Biodiversity, Bioprospecting and Development

Historia de la producción de ácido itacónico

El ácido itacónico se produjo históricamente por diversos productos químicos métodos: (1) Destilación destructiva de ácido cítrico, y este fue el principal método de producirlo antes de la década de 1960; (2) calentar la solución aconitato calcio produce en el refinado de azúcar de caña proceso; (3) El método patentado que implica Montecatini propargilo cloruro; (4) La oxidación del óxido de mesitilo y la subsiguiente isomerización del ácido cítrico formado; y (5) La oxidación de isopreno. El anhídrido maleico también se utiliza en la producción de IA pero el proceso aún no ha alcanzado la industrialización. Ninguno de estos (u otro) procesos compiten favorablemente con la producción fermentativa proceso [22], y la IA se produce ahora casi en su totalidad por fermentación de azúcares por Aspergillus terreus [23].

El ácido itacónico fue descubierto para ser un metabolito biológica cuando se encontró que la producida por una cepa de Aspergillus que era posteriormente llamado Aspergillus itacónico [24] mientras Calam et al. [25] descubrió que A. terreus también se puede acumular en IA aún mayor cantidades que A. itaconicus. La Investigación de la Región Norte Laboratorio (NRRL) del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) proyectó varias cepas de tipo salvaje y identificado A. terreus NRRL 1960, ya que la IA productores más prolíficos cepa [26] que luego pasó a convertirse en la cepa más publicada. Al mismo instituto,

También se hicieron intentos preliminares para desarrollar un proceso biotecnológico para la producción de IA [27]. Más tarde, los procesos industriales optimizados eran establecido proporcionando al mercado limitado con IA.

Los principales avances en la producción IA se produjo dentro de la próxima dos decadas. Basado en el número de publicaciones científicas grabados, se puede inferir que el interés en la producción IA luego disminuyó.

Tras la publicación de un informe publicado por los Estados Unidos ' Departamento de Energía (DoE) que enumera IA como uno de los 12 que promete productos químicos formulario disponible biomasa [28], hubo un renovado interés en su producción (Figura 2).

Biosíntesis de ácido itacónico

El proceso de la biosíntesis de ácido itacónico ha sido un tema de discurso académico y está siendo recientemente acordado. En 1931, Kinoshita [24] sugiere que IA fue producida en A. terreus por el descarboxilación de aconitato. Esto fue apoyado por los estudios de seguimiento de Bentley y Thiesse [29-31] que descubrió la presencia de un aconitato cisdescarboxilasa (GAD) de la enzima que se propuso catalizar la producción de IA. Dwiarti et al. [32] mostró que el vía a través de la aconitasa y CAD era más probable (Figura 3) y aislado y caracterizado la enzima CAD. En 2008, el gen CAD fue identificado por Kanamasa y compañeros de trabajo [33], quien lo utilizó para transformar Saccharomyces cerevisiae, que demuestra que el gen era de hecho responsable de la producción de la enzima CAD, y que el CAD enzima cataliza la producción de IA. Li et al. [34] A. transformado niger células con el gen CAD y fueron capaces de iniciar la producción de IA en A. niger. La revisión por Klement y Buchs [35] a fondo discute los detalles de la biosíntesis y regulación IA en A. terreus.

La figura 3 muestra una vía para la producción de smiplified IA en A. terreus

El ácido itacónico producción fermentativa

Fermentación sumergida

Las condiciones para la producción de IA por Aspergillus terreus por fermentación sumergida (SF) son similares a las del ácido cítrico producción de A. niger. Estas condiciones incluyen la disponibilidad de una exceso de fuente de carbono fácilmente metabolizable, altos niveles de disolvió oxígeno, basado amonio-limitación de las cantidades de iones metálicos y una fuente de nitrógeno.

Microorganismos

Un número de microorganismos han sido seleccionados y estudiado durante la producción de ácido itacónico. Puesto que se observó que A. terreus produce más IA que A. itacónico la búsqueda de la industrial ideales organismo para la producción de IA ha continuado y varios intentos de tener ha hecho de encontrar microorganismos con características mejoradas incluyendo un mayor rendimiento, una mayor tolerancia al esfuerzo cortante, y / o tolerancia a la concentración más alta del producto final.

