Biochimie des hormones et leurs mécanismesd’action. Méthodes de dosage, de biologiemoléculaire, et pharmacologie endocrine

Biochemistry of hormones and their mechanismsof action. Methods of dosage, molecular biology,and endocrine pharmacology

G. Assié a, L. Nonnenmacher c, E. Clauser b, J. Bertherata,*a Service d’endocrinologie hôpital Cochin, Paris, Franceb Institut Cochin, Département d’endocrinologie hôpital Cochin, Paris, Francec Service de médecine nucléaire, hôpital Cochin, 27, rue du Faubourg-Saint-Jacques, 75014, Paris, France

MOTS CLÉSHormone ;RIA ;IRMA ;Elisa ;PCR ;Pharmacocinétique ;Récepteurmembranaire

KEYWORDSHormone;Radio immunoassay;Immuno-radiologicalmeasurement assay;Elisa;Polymerase chainreaction;Pharmacokinetics;Membrane receptor

Résumé Les techniques de biologie utilisées en endocrinologie sont indissociables de laclinique : dosage immunologique et biologie moléculaire sont aujourd’hui réalisés enroutine. En comprendre les principes est essentiel pour une bonne interprétation desrésultats. Les outils de pharmacologie sont utiles en endocrinologie afin de caractériser ledevenir d’une hormone dans l’organisme après sa sécrétion, et l’action de cette hormonesur ses cibles.© 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract Biological methods currently used in endocrinology are strongly linked toclinical practice: methods based on immunoassay or molecular biology are now used on aroutine basis. The understanding of the principles of these methods is crucial for validinterpretations of the results. The tools offered by the pharmacology are also very usefulwhen used in endocrinology for the characterization of the distribution and kinetics of anhormone after its secretion in the blood stream, and the action of this hormone on itstargets.© 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés.

* Auteur correspondant.Adresse e-mail : jerome.bertherat@cch.ap-hop-paris.fr (J. Bertherat).

EMC-Endocrinologie 1 (2004) 93–105

www.elsevier.com/locate/emcend

© 2004 Elsevier SAS. Tous droits réservés.doi: 10.1016/S1762-5653(04)00009-7

Méthodes de dosage hormonalet de biologie moléculaire enendocrinologie

Dosage en endocrinologie

L’endocrinologie est une spécialité où la clinique etla biologie sont indissociables : le diagnostic clini-que est confirmé par le dosage d’hormones ou deleurs actions sur des effecteurs. Les premiers dosa-ges hormonaux ont été réalisés en mesurant l’effetchez l’animal de l’administration d’un échantillon àtester (dosage biologique) : on peut citer l’injec-tion d’urine humaine chez la lapine, permettant ledosage de l’human chorionic gonadotrophin (hCG)urinaire en comptant les points d’ovulation au ni-veau des ovaires (technique de Friedman). Cestechniques ont laissé la place à des techniquesfondées essentiellement sur l’immunologie et labiochimie.

Qualité du dosage et du prélèvement

Qualité du dosageAfin de garantir la qualité des résultats, toutes lestechniques de dosage utilisées à des fins diagnosti-ques font l’objet d’un enregistrement à l’Agencedu médicament. Les principaux critères systémati-quement évalués sont :

• la sensibilité ou limite de détection ;• la spécificité ;• la variabilité : évaluation des variations lors dela répétition des dosages dans des conditionsidentiques, d’un jour à l’autre, d’un manipula-teur à l’autre, d’un échantillon à l’autre, etc. ;

• l’exactitude : évaluation de la concordance dedosages réalisés sur différentes dilutions d’unéchantillon ; de plus, pour les immunodosages,évaluation de l’effet du sérum (ou du plasma)du patient sur le dosage (mesure de la « récu-pération » de l’hormone par le sérum/plasma,mesure d’une interaction avec des composésdu sérum/plasma) ;

• la corrélation à une technique de référence(lorsqu’elle existe), l’utilisation d’un standardde référence pour étalonner chaque dosage,etc.Malgré ces précautions, des variations importan-

tes peuvent être observées lors du dosage d’unmême échantillon d’un laboratoire à l’autre oud’une technique à l’autre. Afin de guider le prati-cien, le laboratoire est tenu d’associer à chaquerésultat les limites normales du test.

Qualité du prélèvementLa qualité d’un dosage dépend également de laqualité de l’échantillon qui parvient au laboratoire.

Un acheminement et un conditionnement rapidesdu prélèvement sont essentiels et sont souvent àl’origine d’erreurs dans les centres où certainesexplorations hormonales délicates ne sont pas réa-lisées régulièrement. Il existe par ailleurs descontraintes particulières pour certains dosages :certaines hormones peptidiques comme l’adreno-corticotrophic hormone (ACTH) (adrénocorticotro-pine) sont très fragiles, nécessitant un transportdans la glace au laboratoire et une centrifugationimmédiate pour congélation. La glycémie veineuse,indispensable pour affirmer le diagnostic d’hypo-glycémie, doit également être acheminée rapide-ment car les hématies présentes dans l’échantillonconsomment le glucose. Il existe enfin des types detubes de prélèvement à respecter en fonction dudosage demandé (à préciser avec le laboratoire :prélèvement sur éthylène-diamine-tétra-acétique[EDTA], héparine, tube sec, etc.).La connaissance des techniques de dosage per-

met de mieux comprendre l’origine des variationset les limites d’un dosage.

Techniques immunologiques de dosage1,6

Ces techniques sont les plus répandues : ellesconsistent à utiliser des anticorps spécifiques deshormones. Les techniques classiques de dosage sontle radio immunoassay (RIA), l’immuno radiologicmeasurement assay (IRMA) ou l’enzyme linked im-munosorbent assay (Elisa). Aujourd’hui apparais-sent, notamment avec l’avènement des automates,des techniques nouvelles dérivées de ces techni-ques fondamentales. Trois critères principaux per-mettent de décrire les principes d’un immunodo-sage :

• le type de dosage : direct ou par compétition ;• le système traceur ;• les supports utilisés pour les réactions.

