 saadus (30 g, 0,101 mol) ja seejärel

naatriumtriatsetoksühüdridoboraat (45 g, 0,202 mol). Reaktsioonisegu segati öö 25

läbi ja seejärel peatati reaktsioon 1 N vesinikkloriidhappe lisamisega (0,5 L)

intensiivse segamise ajal. Saadi kolm kihti ja vesikiht eemaldati. Pärast pesemist

1 N NaOH lahusega (0,5 L) saadi homogeenne orgaaniline kiht, mida pesti

seejärel NaCl küllastunud vesilahusega (0,5 L), kuivatati magneesiumsulfaadiga,

filtriti ja lahusti eemaldati vähendatud rõhu all. Jäägi puhastamiseks lahustati see 30

EE - EP1856050 B1 36

minimaalses koguses 2-propanoolis ja see lahus jahutati temperatuurini 0 °C,

tekkinud tahke aine koguti ja pesti külma 2-propanooliga, et saada 42,6 g

lõppühendit (saagis 95%). MS m/z: [M+H+] arvut. C28H33N3O2 jaoks 444,3; leitud

444,6. Rf = 3.51 min (10–70 ACN : H2O, pöördfaas-HPLC).

VALMISTAMISVIIS 3A 5

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-[2-(bensüülmetüülamino)etüül]piperidiin-4-üülester

Lõppühend valmistati N-bensüül-N-metüületanoolamiini mesüülimisega, millel lasti

seejärel reageerida alküülimisreaktsioonis bifenüül-2-üülkarbaamhappe piperidiin-

4-üülestriga.

500 mL kolbi (kolbreaktorisse) viidi N-bensüül-N-metüületanoolamiin (24,5 mL, 10

DCM (120 mL), NaOH (80 mL, 30 massiprotsendiline lahus) ja

tetrabutüülammooniumkloriid. Väikese kiirusega segamisel kogu reaktsiooni vältel

jahutati segu temperatuurini –10 °C (jahutusvann) ja tilklehter täideti DCM-i

(30 mL) ja mesüülkloriidiga (15,85 mL), mis lisati tilkhaaval konstantse kiirusega

30 minuti jooksul. Lisamine oli eksotermiline ja segamist jätkati 15 minutit, mille 15

jooksul stabiliseerus temperatuur uuesti –10 °C juures. Reaktsioonil lasti toimuda

vähemalt 10 minutit selleks, et tagada mesüülkloriidi liia täielik hüdrolüüs.

250 mL kolbi viidi bifenüül-2-üülkarbaamhappe piperidiin-4-üülester (26 g,

valmistatud valmistamisviisi 1 korral kirjeldatu kohaselt) ja DCM (125 mL), segati

15 minutit toatemperatuuril ja segu jahutati kiiresti temperatuurini 10 °C, et 20

saadasuspensioon. Suspensioon viidi tilklehtri kaudu kolbreaktorisse. Jahutusvann

eemaldati ja reaktsioonisegu soojendati temperatuurini 5 °C. Segu viidi

jaotuslehtrisse, kihtidel lasti eralduda ja vesikiht eemaldati. Orgaaniline kiht viidi

tagasi kolbreaktorisse, segamist jätkati, segu hoiti toatemperatuuril ja reaktsiooni

kulgu jälgiti HPLC abil kokku 3,5 tunni jooksul. 25

Reaktorkolbi viidi NaOH (1 M lahus, 100 mL), segati ja lasti kihtidel eralduda.

Orgaaniline kiht eraldati, pesti (NaCL küllastunud lahus), aurutati vaakumis

osaliselt kokku ja IPA-ga pesemisi korrati. Tahked ained koguti ja lasti kuivada õhu

käes (25,85 g, puhtus 98%). Emalahuse töötlemisel (mahu vähendamine, IPA,

jahutamine) saadi täiendavalt tahkeid aineid. 30

EE - EP1856050 B1 37

VALMISTAMISVIIS 4

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-metüülaminoetüül)piperidiin-4-üülester

Parri hüdrogeenimiskolbi lisati valmistamisviisi 3 saadus (40 g, 0,09 mol) ja

etanool (0,5 L). Kolb puhuti läbi gaasilise lämmastikuga ja lisati palladeeritud süsi

(15 g, 10 massiprotsenti (kuivaine järgi), 37 massiprotsenti) koos äädikhappega 5

(20 mL). Segu hoiti Parri hüdrogeenimisseadmes 3 tundi vesiniku atmosfääris (~

50 psi). Seejärel segu filtriti ja pesti etanooliga. Filtraat kontsentreeriti ja jääk

lahustati minimaalses koguses DCM-is. Tahke aine saamiseks lisati aeglaselt

isopropüülatsetaat (10 mahuosa), tahke aine koguti, et saada 22,0 g lõppühendit

(saagis 70%). MS m/z: [M+H+] arvut. C21H27N3O2 jaoks 354,2; leitud 354,3. Rf = 10

2,96 min (10–70 ACN : H2O, pöördfaas-HPLC).

VALMISTAMISVIIS 5

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-{2-[(4-formüülbensoüül)metüülamino]etüül}-

piperidiin-4-üülester

Kolmekaelalisse 1 L mahuga kolbi lisati 4-karboksübensaldehüüd (4,77 g, 15

31,8 mmol), EDC (6,64 g, 34,7 mmol), HOBT (1,91 g, 31,8 mmol) ja DCM

(200 mL). Kui segu oli muutunud homogeenseks, lisati aeglaselt valmistamisviisi 4

saaduse (10 g, 31,8 mmol) lahus DCM-is (100 mL). Reaktsioonisegu segati

toatemperatuuril ligikaudu 16 tundi ja pesti seejärel vee (1 x 100 mL), 1 N HCl-i

(5 x 60 mL), 1 N NaOH (1 x 100 mL), soolalahusega (1 x 50 mL), kuivatati 20

naatriumsulfaadiga, filtriti ja kontsentreeriti, et saada 12,6 g lõppühendit (saagis

92%; puhtus 85% HPLC analüüsi andmetel). MS m/z: [M+H+] arvut. C29H31N3O4

jaoks 486,2; leitud 486,4. Rf = 3,12 min (10–70 ACN : H2O, pöördfaas-HPLC).

NÄIDE 1

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-25

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülester

EE - EP1856050 B1 38

Kolmekaelalisse 2 L mahuga kolbi viidi heksahüdroisonikotiinamiid (5,99 g,

40,0 mmol), äädikhape (2,57 mL), naatriumsulfaat (6,44 g) ja 2-propanool

(400 mL). Reaktsioonisegu jahutati jäävannil temperatuurini 0–10 °C ja lisati

aeglaselt bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-{2-[(4-formüülbensoüül)metüülamino]-5

etüül}piperidiin-4-üülestri (11 g, 22,7 mmol; valmistatud valmistamisviisi 5 korral

kirjeldatu kohaselt) lahus 2-propanoolis (300 mL). Reaktsioonisegu segati 2 tundi

toatemperatuuril ja jahutati seejärel temperatuurini 0–10 °C. portsjonite haaval

lisati naatriumtriatsetoksühüdridoboraat (15,16 g, 68,5 mmol) ja segu segati 16

tundi toatemperatuuril. Seejärel kontsentreeriti reaktsioonisegu vähendatud rõhu 10

alla mahuni ligikaudu 50 mL ja see segu hapestati 1 N HCl-iga (200 mL) kuni pH

väärtuseni 3. Saadud segu segati 1 tund toatemperatuuril ja ekstraheeritit seejärel

DCM-iga (3 x 250 mL). Vesifaas jahutati seejärel jäävannil temperatuurini 0–5 °C

ja segu pH viimiseks väärtuseni 10 lisati NaOH 50% vesilahust. Seejärel

ekstraheeriti seda segu isopropüülatsetaadiga (3 x 300 mL) ja ühendatud 15

orgaanilisi kihte pesti vee (100 mL), soolalahusega (2 x 50 mL), kuivatati

naatriumsulfaadiga, filtriti ja kontsentreeriti, et saada 10,8 g lõppühendit (saagis

80%). MS m/z: [M+H+] arvut. C35H43N5O4 jaoks 598,3; leitud 598,6. Rf = 2,32 min

(10–70 ACN : H2O, pöördfaas-HPLC).

NÄIDE 2 20

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne difosfaatsool

500 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (0,826 mmol ainet

puhtusega 96%; valmistatud näites 1 toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 5 mL 25

vees ja 1,5 mL 1 M fosforhappelahuses. pH viidi ligikaudu väärtuseni 5,3

täiendava 0,25 mL 1 M fosforhappe lisamisega (kokku 2,1 molaarekvivalenti).

EE - EP1856050 B1 39

Läbipaistev lahus filtriti läbi 0,2 mikromeetriliste avadega filtri, külmutati ja

lüofiliseeriti kuivaks, et saada amorfne difosfaatsool.

20 mg amorfset difosfaatsoola lahustati 2 mL segus IPA : ACN (1 : 1). Lisati

0,1 mL vett ja segu kuumutati segamisel temperatuurini 60 °C. Peaaegu kogu

tahke aine lahustus. Reaktsioonisegul lasti jahtuda segamisel öö läbi 5

toatemperatuurini. Saadud kristallid koguti filtrimisega ja kuivatati 20 minutit õhu

käes, et saada lõppühend (18,5 mg, saagis 93%) valge kristalse tahke ainena.

Mikroskoobi all polariseeritud valgusega uurimisel ilmnes kristallidel teatav

kaksikmurdumine.

NÄIDE 3 10

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne difosfaatsool

5,0 g bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (vaba alus;

valmistatud näites 1 toodud kirjelduse kohaselt) lisati 80 mL segule IPA : ACN 15

(1 : 1). Lisati 4,0 mL vett ja segu kuumutati segamisel temperatuurini 50 °C,

moodustus läbipaistev lahus. Sellele lisati temperatuuril 50 °C tilkhaaval 16 mL

1 M fosfaorhapet. Saadudhägust lahust segati 5 tundi temperatuuril 50 °C,

seejärel lasti jahtuda segamisel öö läbi toatemperatuurini. Saadud kristallid koguti

filtrimisega ja kuivatati 1 tund õhu käes, seejärel 18 tundi vaakumis, et saada 20

lõppühend (5,8 g, saagis 75%) valge kristalse tahke ainena (puhtus 98,3% HPLC

analüüsi andmetel).