Aspergillus terreus cepas

La cepa más usada en la producción de IA es una cepa nativa conocido como A. terreus NRRL 1960, que también se almacena en varios colecciones de cultivos bajo los nombres de CBS 116.46, DSM 826, IAM 2054, IFO 6123, IMI 44243, QM 6856 y WB 1960 [36]. Esta cepa fue grabado para producir hasta 91 g / L IA partir de la glucosa [37]. Aspergilo terreus IMI 282743 es otra cepa nativa que dio 5,76 g / L IA de la palma de efluentes molino de aceite [38] mientras que las concentraciones de IA alrededor del 54 g / L en un medio que contiene 15% de glucosa se ha informado de cepas egipcias de tipo salvaje [39]. A pesar de estos rendimientos registrados en la literatura, la necesidad de que los rendimientos aún más altos tiene cepa necesitado mejora como resultado de lo cual la mayoría de las cepas de alto rendimiento disponibles en la literatura hoy se modifican cepas.

Para mejorar la producción de IA, tanto mutagénesis tensión y genética modificación han sido exploradas en cepas de A. terreus. Yahiro et al. [40] sucesiva mutado un tipo salvaje cepa de A. terreus IFO6365 y aislado una cepa denominada A. terreus TN484-M1, que produjo hasta a 82 g / L IA dentro de los 6 días de fermentación. La transcripción de los de CAD1 (La decarboxilasa del ácido cis-aconítico génico codificado) en el mutante cepa fue cinco veces más fuerte que la de IFO6365, que era creído para tener en cuenta la mejora del rendimiento [33]. Dwiarti et al. [41] exploraron la producción de almidón de sagú IA utilizando el mismo / se obtuvo la cepa y alrededor de 48,2 g L IA. Reddy y Singh [42] SKR10 mutado A. terreus, una cepa nativa, utilizando diversos productos químicos o mutágenos ultravioleta por separado y en combinación. Obtuvieron

dos mejores mutantes: A. terreus N45 que produjo 50 g / L IA a partir de almidón de maíz, y A. terreus UNCS1 que produjo 32 g / L IA a partir de extractos de residuos de frutas. En comparación, la cepa parental sólo sintetiza 31 g / L y 20 g / L IA de los dos sustratos, respectivamente.

Una cepa de tipo salvaje de A. terreus se modificó mediante la incorporación de una modificado gen pfkA de A. niger en su genoma [43]. Esta modificado gen pfkA codifica para una más corta y más activa 6-fosfato-fructo-1- fragmento de enzima quinasa. Ellos obtuvieron transformantes que acumulado una mayor cantidad de IA que la cepa nativa, aunque después de un ya retardo de fase. La IA obtenido de la mejor A729 transformante fue de 45,5 g / L, que fue más del doble de la alcanzada por el padre cepa (21,35 g / L).

Otros microorganismos

Varios organismos poseen varias ventajas inherentes que puedenimpartir en el proceso de fermentación IA. El organismo ideal será uno con rendimientos de hasta (o incluso superar) A. terreus, es susceptible de manipulación genética como E. coli, puede ser fácilmente manejada como levaduras y tendrá mínimo la formación de subproductos. Estas cualidades deseadas pueden ser impartido en un organismo huésped a través de la manipulación genética y una pocos intentos han dado resultados alentadores.

Aparte de A. terreus y A. itacónico, varios otros hongos tienen también se han utilizado para la producción IA. Se detectó en el caldo de fermentación de una cepa zeae Ustilago mientras cribado varios Ustilago cepas para la producción de ácido ustilagic [44]. Más tarde, el Iwata Corporation (Japón) registró una concentración de 53 g / L IA por U. maydis utilizando glucosa como sustrato [45,46]. Levinson et al. [47] obtuvieron 30 g / L de IA de una cepa de la Pseudozyma basidiomiceto antarctica en cultivos en matraz oscilante. De manera similar, una cepa de levadura identificado como Candida se obtuvo después de su examen y posterior mutación, que producido cerca de 53 g / L IA en 5 días [48]. Tkacz y Lange [49] propusieron una estrategia de introducción de la cisaconitate gen descarboxilasa en una cepa por ejemplo, la producción de ácido cítrico A. niger para la producción IA. Esto fue investigado por Li

et al. [34,50] que desarrolló con éxito transformantes de A. niger y optimizado condiciones del medio, dando lugar a 0,13 g / L IA producción. Del mismo modo, una aumento en IA produce hasta un factor de 14-24 se obtuvo por la orientación las enzimas clave en la síntesis de IA, aconitasa y CAD, a la derecha compartimentos celulares en A. niger [51]. De manera similar Escherichia coli podrían ser modificados genéticamente para la síntesis de IA [52].