Dosage par compétition et dosage directDans un dosage par compétition, l’hormone à doserest mélangée avec de l’hormone marquée, puisincubée avec des anticorps spécifiques. On utiliseune faible quantité d’anticorps pour avoir un largeexcès d’hormone. Dès lors, l’hormone à doser etl’hormone marquée entrent en compétition pour laliaison aux anticorps. Après isolement des comple-xes anticorps/hormones, on mesure la quantitéd’hormone marquée. La quantité d’hormone à do-ser est inversement proportionnelle à ce résultat.La technique de référence est le RIA (Fig. 1A) : letraceur est radioactif (Iode 125 ou tritium) ; lesanticorps peuvent être en solution ou fixés à unsupport solide.Dans un dosage direct ou immunométrique,

l’hormone à doser est incubée en présence d’un

94 G. Assié et al.

excès d’anticorps. La technique la plus couranteest la technique « sandwich » : l’hormone à doserest reconnue par deux anticorps spécifiques d’épi-topes différents. Le premier anticorps fixe la tota-lité de l’hormone. Le second, couplé à un traceur,marque les molécules hormonales fixées au premieranticorps. La quantité d’hormone est proportion-nelle à la quantité de traceur mesurée. La techni-que de référence est l’IRMA (Fig. 1B) : le premieranticorps est fixé aux parois du tube de réaction ; letraceur du deuxième anticorps est un isotope ra-dioactif. La technique Elisa dérive directement del’IRMA : le traceur radioactif est remplacé par uneenzyme qui catalyse une réaction colorée.Les techniques par compétition sont en général

moins sensibles et moins spécifiques que les dosa-ges directs, et sont surtout utilisées lorsque l’hor-mone ne possède qu’un seul épitope, c’est-à-direque l’on ne dispose que d’un seul anticorps spécifi-que. Citons l’exemple du cortisol, encore souventdosé par RIA.

Différents systèmes traceursLes isotopes radioactifs ont été les premiers tra-ceurs à avoir été couplés aux hormones et auxanticorps (RIA et IRMA). Des isotopes de demi-vierelativement brève sont généralement utilisés(iode 125), ce qui rend les trousses de dosagerapidement périssables. Ces produits exposent auxrisques des radiations ionisantes lors de leur mani-pulation. Pour ces différentes raisons, d’autres sys-tèmes ont été développés et les dosages par com-pétition sont parmi les seuls qui utilisent encore laradioactivité.La colorimétrie est aujourd’hui très utilisée, no-

tamment dans les automates : une enzyme quicatalyse une réaction colorée est couplée à unanticorps. L’intensité de la couleur du produit estmesurée. Les enzymes les plus courantes sont laphosphatase alcaline, qui transforme le4-nitrophénylphosphate (incolore) en 4-nitrophénol(jaune) et la peroxydase (substrat : orthophénylènediamine associé à l’eau oxygénée). Ces enzymespeuvent également catalyser la formation de com-posés luminescents (c’est-à-dire produisant de lalumière spontanément) : on parle alors de chimio-luminescence. On peut citer l’action de la peroxy-dase sur le luminol. L’Elisa est l’exemple typed’utilisation d’un traceur enzymatique. Ces techni-ques présentent des limites spécifiques à connaî-tre : certains composés inhibent les enzymes,comme l’EDTA (inhibiteur de la phosphatase alca-line). Par ailleurs les techniques optiques de lec-ture peuvent être faussées par la présence en abon-dance dans l’échantillon de certains composéschromogènes comme la bilirubine (ictère sévère)ou l’hémoglobine (prélèvement hémolysé).Il existe d’autres traceurs comme la fluores-

cence ou les microparticules (or, argent) plus rare-ment utilisés. Citons enfin des techniques en déve-loppement consistant à caractériser la formationdu complexe immun des dosages sandwich par me-sure du transfert d’énergie entre deux particules,chacune étant couplée à un anticorps (exemple :technologie Trace®).Le couplage du traceur à l’anticorps monoclonal

peut être direct, covalent ou non. Parfois ce cou-plage est réalisé par le biais d’un autre anticorps.Par exemple : anticorps monoclonal de souris cou-plé à un anticorps antisouris marqué (plus facile àproduire).

Différents supportsLes réactions en phase liquide consistent à incuberen solution les anticorps et les hormones à doser. Laséparation des complexes anticorps/hormone faitensuite appel à différentes techniques biochimi-ques de précipitation, d’adsorption (par exemple,

A

B

Figure 1 A. Le dosage par compétition radio immunologic assay(RIA) : les hormones à doser (en bleu) sont mélangées à deshormones marquées (en jaune) ; les hormones sont en excès parrapport aux anticorps (en rouge), ce qui entraîne une compéti-tion entre hormones à doser et hormones marquées pour lafixation aux anticorps ; on mesure la quantité d’hormone mar-quée fixée aux anticorps qui est inversement proportionnelle àla quantité d’hormone à doser.B. Dosage direct immuno radiologic measurement assay (IRMA) :des premiers anticorps (en rouge) sont en excès par rapport auxhormones à doser (en bleu), permettant une fixation directe etcomplète ; des seconds anticorps (en vert), également en excèset qui sont marqués, se fixent sur un autre épitope de l’hor-mone, réalisant un « sandwich » ; on mesure la quantité d’anti-corps marqué fixé qui est proportionnelle à la quantité d’hor-mone à mesurer.

95Méthodes de dosage, de biologie moléculaire, et pharmacologie endocrine

anticorps biotinylés adsorbés sur de la streptavi-dine). Parfois, ce sont les hormones libres qui sontéliminées (par exemple, adsorption sur charbonsactifs).Les anticorps sont le plus souvent liés à un sup-

port solide comme le tube de réaction : il s’agit deréactions en phase solide. Les tubes peuvent êtreassociés en plaques. Les anticorps peuvent aussiêtre fixés à des microbilles magnétiques, et récu-pérés par l’application d’un champ magnétique.Parfois enfin, les anticorps sont fixés sur des mem-branes.Parfois les supports sont complexes : citons le cas

particulier des bandelettes de dosage qualitatif desb-hCG urinaires (test de grossesse). Il s’agit d’undosage sandwich. L’urine migre par capillarité lelong d’une membrane. Dans la partie inférieure,des anticorps monoclonaux de souris sont libres etse couplent en phase liquide aux molécules d’hCG.Ces anticorps sont couplés à des particules d’orcolloïdes leur donnant une coloration après réhy-dratation (par l’urine). Ils vont migrer avec l’urineet rencontrer deux lignes d’anticorps fixés à lamembrane : une première ligne d’anticorps anti-anticorps de souris (contrôle positif) et plus loin desanticorps anti-hCG reconnaissant un autre épitopede l’hCG. Ainsi, en cas de présence d’hCG, les deuxlignes d’anticorps fixés se colorent, et en l’absenced’hCG, seule la première ligne se colore.