NÄIDE 4

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne monosulfaatsool 25

442 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (0,739 mmol ainet

puhtusega 96%; valmistatud näites 1 toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 5 mL

segus H2O : ACN (1 : 1) ja lisati aeglaselt 1,45 mL 1 N väävelhapet, kontrollides

EE - EP1856050 B1 40

samal ajal pH väärtust. pH viidi väärtuseni ligikaudu pH = 3,3. Läbipaistev lahus

filtriti läbi 0,2 mikromeetriliste avadega filtri, külmutati ja lüofiliseeriti kuivaks, et

saada amorfne monosulfaatsool.

30,3 mg monosulfaatsoola lahustati 1,65 mL segus IPA : ACN (10 : 1).

Suspensiooni kuumutati viaali asetamisega 30 minutiks temperatuurini 60 °C 5

eelkuumutatud vesivanni. Tekkis viskoosne aine ja temperatuur tõsteti 30 minutiks

70 °C-ni. Kuna aine jäi viskoosseks, siis alandati temperatuuri 60 °C-ni ja segu

kuumutati täiendavalt üks tund. Kuumutamine lõpetati ja segul lasti jahtuda

toatemperatuurini. 4 päeva pärast näis aine olevat tahke ja proov jäeti seisma veel

üheksaks päevaks. Seejärel filtriti tahke aine ja kuivatati 1 tund vaakumpumba 10

kasutamisega, et saada lõppühend (23 mg, saagis 76%).

NÄIDE 5

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne monosulfaatsool

161 mg monosulfaatsoola (valmistatud näites 4 toodud kirjelduse kohaselt) 15

lahustati 8,77 mL segus IPA : ACN (10 : 1). Suspensiooni kuumutati viaali

asetamisega 1,5 tunniks temperatuurini 70 °C eelkuumutatud vesivanni. 5 minuti

jooksul moodustusid õlitilgad. Temperatuur alandati 60 °C-ni ja segu kuumutati

täiendavalt 1,5 tundi, seejärel kuumutati 40 minutit temperatuuril 50 °C, 40 minutit

temperatuuril 40 °C, seejärel 45 minutit temperatuuril 30 °C. Kuumutamine lõpetati 20

ja segul lasti aeglaselt jahtuda toatemperatuurini. Järgmisel päeval vaadeldi ainet

mikroskoobi all ja leiti nõela- ja plaadikujulisi kristalle. Seejärel kuumutati ainet 2

tundi temperatuuril 40 °C, 30 minutit temperatuuril 35 °C ja seejärel 30 minutit

temperatuuril 30 °C. Kuumutamine lõpetati ja segul lasti aeglaselt jahtuda

toatemperatuurini. Seejärel filtriti tahke aine ja kuivatati 1 tund vaakumpumba 25

kasutamisega, et saada lõppühend (117 mg, saagis 73%).

NÄIDE 6

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne dioksalaatsool

EE - EP1856050 B1 41

510 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (0,853 mmol ainet

puhtusega 96%; valmistatud näites 1 toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 5 mL

segus H2O : ACN (1 : 1) ja lisati aeglaselt 1,7 mL 1 M oksaalhappe vesilahust,

kontrollides samal ajal pH väärtust. pH viidi väärtuseni ligikaudu pH = 3,0. 5

Läbipaistev lahus filtriti läbi 0,2 mikromeetriliste avadega filtri, külmutati ja

lüofiliseeriti kuivaks, et saada amorfne dioksalaatsool.

31,5 mg dioksalaatsoola lahustati 2,76 mL segus 94% IPA / 6% H2O. Segu segati

2,5 tundi temperatuurini 60 °C eelkuumutatud vesivannil. 25 minuti pärast oli kogu

proov lahustunud. Kuumutamine lõpetati ja segul lasti jahtuda toatemperatuurini. 10

Järgmisel päeval oli olemas väike kogus viskoosset ainet. Viaal jahutati

temperatuuril 4 °C. 4 päeva pärast oli viskoosne aine veel olemas. Seejärel jäeti

viaal toatemperatuuril seisma ja seda vaadati kuu aja pärast. Aine näis olevat

tahke ja mikroskoobi all vaatlemisel kristalne. Seejärel filtriti tahke aine ja kuivatati

1 tund vaakumpumba kasutamisega, et saada lõppühend (20 mg, saagis 63,5%). 15

NÄIDE 7

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne dioksalaatsool

150 mg dioksalaatsoola (valmistatud näites 6 toodud kirjelduse kohaselt) lahustati

13,1 mL segus 94% IPA / 6% H2O. Segu segati 2,5 tundi temperatuurini 60 °C 20

eelkuumutatud vesivannil. Kuumutamine lõpetati ja segul lasti jahtuda

toatemperatuurini. Viaal jahutati temperatuuril 4 °C. 6 päeva ilmnes õlijas aine, mis

tundus viaali seintel olevat kristalne. Viaalil lasti soojeneda toatemperatuurini, siis

lisati idukristallid (näites 6 saadud kristalne aine) ja jäeti seisma 16 päevaks. Selle

aja jooksul sadenes lahusest rohkem kristalle. Seejärel filtriti tahke aine ja kuivatati 25

14 tundi vaakumpumba kasutamisega, et saada lõppühend (105 mg, saagis 70%).

NÄIDE 8

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne vaba alus (vorm I)

EE - EP1856050 B1 42

109 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (valmistatud näites 1

toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 0,56 mL segus H2O : ACN (1 : 1).

Suspensioon jäeti seisma viaalis (lõdvalt suletud korgiga), et aeglustada aurumist.

Viial viidi lämmastikuvoolu alla, kuid lämmastikku ei kasutatud aurumiseks, vaid 5

üksnes keskkonnana. 1 päeva pärast ilmnes sade, mis oli mikroskoobi all

vaadelduna kristalne. Seejärel viidi tahke aine kogu lahusti eemaldamiseks

kõrgvaakumi, et saada lõppühend. Kvantitatiivne saagis, puhtus 97,8% HPLC-

analüüsi andmetel.

Alternatiivse protseduuri korral, pärast lahustamist segus H2O : ACN (1 : 1) 10

(ligikaudu 350 mg/mL), hoiti viaali temperatuuril 5 °C ja sade ilmnes 2. päeval.

Tahke aine filtriti, loputati veega ja kuivatati öö läbi kõrgvaakumis. Saagis oli 55%,

tahke aine puhtus oli 98,2% ja vedela aine puhtus oli 92,8%.

NÄIDE 9

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-15

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne vaba alus (vorm I)

50,4 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (valmistatud näites 1

toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 0,144 mL segus H2O : ACN (1 : 1).

Suspensioon jäeti seisma viaalis (lõdvalt suletud korgiga), et aeglustada aurumist. 20

Viaali jahutati 6 päeva temperatuuril 4 °C. Sade ilmnes 2 päeva pärast. Tahke aine

filtriti ja viidi kogu lahusti eemaldamiseks kõrgvaakumi ning saadi lõppühend valge

tahke ainena (27,8 mg, saagis 55,2%).

NÄIDE 10

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-25

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne vaba alus (vorm I)

230 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (valmistatud näites 1

toodud kirjelduse kohaselt) lahustati nõrgal soojendamisel 0,2 mL segus

EE - EP1856050 B1 43

H2O : ACN (1 : 1). Segu kuumutati seejärel 2 tundi temperatuuril 70 °C vesivannil.

Kuumutamine lõpetati ja segul lasti jahtuda toatemperatuurini, seejärel jahutati 1

tund temperatuuril 4 °C. Seejärel lisati 50 µL vett (eraldus õli), seejärel aine

taaslahustamiseks 40 µL ACN. Toatemperatuuril aeglaselt segades lisati

idukristallid (näites 8 saadud kristalne aine). Hakkasid moodustuma kristallid ja 5

segu jäeti aeglasel segamisel seisma järgmise päevani. Järgmisel päeval tehti

kuumutus-jahutustsükkel (10 minutit temperatuuril 30 °C, 10 minutit temperatuuril

40 °C, seejärel 20 minutit temperatuuril 50 °C). Kuumutamine lülitati välja ja segu

jäeti aeglasel segamisel seisma järgmise päevani. Järgmisel päeval tehti teine

kuumutus-/jahutustsükkel (1 tund temperatuuril 60 °C, temperatuuril 70 °C ilmnes 10

lahustumine). Kuumutamine lülitati välja ja segu jäeti aeglasel segamisel seisma

järgmise päevani. Järgmisel päeval olid olemas kristallid ja tehti kolmas kuumutus-

jahutustsükkel (3 tundi temperatuuril 60 °C). Kuumutamine lülitati välja ja segu

jäeti aeglasel segamisel seisma järgmise päevani. Järgmisel päeval tehti

kuumutus-jahutustsükkel (3 tundi temperatuuril 60 °C, aeglane jahutamine, 15

seejärel 3 tundi temperatuuril 60 °C). Kuumutamine lülitati välja ja segu jäeti

aeglasel segamisel seisma järgmise päevani. Tahke aine filtriti 3 päeva pärast ja

viidi kogu lahusti eemaldamiseks kõrgvaakumi, et saada lõppühend.

NÄIDE 11

Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-20

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne vaba alus (vorm II)

70 mg bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-

üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrit (valmistatud näites 1

toodud kirjelduse kohaselt) lahustati 0,1 mL ACN-is. Pärast 0,3 mL MTBE lisamist

tekkis hägune lahus. Läbipaistva lahuse saamiseks lisati veel 50 µL ACN-i 25

(155 mg/mL ACN : MTBE = 1 : 2). Segu jäeti viaalis seisma ja suleti korgiga.

Järgmiseks päevaks ilmnesid kristallid. Tahke aine filtriti ja viidi kogu lahusti

eemaldamiseks kõrgvaakumi, et saada lõppühend.

NÄIDE 12

Pulber-röntgendifraktogramm 30

EE - EP1856050 B1 44

Pulber-röntgendifraktogrammid registreeriti Rigaku difraktomeetri abil Cu Kα

kiirguse lainepikkusel (30,0 kV, 15 mA). Analüüsiks kasutati pideva skaneerimise

režiimis töötavat goniomeetrit, skaneerimine sammuga 0,03º kiirusel 3º minutis

vahemikus 2 kuni 45º. Proovid valmistati ette kvartsis proovihoidikutes pulbrilise

aine õhukese kihi kujul. Seade kaliibriti metalse räni standardi abil. 5

Näite 2 difosfaatsoola proovi korral PXRD meetodil saadud röntgenogrammi põhjal

oli aine kristalne. Näite 3 kristalse difosfaatsoola proovi korral PXRD meetodil

saadud esinduslik röntgenogramm on kujutatud JOONISEL FIG 1. Näite 4

monosulfaatsoola proovi korral PXRD meetodil saadud röntgenogrammi alusel oli

aine kristalne. Näite 5 kristalse monosulfaatsoola proovi korral PXRD meetodil 10

saadud esinduslik röntgenogramm on kujutatud JOONISEL FIG 8. Näite 6

dioksalaatsoola proovi korral PXRD meetodil saadud röntgenogrammi alusel oli

aine kristalne. Näite 7 kristalse dioksalaatsoola proovi korral PXRD meetodil

saadud esinduslik röntgenogramm on kujutatud JOONISEL FIG 13. Näidete 8 ja 9

vaba aluse (vorm I) proovi korral PXRD meetodil saadud röntgenogrammi alusel 15

oli aine kristalne. Näite 10 vaba aluse (vorm I) proovi korral PXRD meetodil

saadud esinduslik röntgenogramm on kujutatud JOONISEL FIG 18. Näite 11 vaba

aluse (vorm II) proovi korral PXRD meetodil saadud esinduslik röntgenogramm on

kujutatud JOONISEL FIG 23.

