Biofilmes de Candida glabrata: resistênciarepositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/34077/1/Eduarda... · No entanto, ainda há pouca informação sobre os mecanismos de resistência

outubro de 2014

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

Eduarda Patrícia Silva Ramos

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Biofilmes de Candida glabrata: resistência a agentes antifúngicos e perfil proteico

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Dissertação de Mestrado Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica Ramo de Engenharia Clínica

Trabalho efetuado sob a orientação da Professora Doutora Mariana Henriques e co-orientação da Doutora Sónia Silva

outubro de 2014

Universidade do MinhoEscola de Engenharia

Eduarda Patrícia Silva Ramos

Biofilmes de Candida glabrata: resistência a agentes antifúngicos e perfil proteico

ii

Declaração

Nome: Eduarda Patrícia Silva Ramos

Título da dissertação: Biofilmes de Candida glabrata: resistência a agentes antifúngicos e perfil proteico

Orientadora: Professora Doutora Mariana Henriques

Co-orientadora: Doutora Sónia Silva

Ano de conclusão: 2014

Designação do Mestrado:Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica

Ramo: Engenharia Clínica

Escola: de Engenharia

Departamento: de Engenharia Biológica

É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTA DISSERTAÇÃO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE.

Universidade do Minho, ____/____/________

Assinatura: _______________________________________________________________

iii

Agradecimentos

Para a realização desta dissertação várias pessoas contribuíram e sem a

colaboração de todas elas os objetivos propostos não teriam sido alcançados e este

trabalho não teria sido realizado, pelo menos desta forma.

Assim, quero expressar os meus agradecimentos a estas mesmas pessoas.

À professora Mariana, por todo o acompanhamento, atenção e dedicação, através

das suas orientações ao longo de todo o trabalho. Agradeço também pelo incentivo e por

todos os ensinamentos e conselhos. Foi um enorme gosto ter tido esta oportunidade de

ter sido orientada por si.

À Sónia agradeço toda a tua disponibilidade, os teus conselhos, sugestões e

ensinamentos que me ajudaram a cumprir os objetivos. Agradeço também por toda a

ajuda dentro e fora do laboratório, a motivação e companheirismo. A tua ajuda foi

fundamental, o “ meu muito obrigada”.

Ao Leonel, por toda a ajuda, todos os teus conselhos e claro toda a tua paciência.

Obrigada por teres sido tão prestável, por todos os teus ensinamentos, pela tua boa

vontade sempre. Apesar da distância não deixaste de estar disposto a ajudar sempre.

A todos os colegas dos LMA’s, especialmente ao meu grupo das “Candidas” e

ao grupo dos “Fagos”, que convivemos mais de perto. Agradeço pela interajuda

demonstrada, pelo ambiente de trabalho, que contribuíram para a motivação deste

trabalho.

Ao doutor Pedro e ao Departamento de Biologia da Universidade do Minho pela

ajuda prestada e por toda a disponibilidade.

iv

À Filipa, quero agradecer a amizade, por todo o apoio, compreensão e

motivação. Agradeço também por toda a paciência, por me ouvires, por estares sempre

lá. Agradeço-te imenso, não tenho palavras para ti….Obrigada por tudo.

Quero agradecer especialmente aos meus pais, por me terem proporcionado esta

oportunidade, por acreditarem em mim, pelo apoio total, pela paciência em todos os

momentos, pelo estímulo e por estarem sempre comigo.

Para ser grande, sê inteiro; nada

Teu exagera ou exclui;

Sê todo em cada coisa; põe quanto és

No mínimo que fazes….

(Fernando Pessoa)

O presente trabalho foi desenvolvido no âmbito do projeto

PTDC/SAUMIC/119069/2010

v

Resumo

Candida glabrata é uma espécie de Candida não albicans com uma crescente

incidência ao longo destas duas últimas décadas em infeções fúngicas, nomeadamente

candidíases. No entanto, ainda há pouca informação sobre os mecanismos de resistência

desta espécie e, por essa razão, o trabalho desenvolvido no âmbito desta dissertação teve

como objetivo identificar novos determinantes de resistência e consequente de

virulência em C. glabrata, com uma abordagem microbiológica, transcriptómica e

proteómica.

Assim, o primeiro objetivo foi estudar o comportamento de biofilmes pré-

formados de C. glabrata após tratamento com agentes antifúngicos. Os resultados

mostraram que o tratamento com fluconazol e voriconazol não alteraram o número de

células viáveis e de biomassa total, dos biofilmes. Com anfotericina B existiu uma

redução, não significativa, quer de células viáveis quer de biomassa.

Numa segunda fase, avaliou-se a expressão de genes envolvidos na formação de

biofilme e produção de matriz extracelular. Verificou-se que o gene FKS1 não está

envolvido na produção/secreção de β-glucanos, como acontece em C. albicans. No

entanto, os genes ZAP1 e KRE1 pareceram ter um papel ativo no mecanismo de

formação de biofilme. Adicionalmente, analisou-se a expressão destes genes em

biofilmes condicionados com fluconazol e voriconazol e verificou-se que não houve

alteração da sua expressão.

Por último, analisou-se o perfil proteico do proteoma total de células de biofilme

de C. glabrata tratadas com fluconazol e voriconazol ou sem tratamento. Observou-se

que na presença de agentes antifúngicos houve um maior número de proteínas visíveis

do que em células de biofilme sem tratamento. Salienta-se ainda, que um maior número

de semelhanças foi encontrado entre os proteomas das células de biofilmes tratadas com

os dois agentes antifúngicos, fluconazol e voriconazol, comparativamente ao proteoma

das células do biofilme sem tratamento.

Em conclusão, este estudo mostrou que os biofilmes de C. glabrata foram

altamente resistentes a fluconazol e voriconazol e estes pareceram atuar ao nível do

proteoma total das células, bem como os genes ZAP1 e KRE1 desempenharam funções

importantes na formação de biofilme de C. glabrata.

vii

Abstract

Candida glabrata is one of non-Candida albicans Candida species with higher

incidence over the last two decades in fungal infections, including Candidiasis.

However, there is still little information about the mechanisms of resistance, thus the

main goal of this thesis was to identify new determinants of resistance and virulence in

C. glabrata, by microbiological, transcriptomics and proteomics approaches.

The first objective was to evaluate the behavior of the C. glabrata pre-formed

biofilms after treatment with antifungal agents. The results showed that biofilms treated

with fluconazole and voriconazole were not affect in terms of the number of viable cells

and total biomass of biofilm. However, Amphotericin B was able to reduce pre-formed

C. glabrata biofilms however without statistical significant, either in the number of

viable cells or total biomass.

In a second step, the expression of genes involved in biofilm formation and

production of extracellular matrix was evaluated. It was found that the FKS1 gene was

not involved in the production / secretion of β-glucans, as described previously for C.

albicans. In other instance, ZAP1 and KRE1 genes seem to have an active role in the

biofilm formation in C. glabrata. Additionally, the expression of these genes was also

analyzed for cells of biofilms treated with fluconazole and voriconazole and was not

detected any significant statistical alteration.

Finally, the biofilm cells protein profile treated and untreated with fluconazole

and voriconazole were also analyzed by 1D and 2D electrophoresis. It was observed that

the cells of the biofilm treated with antifungal agents presented a higher number of

proteins comparatively to cells of untreated biofilms. It is important to emphasize that

were found more similarities between the proteomes profile of the biofilms cells treated

with fluconazole and voriconazole than with proteome of the biofilm cells without

treatment.

In conclusion, this study revealed that biofilms of C. glabrata were strongly

resistant to fluconazole and voriconazole. Moreover, the antifungal agents seem to have

an effect on the total proteome of the biofilm cells, as well as ZAP1 and KRE1 genes

play relevant functions in C. glabrata biofilm formation.

ix

Índice

Agradecimentos ............................................................................................................. iii

Resumo ............................................................................................................................ v

Abstract ......................................................................................................................... vii

Lista de Abreviaturas .................................................................................................... xi

Lista de figuras ............................................................................................................ xiii

Lista de tabelas ............................................................................................................. xv

CAPÍTULO 1 – Introdução ........................................................................................... 1

1.1. Espécies de Candida .............................................................................................. 3

1.1.1. Candida albicans............................................................................................ 4

1.1.2. Espécies de Candida não albicans ................................................................. 5

1.2. Fatores de virulência .............................................................................................. 8

1.2.1. Biofilmes de Candida..................................................................................... 8

1.3. Agentes antifúngicos no tratamento de Candidíases ........................................... 10

1.3.1. Resistência aos agentes antifúngicos............................................................ 12

1.3.2. Determinantes de resistência de biofilmes ................................................... 15

1.4. A importância das proteínas ................................................................................ 17

OBJETIVOS DA TESE ............................................................................................... 21

CAPÍTULO 2 - Materiais e métodos .......................................................................... 25

2.1. Estirpes e condições de crescimento ................................................................... 27

2.2. Agentes antifúngicos ........................................................................................... 27

2.3. Crescimento de células planctónicas ................................................................... 27

2.4. Formação de biofilme e tratamento com antifúngico .......................................... 28

2.5. Quantificação do biofilme ................................................................................... 28

2.5.1. Quantificação da biomassa total ................................................................... 28

2.5.2. Quantificação do número de células viáveis ................................................ 29

x

2.6. Análise de expressão genética ............................................................................. 29

2.7. Extração de RNA ................................................................................................. 30

2.8. Conversão de RNA em cDNA ............................................................................ 30

2.9. PCR quantitativo em tempo real .......................................................................... 31

2.10. Isolamento do proteoma total .......................................................................... 31

2.11. Quantificação das proteínas ............................................................................. 32

2.12. SDS- PAGE ..................................................................................................... 32

2.13. Coloração dos géis ........................................................................................... 33

2.14. Aquisição da imagem e análise dos dados ....................................................... 34

2.15. Estatística ......................................................................................................... 35

CAPÍTULO 3 - Resultados e discussão ...................................................................... 37

3.1. Biofilmes de Candida glabrata ........................................................................... 39

3.2. Determinantes de resistência associados a biofilmes de Candida glabrata ........ 43

3.3. Perfis proteicos do proteoma total de Candida glabrata ..................................... 47

CAPÍTULO 4 – Conclusões e sugestões de trabalho futuro ..................................... 61

4.1. Conclusões finais ................................................................................................. 63

4.2. Sugestões para trabalho futuro ............................................................................ 65

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 67

ANEXOS ....................................................................................................................... 79

Anexo A – Concentração mínima inibitória e concentração mínima fungicida ............. 81

Anexo B – Eficiência dos primers .................................................................................. 82

Anexo C – Extração de proteínas ................................................................................... 85

Anexo D – Curva de calibração de BSA ........................................................................ 87

xi

Lista de Abreviaturas

Abs - Absorvância

ANOVA – Análise de variância

ATCC – American Type Culture Collection

BSA – Albumina de soro bovino

cDNA – Ácido desoxirribonucleico complementar

CV – Violeta cristal

CWP – Proteínas de parede celular

DMSO – Dimetil sulfóxido

DNA - Ácido desoxirribonucleico

DTT – Ditiotreitol

ECM - Matriz polimérica extracelular

GPI - CWP’s – glicoproteínas dependentes de glicosilfosfatidilinositol

IPG - Immobilized pH gradient

NCA - Candida não albicans

NRT – Minus-reverse transcriptase

PBS - Tampão fostato salino

PCR – Reações em cadeia da polimerase

Pir – Proteínas com repetições internas

RNA – Ácido ribonucleico

RPMI – Roswell Park Memorial Institute

SDS-PAGE – Dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida

xii

SDA – Sabouraud dextrose agar

SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida

TCA – Ácido tricloroacético

Tm – Temperatura de desnaturação

UCI - Unidade de cuidados intensivos

UFC – Unidade formadora de colónias

VIH – Vírus da imunodeficiência adquirida

xiii

Lista de figuras

Figura 1.1 - Morfologia de células de Candida glabrata vista ao microscópio óptico. ... 6

Figura 1.2 - Representação da evolução de um biofilme de Candida em várias etapas. (I)

proliferação das células planctónicas; (II) adesão das células a uma superfície; (III) o

biofilme é protegido por uma matriz polimérica; (IV) invasão do tecido através da

produção de hifas e (V) disseminação das células. .......................................................... 9

Figura 1.3 - Ilustração dos diferentes sítios de ação utilizados pelos agentes antifúngicos

usados no combate de espécies de Candida. .................................................................. 11

Figura 3.1 - Número de células viáveis dos biofilmes de 48 h de Candida glabrata após

tratamento com antifúngicos por mais 24 h. Fluconazol com uma concentração de 325

µg/mL, anfotericina B a 40 µg/mL e voriconazol com concentração de 100 µg/mL.

