10
Bioavailability and Ef®cacy of Antisense Morpholino Oligomers Targeted to c-myc and Cytochrome P-450 3A2 Following Oral Administration in Rats VIKRAM ARORA, DEREK C. KNAPP, MURALIMOHAN T. REDDY, DWIGHT D. WELLER, PATRICK L. IVERSEN AVI BioPharma, 4575 SW Research Way, Suite 200, Corvallis, Oregon 97333 Received 8 February 2001; revised 5 October 2001; accepted 29 November 2001 ABSTRACT: Antisense phosphorodiamidate Morpholino oligomers PMO) are resistant to degradation by cellular hydrolases, DNases, RNases, and phosphodiesterases, but remain sensitive to prolonged exposure to low pH. The present studies evaluate the oral fractional bioavailability, stability, and ef®cacy of two distinct PMO sequences targeted to c-myc and cytochrome P-450 CYP) 3A2. The c-myc antisense 20-mer, AVI-4126 5 0 - ACGTTGAGGGGCATCGTCGC-3 0 ), slowed the regenerative process in the rat liver after a 70% partial hepatectomy PH). Rats were administered 3.0 mg/kg AVI-4126 in 0.1 mL saline via a bolus intravenous injection or in 0.5 mL sterile phosphate-buffered saline via gavage immediately following PH. The areas under the plasma concentration versus time curves revealed a fractional oral availability of 78.8% over a period of 10 min through 24 h. Immunoblot analysis of liver tissue from rats treated orally with AVI-4126 demonstrated a sequence-speci®c reduction in the target protein c-Myc, as well as secondary proliferation markers: proliferating cell nuclear antigen PCNA), cyclin D1, and p53. The CYP3A2 antisense 22-mer AVI-4472 5 0 -GAGCTGAAAGCAGGTC- CATCCC-3 0 ) caused a sequence-dependent reduction of approximately ®ve-fold in the rat liver CYP3A2 protein levels and erythromycin demethylation activity in 24 h fol- lowing oral administration at a dose of 2 mg/kg. It is concluded that oral administration of PMOs can inhibit c-myc and CYP3A2 gene expression in rat liver by an antisense- based mechanism of action. These studies highlight the potential for development of PMOs as orally administered therapeutic agents. ß 2002 Wiley-Liss, Inc. and the American Pharmaceutical Association J Pharm Sci 91:1009±1018, 2002 Keywords: antisense; phosphorodiamidate morpholino; oral bioavailability; CYP3A2; myc INTRODUCTION Phosphorodiamidate Morpholino Oligomers PMO) are third-generation antisense agents that offer the prospect of safe and effective therapy for a broad range of diseases. 1±3 The chemistry of PMOs is different from DNA in that the deoxyr- ibose sugars are replaced with six-membered morpholine ring and the phosphodiester linkages are replaced with nonionic phosphorodiamidate linkages Figure 1). Antisense activity of PMOs has been demonstrated in cell-free translation systems, 4 cultured cells in vitro 5,6 and in animal studies in vivo. 7±9 These oligomers are stable in serum and plasma, but are sensitive to degra- dation after prolonged exposure to low pH. 10 The biological stability of these oligomers combined with their in vivo ef®cacy and potency prompted the present studies to test their ef®cacy following oral administration. The aims of the present studies were to investigate the fractional bioavailability of a 20- mer c-myc antisense PMO, AVI-4126, compared to i.v. administration. Further, these studies were designed to integrate availability with in vivo JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, VOL. 91, NO. 4, APRIL 2002 1009 Correspondence to: Vikram Arora Telephone: 541-753- 3635; Fax: 541-754-3545; E-mail: [email protected]) Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 91, 1009±1018 2002) ß 2002 Wiley-Liss, Inc. and the American Pharmaceutical Association

Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

�������������� �� � ���� � ������� ������������������ �������� �� ����� �� ��������� ���� !�"#����$�� ���� ������������ � %���

&'(%�� �%�%�) *�%�( �+ (,���) �-%�.'��/�, �+ %�**0) *1'2/� *+ 1�..�%) ���%'�( .+ '&�%3�,

��� ������� ��� �� ������ ��� ����� ���� �������� ���� !�"""

�������� � ���� ����� ������ � ����� ����� �������� �� ������ ����

��3�%���4 ��������� �������� ����� ������ ��� �� ����� �� ��������� ��������� �� ������� ��������� ������� ������� ��� ���������������� ���� ��� ��������� � ������ ������ � �� � ! "�� ������ ������� �������� ��� ��#������� ��������������� ���������� ��� �#$���� # �� �������� ��� ��%������ �������� �&� � ��� ����� � �&'() �*+�� ,�-! "�� �&� � ��������� -)& �� �./&'0-1 �(�&�*2""2�2222*�"*2"*2*&,��� ����� ��� ���������� ����� �� ��� �� �����#�� � 3)4 ������ �������� � �� �! ���� ��� �� �������� ,!) �56� �./&'0-1 ��)!0 7 ������ ��� � ���� ��������� ��8����� �� )!( 7 ������ ��������&��##��������� ��� ������ � �������� #������ � ! "�� ���� ���� ��� ���� � ��������������� �� � ����� ������� � #������� �� ������������ # 39!94 �� � ���� # 0) ������� -' �! / ����� �������� # ���� ������ # ��� ������ ���� ���� �./&'0-1�� ������� � ��%�����&�����$� ������� �� ��� ����� ����� �&���� �� ���� ��������� ���#����� �6��: ���#������ ���� ������ ������� ��*���� ������ �0���� �(,! "�� *+�,�- ��������� --& � �./&''3- �(�&2�2*"2���2*�22"*&*�"***&,�� ������ � ��%�����&��������� ������� # ����� ����� $��&#�� �� ����� ���� *+�,�- ����� ������ ��� ���� ���� �� ��������� �������� �� -' � #�&����� �� �� ��������� �� � ��� # - �56�! /� �� �������� ���� �� �� ���������# ���� ��� ������� �&� � ��� *+�,�- ���� �������� �� �� ���� �� �� ���������&����� ������� # �����! "���� ������� ��������� ��� �������� # ������ ��� #���� �� ���� �� �������� ���������� ������! � -))- ;����&7���� /��! ��� ��� � �����

��� ��������� ��������� < ��� =�� >0:0))>?0)09� -))-

�������� ���������@ �������� ����� �����@ �� ��������������@*+�,�-@ ��

',�%�*-��'�,

�������� ����� ������ ���� ������� �� ����&�������� ��������� ������ ����##� ��� ������ # ��#� ��� �##������ ������ #� ��� ���� # ��������!0?, "�� ��� ���� #���� �� ��##���� # ��� �� ���� ��� ����&���� ����� �� ������� ���� ���& � ���� ������ ��� ��� ��� ����������� ���6������ ������� ���� ������ �������� �����

���6���� �A���� 0�! ��������� �������� # ������� ���� �� ������� �� ����&#�� �������������� ��' ������� ����� �� ����(�1 ��� �� ��� ��������� �� ����!3?> "���� ��� �� �� �������� ��� ��� ���� �� ��� �� ��������� � ����&����� �#�� ������ ������ � �� � !0) "���������� ��������� # ����� ��� �� � ��������� ���� �� ���� �#$���� ��� ������ � ������� ������ ������� � ���� ���� �#$���� #�������� �� ���������!"�� �� � # ��� ������ ������� ��� �

����������� ��� #������� �������������� # � -)& � �&� � ��������� ���� �./&'0-1� � ���� ��!�! �� ���������! A����� ����� ������� ����������� � �������� ������������ ���� �� ����

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ���� ���

������������ ��: .�6� �� �"�������: ('0&3(,&,1,(@ A��: ('0&3('&,('(@ B& ���: ���C�����!� �

<���� # ��� ��������� =�������� .�! >0� 0))>?0)09 �-))-�� -))- ;����&7���� /��! ��� ��� � ����� ��� ��������� ���������

Page 2: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

�#$���� �� �� �������� ���� ����� ������ �� ����� ����! "�� $�� ��� ��� ��� ���������� #���� ��������� #������ 3)4 ������ �������&� � �� � �� �� �� ��������� # ��� �&� ���������� ��� �./&'0-1! "�� ���� ��������� ��� ��� ���� ����������� ��������D���00 ������ ������� # ���� ��� �� ��� ������ ����� ������� � ��� �������� ���� �&� � ��� ����& ��� �� ����������� �������� �� ��� � �� ������ ��� �� �� �������� ������� #������ 3)4� !0- "�� ����� �������� ��� ��� ��� �����&��� # ���� ����� � �&'() �*+�� ,�- ��D� ��������� �� �� �� ��������� # � --& � �����./&''3-� ����� �� ��������� � ��� �� *+�,�-!=������ ���������� ��� ��� # ��������� ����&���� �� ��� # ��� ����& ������� �� ���� ���� �� ��������� �� ��� ��������! /�����&������ �� ��������� # ��� ��� �./&'0-1 ������� �������� ���� � ����� �� ���� ����&������3 ����� ������������ �� ��������� #� ����������� ������������ ���� � ��&%����� �� ��� � ��� ��� �./&''3- ��� �������� � ������� �� ���� *+�,�- ��D� ���������!0,

"�� ������ ������� ����������� ��� �##��� #�������� ������ # ���� � ��� ����������&���� ����� # � ��! "�� ������� ��������� �������� � �������������� # ���� �� ��� �� #�&����� �� �� ���������! A����� ���� ���������� � ��� �������� # #���&������ ������ ��� ���� � ��� ��� ����� ��� ������� �� ������ ������� �� ��� ����� # ��� �� �������� ����������� ��&��� ��� *+�,�-� ������������ ��� ������� ������� ��� �����!

����%'�.3 �,* ���/�*3

������

���� =�����&������ ��� �=� ����� 2����*��� �������� ������� -))?--( �� ��� ������� ������� ����� �� ��� 7����� ��� �� ��&����� A������� �� ���� =���� E�������� ��=E��� *������� ��! "�� ��� ��� ��� ��������� ��� ��� ���&������� ���� 0-&� �����5��6������ ��� ������ ������ � � � ����� �� ������ ��� ���� �� ������! "�� �� � ����� # ������� 8����� ���� ��� ��� ���� # ��� ��&6������ ����� ���� �������� ������� ������� �F���� ������ ��������� ���! ��� ��� ������� ��# �� � ��� ������� ���������� #��� 0>3( ��������� # �����6� ��� ��� ��&���� �� ��� GG/����������� ��� �� *�� ��� E��* �����HH # �=E!

������� /���������

"�� ������ ��� ��# �� ����� ������� ����&��%�� �� �������� ��������!0' ���� ��� ����&�����D�� ����� ��I���� ������ 7���!� ���*������ /7� ��� ���� ������ ��#��� ��� ���������� ��� �����&���� ��� ������� ���� ����&����! � ������ ������� ��� ��� � ����� �������� ��� ��� ����� ��� ��#� ������ ���� ���������� ������� ��� ���� �������! "��� ������� ��� ��� # ����� ����� 1( � 3)4 # ��� ��������! "�� ��� ���� �������� ��� ����� �� �������!

������������������ ����������������� 5���6 ������������

��� ���� ��� ��������D�� �� �./ J���� ��*������� ��� �� �������� ��������!, =�&%������ # ��� ���� �� ���������� �� A���� 0!����� ��� ����� ���� >)4 #��� ������� ������ ���� �� �����&����� �7* ��� ��7�/&"�A ��� ���������! 7������D�� ��� � &����� ��� �������� �� ������ ��������&��##��� ������ � 3!' ��� $����� �����)!-&� ������ $���� �2�� ���! ��� ����������� ������� ���� ��� �� �������� ������ � ������ ���� ������ �� )!( 7 ��� � ��� ���������� ����� ����� ��� �� #������ ���� # ���#������ �� ������: 01 ����� ��� ���� - ����������� ���� � , ���� � ��� ��� �"� ��=������$�� =������� �<�! ��� ��� ���� �����&�� ��� ���5������� ����������� ��� �� ����&���� ��� �� � ����� 8����� ���� ��� �� )!0

����� � *�� ���� ������� # ��� ��� ���6������������� ���& � ���� ������ ��� ��� ��� ��&���� �������� ����� ���6���! "�� ���� ��%�����# �� ��� � ��� �� # 2�����6 �������� �� ��+)),>1 ��� ��� ���� ��%����� # �� *+�,�- ��� ��# 2�����6 �������� �� �� E)>3'-! "�� ��&%������ # ��� ��� � ��������� ��� �./&'0-1 ������ *+�,�- ��������� ��� �./&''3- �� ���� �� ������������� ����� �� ��� ����������! J��� ��������� ��� ����#��� �������� �� ������! ��� ���� �./&'0-1 ��� �� �� ���� �� ��� ,� ���! "�� �./&'0-1��%����� �� �������� � �� � ������� � ��� ����� ��� �� ��� � ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 3: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

7 ������ ������! *��� ������ ��������� ���� ����� � �������D� ��� ��� �� ��� ��� # �������� ����!