Limites des techniques immunologiquesLa spécificité des anticorps est parfois insuffisante :il peut exister des réactions croisées (par exemplecertains anticorps utilisés pour le dosage du cortisolreconnaissent aussi certains précurseurs comme la17-hydroxyprogestérone). Il existe, pour certaineshormones, des formes particulières peu actives,parfois abondantes, et que certains dosages identi-fient comme la forme active (exemple : la big bigprolactine, pas ou peu active, peut conduire à undiagnostic erroné d’hyperprolactinémie9). Un anti-corps peut aussi ne pas être spécifique de la formemature d’une hormone peptidique et reconnaîtreaussi son précurseur (par exemple anticorps anti-insuline reconnaissant aussi la pro-insuline). Uneinterférence peut aussi être observée dans certainsdosages avec des médicaments (par exemple dosa-ges de catécholamines). Ces problèmes sont résolusen développant de nouveaux anticorps ou en puri-fiant l’échantillon à doser par des procédés biochi-miques comme la précipitation (au polyéthylèneglycol par exemple) ou la chromatographie.Inversement, la spécificité des anticorps est par-

fois excessive : lors de certaines sécrétions tumo-rales, les hormones peptidiques ne sont pas matu-rées normalement (pro-insuline dans les

insulinomes, pro-opio-mélanocortine dans les tu-meurs hypophysaires ou neuroendocrines) et peu-vent ne pas être reconnues par un dosage trèsspécifique de la forme mature (insuline et ACTHdans ces exemples).Les techniques sandwich (IRMA, Elisa et dérivés)

peuvent sous-estimer de fortes concentrationsd’hormones : dans ce cas, après saturation despremiers anticorps (fixés à un support), des molé-cules hormonales libres persistent dans le milieuréactionnel. Le deuxième anticorps, au lieu de sefixer exclusivement aux molécules hormonales por-tées par les premiers anticorps, se fixera sur desmolécules libres, et sera éliminé après rinçage.L’activité mesurée ne sera alors pas maximale. Àl’extrême, l’ensemble des deuxièmes anticorps sefixe à des molécules hormonales libres et aucuneactivité n’est mesurée. Ce phénomène est appelé« effet crochet ». Le dosage de plusieurs dilutionsde l’échantillon permet d’identifier ce problème. Ilse pose en pratique essentiellement pour des hor-mones dont les concentrations peuvent s’éleverconsidérablement dans certaines situations (parexemple la prolactine dans les macroadénomes hy-pophysaires lactotropes4).Certains patients produisent des anticorps qui

peuvent interférer avec les dosages : il peut s’agird’autoanticorps dirigés contre l’hormone à doser(exemple : anticorps anti-insuline, anti-thyroglobuline), ou d’anticorps dirigés contre desanticorps utilisés par le test (cas des patients pro-duisant des anticorps anti-souris après certainesimmunothérapies ou anticorps hétérophiles chezdes sujets exposés aux animaux). Dans ces situa-tions, les valeurs mesurées sont en général sous-estimées. On évalue la présence de ces anticorpsinterférants soit par dosage direct, soit en mesu-rant le « pourcentage de récupération » : l’hor-mone est dosée dans le sérum du patient puis dansun mélange du sérum et d’une faible quantitéconnue d’hormone purifiée ; lorsque la différencemesurée est inférieure à la quantité d’hormonepurifiée ajoutée, on parle de « récupération » del’hormone par le sérum du patient.

Techniques biochimiques de dosage hormonal6

La biochimie garde une place essentielle dans ledosage des hormones, en permettant de :

• purifier des échantillons avant dosage immuno-logique : ce procédé permet l’élimination decomposés qui interfèrent avec le composé àdoser ;

• doser directement certains composés qui pos-sèdent des propriétés physicochimiques parti-culières.

96 G. Assié et al.

ChromatographieLa chromatographie permet de séparer des hormo-nes d’un échantillon en faisant migrer celui-ci àtravers une phase stationnaire, en faisant interve-nir des mécanismes physicochimiques variables :séparation selon la taille (chromatographie d’ex-clusion), selon la charge (chromatographie échan-geuse d’ions), selon l’affinité pour une molécule(chromatographie d’adsorption/affinité), selonl’hydrophobicité (chromatographie de partage).Le produit de séparation peut être utilisé de

deux façons : il peut servir d’échantillon pour uneautre technique de dosage, permettant par exem-ple l’amélioration d’un immunodosage (chromato-graphie préparative), ou être directement analysélorsque l’hormone à doser possède des propriétésphysiques particulières comme l’absorption de lu-mière d’une certaine longueur d’onde (chromato-graphie analytique). Les techniques préparativesreposent le plus souvent sur des chromatographiesen phase liquide ; une des plus courantes est unechromatographie d’exclusion, la « gel filtration » :un gel de microbilles calibrées permet le passagede molécules jusqu’à une certaine taille (exemple :colonnes SephadexTM). La technique analytique laplus utilisée est la high pressure liquid chromato-graphy (HPLC), par exemple pour le dosage desdifférents métabolites des catécholamines urinai-res.

SpectroscopieLa spectroscopie regroupe un ensemble de techni-ques optiques qui consistent à soumettre une subs-tance en solution à des ondes lumineuses de lon-gueur d’onde définie et à mesurer l’absorption(spectrométrie) ou l’émission de lumière après ex-citation (spectrofluorimétrie). Ces techniques sontutilisables pour certaines substances qui ont despropriétés d’absorption ou de fluorescence particu-lières. Ces techniques sont utilisées pour identifieret quantifier une hormone dans une fraction dechromatographie ou pour révéler des immunodosa-ges.

Autres techniquesD’autres techniques biochimiques sont utiliséespour purifier des échantillons avant les dosages,comme la précipitation (exemple : précipitation del’échantillon au polyéthylène glycol avant le dosagede l’insuline dans le surnageant), l’électrophorèse,l’adsorption (charbon actif).

Autres dosages en endocrinologieEn endocrinologie, le taux d’une hormone n’est pastoujours interprétable sans le taux du produitqu’elle régule. Le dosage de ces composés régulés

fait appel aux techniques de biochimie classique(glycémie, calcémie, etc.) ou de dosage hormonal.Les glandes endocrines peuvent être le siège de

réactions auto-immunes. Le dosage des autoanti-corps fait appel aux techniques d’immunodosagedécrites ci-dessus. L’Elisa est la technique la pluscourante (dosage des anticorps antithyroglobulinepar exemple). Des méthodes compétitives (RIA,enzymologic IA) sont également utilisées. Une tech-nique très courante est l’hémagglutination pas-sive : il s’agit de fixer l’antigène spécifique del’autoanticorps à doser sur des hématies ; la fixa-tion des anticorps entraîne une agrégation des hé-maties que l’on mesure. Cette technique est simplemais semi-quantitative. Enfin certains autoanti-corps sont mis en évidence par immunofluores-cence indirecte : on mesure la fixation des autoan-ticorps sur des coupes histologiques de la glandeétudiée. Cette technique est non quantitative etdépend fortement de la qualité des préparationstissulaires : elle est peu utilisée (par exemple dé-pistage d’anticorps anti-îlots dans le diagnosticétiologique du diabète de type I ou anticorps anti-surrénale dans la rétraction corticale des surréna-les).Des marqueurs tumoraux sont également utiles

en endocrinologie. La thyroglobuline est probable-ment le marqueur le plus souvent dosé : la techni-que Elisa est souvent utilisée. Étant donnée lafréquence des autoanticorps antithyroglobuline,une mesure de la récupération et un éventuel do-sage de ces autoanticorps sont essentiels. Lesautres marqueurs tumoraux en endocrinologie sontles produits des tumeurs neuroendocrines (calcito-nine, chromogranine A, etc.) : leur dosage estprincipalement réalisé par des immunodosages.

