Tallinna Tehnikaülikool

Keemiainstituut

Bioorgaanilise keemia õppetool

BIOKEEMIA LABORATOORSED TÖÖD

Koostajad: Malle Kreen

Terje Robal Tiina Randla

Tallinn 2010

2

SISUKORD

1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA ........................... 4

1.1 VALKUDE REAKTSIOONID .................................................................................... 4

1.1.1 Biureedireaktsioon ............................................................................................ 9

1.1.2 Ksantoproteiinireaktsioon (Mulderi reaktsioon) ............................................... 10

1.1.3 Milloni reaktsioon ............................................................................................ 10

1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon ........................................................................ 11

1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega ..... Error! Bookmark not defined. 1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine) .............. 12

1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH – st ............... 12

1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega ................................................ 13

Kontrollküsimused .................................................................................................... 13

1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID .......................... Error! Bookmark not defined. 1.2.1 Molisch'i test ...................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.2 Osasoonide saamine ........................................ Error! Bookmark not defined. 1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon ...................................... Error! Bookmark not defined. 1.2.4.Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega ....................... ..... ............ 20

1.2.5 Barfoed' reaktsioon ......................................................................................... 21

1.2.6 Selivanoff'i reaktsioon ..................................................................................... 22

1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga ............................................................................. 23

Kontrollküsimused .................................................................................................... 23

1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID ................................................................................... 25

1.3.1 Rasvapleki proov ............................................................................................. 27

1.3.2 Emulsioonitest. ................................................. .... ..........................................28

1.3.3 Akroleiiniproov ................................................... Error! Bookmark not defined. 1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiididesError! Bookmark not defined. 1.3.5 Liebermann - Burchard'i kolesterooli määramise testError! Bookmark not defined. Kontrollküsimused ...................................................... Error! Bookmark not defined.

2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE .................................... 32

2.A Kromatograafilised meetodid ................................................................................ 32

2.B Spektroskoopilised meetodid ................................................................................ 38

3

2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODILError! Bookmark not defined. Teooria ....................................................................... Error! Bookmark not defined. Töö käik .................................................................................................................... 51

Kontrollküsimused ...................................................... Error! Bookmark not defined. 2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINEError! Bookmark not defined.

Teooria ....................................................................... Error! Bookmark not defined. Töö käik .................................................................................................................... 61

Kontrollküsimused .................................................................................................... 63

3. BIOKATALÜÜS ............................................................. Error! Bookmark not defined. 3. A Ensüümide toime ja ensüümireaktsioonide kineetika alused ........... ....................65

3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE ........................................................... 74

Teooria ..................................................................................................................... 74

Töö käik .................................................................................................................... 76

Kontrollküsimused .................................................................................................... 79

3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE ................................ 80

Teooria ..................................................................................................................... 80

Töö käik .................................................................................................................... 82

Kontrollküsimused .................................................................................................... 84

3.3 ENSÜMAATILINE MEETOD GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMISEKS .............. 86

Teooria ..................................................................................................................... 86

Töö käik .................................................................................................................... 88

Kontrollküsimused .................................................................................................... 92

Lisa 1. Spektrofotomeetri UV-1601 kasutamise juhend.. ..... ...........................................94

Lisa 2. Spektrofotomeetri UVmini-1240 kasutamise juhend.... ..... ..................................96

4

1. AINETE TUVASTAMINE KVALITATIIVSETE REAKTSIOONIDEGA

Kvalitatiivsed reaktsioonid võimaldavad kindlaks teha mingi keemilise elemendi, funktsionaalse rühma, ühendi või ühendite rühma olemasolu või puudumist uuritavas materjalis. Saadav informatsioon on seejuures ühebitine - ei või jah, vastav reaktsioon kas toimub või ei toimu ning järelikult aine kas sisaldub või ei sisaldu uuritavas proovis. Hinnatakse

- iseloomuliku värvusreaktsiooni teket, - sademe või hägu moodustumist, - gaasi eraldumist, - muid silmaga nähtavaid muudatusi.

Nagu nimetus ütleb, ei näita need reaktsioonid uuritava komponendi kvantitatiivset sisaldust uuritavas materjalis, küll aga võivad paljud neist kombineerituna teiste uurimismeetoditega (näiteks värvusreaktsioon koos kolorimeetrilise mõõtmisega) olla aluseks kvantitatiivsete analüüside läbiviimisel. Kvalitatiivse analüüsi meetodid ei nõua reeglina reagentide täpset doseerimist (kaalumist, pipeteerimist), vaid piirduda võib silmamõõduga ning suurusjärgu arvestamisega. Käesolevas töös kasutatakse reaktsioonianumana normaalkatseklaase, kus 1-milliliitrisele mahule vastab umbes 1 cm kõrgune vedeliku nivoo. Järgnevalt kirjeldatakse biokeemias oluliste ainegruppide – valkude, süsivesikute ja lipiidide kvalitatiivse analüüsi mõningaid meetodeid.

1.1 VALKUDE REAKTSIOONID

Valgud on polüpeptiidid, milles "ehituskivideks" olevad aminohapped on omavahel seotud amiidsidemete abil, mida biokeemias tuntakse peptiidsidemete nime all. Peptiidside moodustub ühe aminohappe karboksüülrühma reageerimisel teise aminohappe aminorühmaga. Kuna peptiidsideme moodustumisel eraldub vesi, võib seda nimetada ka kondensatsioonireaktsiooniks. Peptiidside on osalise kordsuse tõttu planaarne ning enamasti trans-konformatsioonis.

5

Peptiidsideme moodustumine

Valkude koostises leidub 20 üldlevinud aminohapet, mida nimetatakse proteogeenseteks aminohapeteks. Lisaks neile sisaldavad mõningad valgud ka nn ebaharilikke aminohappeid, peamiselt üldlevinud aminohapete hüdroksü-, metüül-, fosforüül- jt derivaate. Tuntud on ka rida aminohappeid ja nende derivaate, mida ei leidu valkudes, kuid mis täidavad olulisi füsioloogilisi funktsioone (χ-aminobutüraat, β-alaniin, ornitiin jt).