���������������

���� ������ ��� ������ �� ������� ��� $�������� � ������� ���� # #D�� ������ ����&���� �=�6�� A�����6� "����� *��! "�� ������ ���� ������ �� ��� #�� � ����� ��� # ������ ��� #D�� �� � �9)�* #��D�! *����� ���&���� �( �� ��� ��� �� �=E .������� ���������7����� �*������� ���! =����� ��� �� ���� ����� ��6 # ,) �� ��� ������� ����� �����A�� ���&2 ������ ���� �=�����J��������� ���������� J� ����� � �7�! "����� ������� ��� ��6�� ���� � ��6� ���&��� ,)) ������ �������� � �� ��� ������������� �+� �����$� =�&���� ������� �� ��!"�� ������ �� �� ��� 6��� ������� # ���I������� ������� �� 0, �!

'��7����� ������

7����� # ��� ������ ��� ���� ���� �� ;������ ������ ���� ���� �������� ������ *+�,�-��������� ���� ���� �� ���� =&> #������! "������������ ��� ������ � �������� �#�� ��� ���������D���� �� � ����D��� ������ �� �������##� �0��J=� 04 ������ �&')� )!(4 ���� ����������� )!-4=�=�! * �����"����� B�"�&#�� �J������&������� � ������ ���������6���� ������� ��� ����� � #��� ������� ��9 75������! ��������� �� ���� ��� �����#������ 0(�)))� � # -) �� �� '�*� ��� ��� ����&������ ��� ���� �� �9)�* ����� ���! ��� �����&��� ��� ���������� ��� �� #���� ���� #��D�&������ �������! A�#�� ���� � # ���� �������� �������� � � 0-4 ���� ���������#���5����� ��� ��� ��� � �������� ������� �������� ������%��� �� �������� ��#�!3 ��&����� �� �� ��������� # �&��� ����� *,,�������� �0 ����� *-)�� ��� �*�� ����� �*0)���� ������� # =���� *�D J����������=���� *�D� *��! �&����� ����� �*&')� ��� # =�� �� �(, ��������� ���0� ��� # �������������� ������ �*� ������ ���� ��� *+�,�-�������� ��������� ��� # 2������ �;�������! �&����� � ���������� ��� ��# �� ���$ ���� ��� ����� ��� ����� ���� �� ���� ���� # ����� �� �������� ��� �� � ��� ��0)) � -& ������������ -4 =�=� 1-!( �"��& *�� � 1!3 # 0 � �� ()�*� #����� ����� ������� ��� ���6��� ����� �� ��������!

������ ��� ��� ��# �� � � K��6 / ���=����� '') ��B�� J���� ���!

����7����� � ��������� ���� !�" 5�0�!�"6

"�� �������� # *+�,�- ��� ������ �� ��������� ���� �� ��������� �B��B�� �����!0(

"�� �� ���� ��� ������ �� ����� 0!) � #=&> #����� ������ )!' � ���� �����=�� ��� ��� 0!) � ���� �=�� �� �� � $������ � # 0 7 �� )!0 � ������� ����������##� �� � 3!'�! "�� �� ���� ��� ��������� #0( �� �� ,3�*� ���� ���� )!( 7 034 ����������� �=�� �� ��� �����#���� � � <��� �����&#��� �� 0(�))) �# # ( ��! "�� �� ���� ��������� �� � ��� ���� ��� ���� ���� )!' � ���������� �)!)- � -�'&������������ )!14 �5�������� ������ ����� ��� ,!> � � ��� ����������� ��������� �� 3)�* # -) ��! "�� �� ������� ������ � �� ��� ��� � ��� ��������& ��� �� '0- � ! ��������� ��� � ���� � �������� ���� �������� # 6��� �������&���� # # ��������! ���������� ��� ������� � � # ��������5 � �����5 ��!

/�.� *������� � ��� � ������ �� .���� ����7�

� 0)&�7 ���%�� �()) ��� # ��� ������� ���������� �0(& � ���� ��%����� ��� ������ # �(� �������� # �./&'0-1� ��� ����� � ��� -() �7���%��� # ���� � ��� ���� ������ �)!- �5 7��� ����! ������� �,)) �7� ��� ����� � ������ ��� ��� ��� ����� ��� ������! "�� �������� �����#���� # 0) �� ����� � ����&����������#��� ��� ����������� ����#��� � ���B�����# �����! "�� ������ ��� ���� ���������� 0)) �7 "�� � 9� ��� ��� ���� ��##� �������� � ��� ����������! "�� �������������� ������ �� � ���� ���� �� 3)�* # 0) ��!"�� �� ���� ��� ������#���� # 0) ��� ������ ����������� ��� ����#��� � ��� B����&�# �����! ������� ��� � ��� ����� � ��������� ��� ��� �� ���� ��� $����� ����#��� ����� ����� ����� ��� �������D�� �#�� ��� �������# 0)) �7 # �����D�� ���� � ���� ����! "���������D�� �� ���� ��� ����������� �����0)) �7 ���%��� # (�&I����������� ��� �0!)�!�! �����5 7� ���� ��%����� ��� � ��� ��&��� � ���� # �./&'0-1 ��� ��� ��� ��������������! � ��� # �./&'0-1 �������� ��������� �� ���6��� ��� ��� ��� -() �7 ���%���# ����6 �� ���� � �0)� -(� ()� 0))� -()� ())���� 0))) ��5-() �7 # ���� �� ���� ���� ���������� �������! "�� �������� ��� �� �������������!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= �

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 4: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

"�� �� ���� ��� �����D�� �� ��8������ � � ������ ��� ��� ��&0)) ��� � �'� -()& ��� �@ ����� *������ =��������� *������� � .���� ����� ��� ��/&-))� ��������� � .���� �7* �� � � ��� >)0) ����� �%���&��� ���� � .���� I������� ������ � ���>)3(�! "�� ���� ������ ��: )!)-( � "��� � 9@J: )!)-( � "��� � 950!) � ��*�� ��� ����������� �7*&���� ���� ��� ������� ��� $�&���� ����� � )!-& ��� $��� �� � ���! "��������� ��� � ����� ��� L>)?0)4JM ��) �� ��� L((?'(4JM �� -) �� ����� ��� �� ���� ���� �� � I� ��� # 0!( 75 ��! "�� ������ ����� �� ��������� ��� � ����� ����&������� # '>' ��� (09 � � �����������!

������ � *���

"�� ���� ��� ��������� ���� ��� ���������� #��� � ���� ��� �K*�7* �� �����������������!01 "�� /. ���� � ���� ��� $� ��%! 0:03

���� � ���� � !���� �0����� ���� �� ��� ���� � ���������� �� �� � �� � ��� ! �� �������� �� �� � �� � ������������� �������� ��� � �� �� ��� ������ ��� ���&����! ��� ���� �� ����� �� �����=B� ������ ���� �� ��� � ���� ��� /�=���-�2������� =�� ����� *��! 2���� ��� ��&���� ���� ��D �-!) �2�������!

%�3-.�3

�&'��8"9 �� *��������� � ������ �� .���� ����7�

7��� ������� # 3)4 � ��� ������ �������� -!( �56� I�������&������� �./&'0-1 ������ ���� �� ����� ������ �A���� -*� ���I�������� �A���� -�� ������! "�� ��&����� ������� ������ �������� �����������I�������� ���� ��� ������ �� �� ��� �������# ��� ������ ���� ��������� �./&'0-1�A���� -� ��� J�!���� � ��� ���� ������ �� ���� # ���

������ ���� ���� �./&'0-1 ��� ������� ����� � �7* �� �������� �� ��� ������ ������!"�� ������ �� # ���� �� ���� �A���� ,� �� �./&'0-1� ��� ������� ����������� ��� I����������� ��� ��� �� ���� � �����!������������� �� ���� � � ��� �����&��� # ���6� # ��##���� ���� # �� ������&��� �� �������� �� A���� ,!

"�� ���6 ��������� � #���&������ �-)& ���./&'0-1 ��� ������ ������ �� ���� � �� ����# ��� ������ ���� �!�! ���� ,!) �56��./&'0-1 �� � -' � #������ �� ����������A���� ,*�! "�� ���6 ��������� � #���&������ �-)& �� �./&'0-1 ��� ��� ������ ������������ ���� ������ ������� -' � #�������� ��������� �A���� ,��! "��� ���������� ����&��%�� �� ������� # ������� ���6� �������� # ��&0�& �� ��� �������� ������ # �./&'0-1���� ������ ��� �������� �� ���� � ����������!

����� ����������� �&'��8"9 /�� /��������� ��������������

J�� �� ���� ��� �������� # ��� �������!�! ���� ���� ,!) �56� �./&'0-1 �� ) ���0) ��� ,) ��� 0 �� - �� ' �� -' �� ��� '9 �! �./&'0-1 ��� ���������� �� ��� �� � ����� ������ '9 ��� ��� �!�! ��� ���� ������ ����! "�� ���6�# '9&� ���� � �� ���� ��� ���� ��� �����&��� �� �� # ��� ���������� ������%�� ����������� ��� ') ��5 7�! "�� ������� ���6 ���� #���� � �� ���� ��� %���������� ����� � ����&��� ���� �-� )!>>>-,� ���� �� ����� � ���&������ ���� � ����������� �*�� # �./&'0-1�A���� '�!

����� �� ������������� -))� ���� ��� ��&����� # 3)4 � ��� 09 � #������ �� �� �����&���� # -!( �56� �./&'0-1! ��� J� ����� ��������� I������� � ����� ������������ # �� ���������$��� # �./&'0-1&������ ��! �*� �� ����� ��������� I������� � ����� ������������ # �� ���������$��� # I�������&������� �./&'0-1&������ ��!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 5: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

"�� ���� � ���������� ������ ������ #��� �!�! ��� ���� ������ ��� �� �������� ��"���� 0! ��� �� ��������� ������� �� � ��� �# ���������� � -!-� )!- 756� � ���� �0!9� )!1 756� �� /!.!&������ ��� ��� ��� )!)(��� ��##�����! "�� ���� ���� ��� ���� � ��&�������� ����� �� �������� �� "���� -! "������ # ��� � ����� ����� �0) �� � -' ����� 03!-� 0!) ��� -0!9� 0!' ����5 � # ������� �!�!&������ ���� �����������! "�� ��� # ������� ���� ��� ���� � ���������� ����� #�� � /. �0) �� � -' �� ������� �� ������ ���������������� # 39!94! "�� ������ �� ��&������������ �������� � '3!, ��� ')!>4 �������� ���� ��� ����� ��� ������ # 0) �� � ' �� ��� 0) �� � - �� �����������!

����� ����������� �&'��8"9 ��7���� 3�:7����*������ %��7���� � ���������� � %��������� .����

/ ����� �������� ��� ��# �� � ����& ��� �&��� ����� ������ �� #��� �� �����������! "�� �&��� ����� ���� ��� �������� ��������� # ���������� ����� ' � #������ � �A���� (� ��� J�! 7����� # �&��� ����� ���#��� � �� ��� �� �� ���� ������� # ��� ���� ����� ����� � ��� ��� �� �##����� �� ����& ��� ���� �./&'0-1! B������� ������ # �&�������� ��� �������� ' � #������ � � ������ ��� �������� ������ �� ����� # ��� ���������� �������� -!( 0-!( �56� # ��� ���� ��&� �! "��� ��� ���� �������� # ������� # �&��� ���� ��������� ���� �./&'0-1 ���� ��������� � ������� ���?����� ��������� ��� ��������! "�� ������ ������ � ������� �� )!0 �56� ��� ��� ������ ��������� �� 0-!( �56�!�&����� � ���������� � ��� �� � ���� �&������ �� �� ��� ���� ����������� �� ��� �������$ ��� ��������� ������ # ���� ����� �� ��������!