NÄIDE 13 20

Termoanalüüs

Analüüs diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria (DSC) meetodil tehti seadme TA

Instruments Model Q-10 mooduliga, millel oli juhtseade Thermal Analyst. Andmete

kogumiseks ja analüüsimiseks kasutati tarkvara TA Instruments Thermal

Solutions. Täpse kaalutisega proovid massiga 1–4 mg paigutati kaanega 25

alumiiniumpannile. Proove uuriti lineaarse kuumutuskiiruse 10 °C/min tingimustes

vahemikus toatemperatuurist kuni ligikaudu 300 °C. DSC rakust puhuti mõõtmise

ajal läbi kuiva lämmastikku.

Näite 3 kristalse difosfaatsoola proovi korral ilmnes JOONISEL FIG 2 kujutatud

DSC meetodil saadud esinduslikust termogrammist, et on olemas kaks üleminekut 30

EE - EP1856050 B1 45

temperatuuridel ligikaudu 63,8 °C ja 154,3 °C. Need DSC meetodil saadud

termogrammid näitavad, et sellel kristalsel difosfaatsoolal on vastuvõetav termiline

stabiilsus, sulamisele vastav piik on ligikaudu 154,5 °C juures ja termiline

lagunemine puudub 150 °C madalamatel temperatuuridel. DSC meetodil saadud

termogrammid näitavad ka endotermilise soojusvoo ilmnemist alates 5

temperatuurist ligikaudu 135 °C.

Näite 4 monosulfaatsoola proovi korral ilmnes DSC meetodil saadud esinduslikust

termogrammist, et on olemas kaks üleminekut temperatuuridel ligikaudu 57 °C ja

73,2 °C. Näite 5 kristalse monosulfaatsoola proovi korral ilmnes JOONISEL FIG

10 kujutatud DSC meetodil saadud esinduslikust termogrammist, et on olemas 10

üleminek temperatuuril 76 °C ja mis näitab, et selle kristalse monosulfaatsoola

korral on sulamisele vastav maksimum ligikaudu 76,5 °C juures.

Näite 6 kristalse dioksalaatsoola proovi korral ilmnes DSC meetodil saadud

esinduslikust termogrammist, et on olemas kaks üleminekut temperatuuridel

ligikaudu 69,2 °C ja 122,8 °C. Näite 7 kristalse dioksalaatsoola proovi korral ilmnes 15

JOONISEL FIG 15 kujutatud DSC meetodil saadud esinduslikust termogrammist,

et on olemas üleminek temperatuuril 73 °C. See DSC meetodil saadud

termogramm näitab, et selle kristalse dioksalaatsoola korral on sulamisele vastav

piik ligikaudu 73,7 °C juures.

Näite 8 kristalse vaba aluse (vorm I) proovi korral ilmnes DSC meetodil saadud 20

esinduslikust termogrammist, et on olemas üleminek temperatuuril 90,4 °C. Näite

9 kristalse vaba aluse (vorm I) proovi korral ilmnes DSC meetodil saadud

esinduslikust termogrammist kaks üleminekut temperatuuridel 86,1 °C ja 103,6 °C.

Näite 10 kristalse vaba aluse (vorm I) proovi korral ilmnes JOONISEL FIG 19

kujutatud DSC meetodil saadud esinduslikust termogrammist, et suletud panni 25

korral on olemas kaks üleminekut (temperatuuridel 83,9 °C ja 102,1 °C), kuid

lahtise panni korral üks üleminek temperatuuril 102,5 °C (varasem piik on tingitud

veest ja/või lahustitest). See DSC meetodil saadud termogramm näitab, et sellel

kristalsel vabal alusel on suurepärane termiline stabiilsus, sulamisele vastav

maksimum on ligikaudu 102,7 °C juures ja termiline lagunemine puudub 80 °C 30

madalamatel temperatuuridel. DSC meetodil saadud termogrammid näitavad ka

endotermilise soojusvoo ilmnemist alates temperatuurist ligikaudu 90 °C.

EE - EP1856050 B1 46

JOONISEL FIG 24 kujutatud DSC meetodil saadud esinduslikust termogrammist

ilmneb, et näite 11 kristalse vaba aluse (vorm II) korral on üleminek temperatuuril

98,6 °C, mis näitab, et sellel kristalsel vabal alusel on suurepärane termiline

stabiilsus, sulamisele vastav maksimum on ligikaudu ja termiline lagunemine

puudub 75 °C madalamatel temperatuuridel. DSC meetodil saadud termogrammid 5

näitavad ka endotermilise soojusvoo ilmnemist alates temperatuurist ligikaudu

75 °C.

Termogravimeetriline analüüs (TGA) tehti seadme TA Instruments Model Q-50

mooduliga, mis võimaldas kõrglahutust. Andmete kogumiseks ja analüüsimiseks

kasutati tarkvara TA Instruments Thermal Solutions. Proov massiga ligikaudu 10

10 mg paigutati plaatinapannile ja skaneeriti kõrglahutust võimaldava

kuumutuskiirusega vahemikus toatemperatuurist kuni 300 °C. Kaalu- ja

ahjukambrist puhuti mõõtmiste käigus läbi lämmastikku.

Näite 3 kristalse difosfaatsoola korral ilmneb JOONISEL FIG 3 kujutatud TGA

meetodil saadud esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (8,2%) eraldumine 15

155 °C madalamatel temperatuuridel.

Näite 4 kristalse monosulfaatsoola korral ilmneb JOONISEL FIG 4 kujutatud TGA

meetodil saadud esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (12,6%) eraldumine

116 °C madalamatel temperatuuridel. Näite 5 kristalse monosulfaatsoola korral

ilmneb JOONISEL FIG 9 kujutatud TGA meetodil saadud esinduslikust tulemusest 20

lahustite ja/või vee (13,7%) eraldumine 150 °C madalamatel temperatuuridel.

Näite 6 kristalse dioksalaatsoola korral ilmneb JOONISEL FIG 4 kujutatud TGA

meetodil saadud esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (15,4 %) eraldumine

125 °C madalamatel temperatuuridel. Näite 7 kristalse dioksalaatsoola korral

JOONISEL FIG 14 kujutatud TGA meetodil saadud esinduslikust tulemusest 25

ilmneb lahustite ja/või vee (12,7 %) eraldumine 125 °C madalamatel

temperatuuridel.

Näite 8 kristalse vaba aluse (vorm I) korral ilmneb TGA meetodil saadud

esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (7,3 %) eraldumine 75 °C

madalamatel temperatuuridel. Näite 9 kristalse vaba aluse (vorm I) korral ilmneb 30

EE - EP1856050 B1 47

TGA meetodil saadud esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (5,2 %)

eraldumine 70 °C madalamatel temperatuuridel. Näite 10 kristalse vaba aluse

(vorm I) korral ilmneb JOONISEL FIG 20 kujutatud TGA meetodil saadud

esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (3,8%) eraldumine 98 °C madalamatel

temperatuuridel. 5

Näite 11 kristalse vaba aluse (vorm II) korral ilmneb JOONISEL FIG 25 kujutatud

TGA meetodil saadud esinduslikust tulemusest lahustite ja/või vee (3,0 %)

eraldumine 98 °C madalamatel temperatuuridel.

Need TGA meetodil saadud tulemused näitavad, et leiutisekohased kristalsed

ühendid kaotavad oma massist väikese osa temperatuuride vahemikus 10

toatemperatuurist kuni mõõdukalt kõrgemate temperatuurideni (näiteks 75–

150 °C), mis vastab jääkniiskuse või lahusti eraldumisele.

NÄIDE 14

Niiskuse dünaamilise sorptsiooni määramine

Niiskuse dünaamilise sorptsiooni (DMS) määramine (tuntud ka kui niiskuse 15

sorptsiooni-desorptsiooni profiil) tehti VTI õhus kasutatavate mikrokaalude SGA-

100 system (VTI Corp., Hialeah, FL 33016) abil. Kasutati proovi massiga ligikaudu

10 mg ja analüüsi alguses vastas niiskusesisaldus keskkonna niiskusesisaldusele.

Tüüpiline DMS analüüs koosnes kolmest skaneerimisest: vahemikus keskkonna

niiskusesisaldus kuni suhtelise niiskuseni (RH) 2%, vahemikus 2% RH kuni 90% 20

RH, 90% RH kuni 5% RH, laotuskiirusega 5% RH/samm. Mass määrati iga kahe

minuti järel ja RH muudeti järgmise väärtuseni (+/- 5% RH) siis, kui proovi mass oli

konstantne täpsusega 0,01% 5 järjestikulise punkti korral.

Näite 3 kristalse difosfaatsoola korral JOONISEL FIG 4 kujutatud DMS meetodil

saadud esinduslikust tulemusest ilmneb, et on olemas väikese hügroskoopsusega 25

pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil, millele vastab massi suurenemine 3,3%

siis, kui proov on keskkonnas 2–90% RH ja massi suurenemine 0,6% siis, kui

proov on keskkonnas 40–75% RH.