6

Proteogeensete aminohapete struktuurid ja jaotus polaarsuse järgi

Polaarsete mitteionogeensete radikaalidega: Gly, Ser, Asn, Gln, Thr, Cys, Tyr Ionogeensete radikaalidega aluselised (sinisel taustal): Arg, Lys, His

7

Apolaarsete radikaalidega: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro

Ionogeensete radikaalidega happelised: Asp, Glu

8

Valgud, nagu teisedki biopolümeerid, täidavad oma funktsioone tänu iseloomulikele ruumilistele struktuuridele, mis tulenevad primaarsest struktuurist, st aminohapete valikust ja järjestusest polüpeptiidahelas. Ahela lokaalset korrapärastumist iseloomustab sekundaarne struktuur, kogu valgumolekuli kolmemõõtmelise struktuuri iseloomustamiseks kasutatakse tertsiaarse struktuuri mõistet. Kui valgumolekul koosneb enam kui ühest polüpeptiidahelast, st koosneb osamolekulidest e subühikutest, siis nimetatakse valku oligomeerseks ja osamolekulide omavahelist assotsieerumist iseloomustab kvaternaarne struktuur. Näiteks, hemoglobiini molekul koosneb neljast polüpeptiidahelast (osamolekulist) ja omab kvaternaarset struktuuri. Valgumolekulide ruumilised struktuurid on fikseeritud nõrkade keemiliste sidemete ja vastasmõjudega. Valgu unikaalse ruumilise struktuuri lagunemist nimetatakse denaturatsiooniks. Selle käigus grupeeruvad ümber või katkevad ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed, kuid säiluvad aminohappeid ühendavad peptiidsidemed. Valgu denatureerumine võib vähendada tema lahustuvust, mis omakorda põhjustab valgu väljasadenemise lahusest. Valgu peptiidsidemete lagunemist nimetatakse valgu hüdrolüüsiks. Valkude detekteerimiseks (=kindlakstegemiseks) lahustes või bioloogilistes vedelikes kasutatakse mitmeid kvalitatiivse analüüsi meetodeid nagu:

Ø värvusreaktsioonid peptiidsidemete või teatavate aminohapete tuvastamiseks, Ø väljasadestamine lahusest reagentide või temperatuuri toimel denaturatsiooni-

protsessi uurimiseks või valkude eraldamiseks madalama molekulmassiga peptiididest,

Ø väljasoolastamine lahusest erinevate valgufraktsioonide lahutamiseks. Mõningad neist reaktsioonidest on kasutatavad ka valkude kvantitatiivseks määramiseks. Kvalitatiivseid reaktsioone on kahte tüüpi:

Ø universaalsed e üldreaktsioonid (biureedireaktsioon), mis on omased kõikidele valkudele,

Ø spetsiifilised e erireaktsioonid (tiooli-, ksantoproteiini-, Milloni reaktsioon jt), mis on iseloomulikud ainult teatud aminohappeid sisaldavatele valkudele.

Kuna valdav osa valke sisaldab kõiki 20 aminohapet, siis on ka erireaktsioonid kasutatavad enamiku valkude tuvastamiseks, kuid vähesed nn mittetäisväärtuslikud valgud, nagu kollageen, elastiin jt ei anna mõningaid erireaktsioone.

9

1.1.1 Biureedireaktsioon

Ühendid, mis sisaldavad kaht või enamat peptiidsidet, moodustavad aluselises keskkonnas Cu2+-ioonidega violetse kompleksi. Test on oma nimetuse saanud uurea derivaadi biureedi järgi, mis annab Cu2+-ioonidega tüüpilise positiivse reaktsiooni.

Kuna biureedireaktsioon on tingitud peptiidsidemete esinemisest, siis on ta valkude üldreaktsioon. Leeliselises keskkonnas moodustavad Cu2+-ioonid valgumolekulidega sinakasvioletse, lühikese ahelaga peptiididega (valgu hüdrolüüsi produktidega) aga roosa värvusega biureetkompleksi. Kompleksi värvus on tingitud Cu2+-ioonide koordinatiivsest seostumisest nelja peptiidsidemete koostisse kuuluva lämmastiku aatomiga, kaks kummastki polüpeptiidahelast või selle fragmendist. Kompleksi värvuse intensiivsus sõltub valgu kontsentratsioonist ja vase ioonide hulgast lahuses.

Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust. Lisatakse 1 ml 10%-list NaOH lahust ja mõni tilk 1%-list CuSO4 lahust. Katseklaasi sisu loksutatakse hoolikalt. Reaktsiooni kiirendamiseks võib katseklaasi vesivannil soojendada. Jälgitakse reaktsioonisegu värvuse muutumist ja selgitatakse nähtust.

10

1.1.2 Ksantoproteiinreaktsioon (Mulderi reaktsioon) Ksantoproteiinreaktsioon (xanthos – kollane, kr k) tõestab aromaatset tuuma sisalda-vate aminohapete (Tyr, Trp, Phe) olemasolu valgus. Kontsentreeritud lämmastikhappe lisamisel denatureerib valk pöördumatult ja sadestub. Katseklaasi sisu soojendamisel toimub aromaatsete tuumade nitreerumine. Moodustunud nitrofenooli tüüpi ühend on intensiivselt kollase värvusega ja käitub hape/alus indikaatorina, omandades leeliselises keskkonnas oranži värvuse.

Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse 5–6 tilka kontsentreeritud HNO3. Reaktsioonisegu loksutatakse ja soojendatakse kuni tekkinud valge sade värvub kollaseks. Seejärel segu jahutatakse, lisatakse NH4OH lahust kuni ammoniaagi lõhna ilmumiseni ja loksutatakse hoolikalt. Kirjeldatakse toimuvaid muutusi.

1.1.3 Milloni reaktsioon

Reaktsiooni läbiviimiseks kasutatakse Milloni reaktiivi (nimetatud avastaja järgi), mis kujutab endast elavhõbe(II)nitraadi lahust lämmastikhappes vähese NaNO2 lisandiga. Milloni reaktiiviga reageerivad fenoolset hüdroksüülrühma sisaldavad ühendid, seega valkude puhul türosiini (Tyr) radikaalid. Kuna türosiin esineb enamiku valkude koostises, siis suurem osa valkudest annab positiivse Milloni reaktsiooni, mille puhul valgu lahus või denatureerunud valgu sade värvuvad soojendamisel roosakaks kuni tume(telliskivi)-punaseks. NB! MILLONI REAKTIIV ON TUGEVALT TOKSILISE JA KORRODEERIVA TOIMEGA!