����� ����������� �&'��8"9 ��7��� 3��������%��7���� � 3������ ���;�� ����������������� 1��� ���� � %��������� .����

" #���� ��������� ��� �����$���� # �./&'0-1��������� ��������� ���� �������� ������ ���&����� �� �&� ���� ��� ���� �� ��� �������������� ������� � ���� �� ������� �6��!�*�� �� � � ����� # ��� ��� ��� ���� ���� �� ������� ������� # ��� �����������������!09�0> *����� �0 �� ��������� # �������

����� �� ������������� ���� �������� �7*�� ���� � ������ �������� # ��� ��� ��./&'0-1 �� ��� ���� ���� � # �������� �� ���6������ �./&'0-1 ���6 ������@ �J� ���� � # �� ,) ��#������ �� ���� # ,!) �56� �./&'0-1@ �*� ���� �# �� -' � #������ �� ���� # ,!) �56� �./&'0-1@��� ��� ���� ������ # �� -' � #������ �� ���� #,!) �56� �./&'0-1! "�� ������ �� # ���� �� �&��� �� �./&'0-1 ������ ����� 01 ���� ��� 0(& �������� ������� ������ ����� 09 ��� #������� ������ I����������� ��� ��� ������ �����-, ���! =�� ��� ������ ������ # � ��������� # ���������%��!

����� �� ���� � ���������� # �./&'0-1�������� �� ��� �#�� ��������� ���� �%����� �� �� ��������� �$���� �%����� # ,!) �56� ����!J�� �� ���� ��� ���� �� ��� #������ �� ������:0) ��� ,) ��� 0 �� - �� ' �� ��� -' �! ���� �� ��������

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 6: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

����� ��� ���� �����@-) ����� �(, �� � ��������� ����6���� ������ ��� � �� ���� #���� ���� ������� � ��5 �� ������� ����!-0

"�� ������ # ��� ���� ������� �6� ��������� ��� ���� �� � ����� �������� �� �������# ���� ������ �������� -' � #������ � ! ����&��������� ���� # ����� ����� ���� �� ��&������ �� A���� 1! �� ��������� ��� ���� ����������������� ��� ��� ������ # �&��� �����!��� ��� ���������� ��� %���� �� �� ���������&� �D�� �� ������ ��� ��� �� �##����� �� ����& ��� ���� �./&'0-1! �� �������� ��� ������-' � #������ � �� ���� ��� ���� ��� ���������� ������ )!( �56� ��� ���� �./&'0-1!/�������� ���� # ��������� ��� �./&'0-1������ � ���&��������� ������� �� ���� �����&������! �&����� � ���������� � ��� �� � ����������� �� �� ��� ���� ����������� �� ��� �����!

����� ����������� �&'���<" ��7��� � 3��������%��7���� � .���� �0�!�" ������ .����� �� 1��� ��#7������ �0�!� �=�� �������

��� �� ��������� # -!) �56� # ��� *+�,�-��������� ���� �./&''3-� ������ � $��& �����#�� ��������� ��������� # ��� # ��� *+�,�-����� �� ���� ���� �� ������ ��� # �� ����=&> #����� ������ � ����� �A���� 3��

���� ������! � ������� ��� ���� �� ��� ������# �� �������� ������ ���� ����������A���� 3�� ��� ������! ������������ �� ������&��� # ����� ����� $��#�� ��� ������ �� ������� ���� �� ��������� ��������� �� ������&� # *+�,� #�������� ��D� � ��������� �� ����� � �� ���� �A���� 3J�! "�� �������� # ���� =&> #������ # ���� ���&������ ��� �&������ � ������� �� � ����� ������ ������ ����� � ������� # ����� ����� 0,4 ��*+�,� ��D� � �������� � ���� � �����������!

*'3�-33'�,

"��� ����� ���������� ��� ���� �� ��������&������ # ����� ��� ������� �� � ����� ��������� ��� ���� ��� ������ ��� # ����� ����&����� � ����� �� ���� �� �������� ����&������ ������! E��������� ������������ ����6��� #�%������ ������ �� ����� ��� ������ � �����6� �� ������� ����� �� ����������� ����������� # ����� ��� ��� ��������� ���&�������� ��� ������! ���� ��� �� � �������� �� ���������� � ��� ���� �� �� ������� #����������� 6����������� ��� �� ����������� ����� ���� �����$���� ����6� # ����

����� � ���� � ��� ��6������ ��� ���� A������ J��� �� ��������� #,!) �56� �������� ����� ������ ���� � �./&'0-1 /���������� ������ ���� ����

��� ����!�!

�� ������������

�� ���������

��� # �./&'0-1 � �56�� ,!) ,!)�� �� # ��� ��� �� ���� ��� ��� ' '.�� � # ���������� �756�� �� ������ ����� 0!9� )!1 -!-� )!-���� � �������� � 75 ��� )!>3� )!0' )!1)� )!)>"�� ��8����� ��� �� ��� )!0 7 # �!�! ��� )!( 7 # ��@ ��� ������� ��� ��������

��##��� ������! ��� ������ �� ���� ������� � # ��� ���!