Análise estatística utilizando o t-test. ............................................................................. 39

Figura 3.2 - Valores de absorvância obtidos pelo método de violeta cristal usado para

quantificação da biomassa total do biofilme de 48h de Candida glabrata, após

tratamento com diferentes antifúngicos. Os antifúngicos utilizados, fluconazol,

anfotericina B e voriconazol, apresentam-se a concentrações de 325 µg/mL, 40 µg/mL,

100 µg/mL, respetivamente. Análise estatística com t-test, onde (*) é um valor

significativamente diferente, com p <0,05. .................................................................... 40

Figura 3.3 - Percentagem de expressão genética dos genes FKS1, ZAP1 e KRE1 em

células planctónicas e em células de biofilme. Para se observar melhorar as diferenças

nos resultados a figura apresenta-se como (A) genes FKS1 e ZAP1; (B) genes FKS1,

ZAP1 e KRE1. Análise estatística com two-away ANOVA, (*) e (****) valores

estatisticamente significativos, com p <0,05 e p <0,0001, respetivamente. Comparação

de resultados entre células planctónicas e células de biofilme para cada gene. ............. 43

Figura 3.4 - Percentagem de expressão genética de genes em células de biofilme de C.

glabrata tratadas com fluconazol e voriconazol, com concentrações de 325 μg/ mL e

100 μg/ mL, respetivamente. Para se observar melhorar as diferenças nos resultados a

figura apresenta-se como (A) expressão dos genes FKS1 e ZAP1; (B) expressão dos

genes FKS1, ZAP1 e KRE1. Análise estatística com two-away ANOVA, com

comparação dos resultados entre células de biofilme e células de biofilme tratadas com

agentes antifúngicos. ...................................................................................................... 45

Figura 3.5 - Imagem do gel obtida pelo software Quantity One® onde foram realizadas

comparações do perfil proteico do proteoma total de células de biofilme de C. glabrata

tratadas ou não tratadas com antifúngicos. A vermelho estão representadas as bandas

xiv

correspondentes nas diferentes condições; a azul as bandas padrões, a verde o tipo de

bandas conhecido e a amarelo bandas não classificadas. ............................................... 48

Figura 3.6 - Exemplo de imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest do proteoma

de células de biofilme de C. glabrata crescidas em diferentes condições em strips de pH

3-10. (A) C. glabrata sem agente antifúngico. (B) C. glabrata com fluconazol. (C) C.

glabrata com voriconazol. A amarelo estão representados os spots assinalados para

contagem pelo software. ................................................................................................. 52

Figura 3.7 - Imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest de C. glabrata em

diferentes condições com utilização de strips de pH 5-8. (A) C. glabrata sem agente

antifúngico. (B) C.glabrata com fluconazol. (C) C.glabrata com voriconazol. A cor

verde representa os spots comuns nos diferentes géis; as cores azul, vermelho e amarelo

representam análises de T-test comparativas entre os géis efetuadas pelo software. ..... 54

Figura 3.8 -Representação das possíveis proteínas expressas pelos genes FKS1, ZAP1 e

KRE1. A vermelho está representada a proteína expressa pelo gene FKS1 (PM 213,9 e

pI 7,87);a verde a proteína expressa pelo gene ZAP1 (PM 79,4 e pI 6,99) e a azul a

proteína expressa pelo gene KRE1 (PM 38,4 e pI 5,93). ................................................ 59

xv

Lista de tabelas

Tabela 1.1. - Características morfológicas das espécies C. albicans, C. tropicalis, C.

parapsilosis, C. glabrata .................................................................................................. 7

Tabela 2.1 - Primers usados durante este trabalho ......................................................... 29

Tabela 3.1 - Média de proteína extraída de células de biofilmes de C. glabrata formados

na presença e ausência de antifúngicos (fluconazol e voriconazol) ............................... 47

Tabela 3.2 - Número de bandas identificadas do proteoma total de células de C.

glabrata recolhidas de biofilmes crescidos em diferentes condições obtidas por

eletoforese 1D, após coloração do gel com nitrato de prata e análise através do software

Quantity One® ............................................................................................................... 49

Tabela 3.3 - Percentagem de correspondência de bandas obtidas de células da estirpe C.

glabrata ATCC nas diferentes condições, com os valores fornecidos pelos relatórios

obtidos pelo software Quantity One ............................................................................... 49

Tabela 3.4 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis relativos ao

proteoma total de células de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 3-

10, crescidos na presença e ausência de antifúngicos .................................................... 53

Tabela 3.5 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis do proteoma

total de células de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 5-8,

crescidas na presença e ausência de antifúngicos ........................................................... 55

Tabela 3.6 - Número de spots pelo software PDQuest e os spots correspondentes na

estirpe de referência de C. glabrata na presença e ausência de agentes antifúngicos .... 55

Tabela 3.7 - Percentagem de correspondência de spots de C. glabrata na presença e

ausência de agentes antifúngicos, valores fornecidos pelos relatórios elaborados pelo

software PDQuest ........................................................................................................... 56

CAPÍTULO 1 – Introdução

Introdução CAPÍTULO 1

3

1. Introdução

Recentemente tem ocorrido um aumento de incidência de infeções fúngicas

(Lass-Flörl, 2009) e diversos fatores podem estar relacionados com este aumento, sendo

os mais importantes as novas práticas médicas, como as terapias imunossupressivas,

novas técnicas invasivas e também o uso de antibióticos de amplo espectro. O

aparecimento do vírus da imunodeficiência humana (VIH) e do síndrome da

imunodeficiência adquirida (SIDA) propiciaram também o aumento da incidência de

infeções fúngicas (Shahzad, A., et al. 2012).

Os fungos do género de Candida são os patogénicos humanos mais frequentemente

recuperados de infeções. Apesar deste grupo incluir mais de 150 espécies heterogéneas,

apenas uma minoria são implicadas na candidíase humana (Calderone,R., 2002). De

facto, é sabido que aproximadamente 65 % das espécies de Candida não conseguem

crescer à temperatura de 37 °C, o que as impede de serem espécies patogénicas ou

comensais para humanos (Calderone,RA., 2002)

Apesar da maioria dos casos de candidíase ser atribuído a Candida albicans, um

número crescente de infeções causadas por espécies de Candida não albicans (NCA),

especialmente Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida tropicalis, têm sido

reportadas ao longo destas duas últimas décadas (Silva et al. 2011)

1.1. Espécies de Candida

Os fungos do género Candida são comumente encontrados na flora microbiana da

pele, dos tratos gastrointestinal e urogenital, podendo também ser habitantes no trato

respiratório. Estes vivem como comensais em 30 a 60 % dos indivíduos saudáveis

podendo tornar-se patogénicos (Eggimann, et al. 2003a; Lyon & Resende, 2006).

O género Candida é composto por um grupo extremamente heterogéneo de organismos

que cresce na forma de levedura. A maioria dos membros deste género produz um

crescimento filamentoso designado por pseudohifa, mas a espécie C. albicans, por

exemplo, apresenta a capacidade de formar verdadeiras formas filamentosas, as hifas,

sendo por isso considerada uma espécie polimórfica.


4

Para se proceder laboratorialmente a um diagnóstico médico micológico são utilizados

tanto parâmetros microscópicos como de crescimento, de modo a estabelecer-se uma

identificação de espécies de Candida a partir de isolados clínicos. Adicionalmente aos

testes de formação do tubo germinativo e da formação de clamidósporos são também

realizados testes de crescimento em CHROMagar, um meio cromogénico que permite a

diferenciação de um agente patogénico por uma única cor e, também, perfis de

assimilação bioquímicos para a identificação das espécies de Candida (Calderone,R.

2002). No entanto, novas técnicas moleculares têm sido desenvolvidas de modo a

permitir uma identificação e diferenciação de espécies de Candida mais rápida, sensível

e específica. Para a identificação molecular muitos procedimentos têm sido propostos

para detetar e identificar espécies de Candida, quer baseados em métodos de reações em

cadeia da polimerase (PCR) ou em reações não-PCR (Neppelenbroek, KH.et al. 2013).

1.1.1. Candida albicans

Candida albicans é considerado simultaneamente um microrganismo comensal e

um agente patogénico humano, sendo normalmente classificado como agente

patogénico oportunista. Isto deve-se ao facto de em situações de diminuição das defesas

do hospedeiro, C. albicans ter a capacidade de se tornar patogénico e, deste modo,

aceder a diferentes locais do corpo humano e causar infeção, sendo responsável pela

morte de milhares de pacientes imunocomprometidos (Hernández, R., et al.2004).

Esta espécie passa por transformações morfológicas, entre a forma de levedura e hifa,

durante o processo infecioso. Esta transição morfogénica entre as duas formas é

estimulada pelas condições ambientais encontradas no interior do hospedeiro, sendo

consideradas como um fator de virulência. A produção de formação de hifas facilita a

invasão de tecidos e a evasão do sistema imunitário, conferindo propriedades que são

muito vantajosas em diferentes estados e diferentes locais de infeção (Hernández, R.,et

al. 2004).


5

1.1.2. Espécies de Candida não albicans

Ao longo das últimas duas décadas, muitas espécies de NCA têm surgido como

agentes patogénicos com relevância clínica. Estima-se que um elevado número (58 a 71

%) das espécies de Candida isoladas a partir de culturas sanguíneas sejam NCA

(Calderone, R. 2002). Estas espécies de NCA constituem um grupo de organismos

muito heterogéneos que são fundamentalmente diferentes entre si e de C. albicans. Esta

diversidade dentro do género de Candida, associada com a infeção em humanos,

proporciona novos desafios ao diagnóstico e ao tratamento de candidíases (Calderone,

R. 2002).

As espécies de NCA causam cerca de 35 a 65 % de todas as candidíases na população

geral de pacientes. Estas ocorrem mais frequentemente em pacientes com cancro,

maioritariamente naqueles com tumores hematológicos e recetores de transplantes de

medula óssea (40 a 70 %), mas são menos comuns entre pacientes internados em

unidades de cuidados intensivos (UCI) e pacientes sujeitos a cirurgia (35 a 55 %),

crianças (1 a 35 %) e pacientes VHI-positivos (0 a 33 %) (Bassetti, et al. 2006).

As espécies de NCA mais comuns são C. parapsilosis (20 a 40 %), C. tropicalis (10 a

30 %), C. Krusei (10 a 35 %) e C. glabrata (5 a 40%), havendo, no entanto, novas

espécies emergentes (Krcmery & Barnes, 2002). Em termos de virulência e

patogenicidade, algumas espécies de NCA aparentam ter menor virulência em modelos

animais, contudo, comportam-se com igual ou ainda maior virulência no ser humano,

quando comparadas com C. albicans. A mortalidade devido a espécies de NCA é

similar à de C. albicans, variando entre os 15 e os 35 %. No entanto, existem diferenças

na mortalidade geral e na atribuída a cada espécie, sendo que a mortalidade mais baixa

encontra-se associada a C. parapsilosis e a mais alta a C. tropicalis e C. glabrata (40 a

70 %). A mortalidade associada às espécies de NCA parece ser maior em pacientes

submetidos a cirurgia e internadas em UCI e um pouco menor em pacientes com cancro,

crianças e pacientes VIH-positivos (Krcmery & Barnes, 2002). Especificamente, C.

glabrata é uma preocupação crescente em ambientes clínicos, uma vez que causa

infeções das mucosas e está relacionada com cerca de 15 % das infeções sanguíneas

sistémicas relacionadas com espécies de Candida, além do que novas aquisições de C.

glabrata requerem longos períodos de hospitalização (Rodrigues et al. 2014).


6

Candida glabrata

Candida glabrata foi inicialmente considerada como um agente não patogénico

e saprófita da flora normal de indivíduos saudáveis, causando raramente infeções graves

em humanos. Contudo, em consequência da sua disseminação e aumento do uso de

terapias imunossupressivas, juntamente com terapias antimicóticas de largo espectro, a

frequência de infeções da mucosa e sistémicas causadas por C. glabrata tem aumentado

significativamente (Rodrigues, C. et al. 2014). De facto, dependendo do local de

infeção, C. glabrata é frequentemente a segunda ou terceira maior causa de candidíase,

depois de C. albicans (Groot, P. et al 2008).

Em contraste com outras espécies de Candida, C. glabrata não apresenta dimorfismo,

sendo consequentemente encontrada apenas sob a forma de blastoconídea (figura 1.1),

tanto como comensal como agente patogénico. Candida glabrata é a única espécie de

Candida que não apresenta pseudohifas a temperaturas iguais ou superiores a 37 °C

(Rodrigues, C. et al. 2014).

Figura 1.1 - Morfologia de células de Candida glabrata vista ao microscópio óptico (Fidel, P. et al.

1999).

Candida glabrata em Sabouraud Dextrose Agar (SDA) forma colónias suaves

brilhantes e de cor creme, que são aparentemente indistinguíveis de qualquer outra

espécie de Candida, exceto pelo seu tamanho, que é bastante mais reduzido. Em


7

CHROMagar, as colónias de C. glabrata aparecem com uma coloração entre o rosa e o

roxo (tabela 1.1).

Tabela 1.1. - Características morfológicas das espécies C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C.

glabrata (adaptado de Silva, S. et al. 2012)

Espécies Tubo

germinativo

Clamidósporo Hifa/pseudo-

hifa

Tamanho

da

levedura

(μm)

Reação ao

CHROMagar

C. albicans + + +/+ 4-6 × 6-10 Azul-verde

C. tropicalis - ± ±/+ 4-8 × 5-11 Azul escuro

C. parapsilosis - - -/+ 2.5-4 × 2.5-

9

Branco

C. glabrata - - -/- 1-4 Branco, rosa –

roxo

Uma característica fundamental específica de C. glabrata consiste no seu genoma

haploide, em contraste com o genoma diploide de C. albicans e de outras espécies de

NCA (Fidel,P. et al.1999)

As infeções provocadas por C. glabrata são difíceis de tratar, uma vez que estas são

frequentemente resistentes a agentes antifúngicos como os azóis, especialmente o

fluconazol. Consequentemente, as infeções provocadas por C. glabrata correspondem a

elevadas taxas de mortalidade em pacientes de risco. A presença de um tumor sólido, a

transplantação de órgãos, uma doença cardiovascular, uma cirurgia na zona abdominal e

debilidade renal são alguns fatores de risco que podem prever uma infeção invasiva por

C. glabrata. Este tipo de infeção ocorre predominantemente em pacientes em estado

mais grave, explicando a sua maior mortalidade global em comparação com outras

espécies de NCA (Krcmery & Barnes, 2002).