11

Töö käik Võetakse kaks katseklaasi, ühte neist valatakse 1 ml munavalgu lahust, teise 1 ml želatiini lahust. Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5–6 tilka Milloni reaktiivi. Reaktsioonisegu soojendatakse 40–50°C-ni ja jälgitakse toimuvaid muudatusi. Tehakse järeldused munavalgu ja želatiini aminohappelise koostise erinevuste kohta. Sic! Tuleb hoiduda Milloni reaktiivi ülemäärasest lisamisest valgule, mis võib anda ksantoproteiinreaktsioonile iseloomuliku kollase värvuse ja maskeerida Milloni reaktsiooni!

1.1.4 Sulfhüdrüüli- e tioolireaktsioon

Positiivne sulfhüdrüülreaktsioon näitab tsüsteiini (Cys) esinemist valgus. Tsüsteiini radikaalis sisalduv sulfhüdrüül- e tioolrühm (-SH) allub hõlpsasti leeliselisele hüdrolüüsile, andes sulfiidioone, millised Pb2+-ioonide juuresolekul moodustavad musta või tumepruuni ülipeene pliisulfiidi (PbS) sademe. Katse teostatakse pliietanaadi Pb(CH3COO)2 e plii-atsetaadi lahusega, milline moodustab aluselises keskkonnas naatriumplumbaadi(II). Viimane annab valgust vabanenud sulfiidioonidega PbS, mis aeglaselt välja sadeneb.

Töö käik 2 ml Pb(CH3COO)2 0,5 %-lisele lahusele lisatakse ettevaatlikult tilgakaupa 10 %-list NaOH lahust kuni tekkiv Pb(OH)2 sade kaob ja lahuses moodustub naatriumplumbaat Na2PbO2. Seejärel lisatakse katseklaasi 1 ml munavalgu lahust, loksutatakse ja reaktsioonisegu soojendatakse mõne minuti vältel, kuni algab pruunikasmusta kolloidse sademe moodus-tumine. Seejärel asetatakse katseklaas statiivi, kus sademe formeerumine jätkub.

1.1.5 Valkude sadestamine trikloroäädikhappega

Trikloroäädikhape (TKÄ) ehk trikloroetaanhape on laialdaselt levinud valke denatureeriv ja lahusest väljasadestav reagent, kuid TKÄ ei sadesta peptiide, mille molekulmass on alla 10 000. Seetõttu saab trikloroäädikhapet kasutada valkude eraldamiseks madal-molekulaarsetest lämmastikuühenditest, nagu valgu hüdrolüüsi produktid.

12

Töö käik Katseklaasi valatakse 1 ml munavalgu lahust ja lisatakse mõni tilk CCl3COOH lahust. Loksutatakse hoolikalt ja jälgitakse, kas ja milline sade tekib.

1.1.6 Valkude väljasoolastamine (globuliinide ja albumiinide eraldamine)

Neutraalsete soolade [(NH4)2SO4, MgSO4, NaCl jt.] kõrged kontsentratsioonid põhjustavad valkude pöörduvat denaturatsiooni, millega kaasneb väljasadestumine lahusest. Seda nähtust tuntakse väljasoolastamise nime all. Sadestumise protsessi mõjutavad valgu hüdrofiilsus / hüdrofoobsus, laeng, molekulmass ja muud omadused. Nii sadestuvad globuliinid (NH4)2SO4 poolküllastunud lahuses, albumiinide sadestumiseks aga on vaja soola küllastunud lahust.

Töö käik

2 ml munavalgu lahusele lisatakse võrdne maht (NH4)2SO4 küllastunud lahust, loksutatakse ja jäetakse 5 minutiks seisma. Tekkinud globuliinide sade eraldatakse filtrimise teel, milleks kasutatakse ~5 cm diameetriga filterpaberit ja sobiva suurusega klaas- või plastiklehtrit. Katse jätkamiseks piisab umbes ½ lahuse filtrimisest. Saadud filtraadile lisatakse kristalset (NH4)2SO4 kuni küllastuskontsentratsiooni saavutamiseni. Selleks lisatakse väikeste portsjonitena soola ja loksutatakse katseklaasi hoolikalt. Toimingut korratakse seni, kuni soola kristallid enam ei lahustu. Jälgitakse albumiinide sademe moodustumist. Tekkinud sademehulkade põhjal võrreldakse globuliinide ja albumiinide sisaldust munavalgus.

1.1.7 Valkude termiline denatureerimine ja lahustuvuse sõltuvus pH-st

Kõik valgud denatureeruvad kõrgel temperatuuril pöördumatult, kuna ruumilist struktuuri fikseerivad nõrgad sidemed katkevad. Denatureerumise temperatuur sõltub valgu loomusest ja keskkonna koostisest. Tavaliselt kaasneb denatureerumisega valgu väljasadestumine lahusest. Kui aga keskkonna pH väärtus erineb tunduvalt valgu isoelektrilise täpi (pI) väärtusest, siis ei pruugi denatureerunud valk lahusest välja ei sadestuda. Valgu pI näitab keskkonna pH väärtust, mille juures valgumolekulis on positiivsete ja negatiivsete laengute hulk võrdne, seega molekuli summaarne laeng võrdub 0-ga. Sellest tingituna valgumolekulid agregeeruvad hõlpsasti ning sadestuvad lahusest välja. Seevastu pI-st oluliselt erineva pH väärtusega keskkonnas omandavad kõik valgumolekulid ühesuguse laengu („+“ või „-“), valk-valk interaktsioonid lakkavad, agregatsiooni ja väljasadestumist ei toimu.

13

Töö käik

Kahte katseklaasi valatakse kummassegi 2 ml munavalgu lahust. Ühte katseklaasi lisatakse 1 ml kontsentreeritud etaan- e äädikhapet. Mõlemaid katseklaase kuumutatakse keeval vesivannil. Jälgitakse sademe tekkimist katseklaasides ja põhjendatakse täheldatud erinevust.