����� �� ���� E��� ��� ���� � *��������� *���� A������ J����� ��������� # ,!) �56� �������� ����� ������ ���� � �./&'0-1/���������� ����� � ���� ����

��� E��� *��� �!�! ���N�5 7� ��� ���N�5 7������� ���J�������������

0) �� � -' � -0!9� 0!' 03!-� 0!) 39!940) �� � ' � 0,!0� 0!, 1!-� 0!) '3!,40) �� � - � 00!)� )!> '!(� )!' ')!>4

��� ������ �� ���� ������� � # ��� ��� ��� �� ' # ���� ����! "�� ������ ���������������� ��� ���������� �� �������� ��� ���� # �� ���� ��� �� ��������� ���� ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 7: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

#������ ���������� ������� ������������ ���&�������! "�� ��##������ ������� �� �� ���&����5�� ���� ������� ����� ����������� ���������� ��� � ��� ��������� # � �������� ��������&���� ������� � ��� ���� � ���� ���� �� �������� ��� ������� # ����� ��� ����������� ���&����! "��� ��������� �� ����� �������� ������ �������� ����� ��������� � ��!"�� ���� �������� �� ���� ����� �������� ����

���� ���� �����$���� ���������� �� ��� ��&���������� ������ # ��� ���������� # ����� �������! ���6��� �� ��!-- ���� �����)!,4 �������������� # ���� �� �������� ���&�������� ������������� �� � ���� # 1 ������� ������ ��� F����-, ���� ����� 03 �,(4 �������������� ���������� ������� #��& ����� # ���� �� �������� ������������������������! ������ �� ��!-' ���� ���

����� �������� # ������ ��� � �� �� ���� ���� ������� #������ �� �� ��������� # ������ -�&�& ������������������� �� � ���&������ ���� ��� # () �56�! =������ ���� ����&���6��� ������������� ���� ��������� -( �,>4 �������������� #������ ��&�� ����������� � ���� # 0- �!-,�-( ���� ������ ���#����� � ������� � ������ �� ��� ����������&���� ����� ���� ���� ������ # ����&���6���������������� ����� �� ��� ��������� �!-1

"�� ��� # ���� ���� ��� ���� � �������&��� ����� #������ � ������ ���� �� �!�!�� ��������� # �./&'0-1 �� ��� ������ ������"���� -� �������� ���� �./&'0-1 ��� ��� 39!94������������� #������ �� �� ��������� ��� ���� # -' �! � ����������� ���� # ���39!94 �� �������������� $��� ��� � #

����� �� ������������� � ����� �������� #�&��� ��� �&����� �� �� ���� �������! ���� ��� ��������������� �D�� ������ � ���� # ' � #�&����� 3)4 � ! "�� #������ ��� ���� �� ���� ����& ���� ���#� � ����� �� �������� ���� � ��� �� ���:�0� �J=� �-� )!( �56� �./&'0-1� �,� ������� �'� )!0 �56��./&'0-1� �(� )!( �56� �./&'0-1� �1� -!( �56� �./&'0-1� �3� 0-!( �56� �./&'0-1� ��� �9� -!( �56����� ��� �! "�� #������ ��� ���� �� ���� ����& ���� ���#� � ����� �� �������� ���� � ��� �� �J�:�0� �J=� �-� 0-!( �56� ���� ��� �� �,� 0-!( �56��./&'0-1� �'� �J=� �'� 0-!( �56� ���� ��� �!������ ��� ������� # ��� � ����� ����� ��������� ������ �� ���� ���� ��������� �����! ������� ������ ��� ������� �� � ������ ���������� ����� ���� � ������ ���!

����� �� ������������� � ����� �������� #���#������ ���� ������ �������� ������ �0 ��� �(,�� �� ���� ������� ���� ��������� �&����� �����! ������� ����� ���������� �D�� ������ � ����# -' � #������ 3)4 � ! "�� #������ ��� ���� ������ ���� ���� ���#� � ����� �� �������� ���� ����: �0� �J=� �-� )!( �56� �./&'0-1� �,� �J=� �'�)!0 �56� �./&'0-1� �(� )!( �56� �./&'0-1� �1� -!( �56� �./&'0-1� �3� 0-!( �56� �./&'0-1� ��� �9� -!( �56� ���� ��� �! ������ ��� ������� # ���� ����� ����� ��� ������ ������ �� ���� ������������� �����! ��� ���� ������ ��� ������� ��� ������ ��� ������� ����� ���� � ������ ���!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 8: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

������ ��##������ �� ��� ���� � ��� �������&���� �� ��� -'&� �� � ���� �A���� '�! "��� ����������� �� ��� � �#I�� # ��� ���� ���� �������� ��� ���� #������ �� �������! "�� �������&��� # �� �������������� �� ��� ' � ��� - � �� ������ ���� ���� # '3!, ��� ')!>4� ������������"���� -�!"��� ����� ��� ���� ������� �� ���� #���&

����� ��� ����� #������ �� �� ��������� #��������� ��� ������ ������� � �� ������������� �� ��� �� ����: �&� � �� ��� 3)4 � ������� *+�,�- �� ��� ������ ����! "�� $�� ��� #���� ��������� #������ � ��� ���#��������� � ����� ��� ��������� �������� # ��� �&� � ��������� ��� #������ �� �� ���������# ��� #������ �����: �0� ��� �������� # �&� � �� ������ ������� �� ��� ���������� ���������� - � #������ 3)4 � @0- �-� ���� �� ���6��� � � ���� ������� ���� �� ��8��� ���������� ��� �������� # ���� � ���� ��� ����� � ����@ �,� ����� ��6� �� ��� �����&��������� ���� � ���� ����� �� ��� ���� #����������� �� �� ���������@ ��� �'� ��� ��������� #���������� ��������� ������� ��� ���������&����� ���� ��� ���� ������ ���� ��� ���� �&����� �� ��� ����! "�� ���� �� ����� ##������� ��� ����� � ��� ����� ��� ���� �� ����

������ ��������� ��������� # *+�,�- �� ��������� �� ����!"�� ���� �� ���� ����� ����� �� ���������&

����� ������� # ����� # �./&'0-1 ���������� # �&� � �������� �� ��� �� ����&������ ����! "�� ������� # ��� �� ����������� ����� ���� # ���������� ���� �����$ �� �� ����� I�������� ��� ����&��� �A���� -�� ��� �7*&����� ����� #������ ��� �A���� ,*�! � ������� �� ��� �����# ��� ����� ����� �&��� ��� ������ �� ���%�����&�����$� ���� ��� ��� ��� �����&���� � � � ������ �A���� '�! A����� ��� ������# ���� ������� �6� ������ ��� ��� &���� � ��� �� ��� ���������� # �������$��##����! "�� #�������� �##��� # �&� � ���������� ��� ��� # ���#����� �� ��� �������������� ��� ���� ���� �� � ����� �������� #�*��! "�� ����� # ���� ������ ����� ��� �������� ���� � �� �� ������� ������� # �&��#������ ��������09 ��� #��� � �� � ������� � ��������� �������� ���� �� ��� #, &��� ����� �� ��� �� ���� ��������� ���!0> ;� ������ � ���&��������� ��������� �*�� ������ �� ��� ���������� ���� �� ��������� ���� �&� � ��������� ��� �./&'0-1�A���� 1�! =� ��� �##���� ��� ���� � ��� ������# *����� �0� � ������ # ���� ����� �������-)