Biologie moléculaire en endocrinologie

Le champ d’applications de la biologie moléculaireen endocrinologie s’étend rapidement, que ce soitdans l’élaboration de nouveaux outils diagnostiquesou de thérapeutiques de nouvelle nature.

Diagnostic moléculaire3,7

Il s’agit essentiellement de la recherche de muta-tions des gènes codant pour des hormones, desrécepteurs, ou des éléments de voie de signalisa-tion ou de régulation. L’intérêt est multiple : com-prendre la physiopathologie, préciser un sous-typeparticulier d’une maladie (éventuellement un pro-nostic associé), diagnostiquer une pathologie endo-crine multiple devant une forme pauci- ou mono-symptomatique (néoplasie endocrinienne multiplede type 1 ou 2, complexe de Carney, etc.), pouvoirétablir un conseil génétique ou effectuer un dépis-

97Méthodes de dosage, de biologie moléculaire, et pharmacologie endocrine

tage familial. Plusieurs tumeurs endocrines sontfréquemment associées à des mutations : parexemple mutation de rearranged during transfor-mation dans les carcinomes médullaires de la thy-roïde. Ces mutations peuvent être somatiques (uni-quement dans les cellules tumorales) ou germinales(dans toutes les cellules, et donc transmissibles à ladescendance). Les polyendocrinopathies sont éga-lement souvent associées à des mutations, en géné-ral germinales (exemple : néoplasie endocriniennemultiple de type 1 ou 2) plus rarement somatiquesmais présentes dans différents tissus (syndrome deMac-Cune Albright). Dans les polyendocrinopathies,l’identification d’une mutation est un élément es-sentiel du diagnostic. Dans les déficits en 21-hydroxylase, la nature des mutations permet deprédire (notamment en anténatal) la sévérité del’atteinte.La recherche de mutations est réalisée essentiel-

lement par séquençage de portions de gènes candi-dats. L’acide désoxyribonucléique (ADN) est obtenu

depuis des lymphocytes (recherche de mutationsgerminales) ou est extrait d’une tumeur (recherchede mutations somatiques). Des portions de gène dequelques centaines de bases sont amplifiées parpolymerase chain reaction (PCR) (Fig. 2A) puis sé-quencées (Fig. 2B).Même dans des situations de forte probabilité

clinique, on ne parvient pas toujours à identifierdes mutations : en effet, seules quelques régions dugène candidat, essentiellement des régions codan-tes, sont en général explorées. Or, les mutationspeuvent porter sur les portions non codantes. Deplus, dans de telles situations, on ne peut exclure laparticipation d’autres gènes. Certaines pathologiessont aussi hétérogènes au niveau génétique etpourraient être causées par des anomalies de gènesdifférents (complexe de Carney).Un nouveau domaine de la biologie moléculaire

est l’étude de l’expression d’un grand nombre degènes dans une tumeur ou transcriptome : l’utilisa-tion de « biopuces » permet une analyse rapide. Des

(1)

(2)

(3)

(4)

Dénaturation

Hybridation

Élongation

A C GC T G A

GCACT

GCACT

GCACT

GCACT

GCACT

GCCACT

GCCGACT

GCCGATCT

GCCGATCGT

GCCGATCGTA

T T TTC

G

C T A A

C C A C

CGG

GA A G

A T G

Incorporation aléatoire de nucléotidesmarqués et modifiés en 3'

Electrophorèse

Mesure de la fluorescence

B

Figure 2 A. Polymerase chain reaction (PCR). Un cycle de PCR comprend trois étapes : a) dénaturation par chauffage (95 °C) del’acide désoxyribonucléique (ADN) double brin (1) en deux ADN simple brin (2) ; b) hybridation (entre 50 et 65 °C) sur chaque ADNsimple brin d’une amorce (fragment d’ADN d’environ 20 bases) complémentaire à l’extrémité 3′ (3) ; c) élongation (à 70 °C) desamorces par la Taq polymérase en se servant de l’ADN simple brin comme matrice (4). La Taq polymérase est une ADN polymérase quifonctionne au-dessus de 70 °C (température d’hybridation) et résiste à la température de dénaturation. À chaque cycle de PCR, unfragment d’ADN double brin (1) est amplifié en deux fragments double brin (4). Ce cycle est répété entre 20 et 35 fois.B. Séquençage (d’après Sanger modifié). Une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l’ADN à séquencer à partir d’uneamorce spécifique. Parmi les nucléotides incorporés, une faible proportion est marquée par un fluorophore (une couleur par type denucléotide) et modifié en 3′de sorte que la synthèse ne puisse plus continuer. L’incorporation de ces nucléotides est aléatoire etgénère des fragments de taille différente et marqués d’une couleur. Les fragments ainsi obtenus sont séparés par électrophorèse. Unscanner permet d’identifier la couleur de chaque fragment. Un logiciel d’analyse transforme les signaux de couleur en séquencenucléotidique.

98 G. Assié et al.

profils d’expression génique précisant le pronosticdes tumeurs sont en cours de validation.

Thérapie moléculaireLa biologie moléculaire a permis de révolutionnerle traitement des carences en hormones peptidi-ques (diabète de type 1 principalement, déficit enhormones de croissance, etc.) : le génie génétiquepermet la production de l’hormone déficitaire parrecombinaison de bactéries ou de levures. Cetteméthode présente l’avantage majeur de ne pasprésenter de risque d’anthropozoonose (ou decontamination interhumaine pour certaines hormo-nes). Par ailleurs les gènes humains utilisés sontmodifiés, permettant l’obtention de caractéristi-ques pharmacologiques plus intéressantes que leproduit humain (exemple : insulines modifiéesd’action rapide). La biologie moléculaire et cellu-laire en endocrinologie est encore du domaine de larecherche.

Pharmacologie endocrine

Une hormone, par définition, est une moléculeendogène sécrétée dans le sang, et qui a une actionsur un organe cible à distance. La régulation de sasécrétion est souvent représentée comme le para-mètre unique de la modulation de son action. Ce-pendant le transport par le sang, la diffusion versdes organes cibles et l’activation des récepteursspécifiques constituent des étapes déterminantes.Les outils de pharmacologie permettent l’étude deces phénomènes et présentent un triple intérêt :

• en physiologie : étude du métabolisme deshormones, de l’activation de leurs récepteurs ;

• en clinique : définition biologique des patholo-gies endocriniennes ;

• en thérapeutique : création de composés inter-agissant avec des récepteurs hormonaux. Lamajorité des médicaments existants aujour-d’hui agissent par le biais de ces récepteurs.