EE - EP1856050 B1 48

Näite 5 kristalse monosulfaatsoola korral JOONISEL FIG 11 kujutatud DMS

meetodil saadud esinduslikust tulemusest ilmneb, et on olemas väikese

hügroskoopsusega pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil, millele vastab massi

suurenemine 10% siis, kui proov on keskkonnas 2–90% RH ja massi suurenemine

1,8% siis, kui proov on keskkonnas 40–75% RH. 5

Näite 7 kristalse dioksalaatsoola korral JOONISEL FIG 16 kujutatud DMS meetodil

saadud esinduslikust tulemusest ilmneb, et on olemas väikese hügroskoopsusega

pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil, millele vastab massi suurenemine 5,3%

siis, kui proov on keskkonnas 2–90% RH ja massi suurenemine 1,1% siis, kui

proov on keskkonnas 40–75% RH. 10

Näite 10 kristalse vaba aluse (vorm I) korral JOONISEL FIG 21 kujutatud DMS

meetodil saadud esinduslikust tulemusest ilmneb, et on olemas väikese

hügroskoopsusega pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil, millele vastab massi

suurenemine 10% siis, kui proov on keskkonnas 2–90% RH ja massi suurenemine

1,2% siis, kui proov on keskkonnas 40–75% RH. 15

Näite 11 kristalse vaba aluse (vorm II) korral JOONISEL FIG 26 kujutatud DMS

meetodil saadud esinduslikust tulemusest ilmneb, et on olemas väikese

hügroskoopsusega pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil, millele vastab massi

suurenemine 9% siis, kui proov on keskkonnas 2–90% RH ja massi suurenemine

1,3% siis, kui proov on keskkonnas 40–75% RH. 20

Need DMS meetodil saadud tulemused näitavad, et leiutisekohastel kristalsetel

ühenditel on väikese hügroskoopsusega pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil.

Niiskusesisalduse laias vahemikus on kristalsetel ühenditel vastuvõetav massi

suurenemine. Niiskuse pöörduv sorptsiooni-desorptsiooniprofiil näitab, et

leiutisekohased kristalsed ühendid on vastuvõetava hügroskoopsusega ja need ei 25

valgu laiali.

NÄIDE 15

Tahke faasi stabiilsuse määramine

EE - EP1856050 B1 49

Näite 3 kristalse difosfaatsoola proove, kõik massiga 1–2 mg, hoiti paljudes 3 mL

mahuga boorsilikaatklaasist viaalides temperatuuril –20 °C (suletud mahuti) ja

tingimustes 40 °C/75% (avatud ja suletud mahuti). Kindlate ajavahemike järel

analüüsiti vastava viaali sisu järgmise HPLC meetodi kohaselt:

kolonn: Xterra Ms C18, 4.6 x 250 mm, 5 µm (osa nr 186000494); liikuv faas A: 5

0,1 M NH4Ac, pH 7,0; liikuv faas B: 100% ACN; voolutuskiirus: 1 mL/min; süstitav

ruumala: 10 µL; detektor: 240 nm; gradient - aeg minutites (liikuva faasi

protsendiline sisaldus): 0,0 (8); 5,00 (28); 22,00 (42); 30,00 (100); 35,00 (100);

35,10 (8) ja 45,00 (8). Proovid valmistati ette varulahustena kontsentratsiooniga

0,5 mg/mL tavalises 10 nM tsitraatpuhvriga puhverdatud soolalahuses, pH 5. 10

Näite 3 kristalse difosfaatsoola korral oli proovide esialgne puhtus 98,3%,

vastavalt HPLC meetodil määratud pindala väärtusele protsentides. Pärast kuus

nädalat kestnud hoidmist ei ilmnenud kõikides tingimustes hoitud proovide korral

mingeid kindlakstehtavaid muutusi keemilises puhtuses, täheldatavaid muutusi

aine välimuses ning DSC ja TGA meetodil tehtud analüüs ei näidanud mingeid 15

kindlakstehtavaid erinevusi.

NÄIDE 16

Elementanalüüs

Leiutisekohaste kristalsete ühendite proovides määrati järgmiste elementide

protsendiline sisaldus põletusmeetodil seadme Flash EA 1112 Elemental Analyzer 20

(CE Elantech, Lakewood, NJ) abil.

Näite 5 kristalne monosulfaatsool: süsinik 52,88%, vesinik 7,10%, lämmastik

8,81%, hapnik 27,17% ja väävel 4,03% (oodatav); süsinik 52,11%, vesinik 6,90%,

lämmastik 8,42%, hapnik 24,94% ja väävel 4,06% (tulemused).

Näite 7 kristalne dioksalaatsool: süsinik 54,54 %, vesinik 6,57 %, lämmastik 8,15 25

% ja hapnik 30,74 % (oodatav); süsinik 56,33 %, vesinik 6,90%, lämmastik 8,22 %

ja hapnik 26,32 % (tulemused).

EE - EP1856050 B1 50

NÄIDE 17

Mikroniseerimine

Näite 3 kristalse difosfaatsoola 13 g proov mikroniseeriti jugaveskis, et saada 8,7 g

vabalt voolavat valget pulbrit, mille korral ilmnes mikroskoopilisel uurimisel

kaksikmurdumine (saagis 67%). Enne mikroniseerimist oli kristalse difosfaadi 5

esialgne puhtus 98,1%, mis määrati HPLC meetodil määratud pindala

protsendilise väärtuse alusel. Mikroniseeritud aine puhtus oli sama. Enne

mikroniseerimist oli aines vee sisaldus 6,54 massiprotsenti, mikroniseeritud aine

veesisaldus oli 6,23 massiprotsenti.

Mikroniseerimisprotsessi jooksul ei ilmnenud mingeid probleeme. Osakeste 10

granulomeetriline jaotus oli järgmine:

Enne

mikroniseerimist

Pärast

mikroniseerimist

D (v, 0,9) 38,6 µm 5,2 µm

D (v, 0,5) 9,9 µm 2,2 µm

D (v, 0,1) 1,7 µm 0,4 µm

Pulber-röntgendifraktogrammidel ei täheldatud märkimisväärseid muutusi.

Mikroniseeritud aine TGA, DSC, DMS meetoditel saadud andmed, keemiline

puhtus, kiraalne puhtus ja niiskusesisaldus olid võrreldavad mikroniseerimata aine

korral saadud väärtustega. Näiteks, nagu märgitud näites 14, ilmnes näites 3 15

saadud kristalse difosfaatsoola proovi jaoks DMS meetodil saadud esindusliku

tulemuse korral massi juurdekasv 0,6% niiskusesisalduse vahemikus 40–75% RH,

samas niiskusesisalduse vahemikus oli mikroniseerimata aine massi juurdekasv

0,7%.

NÄIDE 18 20

Inhaleerimislahuse stabiilsus

Lahus valmistati vaba aluse ekvivalendi (kasutades näite 3 põhjal valmistatud

kristalset difosfaatsoola lahustamisel kontsentratsioonis) 0,5 mg/mL 10 mM

tsitraatpuhverdatud tavalises soolalahuses pH 5 juures. Kristalse soola lahustuvus

EE - EP1856050 B1 51

puhvris oli vaba aluse ekvivalentides üle 40 mg/mL. Pärast üht kuud kestnud

hoidmist tingimustes 40 °C / 75% RH täheldati lagunemist alla 0,5%.

ANALÜÜS 1

Radioligandi seostumise analüüs Muskariiniretseptori alamtüüpe hM1, hM2, hM3 ja

hM4 ekspresseerivatest rakkudest pärinevad membraanpreparaadid 5

CHO rakuliine, mis ekspresseerisid vastavalt stabiilselt inimese kloonitud

muskariiniretseptori alamtüüpe hM1, hM2, hM3 ja hM4, kasvatati peaaegu

laatumiseni HAM F-12 söötmes, mida oli täiendatud 10% FBS-i ja 250 µg/mL

genetitsiiniga. Rakke kasvatati inkubaatori 5% CO2 keskkonnas temperatuuril

37 °C ja need vabastati 2 mM EDTA-ga dPBS-is. Rakud koguti 5 minutit kestva 10

tsentrifuugimisega 650 x g juures ja rakupelleteid hoiti kas külmutatuna

temperatuuril –80 °C või neist valmistati kohe membraanpreparaadid.

Membraanpreparaatide saamiseks resuspendeeriti rakud lüüsimispuhvris ja

homogeniseeriti koepurustiga Polytron PT-2100 (Kinematica AG, 20 sekundit x 2

impulssi). Puhastamata membraane tsentrifuugiti 40 000 x g juures 15 minutit 15

temperatuuril 4 °C. Seejärel resuspendeeriti membraanipellet puhvris ja

homogeniseeriti uuesti koepurustiga Polytron. Valgu kontsentratsioon

membraansuspensioonis määrati töös Lowry, O. jt, Journal of Biochemistry

193:265 (1951) kirjeldatud meetodil. Kõiki membraane hoiti külmutatuna

alikvootideks temperatuuril –80 °C või kasutati kohe. Valmistatud hM5 retseptori 20

membraanide alikvoodid osteti otse ettevõttest Perkin Elmer ja neid hoiti kuni

kasutamiseni temperatuuril –80 °C.

Radioligandi seostumise analüüs muskariiniretseptori alamtüüpidel hM1, hM2, hM3.

hM4 ja hM5

Radioligandi seostumise analüüs viidi läbi 96-süvendilistel mikrotiiterplaatidel, 25

analüüsiks kasutatav kogumaht oli 100 µL. CHO rakkude membraane, mis

ekspresseerisid stabiilselt muskariinset alamtüüpi hM1, hM2, hM3, hM4 või hM5,

lahjendati määramispuhvris sihtvalgu järgmiste konkreetsete kontsentratsioonideni

(µg/süvendis): hM1 korral 10 µg, hM2 korral 10−15 µg, hM3 korral 10−20 µg, hM4

korral 10−20 µg ja hM5 korral 10−12 µg. Membraane homogeniseeriti enne 30

EE - EP1856050 B1 52

analüüsiplaadile lisamist lühikest aega (10 sekundit) koepurustiga Polytron.

Radioligandi KD väärtuse määramiseks viidi läbi küllastuseostumise uuring L-[N-

metüül-3H]skopolamiinmetüülkloriidi ([3H]-NMS) (TRK666, 84,0 Ci/mmol,

Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglismaa) kasutamisega

kontsentratsioonide vahemikus 0,001 nM kuni 20 nM. Uuritavate ühendite Ki 5

väärtuste määramiseks vajalik väljatõrjumisanalüüs viidi läbi [3H]-NMS

kontsentratsioonil 1 nM ja uuritavate ühendite üheteistkümnel erineval

kontsentratsioonil. Uuritavad ühendid lahustati esialgu lahjenduspuhvris

kontsentratsioonis 400 µM ja lahjendati seejärel lahjenduspuhvriga seeriateks

lõppkontsentratsioonide vahemikus 10 pM kuni 100 µM. Analüüsiplaatidele 10

lisamise järjekord ja lisatavad mahud olid järgmised: 25 µL radioligandi, 25 µL

lahjendatud uuritavat ühendit ja 50 µL membraane. Analüüsiplaate inkubeeriti 60

minutit temperatuuril 37 °C. Seostumisreaktsioonid määrati kiirfiltrimisega läbi 1%

BSA-ga eeltöödeldud GF/B klaaskiudfilterplaatide (PerkinElmer Inc., Wellesley,

MA). Filterplaate loputati seostumata radioaktiivse ühendi eemaldamiseks kolm 15

korda pesemispuhvriga (10 mM HEPES). Seejärel kuivatati plaadid õhu käes ja

igasse süvendisse lisati 50 µL stsintillatsioonivedelikku Micoscint-20 (PerkinElmer

Inc., Wellesley, MA). Plaate loendati vedelikstsintillatsiooniloenduriga PerkinElmer

Topcount (PerkinElmer Inc., Wellesley, MA). Seostumisandmeid analüüsiti

mittelineaarse regressioonanalüüsi meetodil tarkvarapaketi GraphPad Prism 20

(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) abil, kasutati ühesaidilise konkurentsi

mudelit. Ki väärtused uuritavate ühendite jaoks arvutati saadud IC50 väärtustest ja

KD väärtus radioligandi jaoks saadi Chengi-Prusoffi võrrandi abil (Cheng Y; Prusoff

W. H. Biochemical Pharmacology 22 (23):3099−108 (1973)). Ki väärtused

teisendati pKi väärtusteks, et määrata geomeetrilist keskmist ja 95% 25

usaldusvahemikku. Andmete esitamiseks teisendati need summaarsed statistilised

väärtused uuesti Ki väärtusteks.