��� �(,� ����� ��� � � �5��" ������� ���� �� ���� �� ����!-0

"�� ������� �� �������� ������ # ��� ��������� �� #��� ��������� ���� ��������� �����&������ �������������! ����� �� �� �� ����&�� ������� ���� ���� ������ ���� ����������������� ����� ����� ���6��� # ���������'

������ �������� ����� !-3 /� ��� ������������ ���� �� � ���� ����� ��� ��� # ��&��� ��� 0?��� - ������ �*� ������� �����./&'0-1 ��� ����� ������ �������� # ����� �� �&��� ��& ��� �� �7� �����!1 ;� � &����� � �� ��� ������ ���� �� ���� �&����������� �� ������� ��� ������� # �./&'0-1���� #����� � ��������� ��� �������� # �������������� ����� �� �����! "�� ��� ���� ����# ����� ����� ���� ��� �� ������� �� �&����������� ������ #������ 3)4 � � ���� � ��&����� ��##������ ������� ����� ���� �������! "�� ���������� # �&��� ��������#������ 3)4 � �� � ����&������� ���� &����0- ��� ������ ��� ��� ����� # ��� ��� #���� ����� ����� ��� �� ����� �������! "�� ���6# ���������� �� ��� �� �&��� �������� �� ��&����� # �./&'0-1 �� ��� ��6��� ����� # �������&�����$� ��##����� �� ��� ��� # ��������5������

����� �� ��� / ����� �������� # ��� *+�,�-����� ��� ���� ��������� ��� �������� ������� ���� =&> #������ # ��� ������ ���� ���� ������������ ��� �� ��������� *+�,�- ���� �./&''3-!������ ��� ������� # ��� � ����� ����� ��������� ������ �� ���� ���� ��������� �����! ������� ������ ��� ������� �� � ������ ��� ��&����� ����� ���� � ������ ���! �J� B��� ������ ��������� �������� �� ���� =&> #������ ���&������ �� �� # ��������5 �5 ��! "�� ����� ���# �� ��� ��� �� ��� ���� �� ��������� � ��� � & ����� �� ���!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 9: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

������ ������ ����� �� ������ � ����� ���6���# ��� � �� ������ ������ �� ��� -!"�� ���� �������� �� ���� ����� ���� ���

��� �./&''3- ��� ������ �� ���������&����� ������� # ����� ���� ����� � *+�,�-��������� �� ��� ������ �� ���� #������ � ���������� �� �� ���������! =&> #������ # ������ ���� �������� -' � �#�� ��� �� ������&��� ����� � ��%�����&��������� ������� �� ���*+�,�- ����� �A���� 3�� ��� ��D� � ���������A���� 3J�!"�� �� # �� �� ��������� �� ���� �� ���

��� � ��� � ������ # ��� ������� �� ��6��� ����� �� � ����� � ���� � ��� ��������� # ������ �� �������� ��� �� �� ������ ����� ��������� �� ��� ��� ��� �����%���� �������# ��� ����������! "���� ������� ��� ��������� ��� �D� ��� ������ # ���� �� ������������ � �� � �� ��� �� ���! "��� ����� ������ �� ���� � ������� ���� ��� ������� #���� �������! ;� ���� ���� � ����� ��� ��I����� #�� � �� ������! A���� �� ���� � ��� �D� ����##��� # �� ��� ������� �� �� ��������� ������� ���� 0) �! ! =����� �� # ��������� ���� �� �������� ���� �� )!( 7 ���&�����&��##��� ������ ���� ��� �������� ��������� �������! �� ������� ����� �� �������# ���� ����� � � �������� ������ � �����&������� # ������� ���� �� ��������! � ����� #�������� �������� ���� ��������� ��� �� ��&������������ # ��� ������������&������ ������� �� ��� # � ���� ��� �� ��� ��&��#&#���� ����� # ��� �������! ������ ��� F����-,

��� �� ��������� ,) � () �56� �����&������5 ����&���6��� ������������� ���� ���� # � ������ # -( �5 7 ������ ��������! ;��� �� ��!-1 ��� �� ��������� � ��� #0) �56� ����&���6��� ������������ ���� � ��� # � ������ # ( �5 7 �������� �� ��&������! A���� ������������ �� ������� �������� ��� �� # ����� ��� ��� � # ��������� ���� �������!"�� ����� ���� ��� ��6� � ��6������� ���

������� �� ������ # ��� ������ #������ ��� ����������� �� ��������������! ������� ��� ����&���� ��� ������ ������� ��� �������� # ������������������ ������ ���� ���� �� ���#�� �����& ����� ������%��!"�� ����� ������� ���� ���� �������

#������ ���� � ��� ��6������� #������ ���� ���������� ��� ����� #���� ������ ����� ���� ��������� ���������� ������! "�� ���# ������� #�������� ��� ����� �� ������� ���� ������� # �� �������� ����� ������

��$ �� ���� ��� ���� ��� ������ ������ ����� ��������� ������� !

��(,�1.�*2��,�3

"���� ������� ��� ������� ���� #���� # E����� =����� ������ ����� =������ ������ �� 2�('930 ��� �./ J���� �� *���������! "�� ����� ���� ��6� � ����6 ����� =���������� K�6�� ������� *��� ��./�� ��� �����=�� ��=E .������� ��������� 7��!� #��������� ����������!

%�#�%�,��3

0! =� ��� <! 0>>>! ������ ��������� ���& ��: "�� ���� # �� ����� &����������� ����&���� ����! J���� J����� ���� 0'9>:0'0?0(9!