Carbon Fuente / sustrato

Azúcares / Almidón

Aunque A. terreus crece bien en la mayoría de mono- y disacáridos, se puede convertir sólo unos pocos de ellos en IA [53]. La glucosa es un fácilmente sustrato metabolizable por A. terreus y es el más ampliamente utilizado en IA la producción de [42,44,46]. La sacarosa es también un sustrato comúnmente utilizado.

Arabinosa, xilosa y la lactosa también se han probado para la producción IA [54,55], pero los rendimientos fueron bajos (18% a partir de arabinosa, 31% a partir de xilosa y menos de 1% de lactosa). Los almidones de sagú, sorgo, dulce, patata, trigo, patata, yuca y se han utilizado con éxito para producir IA con diferentes grados de éxito y estos resultados son resume en la Tabla 1. Estos almidones sin embargo tienen usos alimenticios, así su uso en la producción de IA puede ser considerado estar en conflicto con los alimentos aplicaciones.

Agro-Desechos y ácido orgánico

Con el precio actual de la glucosa que van desde $ 0.35- $ 0.60 / kg y sacarosa a partir de 0,45 $ 0,72 $ / kg, el uso de estos azúcares como sustratos para Producción IA contribuye significativamente los costes de producción. El uso de sustratos más baratos, como los agro-residuos, podría potencialmente llevar reducir el costo de producción de IA. La Tabla 1 presenta algunos ejemplos de IA formación utilizando los flujos de

residuos agrícolas, como el pastel de semillas de jatropha, melaza y el jarabe de maíz. Agro-residuos son generalmente pre-tratadas por uno o más de una variedad de métodos dilucidado en diversos informes [18,56,57].

Los principales desafíos que plantea la utilización de estos sustratos complejos son: (1) Su composición muy variable a través de sustratos e inclusodentro de diferentes lotes del mismo sustrato. (2) Los rendimientos de sustratos de crudo son generalmente más bajos que los de los azúcares. (3) La presencia de productos químicos potencialmente dañinos en el sustrato que se producen naturalmente, o se forman durante los procesos de pre-tratamiento puede afectar a la el crecimiento y la salida del organismo de fermentación, una mayor disminución rendimientos. (4) Además, las impurezas en el producto final más aumentos costará en forma de requisitos de purificación caros.

Curiosamente, ácido cítrico también se ha utilizado como precursor en IA biosíntesis. Con el precio del ácido cítrico siendo significativamente menor que la de IA, este método puede resultar económica [58].

Minerales y nutrientes

Al igual que muchos otros tipos de fermentación de hongos, IA fermentación es sensible a las concentraciones de metales traza y las fuentes de nitrógeno. Itacónico rendimiento de ácido se mejora significativamente por la presencia de nitrógeno y trazas de Zn2 + y Fe2 + iones [26] mientras iones fosfato debe limitarse una vez el crecimiento del micelio se establece para evitar carbono desviación hacia aún más la producción de micelios. La presencia y cantidades de estos iones en sustratos complejos son por lo general fuera del óptimo y puede influir negativamente en los rendimientos.

Fermentación Tiempo y temperatura

Una amplia gama de tiempos de fermentación han sido estudiados por IA fermentación que van de dos a 14 días [58,67]. La óptima sin embargo se ha reportado el tiempo de producción a ser de siete días por muchos autores [70]. Las temperaturas reportados para la

producción de IA también varían, pero se mantiene de forma óptima en torno a 37 ° C [22]. Intentos exitosos tienen ha hecho de plantear esta óptima y un aumento de cinco veces en la IA

Se observaron rendimientos de una cepa parental en una cepa mutante a 40 ° C [71].

Oxígeno Disuelto / aireación

La fermentación de ácido itacónico es estrictamente aeróbico. Los efectos de oxígeno disuelto (DO) y la velocidad de agitación se evaluaron por Park et al. [72]. Se observó que a pesar de que el rendimiento total aumentó con DO, el rendimiento por unidad de glucosa consumida fue mayor cuando la DO era aproximadamente el 20% del punto de saturación a una velocidad del impulsor de 0,94 m / s (Equivalente a una velocidad de agitación de 320 rpm). Rychtera y Wase [73] encontró que la tasa de aireación óptimo fue a una velocidad de rotor de 0,71 m / s, mientras que Riscaldati et al. [74] informó de que la producción aumentó IA con el aumento de la tasa de hasta agitación a 400 rpm (una velocidad del impulsor de 1,57 m / s).