1.1.8 Valkude sadestamine orgaaniliste lahustitega

Etanool, atsetoon jt. veega segunevad orgaanilised solvendid kutsuvad valgumolekulides esile aminohapete apolaarsete (= füdrofoobsete) radikaalide pöördumise molekulide välispinnale. Toimub valgu dehüdratiseerumine, mistõttu valk sadestub lahusest välja. Kui sadestit ettevaatlikult lisada ja katseklaasi sisu pidevalt loksutada, denatureerub valk pöörduvalt. Sellisel juhul lahustub tekkinud sade uuesti, kui sadesti kontsentratsiooni vee lisamise teel vähendada. Orgaanilise solvendi lisamine ettevaatamatult kiiresti või suures koguses tekitab solvendi kõrge lokaalse kontsentratsiooni, võib toimuda valgu pöördumatu denaturatsioon ja sade ei lahustu enam täielikult.

Töö käik Katseklaasi valatakse 2 ml munavalgu lahust. Tilgakaupa ja segu pidevalt loksutades lisatakse orgaanilist solventi kuni sademe tekkimiseni, millest annab tunnistust lahuse hägustumine. Seejärel lahjendatakse katseklaasi sisu veega ja jälgitakse, kas tekkinud sade lahustub või mitte. Tehakse järeldus, millist tüüpi denaturatsioon – pöörduv või pöördumatu – toimus ja viimasel juhul selgitatakse, milles oli põhjus.

Kontrollküsimused

1. Nimetage, millised toodud valkude reaktsioonidest on üld-, millised erireaktsioonid ja põhjendage sellist jaotust. 2. Kirjutage aminohappe molekuli üldistatud struktuurivalem. Kuidas aminohappeid klassifitseeritakse radikaali keemilise ehituse järgi? 3. Kuidas tekib peptiidside? Kirjutage reaktsioonivõrrand, kasutades vabalt valitud aminohappeid. 4. Kirjutage 2 polüpeptiidahela fragmenti ja näidake, kuidas tekib biureetkompleks valguga. 5. Milliste aminohapete esinemist valgus näitab positiivne a) tioolireaktsioon b) ksanto-proteiinireaktsioon c) Milloni reaktsioon? 6. Kirjeldage ksantoproteiini- ja Milloni reaktsiooni kemismi. 7. Mis on valgu isoelektriline punkt (pI)? 8. Millistel juhtudel ei kaasne valgu denatureerumisega tema lahusest väljasadenemist?

14

9. Mida tähendavad mõisted a) valkude denaturatsioon, b) valkude hüdrolüüs, c) valkude väljasoolastamine? 10. Loetlege valke denatureerivad tegurid ja selgitage, mis valgumolekulis nende toimel aset leiab. 11. Millised vaadeldud teguritest põhjustasid valkude pöördumatut, millised pöörduvat denaturatsiooni? 12. Millele põhineb globuliinide ja albumiinide lahusest väljasadestamine (väljasoolas-tamine) neutraalsete sooladega?

15

1.2 SÜSIVESIKUTE REAKTSIOONID Süsivesikud on arvukas bioloogiliste ühendite rühm, mis koosnevad ainult süsinikust, vesinikust ja hapnikust. Vastavalt struktuurile jaotatakse neid mono- , oligo- ja polüsahhariidideks. Lisaks sellele, et monosahhariidid ehk monoosid (= lihtsuhkrud) täidavad organismides olulist energeetilist rolli ja kuuluvad koensüümide ning nukleiinhapete koostisse, on nad ka oligo- ja polüsahhariidide „ehituskivideks“. Kuigi paljude monosahhariidide molekuli üldvalem on ühesugune, Cx(H2O)y, erinevad nad stereostruktuurilt (funktsionaalsete rühmade ruumilise paigutuse poolest) ja seetõttu võivad nende omadused oluliselt erineda. Molekuli keemiliselt ehituselt on nad kas lineaarsed polühüdroksüaldehüüdid või polühüdroksüketoonid või molekulisisese tsüklisatsiooni tulemusel tekkivad tsüklilised poolatsetaalid või poolketaalid. Tänu aldehüüd- või ketorühma esinemisele omavad kõik monoosid redutseerimisvõimet.

Oligosahhariidide molekulid koosnevad mõnest (2–10) monosahhariidi molekuli jäägist (sahharoos, laktoos, maltoos, maltotrioos, tsellobioos jt), polüsahhariidides ehk polüoosides on aga sajad või tuhanded lihtsuhkru molekulid ühinenud pikkadeks sirgeteks või hargnenud struktuuriga ahelateks (tärklis, glükogeen, tselluloos jt). Oligosahhariidide oluliseks klassifitseerimise tunnuseks on vaba hemi- e poolatsetaalse või hemi- e poolketaalse hüdroksüülrühma esinemine või puudumine molekulis, mille järgi neid

16

jaotatakse redutseerivateks (= taandavateks) ja mitteredutseerivateks (= mittetaanda-vateks). Polüsahhariidide molekulides on vaba poolatsetaalse hüdroksüülrühma osatähtsus marginaalne, sest see esineb vaid iga polüsahhariidi ahela ühes otsas.

Oligo- ja polüsahhaariidides on monomeerid omavahel seotud O-glükosiidsidemega (vt joonist). Levinumad oligosahhariidid, nagu sahharoos, laktoos, maltoos jt omavad ener-geetilist rolli. Oligosahhariidi lisamisel valgule post-translatoorse modifitseerimise käigus tekivad glükoproteiinid. Samuti kuuluvad oligosahhariidid glükolipiidide koosseisu, osaledes rakk-rakk äratundmises, nt ABO veregrupid eristuvad erütrotsüütide memb-raanis olevate oligosahhariide sisaldavate glükolipiidide järgi. Polüsahhariidid, nagu tärklis ja glükogeen (glükoosi polümeerid), on energeetiliseks varu-aineks, taimedes on polüsahhariidid ka

rakukesta ehitusmaterjaliks (tselluloos, pektiin). Enamus süsivesikute kvalitatiivseks (aga ka kvantitatiivseks) määramiseks kasutatavaid reaktsioone baseerub karbonüülrühma esinemisele molekulis (hõbepeegli reaktsioon, reaktsioon Fehlingi lahustega jt). Reaktsioonitingimustest sõltuvalt oksüdeeruvad suhkrud seejuures erinevateks produktideks. Leeliselises keskkonnas redutseerivad suhkrud metallide ioone (Ag+, Cu2+, Fe3+) ning teisi oksüdeerijaid, kusjuures suhkrumolekuli süsinikuahel reaktsiooni käigus reeglina laguneb ning tekib mitmete oksüdatsiooniproduktide segu. Neutraalses või happelises keskkonnas toimub suhkrute oksüdatsioon ilma molekuli destruktsioonita ja produktideks on mitmesugused happed (aldoonhapped, uroonhapped).