8

1.2. Fatores de virulência

As espécies de Candida possuem determinados e característicos fatores de

virulência, tais como: a capacidade de adesão e formação de biofilme, a secreção de

enzimas hidrolíticas (por exemplo, proteases, fosfolipases e hemolisinas) e a capacidade

de produzir formas filamentosas que facilitam a invasão do tecido hospedeiro

(Calderone R. et al. 2001; Haynes, K. 2001). A patogenicidade irá depender dos

diversos fatores de virulência que o microrganismo possui e manifesta (Silva, S. et al.

2012). Especificamente, C. glabrata tem a capacidade de aderir, através de adesinas, e

formar biofilmes, produzir fosfolipases e hemolisinas, mas ao contrário de outras

espécies de Candida não produz proteases (Rodrigues, C. et al 2014). As fosfolipases

promovem uma interface mais poderosa com a musosa do hospedeiro, destruindo-o e

efetuando uma invasão efetiva dos tecidos envolvidos; as hemolisinas são responsáveis

pela degradação da hemoglobina e por extraírem ferro das células hospedeiras. É

através da degradação da hemoglobina que crescem em tecidos hospedeiros, uma vez

que usam este componente como fonte de ferro (Rodrigues, C. et al. 2014).

1.2.1. Biofilmes de Candida

Um dos primeiros eventos que ocorre aquando uma infeção por Candida é a

adesão da levedura ao hospedeiro e/ou à superfície de um dispositivo médico, o que

muitas vezes leva à formação de biofilmes. Os biofilmes são definidos como

comunidades de microrganismos associadas a uma superfície, que se encontram

englobados por uma matriz extracelular e são considerados a forma mais prevalente de

crescimento de microrganismos no corpo humano (Crump, A., et al. 2000; Chandra, J.,

et al. 2001).

Assim, a capacidade de formação de biofilme é considerada como um forte fator de

virulência para algumas espécies de Candida, uma vez que lhes confere uma

significante tolerância à terapia antifúngica, limitando a penetração destas substâncias

através da sua matriz (Donlan, RM., et al. 2002; Mukherjee, PK., et al. 2004). Os

isolados de C. glabrata são hábeis na formação de biofilme e a sua presença durante a

infeção tem sido ligada à sua alta mortalidade comparativamente com isolados

incapazes de formar biofilme (Silva, S., et al. 2011). A formação de um biofilme do


9

género Candida engloba várias etapas (figura 1.2). Primeiramente as células

planctónicas (I) ligam-se ao hospedeiro ou à superfície de dispositivos médicos por

mecanismos de adesão (II). As defesas insuficientes do hospedeiro levam à proliferação

de células de Candida resultante num biofilme complexo protegido por uma matriz

polimérica produzida pelas próprias células (III). Quando ocorre produção de hifas, o

tecido é invadido (IV) e após esta invasão, as células de Candida podem disseminar-se

nos vasos sanguíneos e estas são expostas ao sistema imunitário (V) (Cate, J.M., et al.

2009).

Figura 1.2 - Representação da evolução de um biofilme de Candida em várias etapas. (I)

proliferação das células planctónicas; (II) adesão das células a uma superfície; (III) o biofilme é

protegido por uma matriz polimérica; (IV) invasão do tecido através da produção de hifas e (V)

disseminação das células (Cate, J.M., et al. 2009).

Como anteriormente referido, C. glabrata é capaz de aderir e colonizar tecidos

hospedeiros assim como superfícies abióticas, onde se desenvolve um biofilme

multicamada, apesar de não ser capaz de formar filamentosas (Silva, S., et al. 2009;

Iraqui, I., et al. 2005). Um fator importante relacionado com a sua capacidade de adesão

é a presença de proteínas específicas de parede celular, nomeadamente as da família das

adesinas (De las Penas, A., et al 2003).


10

A forma de biofilme confere a C. glabrata uma vantagem ecológica, ajudando a

sobreviver como comensal ou patogénico dos seres humanos, permitindo-lhe evadir aos

mecanismos imunitários dos hospedeiros, resistir aos tratamentos antifúngicos e à

pressão competitiva por parte de outros microrganismos (Silva, S., et al. 2010). Sob

uma perspetiva clínica, a característica mais importante atribuída aos biofilmes de

Candida é sua elevada resistência às terapias antifúngicas convencionais. Vários

estudos demonstraram já que os biofilmes de Candida levam a um aumento drástico dos

níveis de resistência aos agentes antifúngicos mais usados, fluconazol, voriconazol e

anfotericina B (AmB) (Fonseca, E., et al. 2014; Rodrigues, C. et al. 2014). Assim, C.

glabrata, como as todas as espécies de Candida, possuem a capacidade de responder a

alterações ambientais, nomeadamente ao tratamento antifúngico e tem-se vindo a

demonstrar altamente resistentes (Rodrigues, C. et al. 2014).

1.3. Agentes antifúngicos no tratamento de Candidíases

Os agentes antifúngicos disponíveis pertencem a 4 classes distintas, os azóis, os

polienos, as equinocandinas e análogos de nucleosideo. Os azóis, como o fluconazol e o

voriconazol, bloqueiam a produção de ergosterol, causando a acumulação de um

intermediário tóxico do ergosterol, que resulta num stress da membrana celular. Os

polienos, como a AmB, ligam-se ao ergosterol, causando a formação de poros na

membrana celular. A 5-flucitosina inibe a síntese DNA e RNA. As endocandinas, como

a caspofungina e micafungina, são os agentes antifúngicos mais atuais e inibem a

síntese de β-(1,3)-D-glucano e, consequentemente, rompem a integridade da parede

celular (Calderone, 2002; Cowen,2008).

Os antifúngicos que são comumente utilizados para tratar infeções por Candida

possuem diferentes mecanismos de ação e atuam em diferentes sítios, conforme está

discriminado na figura 1.3.


11

Figura 1.3 - Ilustração dos diferentes sítios de ação utilizados pelos agentes antifúngicos usados no

combate de espécies de Candida ( Mishra, M., et al. 2007).

Fluconazol

O fluconazol é um agente antifúngico que inibe o lanosterol 14α-demetilase

prevenindo a formação do ergosterol, que é um componente essencial na membrana da

célula de Candida. O fluconazol interage com a 14α demetilase, também conhecido

como citocromo P450, que é uma enzima responsável pela conversão do lanosterol em

ergosterol. Como o ergosterol é um componente essencial da membrana celular, a

inibição da sua síntese resulta no aumento da permeabilidade celular, levando à perda de

conteúdos celulares (Pfaller, MA. 2012).

Voriconazol

O voriconazol é um agente antifúngico da segunda geração dos triazóis. A sua

primeira ação passa pela inibição do citocromo P450, mediado pela desmetilação da

14α-demetilase, um passo essencial na biossíntese de ergosterol. A acumulação de

esteróides 14α-metil relaciona-se com a subsequente perda de ergosterol na parede


12

celular e pode ser responsável pela atividade antifúngica do voriconazol (Burn, A. et al.

2004).

Anfotericina B

A AmB é um metabolito de Streptomyces nodosus e é um dos antibióticos

polienos que é usado clinicamente no tratamento de infeções fúngicas sistémicas graves

há mais de 50 anos, sendo que a sua estrutura foi estabelecida em 1970.

A seletividade das moléculas de AmB prende-se com os lípidos membranares das

moléculas de fungos, com a presença de tipos específicos de esteroides, sendo no caso

dos fungos, o ergosterol.

O mecanismo de ação mais conhecido do efeito da AmB nas biomembranas está

diretamente associado com a formação de poros transmembranares que são capazes de

permitir a passagem de iões (K+, Na

+, H

+, Cl

−) e pequenas moléculas orgânicas de

dentro da célula e, consequentemente, leva à morte da célula. Assim, os canais iónicos

membranares formados pela AmB e as moléculas de ergosterol são considerados um

elemento crucial no mecanismo antifúngico para a célula (Gagos, M., et al. 2010)

1.3.1. Resistência aos agentes antifúngicos

Para se erradicar os biofilmes de Candida são utilizados agentes antifúngicos, e o

seu uso frequente tem estado associado a uma resistência a estes agentes por espécies de

Candida, sendo conhecidos diferentes mecanismos que contribuem para a resistência a

este tipo de fármacos.

Os mecanismos de resistência mais frequentes incluem a redução da difusão do

fármaco por parte da célula, bem como a modificação ou degradação do antifúngico

quando este entra na célula. Além disso, podem ocorrer modificações enzimáticas

(Mishra, M., et al. 2007).

Quando em biofilme, a espécie de Candida apresenta também um mecanismo de

resistência aos agentes antifúngicos que é considerado multifatorial (figura 1.4).


13

Figura 1.4 - Representação dos mecanismos de resistência de biofilmes fúngicos (Ramage, G. et al.

2012).

Os mecanismos inerentes à elevada resistência dos biofilmes, comparativamente

a células no estado planctónico, envolvem remodelações fundamentais do estado

celular, como a indução de mudanças morfológicas, a produção de uma matriz

extracelular e modificações na comunicação célula a célula (Mishra, M., et al. 2007).

A densidade celular é um fator de resistência importante, principalmente em azóis. Em

biofilmes maduros, caraterizados normalmente por elevada densidade celular, existe um

espaço heterogéneo entre as microcolónias e os canais de água, que induz a resistência.

É também referido que a densidade celular nos biofilmes causa resistência aos

fármacos, uma vez que com o aumento da densidade celular aumenta a resistência do

biofilme (Ramage, G. et al. 2012). Outra situação associada com biofilmes densos é a

cooperação existente entre células individuais. Este fenómeno ocorre por processos de

quorum sensing, conferindo às células de biofilme a capacidade de coordenar o seu

comportamento através da secreção de moléculas sinalizadoras (Ramage, G. et al.

2012).

O ergosterol tem uma grande importância na resistência dos biofilmes, maioritariamente

nos azóis, que impede a sua síntese (Ramage, G. et al. 2012). Durante a formação de

biofilme de C. albicans, o nível e a composição de esterol varia, contribuindo para a


14

resistência antifúngica. Estas variações podem ser explicadas pela sobre expressão de

genes envolvidos na biossíntese de ergosterol e glucanos (Mukherjee, K. 2010).

As bombas de efluxo contribuem, também, para a resistência antifúngica dos biofilmes,

devido à diferenciação da expressão destas bombas de efluxo durante o

desenvolvimento de biofilme (Mukherjee, K. 2010).

A matriz polimérica extracelular (ECM) representa um papel importante na resistência

aos antifúngicos, porque é uma estrutura que protege as células patogénicas da resposta

imunitária do hospedeiro e impede a difusão dos agentes antifúngicos (Ramage, G. et al.

2012; Mukherjee, K. 2010). Os β-1,3 glucanos são os carbohidratos principais na ECM

de biofilmes de C. albicans, sendo que estes aumentam durante a formação de biofilme,

intensificando a resistência da ECM. Além disso, os β-1,3 glucanos atuam como uma

esponja, sequestrando vários agentes antifúngicos como azóis, equinocandinas,

pirimidinas e polienos (Ramage, G. et al. 2012).

Em biofilmes de C. albicans foi reportada a existência de células “persister” que são

variantes dormentes de células regulares que se formam aleatoriamente em populações

microbianas e são altamente tolerantes a antibióticos e que são maioritariamente

responsáveis pela resistência antifúngica em infeções crónicas (Lewis, K. 2010;

Ramage, G. et al. 2012).

O stress é outro fator importante nos mecanismos de resistência, uma vez que

normalmente, mudanças na temperatura, mudanças osmóticas ou stress oxidativo

causam um stress fisiológico em microrganismos patogénicos, como espécies de

Candida resultando alterações a níveis de resistência (Ramage, G. et al. 2012).

De facto, é sabido que os biofilmes de Candida são resistentes a vários agentes

antifúngicos, incluindo os azóis (Rodrigues, C. et al. 2014). O mecanismo de resistência

aos azóis em biofilmes de espécies de C. albicans é de todos o mais bem estudado,

envolvendo a sobre-expressão de transportadores de multifármacos, a difusão de

fármacos reduzida a uma baixa taxa de crescimento, bem como alterações da membrana

plasmática e da parede celular (Mishra, M., et al. 2007). Sendo que, são necessárias

múltiplas vias de sinalização para pressentir alterações ambientais e despoletar a cascata

de eventos celulares que se manifestam numa resistência aos agentes antifúngicos,

mediada pela formação de biofilme (Cowen & Steinbach, 2008). Apesar de algum

esforço no sentido de uma melhor compreensão nestes mecanismos envolvidos na


15

resistência de biofilmes de Candida a tratamentos com os antifúngicos tradicionais,

estes ainda são pouco conhecidos.

1.3.2. Determinantes de resistência de biofilmes

A resistência do biofilme é um fenómeno complexo multifatorial e diferentes

mecanismos podem ser responsáveis pela intrínseca resistência dos biofilmes de

Candida e especificamente de C. glabrata. Alguns genes de formação de biofilme estão

a ser estudados de modo a se perceber os mecanismos associados a este processo.