Pharmacocinétique d’une hormone

L’action d’une hormone est conditionnée par desparamètres physiologiques comme la sécrétion oul’existence de signaux modulateurs, mais aussi pardes paramètres pharmacocinétiques comme la so-lubilité, l’existence d’une protéine porteuse, lemétabolisme ou l’excrétion.

Facteurs physicochimiques réglant la diffusionLa solubilité des molécules hormonales permet dedéfinir deux grandes classes d’hormones :

• les hormones hydrosolubles circulent libre-ment dans le sang. Leurs récepteurs sont le

plus souvent situés sur la membrane plasmiquedes cellules cibles. La diffusion extravasculairepour aller au contact des cellules cibles estrégie par des lois complexes et mal connues,conduisant certains auteurs à utiliser des tech-niques de dosage in situ (microdialyse) ;

• les hormones liposolubles circulent dans lesang en grande partie associées à des transpor-teurs (cf. ci-dessous). Ces hormones traversentles membranes plasmiques. Leurs récepteurspeuvent être membranaires ou intracellulai-res.

Distribution d’une hormoneLa concentration d’une hormone varie selon l’en-droit de l’organisme, du fait de l’existence debarrières spécifiques et de systèmes anatomiques.

Systèmes portesIl s’agit d’un système veineux (issu d’un réseaucapillaire) se drainant dans un autre réseau capil-laire. Il existe deux systèmes portes :

• le système porte hypothalamo-hypophysaire :les hormones issues de l’hypothalamus, quistimulent l’hypophyse, sont à des taux impor-tants dans le système porte, et à des concen-trations négligeables dans la circulation géné-rale ;

• le système porte hépatique draine l’ensembledu tube digestif et le pancréas vers le foie. Leshépatocytes sont stimulés par des concentra-tions d’hormones (notamment l’insuline) beau-coup plus élevées que dans la circulation géné-rale. Le foie dégrade une forte proportion de laplupart des hormones sécrétées dans la circu-lation porte, de sorte que les taux de la circu-lation générale sont très bas. Ce phénomèneest particulièrement visible dans les tumeursendocrines sécrétantes du tube digestif et dupancréas : les symptômes en rapport avec lasécrétion tumorale (hypoglycémie des insuli-nomes, syndrome carcinoïde, etc.) sont consi-dérablement augmentés lors de l’apparition demétastases hépatiques, du fait de l’absence dedégradation hépatique.Le dosage des hormones dans ou à proximité des

veines portes est possible par cathétérisme (sinuspétreux, veine porte), mais reste réservé à desindications très limitées.

Passage placentaireLe passage placentaire est variable selon l’hor-mone. Les conséquences en pathologie sont dedeux types :

• lorsqu’une hormone passe la barrière placen-taire, une hypersécrétion maternelle ou une

99Méthodes de dosage, de biologie moléculaire, et pharmacologie endocrine

prise d’hormone exogène pendant la grossessepeut parfois avoir des conséquences directessur le fœtus. Le diabète est un cas particulier,car même si l’insuline ne passe pas la barrièreplacentaire, la glycémie du fœtus est en revan-che corrélée à la glycémie maternelle. L’hy-perglycémie maternelle induit alors un hyper-insulinisme fœtal qui conduit à la macrosomie,et peut être à l’origine d’hypoglycémies dunouveau-né au décours immédiat de l’accou-chement ;

• lorsqu’une hormone ne passe pas la barrièreplacentaire, un fœtus peut présenter un défi-cit hormonal congénital qui ne sera pas substi-tué par la mère, avec parfois des conséquencessur son développement (par exemple formesévère du déficit enzymatique en 21 hydoxy-lase chez un fœtus XX, hypothyroïdie congéni-tale, etc.).

Action autocrine/paracrine des hormonesPar définition, une hormone est transportée par lesystème circulatoire et agit à distance. Or, beau-coup d’hormones ont également une action directelocale sur leur lieu de sécrétion : on parle d’auto-crinie lorsque la cible est la cellule sécrétante, oude paracrinie lorsque la cible, située à proximité dela cellule sécrétante, est atteinte par simple diffu-sion dans le milieu interstitiel. On peut citer l’ac-tion de l’insuline sur les cellules b-pancréatiques(autocrinie) et les cellules a-pancréatiques (para-crinie).À l’inverse, certains facteurs décrits initiale-

ment pour leurs actions locales sont en fait devéritables hormones puisqu’ils sont également vé-hiculés par le sang. On peut citer, dans ce cas, lesinterleukines. Endocrinie et autocrinie/paracriniene sont donc pas forcément antinomiques.

Protéines porteusesLes protéines porteuses permettent le transportdes hormones principalement liposolubles.Ces transporteurs sont de deux types : des trans-

porteurs de faible affinité mais en général degrande capacité, comme l’albumine, constituantune réserve d’hormone et des transporteurs deforte affinité mais en général de faible capacité,rapidement saturés lors d’un pic de sécrétion(exemple : cortisol binding protein [CBP] ou trans-cortine). Il existe alors un équilibre entre la frac-tion liée et la fraction libre, qui est la seule formeréellement active.L’existence de ces transporteurs est importante

à connaître : certains dosages plasmatiques d’hor-mones mesurent la quantité totale d’hormones (li-bre et liée), et dans la situation d’une augmenta-

tion des protéines porteuses, le taux d’hormonestotal peut être normal alors que la fraction libre estinsuffisante. On peut citer l’exemple de la contra-ception orale qui entraîne une augmentation de laCBP, conduisant en général à une surestimation desvaleurs mesurées de cortisol plasmatique. Parailleurs, la plupart des dosages de testostéronelibre ayant des limites, le dosage de la testosteronebinding globuline (ou sex hormone binding globu-lin) est intéressant dans les situations de testosté-rone totale limite basse pour apprécier la fonctiongonadique masculine.

Demi-vie d’une hormoneLa demi-vie des hormones est généralement brève,allant de quelques secondes pour les hormones destress, à quelques heures pour des hormones dumétabolisme.Quelques cas de demi-vie longue sont à connaî-

tre : la demi-vie de la thyroxine (T4) est de 7 jours.Cela signifie qu’un dosage de TSH est rarementutile dans les jours qui suivent la modification dutraitement d’une hyperthyroïdie par antithyroï-diens ou d’une hypothyroïdie par thyroxine.