Teine osa analüüsi meetoditest põhineb heterotsükliliste aldehüüdide furfuraali (pentoosidest) või 5-hüdroksümetüülfurfuraali (heksoosidest) moodustumisele süsivesikute kuumutamisel tugeva mineraalhappe juuresolekul. Mõlemad aldehüüdid moodustavad kondenseerumisel fenoolidega (α-naftool, resortsinool jt) värvilisi ühendeid (Molisch’i test, Selivanoff'i reaktsioon).

17

1.2.1 Molisch'i test

Molisch'i testi võib lugeda süsivesikute kvalitatiivse analüüsi põhitestiks, kuna positiivse reaktsiooni annavad nii mono-, oligo- kui polüsahhariidid. Isegi nukleiinhapped ja glükoproteiinid annavad positiivse Molischi reaktsiooni, kuna tugevas happelises keskkonnas toimub pikapeale monosahhariidide vabanemine. Väävelhappe toimel suhkrud dehüdreeruvad, moodustades kas furfuraale või 5-hürdoksümetüülfurfuraale. Tekkinud produktid reageerivad edasi α-naftooliga(C10H7OH), moodustades purpurse kihi uuritava lahuse ja happe piirpinnale.

Töö käik

Võetakse kaks katseklaasi ja neisse valatakse 2 ml erinevate süsivesikute lahust (glükoos, fruktoos, sahharoos, maltoos, laktoos, tärklis vm). Mõlemasse katseklaasi lisatakse 5–6 tilka Molisch'i reaktiivi, mis kujutab endast α-naftooli lahust alkoholis. Katseklaaside sisu loksutatakse hoolikalt. Seejuures võib α-naftool osaliselt lahusest välja sadestuda, kuna tema lahustuvus vees on väga madal, kuid katse käiku see ei mõjuta. Hoides katseklaasi kaldasendis lisatakse ettevaatlikult tilkhaaval 1 ml kontsentreeritud väävelhapet. Hape peab voolama mööda katseklaasi külge selle põhja uuritava lahuse alla. NB! Happe ja proovi segunemist tuleb hoolikalt vältida, st katseklaasi ei tohi loksutada! Süsivesikute esinemise korral uuritavas lahuses tekib happe ja lahuse piirpinnale purpurne või violetne reaktsiooniprodukt, mille värvus sõltub teatud määral ka süsivesiku liigist. Võrdluseks võib katse läbi viia ka munavalgu lahusega. Kirjeldatakse katse tulemust erinevate süsivesikute ja valgu lahuse puhul.

18

1.2.2 Osasoonide saamine

Osasoonid on süsivesikute derivaadid, mis tekivad redutseeriva ehk taandava suhkru reageerimisel fenüülhüdrasiiniga. Kõrvuti monoosidega moodustavad osasoone ka taandavad oligosahhariidid. Osasoonid kristalluvad lahustest hõlpsasti välja, kusjuures tekkivate kristallide kuju ja sulamistemperatuur on lähtesuhkrule iseloomulikud. Osasooni kristallide kuju järgi on võimalik eristada ka neid suhkruid, mille stereostruktuurid erinevad vaid ühe kiraalse tsentri konfiguratsiooni poolest. Ajalooliselt on osasoone suhkrute identifitseerimiseks kasutatud väga laialdaselt, kuid tänapäeval on sel otstarbel enamlevinud kromatograafilised meetodid. Osasoonide moodustumise reaktsioon on kaheetapiline – esmalt toimub reaktsioon C-1 paikneva aldehüüdrühma kaudu ja formeerub hüdrasoon C-1 positsioonis. Teine etapp hõlmab C-2 asendis oleva hüdroksüülrühma oksüdeerumist karbonüüliks ja selle kaudu ka C-2 asendis hüdrasooni formeerumist. Reaktsioon vajab fenüülhüdrasiini liiga ja pikemaajalist kuumutamist.

19

Töö käik Kahte katseklaasi valatakse 2 ml erineva taandava suhkru (glükoos, arabinoos, galaktoos, maltoos, laktoos jne) lahust. Mõlemasse lisatakse ~0,1 g tahket fenüülhüdrasiini ja ~0,2 g kristallilist naatriumatsetaati (NB! Juhinduda näidiskaalutistest!) ning loksutatakse kuni tahked ained on lahustunud. Reaktsioonisegu hoitakse 40 minutit keevas veevannis, aeg-ajalt loksutades ja jahutatakse seejärel jäävannis. Kui osasoonid on hakanud juba moodustuma, pole vaja segu enam loksutada. Katse korrektsel läbiviimisel moodustuvad katseklaasides vastavate suhkrute osasoonid, mis lahusest välja kristalluvad. Moodustunud osasoonide kristallide kuju tehakse kindlaks mikroskoobis. Selleks kantakse preparaadiklaasile üks tilk osasooni suspensiooni, liigne vedelik eemaldatakse filterpaberi tükikese abil ja kristallid kaetakse ettevaatlikult (mitte tugevalt surudes!) katteklaasiga. Valmistatud osasooni preparaate vaadeldakse suurendusega 15 x 8 või 15 x 20 ja joonistatakse üles kristallide kuju. Kirjeldatakse uuritud suhkrute osasoonide erinevusi kristallide kuju, suuruse ja orientatsiooni aspektist. Saadud tulemust võrreldakse kirjanduses toodud erinevate suhkrute osasoonide kristallide kujuga.

1.2.3 Hõbepeegli reaktsioon

Taandavate suhkrute molekulides sisalduv aldehüüdrühm (tsüklilise vormi puhul pool-atsetaalne hüdroksüülrühm) taandab mitmete metallide sooli. Ammoniakaalsest hõbenitraadi lahusest (uurija nime järgi Tolleni regent) sadestub metalliline hõbe aldehüüdide, seega ka taandavate suhkrute toimel välja, moodustades katseklaasi pinnale peegli. Tolleni reaktiivis on aktiivseks komponendiks AgNO3 ja NH3 baasil tekkiv diammiinhõbe(I) [Ag(NH3)2]+. NB! Ajalooliselt nimetatakse koordinatsioonikomplekside koostises olevat NH3 ammiiniks!