Um elemento crucial da matriz do biofilme de muitos microrganismos são os

polissacarídeos extracelulares. O β-1,3 glucano, um polissacarídeo muito importante no

fungo, tem sido associado à proteção do biofilme contra agentes antifúngicos. Sabe-se

(Taff, H. et al. 2012) que foram identificadas três enzimas que estão envolvidas no

mecanismo de excreção dos glucanos do interior da célula para a matriz extracelular.

Em C. albicans as enzimas consistem em duas glucano transferases e uma

exoglucanase, codificadas pelos genes BGL2, PHR1 e XOG1, respetivamente. A figura

1.5 é demonstrativa da importância da proteína FKS1p que está ligada às células

membranares e é responsável pela produção de β-1,3 glucanos, que é incorporado tanto

na parede celular como na matriz extracelular. É proposto (Taff, H., et al. 2012) que as

proteínas PHR1p, BGL2p, e XOG1p são responsáveis pelo fornecimento e disposição

de β-1,3 glucanos na matriz e atuam de forma independente do pathway de arranjo da

parede celular e que atuam de forma complementar e independente da via de produção

de ZAP1p da matriz, que inclui as glucoamilases GCA1p e GCA2p (Taff, H. et al.

2012).


16

Figura 1.5 - Modelo de produção de glucanos e entrega para a matriz do biofilme de C. albicans.

Em que as setas pretas representam o pathway dos glucanos do produto sintetizado dos açúcares

modificados que são incorporados na matriz do biofilme; os círculos representam a produção ou

modificação de enzimas envolvidas nos substratos de hidratos de carbono; os glucanos de matriz

estão representados a roxo para distinguir dos glucanos da parede celular, a cinzento; as linhas a

vermelho representam a inibição de enzimas por fatores de transcrição (Taff, H., et al. 2012).

Sabe-se que (Katiyar, SK., et al. 2012) em C. glabrata o gene FSK1 codifica para a

produção de β-1,3 glucanos, com função redundante com FSK2p. Algumas mutações no

FSK1 conferem resistência a equinocandinas. O gene ZAP1 é dependente da ligação a

iões zinco e tem uma ligação especifica de DNA ao fator de transcrição da RNA

polimerase II (Candida genome database). Por sua vez, o gene KRE1, em C.

parapsilosis tem um papel na biossíntese de β-1,6 glucanos e possui expressão

aumentada em estirpes resistentes a fluconazol e voriconazol (Silva, AP., et al. 2011).


17

1.4. A importância das proteínas

As proteínas no género de Candida desempenham diversas funções, como

atividades hidrolíticas e enzimáticas que fornecem nutrientes e facilitam o estado das

espécies como comensal ou como agente patogénico invasivo (Chaffin, 2008).

Adicionalmente, a integridade da parede celular é claramente extremamente importante

para a sobrevivência do microrganismo (Pitarch et al. 2002). A superfície da célula

desempenha dois papéis, quer mantendo a integridade da célula quer interagindo com o

ambiente envolvente, sendo um ponto de contato entre o microrganismo e o hospedeiro.

Além do que, dado que as células de mamíferos não têm uma parede celular, esta

estrutura celular poderia ser um local molecular promissor para pesquisar novos

fármacos antifúngicos específicos (Pitarch et al. 2002). Para C. albicans, a parede

celular tem sido um foco de atenção ao longo das últimas décadas, enquanto para C.

glabrata a informação é mais escassa.

A parede celular de espécies de Candida é principalmente constituída por polímeros

de manose covalentemente ligados a proteínas ou glicoproteínas (manoproteínas, 30 a

40 %), polímeros de glucose (glucanos, 50 a 60 %) e quitina (0,6 a 9 %) (Pitarch, et al,

2002).

A parede de um fungo é um organelo dinâmico que serve de interface entre o

fungo e o hospedeiro. Esta dá-lhe forma, confere proteção contra condições ambientais

dentro do hospedeiro e medeia as interações hospedeiro-fungo que permitem o

aparecimento de infeções. A parede fúngica é uma estrutura de camada dupla, em que a

camada interna é constituída principalmente por moléculas de β-1,3-glucano, que é

fortificada por ligações de hidrogénio e prolongada por moléculas de β-1,6-glucano,

covalentemente ligadas. As moléculas de β-1,6-glucano podem também estar ligadas a

cadeias de quitina. Estes três constituintes da parede formam uma rede flexível e

tridimensional (Groot et al, 2008; Chaffin, 2008).

A parede é composta por uma rede interna de hidratos de carbono complexos e

uma camada exterior de manoproteínas glicosadas, denominadas de proteínas da parede

celular (cell wall proteins, CWP) covalentemente ligadas aos glucanos da parede.

Existem duas classes de proteínas de parede (figura 1.6), as glicoproteínas dependentes

de glicosilfosfatidilinositol (GPI-CWPs) e as proteínas Pir (proteins with internal

repeats) (Groot et al. 2008; Chaffin, 2008).


18

As paredes de Candida glabrata contêm GPI ligadas covalentemente à parede β-

1,6- glucano, bem como proteínas ligadas através de uma ligação ligeira alcalino-

sensível a β-1,3-glucano. Existe ainda, em C. glabrata, uma terceira classe de proteínas

que não possui uma ligação covalente à matriz de polissacáridos. Algumas destas

proteínas podem estar distribuídas heterogeneamente pela superfície e podem não ter

qualquer associação com o interior da célula. Fazem parte, também, da parede celular os

fosfolipomananos com ligações β-1,2-manose (Groot et al. 2008; Chaffin, 2008).

Figura 1.6 - Representação esquemática dos principais componentes de Candida. A parede celular

está localizada externamente à membrana celular (representada no fundo da imagem, a preto e

branco). Os retângulos vermelhos representam as proteínas GPI e os hexágonos amarelos

representam as proteínas Pir. As linhas azuis escuras representam os β-1,3-glucanos e as linhas

azuis mais claras os β-1,6-glucanos. Os círculos castanhos representam os fosfatomanolípidos e os

círculos verdes, proteínas soltas encontradas na parede celular ou no meio (retirado de (Chaffin,

2008)).

Uma das mudanças nos recentes anos é a aplicação de novas abordagens, não apenas

para a expressão genética, mas também para a quantificação e identificação de proteínas

e do seu metabolismo (Chaffin, 2008).

A proteómica surgiu com este mesmo objetivo de determinar a presença, abundância

relativa e a modificação do estado de um conjunto de proteínas (Wilkins et al. 1995).

Esta técnica de pesquisa permite identificar, quantificar e caracterizar as proteínas

sintetizadas nas células, tecidos ou organismos sobre diferentes condições, como

condições e fatores de crescimento, stress, fármacos e doença (Wang et al; Taylor et al.

2000). Nem o código genético de DNA de um organismo, nem a quantidade de RNA

mensageiro, que é expresso para cada produto genético (proteína), asseguram uma

representação precisa do estado de uma célula viva, que pode ser alterado por várias


19

situações, como as referidas anteriormente. Assim, uma análise proteómica permite

determinar as proteínas que foram condicionalmente produzidas, com que abundância e

se algumas das modificações pós-translacionais foram afetadas. Desta forma, com este

tipo de análise podem ser comparados dois ou mais estados de uma célula e também

pode ser utilizada para tentar identificar mudanças proteicas específicas, a nível

qualitativo e/ou quantitativo (Castle, et al. 2008).

O fracionamento reprodutível de misturas complexas de proteínas é um dos maiores

desafios da análise proteómica, mantendo contudo, as relações qualitativas e

quantitativas. O método que é recorrentemente usado para o desempenho desta tarefa

com sucesso é a eletroforese em géis de poliacrilamida em duas dimensões, tendo-se

tornado na ferramenta primária em investigação de proteómica.

Uma experiência em proteómica, como o estudo de perfis proteicos, é dividida em

várias etapas. Inicialmente, é necessária a preparação e delineação da experiência, de

modo a que os parâmetros chave sejam analisados, otimizados e revistos. De seguida, é

feita a extração, fracionamento e solubilização de proteínas. As proteínas podem ser

solúveis em citosol, inseridas em membranas celulares ou estarem ligadas a ácidos

nucleicos ou outras proteínas. A escolha para o método de lise da célula e a composição

do tampão de lise celular são os fatores principais que afetam diretamente a

solubilização das proteínas. O método escolhido vai depender do tipo de microrganismo

e pode ser um método de extração de proteínas mecânico ou químico. Os métodos

mecânicos compreendem a sonicação com esferas de vidro para a lise das células.

Enquanto no método químico é utilizada uma enzima, como a lisozima, para quebrar as

paredes celulares. No que diz respeito aos tampões de lise, é da maior importância que

contenham inibidores de proteases, para prevenir a degradação de proteínas que podem

resultar na perda de proteínas de alto peso molecular. (Sousa, A., et al. 2014)

Após a solubilização das proteínas é feita a separação das proteínas num gel e,

posteriormente, a sua imagem é adquirida e analisada, permitindo um isolamento e

quantificação relativa das proteínas. É possível, após a excisão das proteínas do gel,

fazer a sua identificação, recorrendo à espectrometria de massa e, finalmente, fazer

também a caracterização funcional das proteínas identificadas (Castle, et al. 2008;

Taylor, et al. 2000).

OBJETIVOS DA TESE

Objetivos da Tese

23

O objetivo principal deste trabalho visou aumentar o conhecimento inerente aos

mecanismos de resistência de biofilmes de Candida glabrata. O trabalho foi dividido

em três partes:

I. Estudar o comportamento de biofilmes pré-formados de C. glabrata após

tratamento com agentes antifúngicos, nomeadamente fluconazol, voriconazol e

anfotericina B.

II. Estudar a expressão de genes envolvidos na formação de biofilme e produção de

matriz extracelular em C. glabrata e avaliar a sua importância na resistência ao

fluconazol e ao voriconazol.

III. Estudar o perfil proteico de células de biofilme C. glabrata após tratamento com

os antifúngicos fluconazol e voriconazol.

Pretendeu-se, assim, usando uma abordagem microbiológica, transcriptómica e

proteómica identificar novos determinantes de resistência e consequente de virulência

em C. glabrata.

CAPÍTULO 2 - Materiais e métodos

Materiais e métodos CAPÍTULO 2

27

2. Materiais e métodos

2.1. Estirpes e condições de crescimento

Neste trabalho prático foi utilizada uma estirpe de referência, C. glabrata 2001

proveniente da American Type Culture Collection (ATCC). Para cada experiência a

estirpe foi cultivada em meio Sabouraud dextrose agar (SDA; Merck, Darmstadt,

Germany) por 48 h a 37ºC. Sempre que necessário a estirpe foi inoculada no meio

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI; Sigma-Aldrich), durante 18 – 20 h a 37

°C, sob agitação (120 rpm). A suspensão resultante foi recolhida por centrifugação a

8000 rpm, durante 10 minutos a 4 °C e o pellet recolhido e lavado duas vezes com

tampão fosfato salino (PBS - 0,1 M, pH 7) estéril. A concentração celular final foi

determinada através da contagem do número de leveduras em câmara de Neubauer e as

suspensões celulares preparadas em meio RPMI para uma concentração final de 1×10 7

células/mL.

2.2. Agentes antifúngicos

Foram usados três agentes antifúngicos, o fluconazol (Pfizer®, S.A), com uma

concentração de 325 μg/mL, o voriconazol (Pfizer®, S.A), com uma concentração de

100 μg/mL e a AmB (Pfizer®, S.A), com uma concentração de 40 μg/mL. Os agentes

antifúngicos foram dissolvidos em DMSO (dimetil sulfóxido) de forma a se obter uma

concentração de 5mg/mL para o fluconazol e o voriconazol e uma concentração de

1mg/mL para a AmB. A concentração de trabalho foi preparada em RPMI.

2.3. Crescimento de células planctónicas

As células planctónicas, numa concentração de 1×107

células/mL, foram crescidas

em meio RPMI a 37 °C e 120 rpm durante 48h. Após 24h de crescimento metade do

meio foi substituído por meio fresco e crescidas por mais 24 h. As células foram

recolhidas através de centrifugação a 8000 rpm durante 10 min.


28

2.4. Formação de biofilme e tratamento com antifúngico

O biofilme foi formado em placas de 24 poços (Thermo Scientific) e para tal 1 mL

de suspensão, 1×10 7

células/mL em RPMI, foi adicionada a cada poço. Após 24 h de

formação, os biofilmes foram tratados com fluconazol, voriconazol e AmB. Para tal,

metade do meio foi removido de cada poço e substituído pelo mesmo volume de

antifúngico, previamente preparado nas concentrações supramencionadas (secção

2.1.2). Como controlo, foi formado um biofilme sem antifúngico, e para tal neste caso

metade do meio foi removido e substituído por meio RPMI novo. Os biofilmes foram

incubar por mais 24h a 37º C e 120 rpm.

2.5. Quantificação do biofilme

2.5.1. Quantificação da biomassa total

A quantificação da biomassa total do biofilme foi realizada através da técnica de

coloração com violeta cristal (Henriques et al, 2006). Assim, após a formação e

tratamento do biofilme com as respetivas concentrações de agentes antifúngicos, toda a

suspensão celular foi removida e o biofilme lavado duas vezes com 1 mL de PBS. O

biofilme foi fixado com 500 μL de metanol (100 %) durante 15 minutos. Após a

remoção do metanol, os biofilmes foram corados com 500 μL de violeta cristal (1 % v/v

em água) durante 5 minutos. O violeta cristal foi removido e o biofilme lavado duas

vezes com água destilada e deixado secar ao ar. Posteriormente, foram adicionados 500

μL de ácido acético (33% v/v em água) de forma a libertar o corante retido pelo

biofilme. A solução foi analisada por espectrofotómetro (Bio-Tek Synergy HT, Izasa,

Lisbon, Portugal) a uma absorvância de 570 nm. Os resultados são apresentados como

Abs/cm2.