Biotransformation d’une hormoneCertaines hormones sont sécrétées sous forme inac-tive et transformées en forme active à distance.Citons le cas de la vitamine D : la forme active estissue de l’hydroxylation en 25 du cholecalciférolpar le foie et en 1 par le rein. En cas d’insuffisancerénale, une substitution de cette fonction est indis-pensable (risque de carence en vitamine D associé àune hyperparathyroïdie secondaire). Un autreexemple est l’angiotensine 2 : l’angiotensinogèneest transformé en angiotensine 1 puis en angioten-sine 2 par l’enzyme de conversion de l’angioten-sine. La connaissance de cette voie de synthèse aconduit à l’élaboration de composés pharmacologi-ques spécifiques : inhibiteurs de l’enzyme deconversion, antagonistes de l’angiotensine 2, qui nesemblent pas avoir exactement les mêmes effets.

ExcrétionLa sécrétion de la plupart des hormones est soumiseà un rétrocontrôle : de ce fait, en cas d’insuffisanced’excrétion (insuffisance rénale ou hépatique),l’accumulation d’hormone est rare. Cependant cer-tains dosages sont compromis dans de telles situa-tions comme les dosages urinaires en cas d’insuffi-sance rénale sévère (exemple : cortisol,cathécholamines, etc.). Par ailleurs dans les traite-ments hormonaux substitutifs, il est parfois néces-saire d’adapter la posologie ou la nature du traite-ment. Par exemple, chez l’insuffisant rénal, uneinsuline ordinaire chez certains patients pourraavoir une durée d’action prolongée.

100 G. Assié et al.

Pharmacologie moléculaire enendocrinologie5

Il s’agit de l’étude de l’activation des récepteurshormonaux. On peut distinguer deux étapes :

• la liaison d’un ligand ;• la transmission du message lorsque le ligandest fixé : les agonistes activent le récepteur,alors que les antagonistes l’inhibent.Nous ne parlerons dans ce chapitre que des ré-

cepteurs membranaires (les récepteurs nucléairesseront traités ailleurs).

Étude de la liaison à un récepteur membranaireOn appelle ligand d’un récepteur une moléculecapable de se fixer à ce récepteur. Les hormonessont des ligands pour leurs récepteurs hormonaux.Il existe cependant d’autres ligands pour ces récep-teurs endogènes ou pharmacologiques.La première étape de la caractérisation fonc-

tionnelle d’un récepteur est l’étude de la fixationde ligands : les deux paramètres recherchés sont :

• l’affinité du récepteur pour le ligand ;• la capacité maximale de liaison du ligand. Pourcela, on utilise des cellules entières exprimantce récepteur ou des fragments de membranesplasmiques. Les ligands sont marqués par unradioélément.

Le plus souvent, la mesure de liaison de l’hor-mone en fonction de la concentration en hormoneconduit à une hyperbole (Fig. 3A).

La modélisation suivante peut être proposée :

H + R ⇔ RH

Avec H : hormone ; R : récepteur libre ; RH :complexe récepteur/hormone.

On peut écrire la relation suivante, dérivée de laloi d’action de masse (A.J. Clark dans les années1920) : la liaison du ligand sur le récepteur estproportionnelle à la quantité de récepteur et laquantité d’hormone. À l’équilibre de la liaison,pour chaque concentration [H] de l’hormone, la

[RH]

[RH]

[RH]

[H] Log [H]

Log [H] Log [H]

Log KD

Log KD Log KD Log KD

[H]

[RT]

[RT] [ RT]

[RT]

[RT]

[RT]

[RT]

KD

KD

[RT]2

100 %

50 %

-1[RT]

2

KD

-1

1

1

[RH]

[H]

[RH] [RH]

[RT][RH]

A B C

D E F

Figure 3 Représentations graphiques de la liaison d’une hormone à son récepteur dans un modèle simple (action de masse). [RH] :concentration du complexe récepteur/hormone ; [H] : concentration en hormone ; [RT] : capacité maximale de liaison de l’hormone ;KD : constante d’affinité.A. [RH] en fonction de [H] : hyperbole d’asymptote [RT] et d’abscisse KD lorsque [RH] = [RT]/2.B. [RH]/[RT] en fonction de log [H] : sigmoïde d’asymptote [RT] et d’abscisse KD lorsque [RH] = [RT]/2.C. [RT]/[RH] en fonction de 1/[H] (représentation de Lineweaver-Burk) : droite dont l’ordonnée à l’origine est 1/[RT] et qui croisel’axe des abscisses en –1/KD.D. [RH]/[H] en fonction de [RH] (représentation de Scatchard) : droite dont la pente est –1/KD et qui croise l’axe des abscisses en [RT].E. Liaison d’une hormone en présence d’un antagoniste compétitif réversible (courbe blanche) : la capacité maximale de liaison [RT]est inchangée, le KD est augmenté en présence de l’antagoniste : on parle d’affinité apparente, qui est diminuée.F. Liaison d’une hormone en présence d’un antagoniste compétitif irréversible (courbe grise) : la capacité maximale de liaison [RT] estdiminuée du fait de la fixation irréversible du 2e ligand. L’affinité n’est pas ou peu diminuée.

101Méthodes de dosage, de biologie moléculaire, et pharmacologie endocrine

quantité de complexe hormone/récepteur mesurée[RH] peut être alors calculée de la façon suivante :

(1)�RH � =1

KD

· �H � · �R �

KD est la constante de dissociation, inversementproportionnelle à l’affinité du ligand pour lerécepteur : plus KD est petit, plus l’affinité estforte. Le KD d’un récepteur membranaire pour sonhormone est en général entre 10–7 et 10–10 M.On appelle RT la capacité maximale de liaison du

ligand (récepteur total).On a : [RT] = [R] + [RH]L’équation (1) peut s’écrire :

[H]·[RT]–[RH]) = KD·[RH]D’où on déduit :

(2)�RH � =�RT � · �H �

KD+�H �

La courbe de fixation (Fig. 3A) permet de déduireles paramètres RT et KD caractéristiques du récep-teur étudié.Cette courbe possède deux caractéristiques no-

tables : [RH] évolue vers une asymptote qui est[RT] ; le point de la courbe correspondant à l’ordon-née [RT]/2 a pour abscisse KD. Ce point correspondà la concentration en hormone nécessaire poursaturer 50 % du récepteur.Trois autres représentations graphiques de cette

équation sont couramment utilisées :• [RH]/[RT] en fonction de log [H]) : le pointd’ordonnée 50 % (appelé EC50) a pour abscisselog (KD). La courbe tend également vers uneasymptote (égale à 100 %). Cette représenta-tion est l’une des plus employées, et convientparticulièrement pour la représentation sur unemême courbe des variations du KD de plusieursligands différents avec des affinités très varia-bles (Fig. 3B) : un déplacement vers la droitecorrespond à une diminution de l’affinité ;

• [RT]/[RH] en fonction de 1/[H] (représentationde Lineweaver-Burk) : on obtient une droited’équation [RT]/[RH] = KD/[H] + 1, qui croisel’axe des ordonnées en 1/[RT] et l’axe desabscisses en –1/KD (Fig. 3C) ;

• [RH]/[H] en fonction de [RH] (représentationde Scatchard) : on obtient une droite d’équa-tion [RH]/[H] = –1/KD (RH – [RT]), dont la penteest –1/KD et qui croise l’axe des abscisses en[RT] (Fig. 3D). Ces deux représentations

étaient particulièrement intéressantes lorsquel’on ne disposait pas d’outils informatiquespuissants pour déduire [RT] et KD depuis plu-sieurs expériences.