NB! Jälgi oksüdatsiooniastmete (märgitud punasega) muutumist reaktsiooni käigus!

20

Töö käik

Hoolikalt pestud katseklaasi valatakse 1ml 1%-list AgNO3 lahust, lisatakse 0,5 ml kontsent-reeritud NH4OH lahust ja loksutatakse. Seejärel lisatakse 1 ml glükoosi lahust, segu loksutatakse hoolikalt ja soojendatakse ettevaatlikult veevannis. Positiivse reaktsiooni puhul sadestub taandunud hõbe katseklaasi seintele peeglina. NB! Määrdunud katseklaasi kasutamisel, ettevaatamatul soojendamisel või reaktiivide kogustega liialdamisel tekib tumehall või must sade ja peeglit ei teki. Sellisel juhul tuleb katset korrata.

1.2.4 Sahharoosi hüdrolüüsi kontroll Fehlingi lahustega.

Taandavate suhkrute määramisel on üheks levinumaks reaktiiviks leeliseline vask(II)-tartraatkompleks ehk Fehlingi reaktiiv, mis saadakse Fehlingi I lahuse (CuSO4 vesilahus) ja Fehlingi II lahuse (leeliseline K,Na-tartraadi e Seignett'i soola vesilahus) kokkusegamisel.

Tekkiv vask(II)-tartraatkompleks reageerib aldooside või ketoosidega alltoodud reaktsiooni kohaselt. Vaba aldehüüd- või ketorühma (poolatsetaalse või -ketaalse hüdroksüülrühma) toimel vask taandub, andes vask(I)oksiidi, mis punase sademena lahusest välja sadestub. Suhkur ise aga oksüdeerub reaktsiooni käigus vastavaks happeks.

Kuna positiivse reaktsiooni annavad ainult taandavad suhkrud, siis sahharoos Fehlingi reaktiiviga ei reageeri, küll aga reageerivad tema hüdrolüüsi produktid glükoos ja fruktoos. Sahharoosi hüdrolüüsi saab kiirendada kas ensümaatiliselt või happe toimel kõrgel temperatuuril. Sahharoosi hüdrolüüsi protsessi nimetatakse inversiooniks ja tekkivat glükoosi ja fruktoosi ekvimolaarset (moolide suhe 1:1) segu tuntakse invertsuhkru nime all.

21

Need on ajalooliselt väljakujunenud terminid (invert – ümber pöörama), viidates suhkrute kui optiliselt aktiivsete ainete eripöörangu märgi muutumisele hüdrolüüsi käigus: sahharoos („+“) → glükoosi ja fruktoosi segu suhtes 1:1 („-“).

Töö käik Kahte katseklaasi valatakse 1ml sahharoosi lahust, ühte neist lisatakse 1 tilk kontsentreeritud HCl. Loksutatakse ja sahharoosi hüdrolüüsi läbiviimiseks hoitakse mõlemat lahust 5 minutit veevannis 80...85°C juures. Seejärel lisatakse mõlemasse katseklaasi 1 ml Fehlingi I ja 1 ml Fehlingi II lahust ja loksutatakse hoolikalt. Katseklaasides olev lahus omandab intensiivse sinise värvuse. Katseklaase soojendatakse uuesti veevannil kuni ühes katseklaasis (kummas?) tekib tugev punane sade. Kirjeldatakse ja põhjendatakse, mis toimus katse erinevatel etappidel.

1.2.5 Barfoed' reaktsioon Suhkrute reaktsioon Barfoed' reaktiiviga [vask(II)atsetaadi Cu(CH3COO)2 lahus äädik-happes] võimaldab eristada taandavaid monosahhariide oligosahhariididest, kuna nõrgas happelises keskkonnas taandavad vaske üksnes monosahhariidid. Reaktsioon Barfoed' reaktiiviga, nii nagu Fehlingi reaktiivigagi, annab punase vask(I)oksiidi Cu2O sademe.

22

Töö käik Võetakse kaks katseklaasi ning ühte valatakse 1 ml monosahhariidi lahust (glükoos, fruktoos vm) ja teise taandava oligosahhariidi (laktoos, maltoos) lahust. Mõlemale lisatakse 3 ml Barfoed' reaktiivi, segatakse hoolikalt ning hoitakse kuumal veevannil maksimaalselt 5 minutit. Jälgitakse Cu2O sademe moodustumist. Monosahhariidide korral peab sade moodustuma 2–3 minuti jooksul. NB! Kui proove kuumutada liiga kaua, tekib sade ka oligosahhariidi sisaldavas katseklaasis, kuna oligosahhariidis toimub glükosiidsideme hüdrolüüs ja vabanevad monosahhariidid taandavad vaske.

1.2.6 Selivanoff'i reaktsioon Suhkrute kuumutamisel tugevate mineraalhapete juuresolekul moodustub pentoosidest heterotsükliline aldehüüd furfuraal, heksoosidest 5-hüdroksümetüülfurfuraal.

Tekkivad ühendid reageerivad (polükondenseeruvad) mitmealuseliste fenoolidega, andes värvilisi produkte, mida sageli kasutatakse ka suhkrute kvantitatiivseks määramiseks.

Üks selleks otstarbeks kasutatavaid reaktiive on tuntud Selivanoff'i reaktiivina. See sisaldab soolhapet, kondenseeriva agendina resortsinooli e benseen-1,3-diooli [C6H4(OH)2] ja katalü-saatorina FeCl3. Reaktsiooni tulemusena tekkiva ühendi värvus varieerub punakaspruunist tumepruunini. Reaktsioon toimub ketoosidega kiiremini kui aldoosidega.

23

Töö käik Võetakse 2 katseklaasi, ühte valatakse 1 ml fruktoosi lahust, teise sama hulk glükoosi lahust. Lisatakse 2 ml Selivanoff'i reaktiivi, loksutatakse ja soojendatakse 4...5 minutit keeval veevannil. Jälgitakse värvilise ühendi tekkimise kiirust ja värvuse intensiivsust glükoosi ja fruktoosi puhul. NB! Kui katseklaase kuumutada kauem, siis värvuste erinevus väheneb või kaob hoopis.