29

2.5.2. Quantificação do número de células viáveis

Para a contagem de número de células viáveis foi utilizado o método de unidade

formadora de colónias (UFC). Assim, após a formação e tratamento do biofilme com as

respetivas concentrações de agentes antifúngicos, toda a suspensão celular foi removida

e o biofilme lavado duas vezes com 1 mL de PBS de forma a remover as células não

fortemente aderidas. Seguidamente, o biofilme foi raspado em PBS e diluições seriadas

foram realizadas e o plaqueamento realizado em SDA. As placas foram incubadas a 37

°C durante aproximadamente 24 h e os resultados apresentados em UFCs/cm2. Foram

realizados três ensaios independentes.

2.6. Análise de expressão genética

Para estudos de expressão genética foram estudados os genes FKS1

(CAGL0G01034g), ZAP1 (CAGL0J05060g) e KRE1 (CAGL0M04169g). Para

determinar o nível de expressão relativo destes genes foi utilizado o PCR quantitativo

de tempo real, sendo o gene ACT1 usado como normalizador. Todos os primers foram

desenhados utilizando o Candida Genome Database e recorrendo ao programa Primer3

(tabela 2.1).

Tabela 2.1 - Primers usados durante este trabalho

Genes

testados

Primer Sequência do Primer (5’-3’) Tm (°C)

FKS1 Forward GTCGTAACCTTGCACACCAG 57

Reverse CTACGCCCAAACATCAGCG

ZAP1 Forward TTGATGTGTTTGGCCATGGG 57

Reverse ACAACAACCGCATCCACTTC

KRE1 Forward CACTGGTACGGCAAACACAC 59

Reverse AGAAGGCTTGGACTTCACGA

ACT1 Forward GTTGACCGAGGCTCCAATGA 57

Reverse CACCGTCACCAGAGTCCAAA


30

2.7. Extração de RNA

Para a extração de RNA, as células planctónicas e de biofilme foram crescidas em

meio RPMI 1640 (secções 3.1.3 e 3.1.4) e os biofilmes tratados com antifúngicos

(secção 3.1.5). Estas células foram depois recolhidas: as células de biofilme por

lavagem com PBS e raspagem; as células planctónicas por centrifugação a 8000g

durante 5 min. As células foram rompidas utilizando o Fastprep (velocidade 6,5 m/s

durante 30 s, sete vezes) em tubos estéreis com esferas de vidro. Após centrifugação

(10000g, 5 min), o sobrenadante foi recolhido e foi adicionado igual volume de etanol

70 % (v/v) livre de RNAses. O RNA foi purificado utilizando o PureLink RNA Mini

Kit® (Invitrogen). Resumidamente, 500 μL da mistura foram transferidos para a coluna

“Spin Cartridge” do Mini Kit e, depois centrifugada a 10000g durante 15 segundos. Este

passo foi repetido e a coluna foi lavada com wash buffer I (500 μL). O tubo de colheita

foi descartado e substituído por um novo. Depois, a coluna foi lavada com wash buffer

II (500 μL) e o conteúdo do tubo de colheita rejeitado (este passo foi repetido mais uma

vez). O RNA foi recuperado por adição na coluna de 50 μL de água livre de RNAses,

com incubação à temperatura ambiente por 2 min, sendo depois centrifugada (1 min,

10000g). O RNA obtido foi posteriormente tratado com DNase I (Deoxyrybonuclease I,

Amplification Grade, Invitrogen). Para tal, foi adicionado 10 μL de amostra para 1 μL

de DNase I. As amostras foram depois incubadas por 15 min à temperatura ambiente.

Para desativar a DNase I foi adicionado 1 μL de 25 mM de EDTA (para cada 10 μL de

amostra) e a mistura foi incubada durante 10 min a 65 ºC. A concentração de RNA foi

determinada através da medição da densidade ótica, na razão 260/280, no aparelho de

medição nanodrop (NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific®).

2.8. Conversão de RNA em cDNA

Depois da quantificação do RNA é necessário converte-lo em cDNA. A conversão

foi realizada pela utilização do kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Life

Technologies). Para tal, foi preparada uma mistura com 8 μL de tampão 5x mistura de

reação iscript, 2 μL de transcriptase reversa iScript e 20 μL de água isenta de nucleases,


31

com um volume final de reação de 40 μL. A síntese de cDNA foi realizada a 42 °C por

30 min e a reação foi parada por aquecimento a 85 °C.

2.9. PCR quantitativo em tempo real

Um protocolo de PCR quantitativo de tempo real foi utilizado para a corrida e a

temperatura ótima de annealing foi otimizada, com uma diferença de valor de treshold

de cDNA e RNA superior a 10 ciclos.

Cada mistura de reação consistiu na concentração de trabalho da master mix

Power SYBR® Green (Applies Biosystems), 300 nM dos primers foward e reverse e 1

μL de cDNA, num volume final de 20 μL. O controlo negativo (água) foi incluído em

cada corrida, bem como os controlos NRT e as diluições decimais de DNA genómico.

A quantificação relativa da expressão dos genes FKS1,ZAP1 e KRE1 foi realizada pelo

método ΔCT (threshold cycle), utilizando os valores do gene housekeeping para

normalizar os dados.

2.10. Isolamento do proteoma total

As proteínas utilizadas neste trabalho foram extraídas utilizando o método

descrito por Visweswaraiah (2011), com algumas modificações. Para tal, os biofilmes

foram lavados com tampão fosfato salino (PBS - 0,1 M, pH 7) e raspados em tampão

PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride – 10 mM, Thermo Scientific). O biofilme raspado

foi sonicado (Ultrasonic Processor, Cole-Parmer, Illinois, USA) durante 30 segundos

com amplitude de 30 %, recorrendo a um protocolo previamente otimizado (Silva et al.,

2009). Após centrifugação a 5000 g durante 5 min o pellet foi recolhido e ressuspendido

em nova solução de água com PMSF. A suspensão foi transferida para tubos de lise

com um ¼ de esferas de vidro e homogeneizada em FastPrep (MP Biomedicals) à

velocidade de 6.5 m/s com duração de 30 s durante 7 ciclos, intercalados com 30 s de

repouso em gelo. Seguidamente, foi realizada nova centrifugação a 2500 g durante 3

min e o sobrenadante resultante transferido para novo eppendorf e submetido a nova

centrifugação de 10 min a 10 000 g. O sobrenadante foi recolhido e a proteína


32

quantificada, e armazenada a -20 °C. A otimização deste processo foi efetuada de

acordo com os resultados apresentados no anexo C.

2.11. Quantificação das proteínas

O conteúdo proteico total das amostras foi obtido recorrendo ao BCA Protein

Assay Kit (Bicinchoninic acid, da Thermo Scientific, Pierce protein Research Products).

A albumina do soro bovino foi utilizada para construir o conjunto de padrões e

determinação da respetiva curva de calibração (ver anexo D).

2.12. SDS- PAGE

Os processos de electroforese SDS-PAGE decorreram todos no sistema Protean

II XL Cell da BioRad.

Electroforese 1D

As amostras foram solubilizadas em igual volume de tampão contendo 125 M de

Tris-HCl, 20 % de glicerol, 0,01 % de azul de bromofenol, 4 % de SDS e 1 % de β-

mercaptoetanol. Estas foram incubadas durante 5 min a 100 °C e, de seguida, colocadas

em gelo. O SDS-PAGE correu em géis de 4 % (gel concentrador) e 12 % (gel

separador) de acrilamida, tendo sido utilizado o Precision Plus Protein TM

All blue

standards da BioRad como marcador de peso molecular. A fonte de alimentação foi

programada, inicialmente, para 150 V até as amostras estarem completamente no gel

separador. Depois, a voltagem foi aumentada para 250 V, até a frente de migração

atingir o limite inferior do gel.

Electroforese 2D

As proteínas das amostras, num total de 200 µg, foram precipitadas utilizando

ácido tricloroacético (TCA) a 100 %, de modo a se obter uma concentração final de 20

%. Após agitada a solução, esta foi colocada em gelo durante 30 minutos e,


33

posteriormente, centrifugada 10 min, à velocidade máxima. O sobrenadante foi

descartado e o pellet ressuspendido em acetona a 100 %, e novamente centrifugado,

durante 10 min à velocidade máxima. De seguida, a acetona foi rejeitada e o pellet

deixado secar completamente e, então, foi ressuspendido em 315 µL de tampão de

rehidratação (ReadyPrep 2-D Starter Kit Rehydration/Sample Buffer da Bio-Rad, 163-

2106).

A focagem isoeléctrica foi realizada utilizando ReadyStrip IPG Strips da BioRad

de 17 cm e com uma gama de pH de 3-10 e 5-8. Esta focagem foi realizada num sistema

Protean IEF Cell da BioRad, tendo sido utilizado um programa de rehidratação em

condições ativas, de 12 a 16h, a 20 °C e 50 V. A focagem isoelétrica realizou-se em três

etapas: (i) 250 V, 15 minutos; (ii) 10 000 V, 2h e (iii) 10 000 V, 2h ou 45 000 V/h. Após

a focagem, as IPG strips foram equilibradas dois tampões distintos, durante 10 minutos

cada. Com um primeiro tampão contendo 6 M de ureia, 1,5 M Tris-HCl, 2 % de SDS,

20 % de glicerol e 2 % de ditiotreitol (DTT), que promove a redução das IPG strips. O

segundo tampão de equilíbrio constituído por 6 M de ureia, 1,5 M Tris-HCl, 2 % de

SDS, 20 % de glicerol e 2,5 % de iodoacetamida, que promove a alquilação das IPG

strips.

A segunda dimensão (SDS-PAGE) correu em géis de 4% (gel concentrador) e

12 % (gel separador) de acrilamida. Após o contacto da IPG strip com o gel, esta foi

envolvida numa solução de agarose contendo 0,5 % de agarose, 0,001 % de azul de

bromofenol e tendo como base uma solução de Tris/Glicina/SDS da Bio-Rad (161-

0772).

A fonte de alimentação do sistema foi programada para 150 V, até as amostras estarem

completamente inseridas no gel separador e, nesse ponto, a voltagem foi aumentada

para 250 V, até a frente de migração atingir o limite inferior do gel.

2.13. Coloração dos géis

Neste trabalho experimental a coloração utilizada foi a coloração com nitrato de

prata.


34

Coloração com nitrato de prata

Após o processo de eletroforese estar terminado, o gel foi colocado durante a

noite numa solução de fixação contendo 50 % etanol (v/v), 12 % ácido acético (v/v) e

0,05 % de formaldeído (v/v). Esta solução de fixação permite a remoção dos iões e

detergente em excesso, bem como é condutora da impregnação da proteína na matriz do

gel. Seguidamente, esta solução foi removida e o gel foi colocado numa solução de

lavagem (20 % de etanol (v/v)) durante 20 minutos e esta foi trocada três vezes de modo

a remover o detergente em excesso. Após a rejeição desta solução, o gel foi colocado

numa solução sensibilizadora (0,02 % de tiossulfato de sódio (p/v) e deixada atuar

durante 2 minutos. Depois de retirada a solução anterior, o gel foi lavado duas vezes

com água ultra-pura. De seguida, foi colocada uma solução de coloração a 4°C,

contendo 0,2 % de nitrato de prata (p/v) e 0,076 % de formaldeído (v/v), durante 30

minutos sob agitação constante e no escuro. Terminado o tempo de coloração o gel foi

lavado duas vezes com água ultra-pura de modo a remover os restantes iões livres.

Posteriormente, o gel foi revelado utilizando uma solução redutora contendo 0,0004 %

de tiossulfato de sódio (p/v), 6% de carbonato de sódio anidro (p/v) e 0,05 % de

formaldeído (v/v). Esta solução atuou até se obter a intensidade de coloração desejada.

Quando esta foi obtida, a solução foi descartada e colocada uma nova solução, uma

solução de paragem contendo 12 % de ácido acético (v/v) de modo a parar a reação de

redução e que atuou durante 10 minutos. Posteriormente o gel foi conservado em água

ultra-pura.

2.14. Aquisição da imagem e análise dos dados

Após a coloração, os géis foram digitalizados recorrendo a um densiómetro (GS-800

calibrated imaging densitometer, BioRad). A análise das imagens dos géis 1D foi

efetuada com recurso ao software Quantity One® Versão 4.6.3 da BioRad e os géis 2D

foram analisados com o software PDQuest Advanced Versão 8.0.1 também da BioRad.


35

2.15. Estatística

Os resultados foram comparados usando o teste estatístico t-student (t-test) e a

análise de variância Two-away ANOVA aplicando os testes de múltiplas comparações,

Sidak e Turkey, com o software GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.,

Califórnia, USA). Todos os testes foram realizados com um nível de confiança de 95 %.