-! =� ��� <� ;���� �! 0>>3! ��������� �������# ����� ��� ��! ���������� ����������01:99>?9>9!

,! =� ��� <� ;���� �! 0>>3! ������ ����&����� ��� ��: ������� ��������� ��� ���&����! ��������� ������� ���� ��� ��� 3:093?0>(!

'! 2��� *� =���� �� ;���� �� /����� �! -)))!B�������� # ��������� ������� � # �����!������ B�D� � ,0,:0,(?0',!

(! 2���� �.� =����� �2� *��6 �B� "��� ��! 0>>>!��������� ����� ������������ ����� ��&����� ���������� # �&� � ���! ���������������� ���� ��� ��� >:-0,?--)!

1! ��D��6 ��� =� ��� <� ;���� ��� /������7! -)))! �������#������ �##���� # ����� ���6����������� ����� ������ ��������� ������������� ������� �&� �! ��������� ������� ������� ��� 0):01,?031!

3! �� .� K���� �*� = ��� J7� =����$��� �7�=���� ��� ����� �"� ;���� ��� /����� �7! -)))!�&��� ��������� �� ��� �� ���� ��������� ������������ �� # �&� � �� ��������� ����� ��&'() ,� ��������! < ��� ��� B�� "�� ->-:>-0?>-9!

9! �� .� /����� �7! -)))! ��������� ��������&����� ������� � ��� �(, ���� ������ ���� �&�������� �� ���! ��� ����� ��������� -9:0,0?0,9!

>! O�� 2� "��� �� ���� ++� /����� �7� K�D�6 7!-)))! /� ��� ��������� # � ����� ������������ � ������� ������� �� ������ #���&�!��������� ������� ���� ��� ��� 0):00?01!

0)! ��D��6 ��� J�#�6� B� J�#�6� �A� ;���� �7� ���� =J� ;���� ��! 0>>1! ���������� # &����� �������� ����� ��� �� � ��D�& ���� ���������! ������� ���� ��� ��� 1:-13?-3-!

���7 ���/�/="��"/�� �A ��"/=B�=B ���� �7/�� �7/2��B�= ��

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����

Page 10: Bioavailability and efficacy of antisense morpholino oligomers targeted to c-myc and cytochrome P-450 3A2 following oral administration in rats

00! ����������� 2K� ��A����� �*! 0>>3! 7������������! =������ -31:1)?11!

0-! K�� J"� "� ���� < � =��� *<! 0>>1! ����������� ��� ��������� ����� �� ���� ���������!� < ������ -3)�(� �� 0�:231,?2333!

0,! ���8����� <�� /����� �7! 0>>(! /�������� # ����� ����� � �'() ,�- �� �� ��������� ���&�������� ���������������� �� ���! < ���& ��� B�� "�� -3(:01)9?010,!

0'! ������ 2�� ������ ��! 0>,0! �������� #���� #������ ������ ������� � ���! �������� 0-:091!

0(! 2�D���D A! 0>9>! "�� ������ ����� ���&�� � �'()�! ��� ��� ��� '):-',?-93!

01! =�� �6��*! 0>91! �6����: � ����� ���������� � &���� ��� # ����������� ��� ��� ��6�������������� # ����! ��� ����� ��� 03:,,0?,'9!

03! 2������ �� ���� �! 0>9-! ��� ��6�������� -����! ��� +6: ����6 ��66�! �� '(?000!

09! ���� �� 2�� +� F���� �� �������� ��� �������6�� ����6 2+! 0>>9! E�� # ���#������ ���� ������������� �� � �6� # ���� ��������� �#�� ��&���� �������� � �� ���! < 7�� *��� ��� 0,0�,�:-(0?-(1!

0>! A��� <� "� "� ����� �� J������� J�2������� "7! 0>>,! * ����� # ���#���������� ������ ������� � �������� ��� ����� �� � �6� # ���#����� ���������� �� ���! B���� ����� ������� 0)0�=���� (�:0>>?-)1!

-)! =���6��� =B� =���6�� ".! 0>>>! *��� ����� ����# ������ ����� ��� ������ �����: B�&����� ��� �� ������! *�� ��� ,(:>3?001!

-0! K��� B� A������6�� =� �� �# � J�6 ��� ��B���� ! 0>>>! B������� # �� �� �(, �%����

���������� ��������� # ���������� # ��� �(,� �� �� ��&0� �A&6����J ��� ���5���!������� 09:-3-9?-3,9!

--! ���6��� �7� J����� �� 2������� <� *��� =<�*� ��� 77� �������� <2� �������� <�! 0>>9!��� ��� �������������� # � ��������&��� ������������ �*2� 1'0-9��: * ��������� ��� ������� ����! ��� ��� 0(:(9,?(>0!

-,! ������ =� F���� �! 0>>9! ��� ��6������� ����������������� # ��������� ������������� #���&��� �� ��� ������� �� ���������� �� �����& ����� ��� ���! /�: *6� ="� ����! ��������������� ��� ����������� 0�� ��! ��� +6:=�����&.����! �� (-(?(',!

-'! ������ =� F���� P� 7� F� F�� � "� ���� <��+�� <� *�� � ����� �J� ���� /� <���� F� �� ��!0>>(! �������� ������ ���������� ��� �� ������������ �� ��� # � ����� ��������� ��������&���� #������ �� �� ���������! J���� ���& ��� ():(30?(31!

-(! ������ =� /�� ��! 0>>3! ����������� �� ��������������������! ��� ��� "�� 31:0(0?01)!

-1! ;��� � *�� O� F��� P� +� �� ������ =� F���� �!0>>>! ������ �������� ��� ��� ��6������� # � ���� ���6��� ��������� ������������ �������� ��� �/� ������� # ����� 6����� � �#�� ���� ���������! �� ���� ���� =�� E=� >1:0,>9>?0,>>'!

-3! =���� �� A��� B� ���� =J�;���� �� =� ���<! 0>>3! � �����$���� � ����� # #� ��������������: ������� -�&�& ����� ���� ���� �������������� ���! ��������� ������� ������� ��� 3:0(0?0(3!

�� ����� B" �7!

#�$�%�& �' �(��)��*$+���& ���*%�*�� ��&, !-� %�, � ����& ����