1.2.7 Tärklise reaktsioon joodiga Tärklistele iseloomulik omadus moodustada joodiga intensiivselt lillakas-siniseid komplekse on tingitud polüsahhariidi ahelate keerdumisest joodi molekulide ümber. Tekkinud kompleks laguneb kõrgemal temperatuuril ja kaotab värvuse (pöörduv reaktsioon). Joodiga värvuvad ka taimsest materjalist (kartulist, teraviljadest) eraldatud natiivsed tärkliseterakesed ning värvununa on nende suurus ja kuju mikroskoobis hõlpsamini vaadeldavad, võimaldades kindlaks teha, millisest taimest tärklis pärineb.

Töö käik A. Katseklaasi valatakse 4–5 ml tärkliselahust ja lisatakse 1 tilk joodilahust. Segu loksutatakse ja kuumutatakse keemiseni. Seejärel katseklaasi alumine pool jahutatakse jäävee vannil või veejoa all. Kirjeldatakse ja põhjendatakse lahuse värvusega toimuvaid muutusi. NB! Vältida tuleb liigset joodi lisamist tärkliselahusele, kuna sel juhul ei pruugi värvus kaduda! B. Mikroskoobi alusklaasile kantakse erinevate tärkliste või tärkliserikka materjali (jahu) proovid. Lisatakse 1 tilk lahjendatud (helekollast) joodilahust, mille liig kõrvaldatakse filterpaberi tükikesega. Preparaadid kaetakse katteklaasidega nii, et õhumullid klaasi alla ei jääks ja vaadeldakse mikroskoobis suurendusega 15 x 8. Joonistatakse üles erinevate tärkliseliikide terade kuju ja võrreldakse omavahel nende suurust.

Kontrollküsimused

1. Kuidas jaotatakse monosahhariide süsinikuaatomite arvu, molekuli keemilise ehituse ja molekuli kuju järgi? 2. Millise keemilise omaduse järgi klassifitseeritakse oligosahhariide? Nimetage nende rühmade esindajaid. 3. Millistele keemilistele omadustele (funktsionaalsetele rühmadele) baseerub enamus süsivesikute kvalitatiivseid reaktsioone?

24

4. Millised reaktsioonid olid seotud furfuraali ja 5-hüdroksümetüülfurfuraali tekkimisega? Kirjutage nende ühendite struktuurid ja kirjeldage, millest ning mille toimel nad moodus-tuvad. 5.Milline läbiviidud reaktsioonidest võimaldab kindlaks teha mistahes süsivesiku esinemist lahuses? 6. Mis on osasoonid? Miks saab osasoonide tekke reaktsiooni kasutada süsivesikute kvalitatiivse reaktsioonina? 7. Millise reaktiiviga viiakse läbi hõbepeegli reaktsiooni ja millised tegurid võivad segada positiivse reaktsioonitulemuse saamist? 8.Valige välja reaktsioonid, millised võimaldavad eristada taandavaid ja mittetaand-avaid suhkruid. 9. Millist reaktsiooni kasutatakse mono- ja disahhariidide eristamiseks? Milline on selle reaktsiooni kemism? 10.Iseloomustage järgmiste reaktiivide koostist: a) Fehling’i b) Barfoed’ c) Molisch’i reaktiiv? 11. Milline süsivesik on sahharoos ja mis on tema hüdrolüüsi produktideks? Millise reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas toimus sahharoosi hüdrolüüs? 12. Milline süsivesik on tärklis? Kuidas saab kindlaks teha a) tärklise esinemist lahuses b) teralise tärklise päritolu?

25

1.3 LIPIIDIDE REAKTSIOONID

Lipiidid on heterogeenne ühendite rühm, mille molekulide keemilist ehitust iseloomustab enamasti estersideme(te) esinemine. Reeglina ei lahustu lipiidid vees ja vesilahustes, vaid apolaarsetes orgaanilites solventides, nagu triklorometaan (kloroform), tetraklorometaan (tetrakloorsüsinik), benseen, eeter, jt. Vähemal määral lahustuvad nad polaarsetes solventides, nagu metanool, etanool jt. Lipiidide lahustumatus vees ja vesilahustes on tingitud hüdrofoobsete aatomirühmade ja pikkade süsivesinikradikaalide sisaldusest molekulis. Lipiidid on kõikides organismides rakumembraanide põhiliseks koostis-komponendiks, loomsetes organismides, aga ka mitmetes taimsetes kudedes peamiseks energeetiliseks varuaineks. Lisaks sellele on neil ka kaitse- ja regulatoorsed funktsioonid, nad on signaalmolekulideks ning mängivad olulist rolli hormonaalses tasakaalus. Lipiide võib vastavalt molekuli ehitusele ja omadustele klassifitseerida mitmeti. Üldlevinud on järgmine rühmitamine:

Ø rasvhapped, Ø rasvad, Ø glütserofosfolipiidid, Ø sfingolipiidid, Ø vahad, Ø steroidid, Ø terpenoidid.

Lähtudes seebistumisvõimest võib lipiide jaotada: Ø seebistuvateks (rasvad, glütserofosfolipiidid, sfingolipiidid, vahad), Ø mitteseebistuvateks (steroolid, prostaglandiinid ja terpenoidid).

Vastavalt molekuli struktuurile võib lipiidid jaotada ka veel liht-, liit- ning tsüklilisteks lipiidideks. Lihtlipiidid on (neutraal)rasvad ja vahad, liitlipiidide rühma kuuluvad fosfo- ja glükolipiidid, tsükliliste lipiididena tuntakse tsükliliste alkoholide baasil moodustuvaid lipiide, nagu näiteks kolesteriidid. Rasvad e. triatsüülglütseroolid (nimetatakse ka neutraalrasvadeks, samuti triglütse-riidideks) on keemiliselt ehituselt rasvhapete glütserüülestrid. Hüdrofoobsed rasvamolekulid sobivad toiduenergia säilitamiseks, olles loomades akumuleerunud rasvadepoodesse, kõrgemates taimedes seemnetesse. Naturaalsetes rasvades sisaldub lai valik erinevaid, nii küllastunud kui küllastumata rasvhappeid. Inimesele on erilise tähtsusega linool- ja α-linoleenhape (nn asendamatud rasvhapped), kuna neid inimorganismis ei sünteesita ja peab saama toidurasvadega. Looduslikel küllastumata rasvhapetel esinevad kaksiksidemed valdavalt cis-konfiguratsioonis (süsinikuahela osad on ühel pool kaksiksideme tasandit), mistõttu ahel on kujult väändunud. trans-