CAPÍTULO 3 - Resultados e discussão

Resultados e discussão CAPÍTULO 3

39

3. Resultados e discussão

3.1. Biofilmes de Candida glabrata

A formação de biofilme tem papel fundamental na patogenicidade de fungos. O

desenvolvimento de biofilme em multicamada facilita a dispersão de células de C.

glabrata e a consequente colonização de tecidos do hospedeiro e/ou superfícies

abióticas. Além disso, o desenvolvimento de biofilme contribui para o aumento da

resistência a agentes antifúngicos e, desta forma, ocorre a persistência de infeções

(Riera,M., et al. 2012).

É sabido que um biofilme é cerca de 10 a 100x mais resistente que as suas

células planctónicas (Douglas LJ., 2003). Assim, durante este trabalho experimental foi

analisada a ação de três antifúngicos, nomeadamente do fluconazol, voriconazol e

anfotericina B, no tratamento biofilmes de C. glabrata com concentrações referidas na

secção 2.1.2 tendo em conta os valores MFC, a concentração mínima de antifúngico

capaz de inibir o crescimento do microrganismo (tabela no Anexo A). Após tratamento

dos biofilmes com os três agentes antifúngicos estes foram analisados pelo método de

unidade formadora de colónias (UFC) (Figura 3.1) e pelo método de quantificação de

biomassa total (figura 3.2).

Lo

g U

FC

/cm

2

Co

ntr

olo

Flu

co

nazo

l

An

fote

r icin

a B

Vo

r ico

nazo

l

05

10

15

C o n tr o lo

F lu c o n a z o l

A n fo te r ic in a B

V o r ic o n a z o l

Figura 3.1 - Número de células viáveis dos biofilmes de 48 h de Candida glabrata após tratamento

com antifúngicos por mais 24 h. Fluconazol com uma concentração de 325 µg/mL, anfotericina B a

40 µg/mL e voriconazol com concentração de 100 µg/mL. Análise estatística utilizando o t-test.


40

É de notar que utilização de qualquer um dos três agentes antifúngicos nestas

concentrações não apresenta uma redução significativa do número de células viáveis do

biofilme de C. glabrata, comparativamente ao biofilme sem tratamento (Figura 3.1).

Figura 3.2 - Valores de absorvância obtidos pelo método de violeta cristal usado para quantificação

da biomassa total do biofilme de 48h de Candida glabrata, após tratamento com diferentes

antifúngicos. Os antifúngicos utilizados, fluconazol, anfotericina B e voriconazol, apresentam-se a

concentrações de 325 µg/mL, 40 µg/mL, 100 µg/mL, respetivamente. Análise estatística com t-test,

onde (*) é um valor significativamente diferente, com p <0,05.

Através da análise da figura 3.2 relativa à quantificação da biomassa total verificou-se

que os agentes antifúngicos apresentam comportamentos distintos. Tanto na presença de

fluconazol como voriconazol verifica-se um pequeno aumento da biomassa total em

relação ao biofilme de C. glabrata sem tratamento, embora não estatisticamente

significativo (p>0,05). Contrariamente, o tratamento com anfotericina B apresenta uma

redução significativa de biomassa total comparativamente com o controlo. De facto,

verificou-se uma redução de aproximadamente 50 % no valor total da biomassa do

biofilme.

É importante evidenciar que de um modo geral os dois métodos de avaliação do

tratamento do biofilme de C. glabrata com os três agentes antifúngicos apresentam

resultantes concordantes. Sabe-se que o violeta cristal é um dos primeiros métodos a ser


41

adotado para a quantificação de biomassa dos biofilmes. Este método consiste em corar

as moléculas carregadas negativamente, que após a coloração o violeta cristal é eluído

através de um solvente, ácido acético. A quantidade de corante solubilizado pelo

solvente é diretamente proporcional à biomassa. Contudo, este método apresenta uma

fraca reproducibilidade, isto é, a condição experimental de crescimento do biofilme, a

natureza e concentração do solvente e o tempo de eluição são passos fundamentais.

Além disso, o corante não distingue células vivas de células mortas, não apresentando

informação sobre o número de células vivas e, desta forma, a eficácia de agentes

antifúngicos no biofilme é fracamente avaliada. De modo a ultrapassar este problema

foi utilizado adicionalmente o método de unidade formadora de colónias (UFC) que

contabiliza o número de células viáveis no biofilme (Hazan, R., et al. 2012; Pantanella,

F. et, al. 2013). Através dos resultados obtidos nos dois métodos, no caso do fluconazol

e do voriconazol não houve alteração quer do número de células viáveis, quer da

biomassa total e quando foi utilizada a anfotericina B, observou-se uma redução do

número de células viáveis (embora não significativa) e da biomassa.

Muitos isolados de Candida apresentam resistência inata ao fluconazol e o tratamento

muitas vezes não é eficaz. A forma de biofilme, a forma mais prevalente de crescimento

de microrganismos, confere à espécie de Candida um aumento de resistência ao

tratamento com agentes antifúngicos (Donlan et al. 2002; Mukherjee et al. 2004).

Assim, tal como o verificado para outras espécies de Candida também biofilmes de C.

glabrata analisados neste trabalho se apresentam extremamente resistentes ao

tratamento com antifúngicos. Segundo Shin et al. (2002) C. glabrata forma menos

biofilme que outras espécies de Candida, no entanto a sua habilidade de formação, a sua

estrutura e a composição da matriz são fatores importantes no que concerne à resistência

dos antifúngicos. A presença e composição da matriz extracelular provocam uma

barreira para a difusão de agentes antimicrobianos, uma vez que limita o acesso destes

agentes aos organismos na base do biofilme, explicando porque pode não ocorrer a

erradicação de biofilmes na presença de antifúngicos (Al-Fattani et al. 2006).

Além disso, em biofilmes maduros com alta densidade celular, existe uma

heterogeneidade espacial entre as microcolónias e os canais de água, induzindo a

resistência. Outra situação associada à densidade celular é a cooperação existente entre

as células. Este fenómeno ocorre por processos quórum sensing, conferindo às células

de biofilme a capacidade de coordenar o seu comportamento através de secreção de

moléculas sinalizadoras (Ramage, G. et al. 2012). As bombas de efluxo podem estar


42

também associadas ao aumento de resistência, uma vez que o número de bombas de

efluxo e a sua função varia conforme o estágio de maturação do biofilme. Em fases mais

avançadas do biofilme, a susceptibilidade a agentes antifúngicos diminui (Mukherjee,

P., et al. 2004). Um outro fator importante envolvido no mecanismo de resistência aos

agentes antifúngicos é o stress. Normalmente, mudanças na temperatura, stress iónico,

mudanças osmóticas ou stress oxidativo causam um stress fisiológico em

microrganismos patogénicos, como nas espécies de Candida. Quando estas fontes de

stress chegam aos recetores do hospedeiro, algumas vias de sinalização são

automaticamente ativadas, nomeadamente podem interferir na formação de biofilme e,

consequentemente, na sua resistência a antifúngicos (Ramage, G. et al. 2012).

As leveduras da espécie de C. glabrata são normalmente sensíveis aos derivados de

polienos, nomeadamente a anfotericina B, mas os seus efeitos tóxicos limitam o seu uso

(Kiraz, N., et al. 2010). A anfotericina B tem como alvo o ergosterol fúngico, o

componente principal da membrana celular. Os azóis são inibidores da enzima 14α-

demetilase, bloqueando a produção de ergosterol, componente da membrana celular do

fungo, desempenhando o seu papel no tratamento de candidíases. Contudo, o uso

abrangente de fluconazol e outros azóis leva à ocorrência de novos casos de resistência

a azóis. Também, o facto de C. glabrata ser um fungo haploide pode promover o

desenvolvimento de uma resistência secundária. Além disso, a resistência cruzada com

outros azóis ocorre, nomeadamente com voriconazol (Kiraz, N., et al. 2010).

Apesar da redução ocorrida com a utilização de anfotericina B, este agente antifúngico

apresenta valores muito variáveis e um comportamento inconstante, pelo que no

seguimento do trabalho apenas se utilizarão os agentes antifúngicos azóis, o fluconazol

e o voriconazol.

De modo a perceber-se os fatores que envolvem a formação de biofilme de C.

glabrata e a produção de matriz extracelular podem estar associadas à resistência, foram

estudados na segunda parte deste trabalho genes associados à regulação destes

mecanismos.


43

3.2. Determinantes de resistência associados a biofilmes de Candida

glabrata

Se em C. albicans os mecanismos de regulação de formação de biofilme são pouco

conhecidos, o conhecimento é muito mais escasso em C. glabrata. Desta forma, nesta

parte do trabalho pretendeu-se avaliar a importância de genes descritos como

importantes na formação de biofilme e produção de matriz em biofilmes de C. glabrata.

Para tal, foram selecionados como alvo de estudo o gene 0ZAP1 (factor de transcrição

envolvido no processo de produção de biofilme em C. albicans), o gene FSK1

(responsável pela produção de β-1,3 glucanos para a matriz em C. albicans) e o gene

KRE1 (ligado à síntese de β-1,6 glucanos da parede celular de C. parapsilosis).

A expressão dos genes FKS1 e ZAP1 foi avaliada em células planctónicas e células de

biofilme (Figura 3.3 A) de forma a inferir sobre a envolvência destes genes na formação

de biofilme em C. glabrata

.

Figura 3.3 - Percentagem de expressão genética dos genes FKS1, ZAP1 e KRE1 em células

planctónicas e em células de biofilme. Para se observar melhorar as diferenças nos resultados a

figura apresenta-se como (A) genes FKS1 e ZAP1; (B) genes FKS1, ZAP1 e KRE1. Análise

estatística com two-away ANOVA, (*) e (****) valores estatisticamente significativos, com p <0,05 e

p <0,0001, respetivamente. Comparação de resultados entre células planctónicas e células de

biofilme para cada gene.


44

Através da figura 3.3, é possível verificar que a expressão genética de ambos os genes

apresenta comportamentos distintos quando em células planctónicas ou em biofilme. Na

figura 3.3 (A) verifica-se que existe uma maior expressão do gene ZAP1 em células de

biofilme, cerca de 2 vezes mais, comparativamente ao estado planctónico (p<0,05). Por

outro lado, verificou-se uma diminuição de expressão do gene FSK1 nas células

planctónicas para as células do biofilme. Estes resultados sugerem uma possível

envolvência do gene ZAP1, tal como em C. albicans (Taff, H. et al. 2012), na formação

de biofilme por C. glabrata. A diminuição de expressão do gene FSK1 em células de

biofilme por outro lado parece ser indicativo do não envolvimento deste gene na

produção/secreção de β-glucanos para a matriz, contrariamente ao descrito para C.

albicans (Taff, H. et al. 2012).

Foi também selecionado o gene KRE1, como alvo de estudo, uma vez que este está

descrito como envolvido na resistência a azóis em C. parapsilosis (Silva, AP., et al.

2011). Após análise bioinformática foi encontrado um ortólogo em C. glabrata e a sua

expressão avaliada em células planctónicas e de biofilme.

No estudo relativo ao gene KRE1 (figura 3.3 (B)) verifica-se um aumento acentuado de

expressão em células de biofilme (p<0,0001) em relação às células planctónicas, cerca

de aproximadamente 20 vezes mais. Assim, este estudo é indicativo da importância do

gene KRE1 na formação do biofilme em C. glabrata. Contudo, para validar este

resultado o gene terá de ser eliminado e os testes de formação de biofilme repetidos.

A segunda etapa deste trabalho consistiu na avaliação da importância destes três

genes na resistência do biofilme de C. glabrata ao fluconazol e ao voriconazol. Para tal

a expressão destes três genes foi avaliada em biofilmes pré-formados de C. glabrata

após tratamento com ambos os agentes (Figura 3.4).


45

Figura 3.4 - Percentagem de expressão genética de genes em células de biofilme de C. glabrata

tratadas com fluconazol e voriconazol, com concentrações de 325 μg/ mL e 100 μg/ mL,

respetivamente. Para se observar melhorar as diferenças nos resultados a figura apresenta-se como

(A) expressão dos genes FKS1 e ZAP1; (B) expressão dos genes FKS1, ZAP1 e KRE1. Análise

estatística com two-away ANOVA, com comparação dos resultados entre células de biofilme e

células de biofilme tratadas com agentes antifúngicos.

Na figura 3.4 (A), é possível observar que não existe alteração na expressão do gene

FKS1 e ZAP1 após tratamento com fluconazol ou voriconazol comparativamente à

ausência de tratamento. Assim, através deste trabalho é possível presumir que estes

genes não estão envolvidos na resposta das células do biofilme de C. glabrata ao stress

causado por agentes antifúngicos. Relativamente ao gene KRE1 (figura 3.4 (B))

verificou-se a existência de uma sobre-expressão (p<0,0001) em células de biofilme,

em relação às células planctónicas tal como já previamente descrito. Por outro lado,

quando avaliada a expressão de KRE1 em células de biofilme tratadas e não tratadas

com antifúngicos não se verificam alterações de expressão. Assim, este gene tal como o

gene ZAP1,parece estar envolvido na formação de biofilme em C. glabrata, mas não

numa resposta ao stress causado pelos agentes antifúngicos, tal como o descrito para C.

parapsilosis (Silva, AP., et al. 2011).


46

Assim, com esta parte do trabalho pode-se concluir que os genes KRE1 e ZAP1 parecem

ter um papel importante na formação de biofilme de C. glabrata contrariamente ao gene

FSK1. Adicionalmente verificou-se que o tratamento dos biofilmes com fluconazol e

voriconazol de C. glabrata não condiciona a expressão destes três genes e

consequentemente parecem não estar envolvidos na resistência.