Selles analüüsis saadud väiksem Ki väärtus näitab, et uuritaval ühendil on katses

kasutatava retseptoriga seostumisel suurem afiinsus. Selle või analoogilise

analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on Ki väärtus muskariiniretseptori 30

alamtüübi M3 korral väiksem kui 5 nM.

ANALÜÜS 2

EE - EP1856050 B1 53

Muskariinse retseptori funktsionaalse efektiivsuse analüüsid Agonisti poolt

vahendatud cAMP akumuleerimise inhibeerimise blokaad

Selles analüüsis määrati uuritava ühendi funktsionaalne efektiivsus uuritava

ühendi võimena blokeerida hM2 retseptorit ekspresseerivates CHO-K1 rakkudes

forskoliiniga vahendatud cAMP akumuleerimise inhibeerimist oksotremoriini poolt. 5

cAMP määramine viidi läbi radioimmunoanalüüsi meetodil, milleks kasutati

adenüültsüklaasi aktiveerimise komplekti koos 125I-cAMP-iga (NEN SMP004B,

PerkinElmer Life Sciences Inc., Boston, MA) tootja juhendi kohaselt.

Rakke loputati üks kord dPBS-iga ja vabastati trüpsiin-EDTA lahusega (0,05%

trüpsiini / 0,53 mM EDTA) vastavalt eespool toodud lõigus rakukultuuride ja 10

membraanpreparaatide kohta toodud kirjeldusele. Eraldatud rakke pesti kaks

korda tsentrifuugimisega viis minuti 650 x g juures 50 mL dPBS-is. Seejärel

resuspendeeriti rakupellet 10 mL dPBS-is ja rakud loendati seadmega Coulter Z1

Dual Particle Counter (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Rakke tsentrifuugiti uuesti

viis minutit 650 x g juures ja resuspendeeriti stimuleerimispuhvris analüüsil 15

kasutatava kontsentratsioonideni vahemikus 1,6 x 106–2,8 x 106 rakku/mL. Uuritav

ühend lahustati esialgu lahjenduspuhvris (dPBS, mida oli täiendatud 1 mg/mL

BSA-ga (0,1%)) kontsentratsioonis 400 µM ja lahjendati seejärel

lahjenduspuhvriga seeriateni, mille molaarne kontsentratsioon oli vahemikus

100 µM kuni 0,1 nM. Oksotremoriini lahjendati analoogilisel viisil. 20

AC aktiivsuse inhibeerimise määramiseks oksotremoriini poolt lisati agonisti

analüüsisüvenditesse 25 µL forskoliini (lõppkontsentratsioon 25 µM lahjendatuna

dPBS-is), 25 µL lahjendatud oksotremoriini ja 50 µL rakke. Uuritava ühendi võime

määramiseks blokeerida oksotremoriini poolt inhibeeritud AC aktiivsust lisati

ülejäänud analüüsisüvenditesse 25 µL forskoliini ja oksotremoriini 25

(lõppkontsentratsioonid vastavalt 25 µM ja 5 µM, lahjendatuna dPBS-is), 25 µL

lahjendatud uuritavat ühendit ja 50 µL rakke.

Reaktsioonisegusid inkubeeriti 10 minutit temperatuuril 37 °C ja reaktsioon peatati

100 µL jääkülma määramispuhvri lisamisega. Plaadid suleti hermeetiliselt,

inkubeeriti öö läbi toatemperatuuril ka loendati järgmisel hommikul 30

EE - EP1856050 B1 54

vedelikstsintillatsioonloenduriga PerkinElmer TopCount (PerkinElmer Inc.,

Wellesley, MA). Tekkinud cAMP kogus (pmol/süvend) arvutati proovide ja cAMP

standardi korral saadud loendatud impulsside arvu alusel kasutusjuhendis toodud

tootjapoolse kirjelduse kohaselt. Andmeid analüüsiti mittelineaarse

regressioonanalüüsi meetodil tarkvarapaketi GraphPad Prism (GraphPad 5

Software, Inc., San Diego, CA) abil, kasutati mittelineaarse regressioon võrrandit

ühesaidilise konkurentsi jaoks. Ki arvutamiseks kasutati Chengi-Prusoffi võrrandit,

milles kasutati KD ja [L] jaoks vastavalt oksotremoriini kontsentratsiooni ja efekti

suhet iseloomustavast kõverast saadud EC50 ja analüüsis kasutatud oksotremoriini

kontsentratsiooni. Ki väärtused teisendati pKi väärtusteks, et määrata geomeetrilist 10

keskmist ja 95% usaldusvahemikku. Andmete esitamiseks teisendati need

summaarsed statistilised väärtused uuesti Ki väärtusteks.

Selles analüüsis saadud väiksem Ki väärtus näitab, et uuritaval ühendil on katses

kasutatava retseptoriga seostumisel suurem funktsionaalne aktiivsus. Selle või

analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on Ki väärtus väiksem 15

kui 5 nM hM2 retseptorit ekspresseerivates CHO-K1 rakkudes forskoliiniga

vahendatud cAMP akumuleerimise inhibeerimisel oksotremoriini poolt.

Agonisti poolt vahendatud [35S]GTPγS-i seondumise blokeerimine

Teises funktsionaalses analüüsis saab määrata uuritavate ühendite

funktsionaalset võimet blokeerida hM2 retseptorit ekspresseerivates CHO-K1 20

rakkudes oksotremoriiniga stimuleeritud [35S]GTPγS-i seostumist.

Kasutamise ajaks sulatati külmutatud membraanid üles ja lahjendati seejärel

määramispuhvriga sihtkoe lõppkontsentratsioonini 5–10 µg valku süvendis.

Membraane homogeniseeriti lühikest aega koepurusti Polytron PT-2100 abil ja

lisati seejärel analüüsiplaatidele. Igas katses määrati EC90 väärtused 25

(maksimaalsest 90% reaktsiooni saamiseks vajalik efektiivne kontsentratsioon),

mis olid vajalikud [35S]GTPγS-i seostumise stimuleerimiseks agonisti

oksotremoriini poolt.

Uuritava ühendi võime määramiseks inhibeerida oksotremoriini poolt stimuleeritud

[35S]GTPγS-i seostumist lisati 96-süvendilise plaadi kõikidesse süvenditesse 30

EE - EP1856050 B1 55

järgmist: 25 µL määramispuhvrit koos [35S]GTPγS-iga (0,4 nM), 25 µL

oksotremoriini (EC90) ja GDP (3 µM), 25 µL lahjendatud uuritavat ühendit ja25 µL

CHO rakke, mis ekspresseerivad hM2 retseptorit. Seejärel inkubeeriti

analüüsiplaate 60 minutit temperatuuril 37 °C. Seejärel filtriti analüüsplaadi

PerkinElmeri 96-süvendilise rakkude kogumisseadme abil läbi 1% BSA-ga 5

eeltöödeldud GF/B filtrite. Plaate loputati 3 x 3 sekundit jääkülma pesemispuhvriga

ja kuivatati seejärel õhu käes või vaakumis. Igasse süvendisse lisati

stsintillatsioonivedelikku Microscint-20 (50 µL) ja kõik plaadid suleti hermeetiliselt

ja radioaktiivsus määrati loenduriga (PerkinElmer). Andmeid analüüsiti

mittelineaarse regressioonanalüüsi meetodil tarkvarapaketi GraphPad Prism 10

(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) abil, kasutati mittelineaarse

regressioon võrrandit ühesaidilise konkurentsi jaoks. Ki arvutamiseks kasutati

Chengi-Prusoffi võrrandit, milles kasutati KD ja [L], ligandi kontsentratsiooni jaoks

vastavalt uuritava ühendi kontsentratsiooni ja efekti suhet iseloomustavast

kõverast saadud IC50 väärtusi ja analüüsis kasutatud oksotremoriini 15

kontsentratsiooni.

Selles analüüsis saadud väiksem Ki väärtus näitab, et uuritaval ühendil on katses

kasutatava retseptoriga seostumisel suurem funktsionaalne aktiivsus. Selle või

analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on Ki väärtus väiksem

kui 5 nM hM2 retseptorit ekspresseerivates CHO-K1 rakkudes oksotremoriini poolt 20

stimuleeritud [35S]GTpγS-i seostumise blokeerimisel.