Étude de liaison d’une hormone en présenced’un ligand compétitifLa liaison d’une hormone marquée peut être dimi-nuée par la présence d’un deuxième ligand (nonmarqué) lorsque les deux ligands se lient à unmême site (compétition).Deux situations sont possibles :• la diminution de liaison est surmontable : lacapacité maximale de liaison obtenue est iden-tique à celle obtenue en l’absence de l’antago-niste, mais pour des concentrations plus éle-vées en hormone (Fig. 3E). L’affinité del’hormone est diminuée : on parle d’affinitéapparente. Il s’agit d’un ligand compétitif ré-versible (c’est-à-dire dont la liaison peut êtrecompensée par une augmentation de laconcentration en hormone) ;

• la diminution de fixation n’est pas surmonta-ble : la capacité maximale de liaison de l’hor-mone est diminuée par la fixation de l’antago-niste même lorsqu’on augmente laconcentration d’hormone. Il s’agit d’un ligandcompétitif irréversible (sa fixation sur le sitede fixation de l’hormone est définitive).

Mesure de cinétique de liaison et de dissociationLes mesures de liaison présentées ci-dessus sontréalisées « à l’équilibre », c’est-à-dire après untemps suffisant pour que la liaisonhormone/récepteur soit maximale dans les condi-tions de mesure. Deux autres types de mesures deliaison sont importantes dans la caractérisationd’un récepteur : la vitesse d’association de cons-tante k1 de l’hormone et du récepteur et la vitessede dissociation de constante k2 (Fig. 4).La détermination de k1 et k2 exige des mesures

de liaison dans des intervalles de temps beaucoupplus courts que pour la détermination de la cons-tante d’affinité KD. À l’équilibre, il y a autantd’hormone qui se lie au récepteur que de complexeHR qui se dissocie. On a alors :

k1 �H � �R � = k2 �HR �

D’où la relation suivante entre KD, k1 et k2 :

KD=k2

k1

Mesure de l’activation d’un récepteurmembranaireLa liaison de l’hormone au ligand est la premièreétape nécessaire à l’activation du récepteur.

H + R HR

k1

k2

Figure 4

102 G. Assié et al.

Liaison au récepteur n’est pourtant pas synonymed’activation du récepteur, et l’étude directe del’activation du récepteur par une hormone est in-dispensable.Il est possible de mesurer l’activation d’un ré-

cepteur en mesurant l’effet biologique induit. Lesoutils modernes de biologie moléculaire et cellu-laire permettent de mesurer des effecteurs de plusen plus proches du récepteur, principalement desseconds messagers : calcium intracellulaire, inosi-tol phosphates, adényl monophosphate cyclique(AMPc), etc.L’activité constitutive d’un récepteur corres-

pond à son activité en l’absence de ligand. Pourcertains récepteurs, cette activité peut être tout àfait significative. Certains récepteurs mutants pré-sentent aussi une augmentation importante decette activité constitutive8 (par exemple mutantsdu récepteurs de la thyroid stimulating hormone[TSH] observés dans les nodules toxiques de lathyroïde).Les mesures d’activation des récepteurs ont per-

mis d’identifier deux types de ligands : des agonis-tes, qui activent le récepteur, et des antagonistes,qui inhibent l’action d’un ligand endogène.

Modulation de l’activité d’un agoniste parmodulation de sa liaisonUn antagoniste provoque en général une diminutionde la liaison d’un agoniste, ce qui conduit à dimi-nuer l’efficacité de cet agoniste. Les études deliaison permettent de quantifier cette diminutionde fixation. Différents paramètres interviennent :

• le site de liaison au récepteur : un antagonistecompétitif se fixe sur le site de liaison du ligandendogène. Un antagoniste non compétitif sefixe sur un autre site du récepteur : sa fixationn’est donc pas directement influencée par laprésence de l’agoniste, même à forte concen-tration ;

• la réversibilité de la liaison au récepteur : laliaison peut être réversible ou définitive ;

• le caractère surmontable ou non.Les mesures directes de l’activation des récep-

teurs ont montré que souvent le niveau d’activationd’un récepteur n’est pas proportionnel à la liaisonde l’agoniste : même si la liaison est indispensable,d’autres mécanismes modulent la capacité d’unagoniste à activer un récepteur.

Modulation de l’activité d’un ligand par d’autresmécanismes2

Fondés sur les mesures d’activation des récepteurset l’étude de mutations des récepteurs (principale-ment les récepteurs couplés aux protéines G), desmodèles allostériques, intégrant la stéréo-

isomérie, sont actuellement admis : un récepteurpossède une forme inactive R avec une affinité KDpour son hormone, en équilibre avec une formeactive R* avec une affinité différente KD* (Fig. 5).Dans ce modèle, l’activité du récepteur est pro-

portionnelle au taux de récepteurs dans la formeactive (R* et R*H). Les définitions d’agonistes etantagonistes doivent être précisées :

• un agoniste est un ligand qui se lie principale-ment à la forme active, et par cette liaisondéplace l’équilibre R/R* vers la forme active.Un agoniste partiel a une affinité légèrementsupérieure pour la forme active par rapport à laforme inactive. L’agoniste partiel se lie doncaux deux formes du récepteur, mais la fixationreste prédominante sur la forme active. Lafixation maximale à la forme active est ainsi unpeu diminuée par rapport à un agoniste com-plet (qui a une affinité très supérieure pour laforme active). L’agoniste partiel peut se fixersur le site de liaison du ligand endogène (com-pétitif) ou sur un autre site (non compétitif).On parle, dans ce dernier cas, d’agoniste allo-stérique. En présence d’un agoniste complet,un agoniste partiel compétitif peut avoir uneaction antagoniste, par compétition : on parlealors d’agoniste antagoniste ;

• un agoniste inverse a une affinité supérieurepour la forme inactive et déplace l’équilibreR/R* vers la forme inactive. La liaison peut êtrecompétitive ou non par rapport à un ligandendogène (antagoniste allostérique). Dans lasituation d’un agoniste inverse compétitif, enprésence d’un agoniste complet, l’effet anta-goniste sera double : par compétition et pardéplacement de l’équilibre forme active/forme inactive vers la forme inactive. Enfinseuls, les agonistes inverses seront capablesd’antagoniser les mutants constitutivementactifs, c’est-à-dire des récepteurs en confor-mation active à l’état basal.L’étude de la liaison d’un ligand permet de pré-

ciser la fixation globale du ligand aux formes R etR*, mais ne permet pas de déterminer l’état del’équilibre R/R*. Différentes techniques sont utili-sés dans ce but : mesures de liaison en compétitionavec des ligands spécifiques de la forme active oude la forme inactive, mutagenèse, etc. On définitainsi, pour chaque agoniste, une « activité intrin-