Incluso un cese temporal de aireación tal como durante el manual proceso de toma de muestras en la fermentación de frasco de agitación puede dañar irreversiblemente los micelios y efectivamente detener la fermentación [75]. Lin et al. [76] informado de la integración de gen de la hemoglobina Vitreoscilla (VGB), que reducido el impacto de dicha interrupción breve en la aireación durante fermentación con cierto éxito. La interrupción resultó en una disminución de sólo 39,2% en la tasa de producción IA del transformante

PAN-VGB-2 en comparación con una disminución del 51,2% en A. terreus M8, el nativo cepa. Esto puede ser atribuido al aumento de más de 8 veces en oxígeno absorción en la cepa de hemoglobina transformada.

Las tasas de aireación óptimas para la producción IA reportados en la literatura variar ampliamente. Hay así una necesidad de determinar los aerationneeds apropiadas para sistemas de fermentación específicos con el fin de evitar ya sea pura la tensión en los micelios debidas a las velocidades del impulsor excesivas o mala velocidad de transferencia de oxígeno a bajas

velocidades. Nuevo incremento en las tasas de aireación daría lugar a un crecimiento celular mejorada, pero esto puede no justificar lacosto adicional incurrido por el aumento de la tasa de aireación.

Inmovilización

La biosíntesis de IA usando microorganismos inmovilizados también han sido investigado. La primera matriz utilizada en la producción de IA era gel de poliacrilamida [77]. Desde entonces, varios otros matrices han sido utilizado incluyendo un sistema de reactor disco poroso, el material a base de sílice, alginato, cubos de poliuretano, y la red fibrosa estructural de madera del tronco papaya [27,65,67]. Vassilev et al. [61] informó de que la tamaño de poro del soporte de espuma de poliuretano no afectó a la carga tasa de A. terreus y obtenido un rendimiento promedio de 15,1 g / L IA más de cinco ciclos con el transportista.

Fermentación en estado sólido

El ácido itacónico se ha producido con éxito utilizando estado sólido fermentación (SSF). Los desechos agrícolas son los mejores sustratos para SSF y se han utilizado para producir con éxito una serie de importantes metabolitos. La agro-residuos puede servir únicamente como soporte mecánico o ancla para el organismo en cuyo caso puede ser complementado con nutrientes adicionales, o puede contener la mayor parte de los nutrientes requeridos para la fermentación. Vassilev et al. [60] produce 44 g / L de IA residuos de olivo secas y pressmud remolacha utilizando Aspergillus terreus CECT 20.365, mientras que un rendimiento de 55 g / L IA se obtuvo en un SSF patentado método que utiliza un mutante, A. terreus M8, en las soluciones de azúcar o almidón adsorbido hidrolizado de caña de azúcar pressmud [66].

La humedad es un factor muy importante en SSF con un nivel óptimo de 65% -70% reportó para la producción de IA a partir de desechos agrícolas [60].

Los niveles de humedad por debajo de este óptimos resultados en la baja solubilidad de los nutrientes y la disminución de la inflamación de la remolacha pressmud utiliza como sustrato mientras que en niveles

superiores a 70% el equilibrio del aire: sólidos: agua fue interrumpido, lo que afecta negativamente a la porosidad y de partículas la agregación del sustrato.

Dado que las temperaturas óptimas para la fermentación IA son ligeramente mayor que la ambiente, hay una necesidad de calentar el sustrato a la cama temperatura óptima para asegurar la germinación de esporas y el producto formación. La aireación servirá el doble propósito de proporcionar oxígeno para las células y recircular el calor para evitar puntos calientes.

La opinión generalizada es que las SAI puede proporcionar rendimientos mejores o similares obtenido en la fermentación sumergida en muchas producción bioquímica procesos. En teoría, como un proceso estrictamente aeróbico que se produce en temperaturas elevadas y utiliza un hongo filamentoso, la IA proceso de producción parece ser idealmente adecuados para las condiciones de la SSF.

Recientemente, existe un creciente interés por la SSF, especialmente mediante la agricultura perder como sustratos. Sin embargo, las condiciones de fermentación todavía necesitan una mayor optimización.