Agonisti poolt vahendatud kaltsiumi vabanemise blokeerimine FLIPR-analüüs

Muskariiniretseptori alamtüübid (M1, M3 ja M5 retseptorid), mis seostuvad Gq-

valkudega, aktiveerivad fosfolipaasi C (PLC) reaktsiooniraja agonisti seostumisel

retseptoriga. Selle tulemusena hüdrolüüsib aktiveeritud PLC 25

fosfatüülinositooldifosfaadi (PIP2) diatsetüülglütserooliks (DAG) ja fosfatidüül-

1,4,5-trifosfaadiks (IP3), mis omakorda genereerib kaltsiumi vabanemise

intratsellulaarsetest varudest, see tähendab endoplasmalisest ja

sarkoplasmalisest retiikulumist. FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)

analüüsis määratakse kaltsiumi intratsellulaarse sisalduse suurenemine kaltsium-30

tundliku värvaine (Fluo-4AM, Molecular Probes, Eugene, OR) abil, mis

fluorestseerub vabade kaltsiumiioonide seondumisel. Seda fluorestsentsi

EE - EP1856050 B1 56

määratakse reaalajas seadmega FLIPR, mis tuvastab muutuse inimese M1 ja M3

ning šimpansi M5 retseptoritega kloonitud rakkude monokihist pärinevas

fluorestsentsis. Antagonisti efektiivsust saab määrata antagonistide võimega

inhibeerida agonisti poolt vahendatud intratsellulaarse kaltsiumisisalduse

suurenemist. 5

Selleks, et määrata FLIPR-i abil kaltsiumisisalduse stimuleerimist, külvati hM1, hM3

ja cM5 retseptoreid stabiilselt ekspresseerivad CHO rakud 96-süvendilistesse

FLIPR plaatidele ööl enne määramise tegemist. Külvatud rakke pesti kasvusöötme

eemaldamiseks kaks korda vedelikuga Cellwash MTX Lab-systems, Inc.) koos

FLIPR puhvriga (10 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM kaltsiumkloriid, 2,5 mM 10

probenetsiid HBSS-is ilma kaltsiumi- ja magneesiumiioonideta) ja süvenditesse

jäeti FLIPR puhver koguses 50 µL/süvend. Seejärel inkubeeriti rakke 40 minutit

50 µL/süvend 4 µM FLUO-4AM (valmistati 2X lahus) tingimustes temperatuur

37 °C, 5% süsinikdioksiid. Pärast värvaine inkubeerimisperioodi pesti rakke kaks

korda FLIPR-puhvriga, jättes süvendisse lõppruumalana 50 µL/süvend. 15

Antagonisti efektiivsuse määramiseks määrati esmalt annusest sõltuv Ca2+

intratsellulaarse vabanemise stimuleerimine oksotremoriini poolt, mis võimaldab

hiljem määrata antagonisti efektiivsust oksotremoriini stimuleerimise EC90

väärtusele vastaval kontsentratsioonil. Esmalt inkubeeriti rakke 20 minuti ühendit

sisaldavas lahjenduspuhvris, seejärel lisati agonist, milleks kasutati seadet FLIPR. 20

EC90 väärtus oksotremoriini jaoks saadi vastavalt meetodile, mida on

üksikasjalikult kirjeldatud allpool FLIPR meetodit ja andmetöötlust käsitlevas osas,

valemi ECF = ((F/100-F)^1/H)*EC50 abil. Stimuleerimisplaatidel valmistati

oksotremoriini kontsentratsioon 3 x ECF nii, et antagonisti inhibeerimisplaatide

igasse süvendisse lisati oksotremoriini kontsentratsioonis EC90. 25

FLIPR analüüsis kasutatavad parameetrid olid: kokkupuuteaeg 0,4 sekundit,

laserikiirguse võimsus 0,5 vatti, ergastav lainepikkus 488 nm ja emissioonile

vastav lainepikkus 550 nm. Fooni kõver määrati fluorestsentsi muutumise

mõõtmisega 10 sekundit enne agonisti lisamist. Pärast agonisti stimuleerimist

määrati seadmega FLIPR pidevalt fluorestsentsi muutus 1,5 minuti jooksul 30

intervalliga 0,5 kuni 1 sekund, et kindlaks teha fluorestsentsi maksimaalset

muutmust.

EE - EP1856050 B1 57

Fluorestsentsi muutus avaldati iga süvendi kohta maksimaalse fluorestsentsi ja

foonikõvera vahena. Saadud andmeid analüüsiti ravimi kontsentratsiooni logaritmi

teljestikus mittelineaarse regressioonanalüüsi meetodil tarkavara GraphPad Prism

(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) abil, kasutades olemasolevat mudelit

sigmoidse annuse-efekti suhte jaoks. Antagonisti Ki väärtused määrati tarkvara 5

Prism abil, kasutades KD jaoks oksotremoriini EC50 väärtust ja ligandi

kontsentratsiooni jaoks oksotremoriini EC90 väärtust vastavalt Chengi-Prusoffi

võrrandile (Cheng ja Prusoff, 1973).

Selles analüüsis saadud väiksem Ki väärtus näitab, et uuritaval ühendil on katses

kasutatava retseptoriga seostumisel suurem funktsionaalne aktiivsus. Selle või 10

analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on Ki väärtus väiksem

kui 5 nM hM3 retseptorit stabiilselt ekspresseerivates CHO rakkudes agonisti poolt

vahendatud kaltsiumiiooni vabanemise blokeerimisel.

ANALÜÜS 3

Kopsude kaitse kestuse määramine meriseamudeli korral atsetüülkoliini poolt 15

indutseeritud bronhokonstriktsiooni korral.

Seda in vivo analüüsi kasutati muskariiniretseptori suhtes antagonistlikku toimet

omavate uuritavate ühendite bronhe kaitsva toime hindamiseks. Kuuest isasest

meriseast Duncan-Hartley (HsdPoc:DH) Harlan, Madison, WI) massiga vahemikus

250 kuni 350 g koosnevad rühmad tähistati eraldi puuril olevate kaartidega. Kogu 20

uuringu ajal oli loomadel ad libitum juurdepääs toidule ja veele.

Uuritavaid ühendeid manustati inhaleerimisel 10 minuti jooksul kogu keha

mahutavas annustamiskambris (R&S Molds, San Carlos, CA). Annustamiskambrid

paiknesid selliselt, et aerosool juhiti tsentraalsest torutikust samaaegselt 6 eraldi

kambrisse. Merisead allutati testitava ühendi vehiikuli (WFI) aerosooli või toimele. 25

Need aerosoolid genereeriti vesilahustest seadme LC Star Nebulizer Set (Model

22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, VA) abil, kasutades rõhul 22

psi olevat gaaside segu (CO2 = 5%, O2 21% ja N2 = 74%). Gaasi juhiti sellel

töörõhul läbi nebulisaatori kiirusega ligikaudu 3 L/minut. Genereeritud aerosoolid

juhiti kambritesse ülerõhu all. Lahusest saadud aerosoolide manustamisel ei 30

EE - EP1856050 B1 58

kasutatud lahjendamiseks õhku. 10 minutit kestva nebuliseerimise ajal

nebuliseerub ligikaudu 1,8 mL lahust. See määratakse täidetud nebulisaatori

masside võrdlemisel gravimeetrilisel meetodil enne ja pärast nebuliseerimist.

Inhaleerimisega manustatud uuritavate ühendite bronhe kaitsvat toimet hinnati

kogu keha mahu pletüsmograafilise määramisega 1,5, 24, 48 ja 72 tundi pärast 5

annustamist.

Nelikümmend viis minutit enne pulmonaalfunktiooni hindamist anesteseeriti kõik

merisead ketamiini (43,75 mg/kg), ksülasiini (3,50 mg/kg) ja atsepromasiini

(1,05 mg/kg) intramuskulaarse süstimise abil. Pärast seda eemaldati

operatsioonikohast karvad ja see puhastati 70% alkoholiga ning tehti kaela 10

ventraalkülje keskjoonel 2–3 cm pikkune sisselõige. Seejärel isoleeriti kägiveen ja

see kannüleeriti soolalahusega täidetud polüetüleenkateetriga (PE-50, Becton

Dickinson, Sparks, MD), et võimaldada soolalahuses oleva ACh (Sigma-Aldrich,

St. Louis, MO) intravenoosset infusiooni. Seejärel lõigati lahti hingetoru ja

kannüleeriti 14G teflontoruga (#NE- 014, Small Parts, Miami Lakes, FL). Vajadusel 15

säilitati tuimastus ülalmainitud anesteseeriva segu täiendava intramuskulaarse

süstimisega. Tuimastuse sügavust jälgiti ja seda reguleeriti juhul, kui loom

reageeris käpa näpistamisele või kui hingamissagedus ületas 100 hingamistsüklit

minutis.

Kui kannüleerimine oli lõppenud, siis paigutati loom pletüsmograafi (#PLY3114, 20

Buxco Electronics, Inc., Sharon, CT) ja pulmonaalse käitusrõhu (rõhu)

määramiseks paigaldati ösofageaalne survestav kanüül (PE-160, Becton

Dickinson, Sparks, Mod). Hingetorus olev teflontoru ühendati pletüsmograafiga, et

võimaldada meriseal hingata väljaspool kambrit ruumis olevat õhku. Seejärel suleti

kamber hermeetiliselt. Keha temperatuuri säilitamiseks kasutati soojenduslampi ja 25

merisea kopsu puhuti kolm korda 4 mL õhku, kasutades selleks 10 mL mahuga

kaliibritud süstalt (#5520 Series, Hans Rudolph, Kansas City, MO), et olla kindel

selles, et alumised hingamisteed ei ole kollapseerunud ja et loom ei kannata

hüperventilatsiooni all.

Kui leiti, et foonikõvera väärtused vastavad kopsu järeleandvuse väärtustele 30

0,3−0,9 mL/cm H2O ja takistus on vahemikus 0,1−0,199 cm H2O/mL sekundis, siis

EE - EP1856050 B1 59

alustati kopsufunktsioonide määramist. Kopsufunktsioonide väärtuste kogumist ja

töötlemist võimaldas pulmonaarmõõtmistel kasutatav Buxco arvutiprogramm

Programmi käivitamine initsieeris eksperimendi protokolli ja andmete kogumise.

Mahu ajalist muutust pletüsmograafis iga hingamistsükliga määrati Buxco

rõhuanduriga. Signaali integreerimisega ajas arvutati iga hingamistsükli korral 5

voog. See signaal koos muutusega pulmonaalse käitusrõhu väärtustes, mis koguti

rõhuanduri Sensym (#TRD4100) abil, suunati eelvõimendi Buxco (MAX 2270)

kaudu andmekogumisliidesesse (# SFT3400 ja SFT3813). Kopsude kõik

ülejäänud parameetrid saadakse nendest kahest lähteandmest.

Foonile vastavad väärtused koguti 5 minuti jooksul, selle aja möödumisel 10

manustati merisigadele ACh. ACh (0,1 mg/mL) infundeeriti intravenoosselt 1

minuti jooksul pumpsüstlaga (sp210iw, World Precision Instruments, Inc.,

Sarasota, FL) järgmistes annustes kindlatel aegadel eksperimendi algusest: 1,9

µg/minutis 5 minutil, 3,8 µg/minutis 10 minutil, 7,5 µg/minutis 15 minutil,

15,0 µg/minutis 20 minutil, 30 µg/minutis 25 minutil ja 60 µg/minutis 30 minutil. Kui 15

takistuse või kopsu järeleandvuse väärtus ei taastunud foonile vastava väärtuseni

3 minuti jooksul pärast iga ACh annust, siis puhuti merisea kopsudesse 3 korda

4 mL õhku 10 mL mahuga kaliibritud süstlast. Kopsude registreeritud parameetrid

hõlmasid hingamissagedust hingamistsüklit minutis), järeleandvust (palju H2O-d) ja

hingamisteede takistust (cm H2O/mL sekundis). Kui kopsufunktsioonide 20

määramine lõpetati selle katsekorralduse juures 35. minutiks, siis võeti merisiga

pletüsmograafist välja ja surmati valutult lämmatamisel süsinikdioksiidiga.