Para se estudar a expressão de proteínas envolvidas no mecanismo de resistência

de C. glabrata ao fluconazol e ao voriconazol, possivelmente expressas pelos genes

anteriormente estudados, foi utilizada uma abordagem proteómica na última parte deste

trabalho experimental.


47

3.3. Perfis proteicos do proteoma total de Candida glabrata

Nesta parte experimental foram estudados os perfis proteicos do proteoma total de

células de biofilme de C. glabrata tratadas com dois agentes antifúngicos, o fluconazol

e o voriconazol. Na sequência do trabalho anterior (secção 3.1) pretendeu-se não só

estudar o perfil proteico de biofilmes de C. glabrata tratados com fluconazol e

voriconazol como identificar e avaliar a presença das proteínas correspondentes aos

genes estudados na secção 3.1.

Para cada condição em teste e após a extração do proteoma total, a quantidade de

proteína total extraída foi quantificada (Tabela 3.1).

Tabela 3.1 - Média de proteína extraída de células de biofilmes de C. glabrata formados na presença

e ausência de antifúngicos (fluconazol e voriconazol)

Média de proteína extraída (µg/mL)

C. glabrata sem antifúngico 1070,8

C. glabrata com fluconazol 1216,8

C. glabrata com voriconazol 1211,9

A quantificação de proteína extraída é de facto um passo fundamental para as etapas

seguintes de eletroforese, quer unidimensional ou bidimensional, uma vez que é

necessário ter a mesma quantidade de proteínas em todas as condições para se iniciar

uma corrida e estabelecer comparações.

O perfil das proteínas obtidas foi avaliado em eletroforese unidimensal (1D) e

bidimensional (2D), tendo sido posteriormente tratados os géis, através dos softwares

Quantity One® e PDQuest, respetivamente.

3.3.1. Electroforese 1D

Quando se pretende verificar a presença ou ausência de proteínas, a coloração

com nitrato de prata é a indicada, uma vez que permite constatar as variações

qualitativas. À luz da literatura (Chevallet et al. 2007), a boa distinção das bandas e o

seu número seriam de esperar utilizando nitrato de prata, devido à sua alta sensibilidade


48

comparativamente aos outros métodos. Com esta coloração não é necessária tanta

quantidade de amostra para correr os géis, bem como é possível utilizar amostras

diluídas. A pureza da proteína também pode ser verificada e desta forma, os

contaminantes são detetados com mais confiança. Dados estes fatores a coloração

escolhida para este trabalho foi a coloração com nitrato de prata.

Com a utilização do software Quantity One® foi primeiramente identificado e

contabilizado o número de bandas obtidas para cada condição da espécie de C. glabrata

em estudo, apresentando-se os resultados resumidos na figura 3.5 e na tabela 3.2. É de

notar que cada banda obtida por este método pode representar uma proteína ou um

grupo de proteínas com o mesmo peso molecular.

Figura 3.5 - Imagem do gel obtida pelo software Quantity One® onde foram realizadas

comparações do perfil proteico do proteoma total de células de biofilme de C. glabrata tratadas ou

não tratadas com antifúngicos. A vermelho estão representadas as bandas correspondentes nas

diferentes condições; a azul as bandas padrões, a verde o tipo de bandas conhecido e a amarelo

bandas não classificadas.

Stand. Controlo Fluconazol Voriconazol

KDa

225 150

100

75

50

35

25


49

A tabela 3.2 sumariza o número de bandas identificadas no proteoma total de C. glabrata em

diferentes condições obtidas pela eletroforese 1D.

Tabela 3.2 - Número de bandas identificadas do proteoma total de células de C. glabrata recolhidas

de biofilmes crescidos em diferentes condições obtidas por eletoforese 1D, após coloração do gel

com nitrato de prata e análise através do software Quantity One®

Número de bandas identificadas

C. glabrata sem antifúngico 16

C. glabrata com fluconazol 14

C. glabrata com voriconazol 19

Através da análise da tabela 3.2, constata-se, que o tratamento de biofilmes de C.

glabrata com agentes antifúngicos influencia a expressão de proteínas, em relação à

condição que não utiliza agentes antifúngicos. O proteoma total resultante das células de

biofilme tratadas com voriconazol resulta num número adicional de 3 bandas em relação

à condição controlo, por oposição ao tratamento do biofilme com fluconazol onde se

identificou um número menor de bandas do que o controlo.

A tabela 3.3 identifica a percentagem de similaridade de bandas obtidas de células de

biofilme de C. glabrata nas diferentes condições, obtidas por eletroforese 1D.

Tabela 3.3 - Percentagem de correspondência de bandas obtidas de células da estirpe C. glabrata

ATCC nas diferentes condições, com os valores fornecidos pelos relatórios obtidos pelo software

Quantity One

Bandas Correspondentes

C.glabrata controlo

C.glabrata c/ fluconazol

86,67 %

C. glabrata controlo

C. glabrata c/ voriconazol

78,95 %

C. glabrata c/ voriconazol

C. glabrata c/ fluconazol

68,42 %


50

A análise conjunta da figura 3.5 e a tabela 3.3 permite constatar que as

percentagens de correspondência em todos os casos foram superiores a 50 %. A maior

diferença a nível de percentagens de semelhança encontra-se na comparação do

proteoma de células do biofilme tratados com os dois antifúngicos, no entanto ainda

com uma correspondência de aproximadamente 68,42 %.

Esta diferença entre os dois agentes não era esperada uma vez que os

antifúngicos da classe dos azóis, como o fluconazol e voriconazol, bloqueiam a síntese

de ergosterol da parede de Candida, através da inibição do lanosterol 14α-demetilase, e

tratando-se de dois azóis seria de esperar um comportamento semelhante. Apesar de que

o voriconazol, como antifúngico mais recente, tem uma capacidade de inibição mais

extensa (Greer, N. 2003). Adicionalmente, apesar do fluconazol e voriconazol terem

uma estrutura semelhante, a maior diferença consiste na substituição de um grupo

fluoropirimidina por uma porção triazol, o que poderá influenciar diferenças de

comportamentos (Greer, N. 2003).

Esta análise proteica foi aprofundada com a elaboração de uma eletroforese 2D,

de modo a obter-se com maior detalhe o perfil proteico das diferentes condições

testadas.

3.3.2. Electroforese 2D

As proteínas extraídas das amostras em questão foram corridas numa primeira

dimensão em IPG strips com diferentes gamas de pH, 3 a 10 e 5 a 8. É importante

salientar que o uso de diferentes strips com intervalos de valores de pH mais apertados

são a forma apropriada para mais facilmente distinguir as manchas e assim garantir uma

melhor e mais correta identificação das proteínas.

Tal como para os géis obtidos pela técnica 1D também os géis obtidos por

análise bidimensional foram corados com nitrato de prata, uma vez que esta coloração é

descrita como uma das mais sensíveis e adequada na procura de presença ou ausência de

proteínas, o que era pretendido nesta parte experimental do trabalho.

Inicialmente, foram tratadas as imagens provenientes do densiómetro com o

software PDQuest Advanced, tendo sido determinado o número de spots presentes em

cada gel. Posteriormente, com o mesmo sofware foram realizados estudos comparativos


51

entre as diferentes condições de C. glabrata, proteoma total de células de biofilme após

tratamento com fluconazol e voriconazol e na ausência destes.

O estudo comparativo entre as diversas condições, anteriormente referidas,

utilizando IPG strips de pH 3-10 na estirpe de referência de C. glabrata encontra-se

representado na figura 3.6.


52

Figura 3.6 - Exemplo de imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest do proteoma de células de biofilme de C. glabrata crescidas em diferentes condições em

strips de pH 3-10. (A) C. glabrata sem agente antifúngico. (B) C. glabrata com fluconazol. (C) C. glabrata com voriconazol. A amarelo estão representados os spots

assinalados para contagem pelo software.


53

Com base nos relatórios obtidos pelo software foi possível identificar o número

de spots em cada gel. Estes dados encontram-se resumidos na tabela 3.4.

Tabela 3. 4 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis relativos ao proteoma total

de células de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 3-10, crescidos na presença e

ausência de antifúngicos

pH 3-10 Número de spots




Esta tabela é indicativa que o perfil proteico obtido para cada uma das condições em

análise não difere muito entre eles.

Como nestas condições não se verificou uma completa e total separação das

proteínas (“spots”), como se pode verificar na figura 3.6, principalmente no centro do

gel, as mesmas amostras foram corridas em IPG strips de pH 5-8 e géis obtidos

novamente analisados (figura 3.7).


54

Figura 3.7 - Imagens dos géis obtidas pelo software PDQuest de C. glabrata em diferentes condições com utilização de strips de pH 5-8. (A) C. glabrata sem agente

antifúngico. (B) C.glabrata com fluconazol. (C) C.glabrata com voriconazol. A cor verde representa os spots comuns nos diferentes géis; as cores azul, vermelho e

amarelo representam análises de T-test comparativas entre os géis efetuadas pelo software.


55

Mais uma vez, e tendo como base os relatórios efetuados pelo software foi possível

identificar o número de spots presentes em cada um dos géis, encontrando-se os

resultados resumidos na tabela 3.5.

Tabela 3.5 - Número de spots detetados pelo software PDQuest nos géis do proteoma total de células

de biofilme de C. glabrata com utilização de strips com pH 5-8, crescidas na presença e ausência de

antifúngicos

pH 5-8 Número de spots




A análise da tabela 3.5 permitiu inferir que há um maior número de proteínas

(spots) no proteoma total de células do biofilme tratados com fluconazol e voriconazol,

comparativamente ao proteoma de células de biofilme de C. glabrata sem tratamento.

Assim, é possível concluir que a presença de agentes antifúngicos no tratamento de

biofilmes de C. glabrata resulta num aumento do número de proteínas expressas. De

facto o proteoma das células de biofilme de C. glabrata tratadas com fluconazol

apresenta mais 92 que o controlo e as tratadas com voriconazol, apesar de um número

ser menor, apresenta apenas mais 28 que o controlo. Este software permite também

identificar o número de spots comuns entre as diferentes condições, tendo-se obtido os

resultados apresentados na tabela 3.6.

Tabela 3. 6 - Número de spots pelo software PDQuest e os spots correspondentes na estirpe de

referência de C. glabrata na presença e ausência de agentes antifúngicos

C. glabrata Número de spots Spots correspondentes

Controlo 192 146

Fluconazol 284

Controlo 192 86

Voriconazol 220

Fluconazol 284 92

Voriconazol 220


56

Assim, verificou-se maior similaridade, 146 spots, entre o proteoma de células de

biofilme de C. glabrata tratadas com fluconazol e o biofilme não tratado. Por sua vez, a

menor similaridade corresponde ao proteoma de células de biofilme de C. glabrata

tratadas com voriconazol com a condição controlo, com 86 spots. Foi também realizado

um estudo comparativo entre as diversas condições de crescimento dos biofilmes de C.

glabrata em estudo, tendo-se obtido os resultados presentes na tabela 3.7. É de notar

que software PDQuest apenas permite fazer comparações entre dois géis e, visto que

foram identificados número de spots diferentes entre as diversas condições, as

percentagens de correspondência apresentam-se também diferentes, consoante o gel

escolhido como referência.

Tabela 3.7 - Percentagem de correspondência de spots de C. glabrata na presença e ausência de

agentes antifúngicos, valores fornecidos pelos relatórios elaborados pelo software PDQuest

C. glabrata Controlo Fluconazol Voriconazol

Controlo - 50 % 39 %

Fluconazol 53 % - 41 %

Voriconazol 34 % 28 % -

A análise da tabela 3.7 e dos relatórios de comparação, fornecidos pelo software

PDQuest, permitem constatar que o proteoma de células de biofilme de C. glabrata

tratadas com fluconazol apresentam maiores percentagens de semelhança, cerca 53 %

com o proteoma de células de biofilme de C. glabrata não tratadas com antifúngico e 41

% de similaridades com o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas com

voriconazol. Por outro lado, o proteoma de células de biofilme de C. glabrata tratadas

com voriconazol é a que apresenta menores percentagens de semelhança, com 34 % e

28 % para C. glabrata controlo e com fluconazol, respetivamente.

Avaliando os resultados obtidos pelos dois métodos eletroforéticos é possível observar

que a maior percentagem de correspondência na eletroforese 1D (tabela 3.3) foi também

obtida entre a comparação do proteoma de células de biofilme de C. glabrata não

tratadas com as tratadas com fluconazol mas com uma percentagem de

aproximadamente 87 %, enquanto na eletroforese 2D o maior valor é de 53 %. Na

eletroforese unidimensional o proteoma das células de biofilme de Candida sem

antifúngico e tratadas com voriconazol apresenta uma percentagem de correspondência


57

superior com 78,95 % e na comparação entre os dois agentes antifúngicos também se

verifica valores superiores com 68,42 %. Constata-se que existe uma diferença entre os

valores de percentagem de semelhança entre os dois métodos, com a eletroforese

unidimensional a apresentar percentagens mais elevadas em todos os casos. Constata-se

que o número de proteínas detetadas para cada uma das condições das células de

biofilme de C. glabrata em estudo é muito superior na eletroforese 2D do que na 1D.