Procesamiento aguas abajo y la recuperación del producto

El ácido itacónico es relativamente fácil de recuperar porque cristaliza fácilmente. Tras el agotamiento de los azúcares fermentables, la fermentación licor se filtra para eliminar los sólidos suspendidos y micelios. El licor es después se concentró por evaporación a aproximadamente un quinto de su volumen original y luego cristalizado. Estos cristales se lavan a continuación y se recristalizaron para eliminar las impurezas [14]. El ácido itacónico también se puede precipitar como sales de metales tales como calcio o plomo [78]. En comparación con el calcio la sal, la precipitación de IA como una sal de plomo tiene la ventaja de no que requiere un pre-concentración del caldo, ya que es casi insoluble en agua. El plomo es preferible a la precipitación de sales de calcio debido a que el plomo sal de IA es casi insoluble en agua que es más soluble que para ejemplo citrato de calcio, y por lo tanto no se

puede utilizar tan fácilmente como la este último en el proceso de purificación de IA por precipitación. En producto situ eliminación tiene un gran potencial, especialmente en las fermentaciones de alto rendimiento para prevenir la inhibición del producto final. Aunque la recuperación de ácido itacónico de soluciones modelo utilizando electrodiálisis ha sido probado [79], el separación de membrana como medio de recuperación IA está en su infancia y información limitada está disponible.

Perspectivas de futuro

El ácido itacónico ha ido ganando interés en los últimos años de su aplicación potencial como una importante plataforma de química de base biológica.

El mayor potencial de mercado para el ácido itacónico está en nuevas aplicaciones como resinas de poliéster, detergentes constructores y para la producción de insaturados metacrilato de metilo. La aplicación proyectada más grande para itacónico ácido es metacrilato de metilo, lo que puede explicar 52,2% de la mercado mundial de ácido itacónico en 2020 [13]. Resinas de poliéster insaturadas y mejoradores de la detergencia puede dar cuenta de un 18,8% y el 10,8% de mundial mercado del ácido itacónico en 2020. El principal factor que limita a esto es la relativamente más alto precio de IA en comparación con las posibles alternativas tales como cianhidrina de acetona. El mismo escenario se aplica con el potencial para la sustitución de anhídrido maleico con IA en la producción de resinas de poliéster insaturado (UPR) con ácido fumárico como competir monómero. Voll y Marquardt [19] también produjo 3- metiltetrahidrofurano de IA, pero concluyó que el proceso de requirió una fuente barata de IA sea factible.

Sin embargo Weastra et al. en el mismo informe [13] postulan que la No se espera que la capacidad de producción de ácido itacónico a crecer dramáticamente, pero en el caso de aumento de la demanda, la producción de ácido cítrico se puede cambiar fácilmente a itacónico ácido. El informe, sin embargo añade la advertencia de que esto podría cambiar si Lucite International, que ya posee patentes sobre la producción de metacrilato de metilo de IA, se inicia la producción comercial en 2016, ya que han anunciado en

asociación con Mitsubishi Rayon. Su meta para producir el 50% de metacrilato de metilo (aproximadamente 400.000 toneladas) puede resultar en aumento significativo de la demanda de ácido itacónico. Itaconix Corporación un Empresa estadounidense que es líder mundial en la producción de polímeros IA fabrica polímeros patentadas de quelación y constructores como sustitutos de los productos químicos a base de petrodólares en los detergentes y agua tratamientos.

Conclusión

Actualmente ácido itacónico se produce predominantemente por fermentaciones utilizando varias cepas de Aspergillus terreus. El ácido itacónico es una sustancia química versátil, que se utiliza en la producción de polímeros con muchas características deseables. A pesar de que puede potencialmente sustituir los productos químicos derivados del petróleo como monómero en diversos procesos de polimerización, la aplicación IA se ve obstaculizada por su costo de producción de alta relativa. La forma más prometedora para reducir la costo de producción IA es reducir el coste del sustrato / prima mediante la utilización de materiales novedosos, sustratos baratos, no alimentarios. Adicionalmente, fermentación en estado sólido también puede ser explotada en la reducción de la costo de producción.

Aumentar el rendimiento de conversión de sustrato a IA mediante la mejora de la eficiencia de las vías de biosíntesis Ia también reducirá el costo.

La manipulación genética de E. coli y el productor de ácido cítrico prolífico Aspergillus niger puede resultar muy valiosa en este sentido.

Además, la exploración de la recuperación del producto más eficientemétodos ayudarán a minimizar las pérdidas de producto y por lo tanto reducir el costo de producción.

En conclusión, si los planes generalizadas para minimizar el impacto ambiental causado por el uso de productos a base de petroquímicos por reemplazándolos con drop-ins o sustituciones de base biológica convertirse en un realidad, la producción de

ácido itacónico a continuación, mediante fermentación microbiana voluntad testigo de los rápidos avances.