Andmeid hinnati ühel või mõlemal alltoodud viisil.

(a) Hingamisteede takistus (RL, cm H2O/mL sekundis) arvutati „muutus rõhus“ ja

„muutus voos“ suhtest. RL vastus ACh-le (60 µg/min, IH) arvutati vehiikulit ja 25

uuritavat ühendit saanud rühmade jaoks. Vehiikulit saanud loomade jaoks

arvutati keskmine reaktsioon ACh-le kõikidel kindlatel aegadel ja seda

kasutati ACh-le reaktsiooni inhibeerimise arvutamiseks protsentides uuritava

ühendi iga annuse korral vastaval kindlaksmääratud ajal. Inhibeerimise

annuse-efekti suhtele vastavad kõverad ’RL’ jaoks sobitati neljaparameetrilise 30

logistilise võrrandiga tarkavarapaketi GraphPad Prism, Windowsi versioon

3.00 (GraphPad Software, San Diego, California) abil, et hinnata bronhe

EE - EP1856050 B1 60

kaitsva ID50 väärtust (annus, mis on vajalik ACh (60 µg/min)

bronhokonstriktoorse reaktsiooni inhibeerimiseks 50% ulatuses). Kasutati

järgmist võrrandit:

,

milles X on logaritm annusest, Y on reaktsioon (ACh-st indutseeritud RL 5

suurenemise inhibeerimine protsentides). Y algväärtus on Min ja läheneb

asümptootiliselt väärtusele Max vastavalt sigmoidsele kõverale.

(b) Suurus PD2, mis on määratletud kui ACh või histamiini kogus, mis on vajalik

fooni kõverale vastava hingamistakistuse väärtuse kahekordistamiseks,

arvutatakse hingamisteede takistuse väärtusest, mis saadi voo ja rõhu 10

andmetest üle kogu ACh või histamiini annuste vahemiku järgmise võrrandi abil

(tuletatud võrrandist, mida kasutati PC20 väärtuste arvutamiseks väljaandes

American Thoracic Society, Guidelines for methacholine and exercise challenge

testing - 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161: 309–329 (2000)):

, 15

milles: C1 on ACh või histamiini kontsentratsioon, mis eelneb C2-le; C2 on

ACh või histamiini kontsentratsioon, mis põhjustab hingamisteede takistuse

(RL) vähemalt kahekordse suurenemise; R0 on foonikõverale vastav RL

väärtus; R1 on RL väärtus pärast C1 ja R2 on RL väärtus pärast C2. Efektiivne

annus on määratletud annusena, mis piirab bronhokonstriktsiooni vastusena 20

ACh annusele 50 µg/mL hingamisteede takistuse foonikõverale vastava

kahekordse väärtusega (PD2(50)).

Andmete statistiline analüüs tehti kahepoolse Studenti t-testi abil.

Oluliseks loeti P väärtust < 0,05. Üldjuhul olid selles analüüsis eelistatavad need

uuritavad ühendid, mille PD2(50) väärtus oli alla 200 µg/mL ACh-indutseeritud 25

bronhikonstriktsiooni korral 1,5 tundi pärast annuse manustamist. Selle või

analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on eeldatavalt PD2(50)

EE - EP1856050 B1 61

alla 200 µg/mL ACh-indutseeritud bronhokonstriktsiooni korral 1,5 tundi pärast

annuse manustamist.

ANALÜÜS 4

Inhaleerimise mõju uurimine merisea süljeeritusele

Merisead (Charles River, Wilmington, MA) massiga 200–350 g aklimatiseeriti 5

sisemises meriseakoloonias vähemalt 3 päeva jooksul pärast saabumist. Uuritav

ühend või vehiikul annustati inhaleerimise (IH) teel 10 minuti jooksul

pirukakujulises annustamiskambris (R&S Molds, San Carlos, CA). Uuritavad

lahused saadi lahustamisel steriilses vees ja neid manustati nebulisaatoriga, mis

oli täidetud 5,0 mL annustatava lahusega. Merisigu hoiti inhalatsioonikambris 30 10

minutit. Selle aja jooksul oli merisigade liikumine piiratud ligikaudu 110

ruutsentimeetrise pinnaga. See ruum oli piisav selleks, et loomad said vabalt

pöörata, muuta asendit ja puhastada karvkatet. Pärast 20-minutilist

aklimatiseerimist allutati merisead aerosooli toimele, mis genereeriti seadmega LC

Star Nebulizer Set (Model 22F51, PARI Respiratory Equipment, Inc. Midlothian, 15

VA) abil, kasutades rõhul 22 psi toaõhku. Pärast nebuliseerimise lõppemist hinnati

merisigu 1,5, 6, 12, 24, 48 või 72 tunni möödumisel ravimenetlusest.

Merisead anesteseeriti üks tund enne 43,75 mg/kg ketamiini, 3,5 mg/kg ksülasiini

ja 1,05 mg/kg atsepromasiini segu intramuskulaarset süstimist mahus 0,88 mL/kg.

Loomad paigutati kõhuli soojendatavale (37 °C) tekile nii, et nende pea oli 20

suunatud 20-kraadise nurga alla allapoole. Merisea suhu pandi neljakihiline

marlitampoon suurusega 2 x 2 tolli (Nu-Gauze General-use sponges, Johnson and

Johnson, Arlington, TX). Viie minuti pärast manustati muskariini agonist pilokarpiin

(3,0 mg/kg, SC) ja marlitampoon visati ära ja asendati eelnevalt kaalutud uue

marlitampooniga. Sülge koguti 10 minutit, siis kaaluti marlitampoon ja kogunenud 25

sülje mass (mg) leiti määratud masside vahena. Kogunenud sülje keskmine mass

arvutati vehiikulit ja iga annust saanud loomade jaoks. Vehiikulit saanud rühma

käsitleti 100% süljeeritumisega. Tulemused arvutati saadud keskväärtuste (n = 3

või enam) abil. Usaldusintervallid (95%) arvutati iga annuse ja iga ajahetke jaoks

kahepoolse ANOVA abil. See mudel kujutab endast töös Rechter, "Estimation of 30

anticholinergic drug effects in mice by antagonism against pilocarpine-induced

EE - EP1856050 B1 62

salivation" Acta Pharmacol. Toxicol. 24: 243–254 (1996) kirjeldatud protseduuri

modifitseeritud versiooni.

Vehiikulit saanud loomade jaoks arvutati sülje keskmine mass kõikidel kindlatel

aegadel ja seda kasutati süljeerituse inhibeerimise arvutamiseks protsentides iga

annuse korral vastaval kindlaksmääratud ajal. Inhibeerimise annuse-efekti suhtele 5

vastavad kõverad sobitati neljaparameetrilise logistilise võrrandiga tarkavarapaketi

GraphPad Prism, Windowsi versioon 3.00 (GraphPad Software, San Diego,

California) abil, et hinnata süleeritumisvastase ID50 väärtust (annus, mis on vajalik

pilokarpiini poolt indutseeritud süljeeritumise inhibeerimiseks 50% ulatuses).

Kasutati järgmist võrrandit: 10

,

milles X on logaritm annusest, Y on reaktsioon (süljeeritumise inhibeerimine

protsentides). Y algväärtus on Min ja läheneb asümptootiliselt väärtusele

Max vastavalt sigmoidsele kõverale.

Süljeeritumisvastase ID50 ja bronhe kaitsva ID50 suhet kasutati uuritava ühendi 15

kopsude suhtes näiva selektiivsusindeksi arvutamiseks. Üldjuhul on eelistatavad

need ühendid, mille kopsude suhtes näiva selektiivsusindeksi väärtus on suurem

kui 5. Selle või analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on

eeldatavalt kopsude suhtes näiva selektiivsusindeksi väärtus on suurem kui 5.

ANALÜÜS 5 20

Metakoliini poolt indutseeritud depressorreaktsioonid teadvusel olevatel

merisigadel.

Nendes uuringutes kasutati terveid, täiskasvanuid, isaseid Sprague-Dawley liini

merisigu, (Harlan, Indianapolis, IN), massiga vahemikus 200 kuni 300 g.

Isofluraaniga (toimeaine) anesteseeritud loomadele paigaldati tavalised unearteri 25

ja kägiveeni kateetrid (PE-50 torud). Kateetrid toodi välja subskapulaarsesse

piirkonda suubuva subkutaansest tunnelist. Kõik kirurgilised õmblused tehti niidiga

4-0 Ethicon Silk ja kateetrid suleti hepariiniga (1000 ühikut/mL). Kõikidele

loomadele manustati operatsiooni lõpul soolalahust (3 mL, SC) ja buprenorfiini

EE - EP1856050 B1 63

(0,05 mg/kg, I1V1). Loomadel lasti taastuda soojendustekil enne nende

tagasiviimist pidamisruumidesse.

Loomad kaaluti ligikaudu 18 kuni 20 tundi pärast operatsiooni ja kõikide loomade

unearteris olevad kateetrid ühendati arteriaalse vererõhu registreerimiseks

anduritega. Arteriaalne vererõhk ja pulsisagedus registreeriti seadmega Biopac 5

MP-100 Acquisition System. Loomadel lasti aklimatiseeruda ja stabiliseeruda 2o

minuti jooksul.

Kõikidele loomadele manustati kägiveenitee kaudu MCh (0,3 mg/kg, IV) ja

kardiovaskulaarset reaktsiooni jälgiti 10 minuti jooksul. Seejärel paigutati loomad

kogu keha hõlmavasse annustamiskambrisse, mis oli ühendatud uuritava ühendi 10

või vehiikuli lahust sisaldava nebulisaatoriga. Lahust nebuliseeriti 10 minuti

jooksul, selleks kasutati hingatavast õhust ja 5% süsihappegaasist koosnevat

gaasisegu voolutuskiirusega 3 L/minut. Seejärel võeti loomad kogu keha

hõlmavast annustamiskambrist välja ja pandi tagasi oma puuridesse. 1,5 ja 24

tunni möödumisel manustati loomadele uuesti MCh (0,3 mg/kg, IV) ja määrati 15

hemodünaamiline reaktsioon. Seejärel surmati loomad valutult

naatriumpentobarbitaaliga (150 mg/kg, IV).