Isto é facilmente compreendido, uma vez que na eletroforese 2D a separação das

proteínas ocorre de acordo dois parâmetros independentes, o seu ponto isoelétrico,

numa primeira dimensão, e a sua massa molecular, numa segunda dimensão. Sabe-se

que a eletroforese 2D tem uma capacidade de resolução de aproximadamente 10 000

proteínas em simultâneo, o que não acontece em qualquer método a uma dimensão, que

somente tem uma resolução de aproximadamente 100 componentes proteicos (Castle, et

al.; López, 2007). No entanto, ainda existem algumas limitações a superar pela

eletroforese 2D, sendo exemplo a capacidade de analisar proteínas muito alcalinas,

hidrofóbicas e/ou com baixa massa molecular com elevada resolução. Além disso, a

existência de métodos de quantificação e comparação quantitativos das proteínas que

sejam sensíveis, rápidos, simples, fiáveis e reprodutíveis. Por último, a simplificação e

automação dos procedimentos de separação de proteínas (Bunai, et al. 2005; López,

2007).

À luz da literatura, a classe de agentes antifúngicos mais efetivos são os azóis,

especificamente, o fluconazol e o voriconazol. Contudo, a existência de resistência aos

azóis tem resultado em dificuldade de tratamento de candidíases (Il yoo et al. 2013).

Neste estudo, verificou-se que há um aumento de expressão de proteínas na presença

destes antifúngicos, fluconazol e voriconazol, contudo pequenas diferenças na estrutura

molecular dos compostos e no seu mecanismo de ação podem ser causadoras de

diferenças na expressão. Esta ação do metabolismo de C. glabrata é apontada em

estudos de outros autores, embora o mecanismo do voriconazol ainda não seja bem

compreendido (Il yoo et al. 2012; 2013).

Existem proteínas, tais como as codificadas pelos genes ZAP1, FKS1 e KRE,

estudados anteriormente, que estão descritas como envolvidas na capacidade adaptativa

de espécies de Candida ao estado de biofilme que deveriam ser identificadas ao longo

deste trabalho experimental. Apesar de conhecido o seu ponto isoelétrico e o peso

molecular FSKp1 (PM 213,9 kDa; pI 7,87), o ZAPp1 (PM 79,4 kDa; pI 6,99), o KREp1

(PM 38,4 kDa; pI 5,93) torna-se difícil a sua identificação no espectro proteico obtido


58

(figura 3.8). Um estudo mais exaustivo seria assim necessário para melhorar a sua

identificação. Contudo, após uma análise exaustiva dos géis obtidos podem identificar-

se “spots” ou grupos de “spots” como potenciais candidatos aos genes em avaliação.

Estes terão de ser removidos do gel, e após tratamento com tripsina e sequenciados por

espectrometria de massa de forma a obter a sequência das proteínas.

.


59

Figura 3.8 -Representação das possíveis proteínas expressas pelos genes FKS1, ZAP1 e KRE1. A vermelho está representada a proteína expressa pelo gene FKS1

(PM 213,9 e pI 7,87);a verde a proteína expressa pelo gene ZAP1 (PM 79,4 e pI 6,99) e a azul a proteína expressa pelo gene KRE1 (PM 38,4 e pI 5,93).

CAPÍTULO 4 – Conclusões e sugestões de trabalho

futuro

Conclusões e perspectivas futuras CAPÍTULO 4

63

4.1. Conclusões finais

Candida glabrata é uma das espécies NCA que nas últimas décadas tem estado

muito associada ao número crescente de candidíases. As infeções associadas a biofilmes

são extremamente difíceis de tratar, havendo estudos que mostram que as células em

biofilme exibem características fenotípicas extremamente diferentes daquelas que se

encontram na sua forma planctónica. Assim, o presente trabalho visou contribuir para

uma maior compreensão dos mecanismos de resistência de biofilmes de C. glabrata.

Neste trabalho, comprovou-se a resistência dos biofilmes de C. glabrata aos

agentes antifúngicos usados em prática clínica, fluconazol, voriconazol e AmB. De

facto, nem concentrações elevadas de antifúngicos foram capazes de erradicar biofilmes

de C. glabrata. Verificou-se, ainda, que os dois métodos utilizados para analisar os

biofilmes, violeta cristal e viabilidade celular, apresentam resultados concordantes. O

tratamento com fluconazol e voriconazol não altera o número de células viáveis nem a

biomassa total, por sua vez com AmB existiu uma redução significativa da biomassa

total.

No sentido de se compreender melhor os mecanismos de regulação de formação

de biofilme e produção de matriz em biofilmes de C. glabrata foram estudados os genes

FKS1, ZAP1 e KRE1. Os genes ZAP1 e KRE1 parecem ter um papel importante na

formação de biofilme de C. glabrata, ao contrário do gene FKS1. O gene FSK1 que está

reportado para C. albicans como envolvido na produção/ secreção de β-glucanos para a

matriz em função dos resultados obtidos parece não ter um papel preponderante na

produção de matriz em C. glabrata. Quando os biofilmes são tratados com fluconazol e

voriconazol, estes não condicionam a expressão de qualquer um dos três genes em C.

glabrata.

No que concerne ao perfil proteico de C. glabrata, a eletroforese bidimensional

apresenta uma maior sensibilidade em relação à eletroforese unidimensional, com uma

maior deteção do número de proteínas. Este estudo mostrou que há um maior número de

proteínas do proteoma total de células de biofilme tratadas com fluconazol e

voriconazol do que células de biofilme sem tratamento. No entanto, o proteoma de

células de biofilme tratado com fluconazol é o que apresenta maiores percentagens de

semelhança com o proteoma de células de biofilme de C. glabrata não tratadas com

Conclusões e sugestões de trabalho futuro CAPÍTULO 4

64

antifúngico. Assim, a presença de agentes antifúngicos no tratamento de biofilmes de C.

glabrata resulta num maior expressão de proteínas.

Este trabalho permitiu concluir que através de uma análise microbiológica, os

biofilmes de C. glabrata apresentam um comportamento resistente, não sendo o

fluconazol, o voriconazol e AmB capaz de os erradicar. Com o estudo mais direcionado,

através da transcriptómica, foi possível também pela primeira vez identificar o

envolvimento de dois genes (ZAP1 e KRE1) na formação de biofilme de C. glabrata.

Diferenças a nível dos perfis proteicos obtidos por análise proteómica, observados em

géis 2D, dão-nos indicativos importantes da expressão de proteínas diferentes

resultantes de uma resposta do biofilme ao tratamento antifúngico e que podem ser alvo

para identificação de novos genes de resistência de biofilmes de C. glabrata.

Conclusões e perspectivas futuras CAPÍTULO 4

65

4.2. Sugestões para trabalho futuro

Como anteriormente reportado, os mecanismos de resistência de biofilmes de C.

glabrata estão pouco estudados e desta forma este trabalho foi desenvolvido nesse

sentido.

No entanto, e tendo em conta os resultados obtidos neste trabalho é possível

fazer algumas sugestões para futuras investigações:

I. Estudar o efeito dos agentes antifúngicos fluconazol, voriconazol e anfotericina

B em células de biofilme de mais estirpes de C. glabrata.

II. Criar mutantes para os genes ZAP1 e KRE1 de forma a validar molecularmente

os resultados obtidos durante este trabalho.

III. Identificar as possíveis proteínas envolvidas na capacidade adaptativa de C.

glabrata ao estado de biofilme recorrendo a espectrometria de massa, como

MALDI – TOF.

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Referências

78

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Membrane Proteins From Voriconazole-Resistant Candida glabrata. Osong Public

Health Res Perspect, 4(6), 293-300.

ANEXOS

Anexos

81

Anexo A – Concentração mínima inibitória e concentração mínima

fungicida

É apresentado na tabela A.1 os valores de concentração mínima inibitória (MIC) e de

concentração mínima fungicida (MFC) da espécie de C. glabrata, para três

antifúngicos.

Tabela A.1 – Valores da concentração mínima inibitória (MIC) e da concentração mínima

fungicida (MFC) da espécie de C. glabrata

Espécie

Estirpe Fluconazol Voriconazol Anfotericina B

MIC

(mg/mL)

MFC

(mg/mL)

MIC

(mg/mL)

MFC

(mg/mL)

MIC

(mg/mL)

MFC

(mg/mL)

C.

glabrata

ATCC

2001

64 1250 0.5 1-2 2 2

Anexos

82

Anexo B – Eficiência dos primers

São apresentados neste anexo as curvas (Figuras B.1, B.2, B.3) referentes às eficiências

dos primers escolhidas, bem como as tabelas (B.1, B.2, B.3) com as diferentes

temperaturas de melting e eficiências estudadas para os genes FKS1, ZAP1 e KRE1.

A sublinhado a amarelo nas tabelas encontra-se a eficiência determinada e a temperatura

de melting utilizada.

Figura B.1- Curva de eficiência dos primers do gene FKS1 à temperatura de 57,2°C.

Através da figura B.1 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 57,2

°C para o cálculo da eficiência dos primers do gene FKS1.

Tabela B.1– Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do

primers do gene FKS1

Temperatura (°C) Declive Eficiência

59 3,4747 1,939968

58 3,4183 1,961296

57 3,1425 2,080741

56 3,1857 2,060169

55 3,5412 1,915976

Na tabela B.1 observamos o gradiente de temperaturas de melting estudadas e a

determinação da eficiência para os primers do gene FKS1. A sublinhado encontra-se a

temperatura escolhida, 57°C, com uma eficiência de 2,08.

y = -3,1425x + 22,893 R² = 0,987

22

24

26

28

-1,600 -1,400 -1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000

Ct

Log10 ([DNA])

FKS1 57,2ºC

Anexos

83

Figura B.2- Curva de eficiência dos primers do gene ZAP1 à temperatura de 57,2°C.

Através da figura B.2 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 57,2

°C para o cálculo da eficiência dos primers do gene ZAP1.

Tabela B.2– Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do

primers do gene ZAP1


58 3,5279 1,920679

57 3,7965 1,834005

56 3,9896 1,78095

55 3,5179 1,924246

54 3,6408 1,882196


determinação da eficiência para os primers do gene ZAP1. A sublinhado encontra-se a

temperatura escolhida, 57°C, com uma eficiência de 1,83. Apesar de haver a

temperatura de 58 °C com eficiência melhor, foi escolhida esta porque a diferença dos

valores de eficiência não afetaria os resultados e assim teria a mesma temperatura do

que o gene housekeeping, a actina.

y = -3,7965x + 21,784 R² = 0,9989

0

10

20

30

-1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 0,200 0,400

Ct

Log10 ([DNA])

ZAP 57,2 °C

Anexos

84

Figura B.3- Curva de eficiência dos primers do gene KRE1 à temperatura de 59°C

Através da figura B.3 é possível observar a curva correspondente à temperatura de 59°C

para o cálculo da eficiência dos primers do gene KRE1.

Tabela B.3 – Gradiente de temperaturas de melting estudadas para a determinação da eficiência do

primers do gene KRE1


59 3,5853 1,900714

58 2,4981 2,513647

57 2,2656 2,763021

56 1,9229 3,311676


determinação da eficiência para os primers do gene FKS1. A sublinhado encontra-se a

temperatura escolhida, 59°C, com uma eficiência de 1,9.

y = -3,5853x + 29,443 R² = 0,9291

28293031323334

-1,200 -1,000 -0,800 -0,600 -0,400 -0,200 0,000 0,200 0,400

Ct

Log10 ([DNA])

KRE1 59°C

Anexos

85

Anexo C – Extração de proteínas

O processo de extração de proteínas por lise mecânica utilizando esferas de

vidro foi otimizado. Foram realizados ciclos de 30 segundos com velocidade de 6,5 m/s

com paragem de 30 ciclos para colocação das amostras em gelo, entre cada ciclo, como

é possível observar na figura C.1.

Figura C.1 – Absorvância de proteína extraída do biofilme de C.glabrata ATCC 2001 por cada

ciclo de lise (30 segundos) no FastPrep.

Através da figura C.1 é possível verificar que após o quinto ciclo é onde se

encontra o máximo de libertação de proteína por parte da célula quando esta é lisada.

Entre o quinto e o sétimo ciclo não existe uma grande variação de valores, pelo que o

máximo de libertação de proteínas já fora atingido, tendo tendência para depois começar

a decrescer.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 1 2 3 4 5 6 7

Ab

s 5

62

nm

Tempos de lise (30 seg)

C.glabrata ATCC 2001

Anexos

86

Figura C.2- Utilização do método UFC para verificar a quantidade de células vivas por cada 30

segundos de ciclo.

Na figura C.2 é possível observar o decréscimo do número de células vivas à

medida que aumentam o número de ciclos. Verifica-se que do ciclo quinto ao sétimo

não existe variação do número de células vivas que, como visto na figura C.1, é onde se

encontra o máximo na libertação de proteínas por parte da célula.

Desta forma, para a obtenção do máximo de proteína são necessários no mínimo cinco

ciclos de 30 segundos na velocidade de 6,5 m/s. A partir deste ciclo, a quantidade de

proteína extraída é aproximadamente a mesma.

0

2

4

6

8

10

12

0 1 2 3 4 5 6 7

Log

UFC

/ml

Tempos de lise ( 30 seg)

C.glabrata ATCC 2001

Anexos

87

Anexo D – Curva de calibração de BSA

A curva de calibração foi realizada para a quantificação de proteínas. Na figura D.1 é

representada a relação entre a concentração (µg/mL) de uma proteína (BSA) e a

densidade ótica (562 nm).

Figura D.1 – Curva de calibração de BSA

Documents

Biofilmes de Candida glabrata: resistênciarepositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/34077/1/Eduarda... · No entanto, ainda há pouca informação sobre os mecanismos de resistência