R R*

RH R*H

KD*KD

Figure 5

103Méthodes de dosage, de biologie moléculaire, et pharmacologie endocrine

sèque », qui correspond schématiquement à la pré-férence pour la forme active par rapport à la formeinactive du récepteur : elle est de 1 pour un ago-niste complet et de –1 pour un agoniste inversecomplet.Concernant les récepteurs couplés aux protéines

G, dans ce modèle allostérique, l’interaction avecles protéines G modifie également l’équilibre R/R*.Certains auteurs proposent même l’existence deplusieurs états conformationnels actifs selon, entreautres, le type d’agoniste, l’interaction avecd’autres protéines (par exemple liaison aux protéi-nes G).En résumé, l’activité d’un agoniste dépend du

nombre de sites récepteurs liés et de son activitéintrinsèque.Il faut ajouter un niveau de complexité supé-

rieure : la transduction du signal n’est pas toujourslinéaire, et peut être modulée par l’interactiond’autres voies de signalisation appelée « cross-talk ».Un dernier modèle, les récepteurs de réserve

(« spare receptors ») rend compte du phénomènesuivant : certains récepteurs, principalement lesrécepteurs à activité tyrosine kinase, présententune activation maximale alors qu’un nombre faiblede sites sont occupés. Si l’on augmente la concen-tration d’hormones, l’activation du récepteur n’estpas supérieure. Dans cette situation, la perte d’ungrand nombre de récepteurs n’altère pas forcé-ment l’activation maximale. Dans cette situation,l’efficacité d’un antagoniste compétitif est condi-tionnée par sa haute affinité et non pas par saconcentration.D’importants travaux de biologie moléculaire et

structurale sont en cours afin d’identifier les déter-minants moléculaires de la liaison d’un ligand et dela capacité d’un récepteur à transmettre le signalhormonal.

Recherche de ligands pour un récepteurmembranaireLa recherche de ligands pour un récepteur repré-sente un enjeu pharmacologique majeur : les ré-cepteurs sont les cibles principales des médica-ments. L’intérêt pour la recherche est double :

• étude de la physiologie d’un récepteur parl’utilisation de ligands ayant des propriétéspharmacologiques particulières ;

• identification de la fonction de récepteurs« orphelins » : de nombreux récepteurs ont étéidentifiés par clonage, grâce à l’homologie deleur séquence génétique avec la séquenced’autres récepteurs connus. La déterminationde la fonction de ces récepteurs passe parl’identification de leurs ligands.

Les méthodes employées sont de deux sortes : laconnaissance de la structure d’un site de liaisonpermet de déterminer la structure requise pour laliaison d’un ligand ; par génie chimique, de tellesmolécules peuvent être synthétisées. Par ailleurs,la connaissance de la structure d’un ligand permetla fabrication de molécules proches dont les pro-priétés sont étudiées. Une autre stratégie, pharma-cologique, consiste à rechercher des ligands sansconnaissance de la structure du site de liaison :toutes sortes d’échantillons sont purifiés (chroma-tographie) et étudiés lorsqu’ils se lient à un récep-teur.

Excès et insuffisance hormonale : définitiond’une valeur normale

Les données pharmacocinétiques et pharmacody-namiques montrent la complexité des étapes entrela libération d’une hormone dans le sang et l’acti-vation de son récepteur. On comprend aisémentdès lors que l’effet biologique d’une hormone nepeut pas se résumer à son taux sanguin. Cela estimportant en pathologie endocrinienne : quellessont les valeurs limites du taux d’une hormonedéfinissant le seuil de la pathologie ? Ces valeursexistent-elles vraiment ?Pour chaque hormone (ou effecteur d’hormone),

il existe des valeurs « normales », c’est-à-dire unintervalle regroupant le taux de la majorité desindividus de la population générale. Ces limites nedoivent pas être utilisées comme seuil au-delà du-quel un individu est considéré comme malade, carce n’est pas leur définition.Dans certaines situations, des limites ont été

définies. Elles sont fondées sur la survenue designes cliniques pathologiques. Citons l’exemple dela glycémie à jeun définissant le diabète : la limitedes 1,26 g l–1 a été définie par rapport au risque desurvenue des complications microangiopathiquesdu diabète. Même si la définition paraît plus rigou-reuse, l’interprétation d’une glycémie de 1,26 g l–1

ne sera pas la même chez un patient de 40 ansprésentant des facteurs de risque cardiovasculaireque chez un patient de 85 ans. Enfin cette défini-tion n’est probablement pas parfaite : 1,10 g l–1 àjeun à 25 ans n’est pas parfaitement « normal ».L’interprétation d’un dosage hormonal ne peut

donc se limiter à la comparaison à des valeurslimites :

• l’examen clinique occupe une place centrale :il s’agit de rechercher des signes de dysfonc-tion hormonale et d’évaluer le terrain du pa-tient ;

• selon les dosages, un « léger » dépassementdes limites n’aura pas la même signification :

104 G. Assié et al.

par exemple, une TSH à 0,05 lU ml–1 en des-sous du seuil inférieur normal de la TSH (de0,1 lU ml–1) sera probablement la marqued’une hyperthyroïdie, alors que la même diffé-rence au-dessus du seuil supérieur (en général4,5 lU ml–1) n’aura aucune valeur ;

• un dosage ne peut s’interpréter seul : parexemple, une parathormone (PTH) « normale »sera pathologique en cas d’hypercalcémie ;

• certains dosages doivent être répétés (patho-logies intermittentes ou fluctuantes, en parti-culier certaines sécrétions tumorales : insuli-nomes, syndrome de Cushing, etc.) etcomplétés par d’autres dosages (par exempletests dynamiques : épreuve de jeûne, test defreinage à la dexaméthasone) en cas de suspi-cion clinique non confirmée par des premiersdosages ;

• certains dosages sont modifiés par des traite-ments ou des situations cliniques particulières(par exemple dosage de la cortisolémie aug-mentée en cas de traitement œstrogénique oulors de la grossesse) ;

• enfin, pour chaque pathologie endocrinienne,il existe des tests de référence qui sont souventrequis pour le diagnostic (par exemple un do-sage d’hormone de croissance [GH] de base estsouvent insuffisant pour un diagnostic d’acro-mégalie ou de déficit en GH et un test de

freinage par hyperglycémie orale ou de stimu-lation par hypoglycémie insulinique est alorsnécessaire).

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