MCh põhjustab keskmise arteriaalse vererõhu (MAP) vähenemise ja

pulsisageduse vähenemise (bradükardia). MAP maksimaalne vähenemine

foonikõvera suhtes (depressorreaktsioon) määrati MCh iga manustamise korral 20

(enne ja pärast IH-annustamist). Ravimenetluse mõju MCh reaktsioonile avaldati

inhibeerimise protsendimäärana (keskväärtus +/- SEM (keskmine standardviga))

kontrollkatse depressorreaktsiooni suhtes. Ravimenetluse ja sellele eelneva aja

mõju uurimiseks kasutati kahepoolset ANOVA analüüsi sobiva post-hoc testiga.

Eeldatavalt on depressorreaktsioon MCh-le suhteliselt muutumatu 1,5 ja 24 25

möödumisel vehiikulit sisaldava annuse inhaleerimisest.

Depressorivastase ID50 ja bronhe kaitsva ID50 suhet kasutati uuritava ühendi

kopsude suhtes näiva selektiivsuse arvutamiseks. Üldjuhul on eelistatavad need

ühendid, mille kopsude suhtes näiva selektiivsusindeksi väärtus on suurem kui 5.

Selle või analoogilise analüüsi tulemusena leiti, et valemiga I ühendil on 30

eeldatavalt kopsude suhtes näiva selektiivsusindeksi väärtus on suurem kui 5.

EE - EP1856050 B1 64

Patendinõudlus

1. Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalne farmatseutiliselt

vastuvõetav sool või vaba alus valemiga I:

5

või selle farmatseutiliselt vastuvõetav solvaat.

2. Ühend vastavalt punktile 1, milles valemiga I kristalne sool või vaba alus on

difosfaatsool, mis erineb selle poolest, et (i) pulber-röntgendifraktogrammil

on kaks või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtusel, mis on valitud 6,4 ±0,2,

7,6 ±0,2, 8,6 ±0,2, 13,7 ±0,2, 15,0 ±0,2, 19,4 ±0,2, 21,6 ±0,2, 22,1 ±0,2, 10

22,9 ±0,2 ja 23,7 ±0,2 hulgast; ning (ii) a diferentsiaalse skaneeriva

kalorimeetria meetodil saadud termogrammil on endotermilise soojusvoo

maksimum temperatuuril ligikaudu 154,5 °C.

3. Ühend vastavalt punktile 1, milles valemiga I kristalne sool või vaba alus on

monosulfaatsool, mis erineb selle poolest, et (i) pulber-15

röntgendifraktogrammil on kaks või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtusel, mis

on valitud 7,7 ±0,2, 8,4 ±0,2, 8,8 ±0,2, 12,6 ±0,2, t3,7 ±0,2, 14,1 ±0,2,

15,3 ±0,2, 16,0 ±0,2, 19,7 ±0,2, 20,6 ±0,2, 23,0 ±0,2 ja 24,4 ±0,2 hulgast;

ning (ii) a diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria meetodil saadud

termogrammil on endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril ligikaudu 20

76,5 °C.

4. Ühend vastavalt punktile 1, milles valemiga I kristalne sool või vaba alus on

dioksalaatsool, mis erineb selle poolest, et (i) pulber-röntgendifraktogrammil

on kaks või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtusel, mis on valitud 7,7 ±0,2,

8,7 ±0,2, 13,5 ±0,2, 14,0 ±0,2, 14,8 ±0,2, 15,4 ±0,2, 15,8 ±0,2, 19,4 ±0,2, 25

22,9 ±0,2, 23,3 ±0,2 ja 24,6 ±0,2 hulgast; ning (ii) a diferentsiaalse

EE - EP1856050 B1 65

skaneeriva kalorimeetria meetodil saadud termogrammil on endotermilise

soojusvoo maksimum temperatuuril ligikaudu 73,7 °C.

5. Ühend vastavalt punktile 1, milles valemiga I kristalne sool või vaba alus on

vaba alus, mis erineb selle poolest, et (i) pulber-röntgendifraktogrammil on

kaks või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtusel, mis on valitud 4,7 ±0,2, 5

9,6 ±0,2, 12,7 ±0,2, 13,7 ±0,2, 16,7 ±0,2, 17,4 ±0,2, 18,5 ±0,2, 19,4 ±0,2,

20,8 ±0,2, 21,4 ±0,2, 24,2 ±0,2 ja 25,6 ±0,2 hulgast; ning (ii) a diferentsiaalse

skaneeriva kalorimeetria meetodil saadud termogrammil on endotermilise

soojusvoo maksimum temperatuuril ligikaudu 102,7 °C.

6. Ühend vastavalt punktile 1, milles valemiga I kristalne sool või vaba alus on 10

vaba alus, mis erineb selle poolest, et (i) pulber-röntgendifraktogrammil on

kaks või enam difraktsioonipiiki 2Θ väärtusel, mis on valitud 4,6 ±0,2,

9,3 ±0,2, 12,9 ±0,2, 13,6 ±0,2, 14,0 ±0,2, 14,6 ±0,2, 16,5 ±0,2, 18,64 ±0,2,

19,1 ±0,2, 20,9 ±0,2, 22,1 ±0,2, 22,7 ±0,2 ja 25,7 ±0,2 hulgast; ning (ii) a

diferentsiaalse skaneeriva kalorimeetria meetodil saadud termogrammil on 15

endotermilise soojusvoo maksimum temperatuuril ligikaudu 98,6 °C.

7. Ravimkoostis, mis sisaldab farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet ja

ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastavat ühendit.

8. Ravimkoostis vastavalt punktile 7, mis erineb selle poolest, et sisaldab

täiendavalt toimeainet, mis on valitud β2-adrenergilise retseptori agonistide, 20

steroidsete põletikuvastaste toimeainete, fosfodiesteraas-4 inhibiitorite ja

nende kombinatsioonide hulgast; seejuures on ühend ja toimeaine kas

seguna või eraldi.

9. Koostis vastavalt punktile 8, mis erineb selle poolest, et sisaldab

terapeutiliselt toimivas koguses β2-adrenergilise retseptori agonisti ja 25

steroidset põletikuvastast toimeainet.

10. Koostis vastavalt punktile 8, mis erineb selle poolest, et β2-adrenergilise

retseptori agonist on N-{2-[4-((R)-2-hüdroksü-2-fenüületüülamino)-

fenüül]etüül}-(R)-2-hüdroksü-2-(3-formamido-4-hüdroksüfenüül)etüülamiini

monovesinikkloriidsool. 30

EE - EP1856050 B1 66

11. Koostis vastavalt punktile 8, mis erineb selle poolest, et steroidne

põletikuvastane toimeaine on 6α,9α-difluoro-17α-[(2-furanüülkarbonüül)-

oksü]-11β-hüdroksü-16α-metüül-3-oksoandrosta-1,4-dieen-17β-

karbotiohappe S’-fluorometüülester.

12. Koostis vastavalt punktile 7, mis erineb selle poolest, et koostis on 5

valmistatud manustamiseks inhaleerimise teel.

13. Koostis vastavalt punktile 7, mis erineb selle poolest, et kandeaine on

vesipõhine isotooniline soolalahus, mille pH on vahemikus ligikaudu 4 kuni

ligikaudu 6.

14. Koostis vastavalt punktile 13, mis erineb selle poolest, et hõlmab 10

tsitraatpuhvrit.

15. Ravimi manustamiseks mõeldud vahend, mis sisaldab punktile 7 vastavat

koostist.

16. Ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastava ühendi kristalne vorm

mikroniseeritud kujul. 15

17. Ravimkoostis, mis sisaldab farmatseutiliselt vastuvõetavat kandeainet ja

punktile 16 vastavat ühendit.

18. Koostis vastavalt punktile 17, mis erineb selle poolest, et kandeaine on

laktoos.

19. Meetod punktile 2 vastava ühendi valmistamiseks, mis hõlmab bifenüül-2-20

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri reageerimist fosforhappega.

20. Meetod punktile 3 vastava ühendi valmistamiseks, mis hõlmab bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri reageerimist väävelhappega. 25

21. Meetod punktile 4 vastava ühendi valmistamiseks, mis hõlmab:

EE - EP1856050 B1 67

bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalse dioksalaatsool

idukristalli saamist bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüül-

piperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri

reageerimisel oksaalhappega; 5

bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestrioksalaatsolla saamist

bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri reageerimisel oksaal-

happega 10

ja soola lahustamist inertses lahjendusaines lahuse saamiseks ning

idukristalli lisamist lahusele.

22. Meetod punktile 5 või 6 vastava ühendi valmistamiseks, mis hõlmab:

kristalse vaba aluse saamist bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-15

üülestri segamisel inertse lahjendusainega;

kristalse vaba aluse saamist bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülestri segamisel inertse lahjendusainega

ja saadud kristalse estri lahustamist lahuse saamiseks ning idukristalli 20

lisamist lahusele.

23. Ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastava ühendi kasutamine bifenüül-2-

üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-

metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri puhastamise protsessis, mis hõlmab

bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-25

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri kristalse soola või kristalse

aluse saamist.

24. Ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastav ühend kasutamiseks ravis või

ravimina.

EE - EP1856050 B1 68

25. Ükskõik millisele punktile 1 kuni 6 vastava ühendi kasutamine ravimi

valmistamiseks.

26. Kasutamine vastavalt punktile 25, mis erineb selle poolest, et ravim on

mõeldud kopsuhaiguse raviks.

27. Kasutamine vastavalt punktile 25, mis erineb selle poolest, et ravim on 5

mõeldud bronhodilatatsiooni tekitamiseks.

28. Kasutamine vastavalt punktile 25, mis erineb selle poolest, et ravim on

mõeldud kroonilise obstruktiivse kopsuhaiguse või astma raviks.

29. Bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)-

bensoüül]metüülamino}etüül)piperidiin-4-üülestri difosfaat-, monosulfaat- või 10

dioksalaatsool.

30. Ühend vastavalt punktile 29, mis on bifenüül-2-üülkarbaamhappe 1-(2-{[4-(4-

karbamoüülpiperidiin-1-üülmetüül)bensoüül]-metüülamino}etüül)piperidiin-4-

üülestri difosfaatsool.

EP 1 856 050 B1

36

EP 1 856 050 B1

37

EP 1 856 050 B1

38

EP 1 856 050 B1

39

EP 1 856 050 B1

40

EP 1 856 050 B1

41

EP 1 856 050 B1

42

EP 1 856 050 B1

43

EP 1 856 050 B1

44

EP 1 856 050 B1

45

EP 1 856 050 B1

46

EP 1 856 050 B1

47

EP 1 856 050 B1

48