26

konfiguratsioonis küllastumata rasvhapete ahelad on sik-sak-kujuga ning seega käituvad biomembraanides sarnaselt küllastunud rasvhapetele. Organismis on nad raskesti metaboliseeritavad, mistõttu neid peetakse südame-veresoonkonna haiguste riskifaktoriks. Vähesel määral leidub erinevate kudede rasvades ka diatsüül- ja monoatsüülglütseriide. Kõikide rakumembraanide peamiseks koostisosaks olevad glütserofosfolipiidid kujutavad endast amfifiilseid (= amfipaatseid) molekule, sest lisaks kahele rasvhappe radikaalile, mis annavad molekulile hüdrofoobsuse, sisaldavad nad fosforhappe jääki, mille kaudu seonduvad erinevad aminoalkoholid ja mille tulemusena moodustub molekulis polaarne tsenter. Just amfipaatsuse tõttu saavad need lipiidid moodustada vesikeskkonnas struktuure, nagu membraanid, vesiikulid või liposoomid. Steroolide ehk steroidalkoholide ehituslikuks aluseks on steraanituum, st tsüklopentano-perhüdrofenantreen (seostunud 3 tsükloheksaani ja 1 tsüklopentaani tsükkel), mis asendis C-3 on hüdroksüleeritud. Seetõttu on steroolid võimelised moodustama rasvhapetega estreid, mida tuntakse steriidide nime all. Levinuim loomne sterool on kolesterool, mida leidub pea kõikide loomsete rakumembraanide koostises ja mis tagab membraanide läbitavuse ja liikuvuse/voolavuse. Lisaks sellele toodetakse kolesteroolist sapphappeid, steroidhormoone ning D-vitamiini. Kuigi pikka aega on kõrget kolesteroolitaset peetud südame- ja veresoonkonna haiguste riskifaktoriks, on määravaks teguriks kolesterooli jaotumine nö aterogeensete ja kaitsvate lipoproteiinide vahel. Taimerakkude membraanides sarnast funktsiooni täitvate steroolide ehk fütosteroolide esindajad ergosterool, stigmasterool, kampesterool jt erinevad kolesteroolist ja ka üksteisest C-17 asendusrühma ehituse poolest. Mitmetes taimeõlides (maisiõli, sojaõli jt) on fütosteroolide sisaldus märkimisväärselt kõrge, küündides sadade milligrammideni 100 g õli kohta. Fütosteroolidele omistatavat positiivset toimet inimorganismile põhjendatakse asjaoluga, et nad takistavad kolesterooli imendumist.

27

1.3.1 Rasvapleki proov

Kõikide lipiidide ühiseks omaduseks on lahustuvus orgaanilistes lahustites. Lipiidi sisaldava lahuse tilga kandmisel paberile ja lahusti aurustumisel moodustub lipiide sisaldava proovi korral paberile rasvaplekk, millest paberi läbipaistvus suureneb. Rasvaplekk on vastu valgust vaadates muust paberist heledam ja pimeda poole vaadates tumedam. Oluline on meeles pidada, et järeldusi saab teha kuiva(tatud) proovidega paberit uurides, sest niiske paberi läbipaistvus on suurenenud ka lipiide mittesisaldavate lahuste korral.

Töö käik

Uuritakse kahte tahket materjali, millest üks sisaldab lipiide. Võetakse kaks kuiva katseklaasi, millesse pannakse umbes 1 g tahket ainet, milles soovitakse lipiidi olemasolu kindlaks teha. Mõlemasse katseklaasi lisatakse mitte rohkem kui 0,5 ml orgaanilist lahustit: atsetooni, tetraklorometaani (=tetrakloorsüsinikku) CCl4, triklorometaani (=kloroformi) CHCl3 või muud. Loksutatakse hoolikalt ja lastakse tahke materjali settimiseks umbes 5 minutit seista. Kui sademe kohale on tekkinud selge lahuse kiht, siis kantakse mõlemast katseklaasist pipetiga tilk lahust filterpaberile ja lastakse kuivada. Parema tulemuse saamiseks võib lahuseid samadesse punktidesse ka teist korda tilgutada. Kuiva paberit vaadatakse vastu valgust ning varju suunas. Tehakse järeldus, milline proov sisaldas lipiide.

28

1.3.2. Emulsioonitest

Emulsioonid on üks liik kahe- või enamafaasilistest süsteemidest, mida tuntakse kolloidide nime all. Kolloidid koosnevad kahest mittesegunevast vedelikust, millest üks (dispergeerunud faas) on jaotunud mikroskoopiliste tilgakestena teises vedelikus (pidevas faasis). Kuna emulsioonid hajutavad läbivat valgust, siis emulsiooni moodustumisest annab informatsiooni selge lahuse muutumine häguseks. Rasvade kui rasvhapete glütserüülestrite iseloomulikuks tunnuseks on hüdrofoobsus ja lahustumatus vees ja vesilahustes. Küll aga lahustuvad nad orgaanilistes solventides, nagu kloroform, benseen, aga ka atsetoon, metanool jt. Kui taolises solvendis valmistatud rasvalahus viia hüdrofiilsesse vesikeskkonda ja seda intensiivselt segada või loksutada, siis moodustub õli-vees tüüpi emulsioon. Emulsioonid on üldlevinud toiduainete valdkonnas (piim on õli-vees tüüp, või on vesi-õlis tüüp), värvitööstuses (lateksvärvid) ja paljudel muudel elualadel. Reeglina on neil juhtudel tegu rohkem kui kahekomponentsete süsteemidega, mis emulsiooni stabiilsuse eesmärgil sisaldavad ka stabiliseerivaid lisandeid.

Töö käik

Kahte kuiva katseklaasi valatakse 2 ml 96%-list etanooli ja lisatakse 2 ml kahte erinevat uuritavat lahust, millest üks sisaldab lipiidi, teine mitte. Katseklaase loksutatakse kuni homogeense lahuse moodustumiseni. Seejärel lisatakse mõlemasse 4 ml destilleeritud vett ja loksutatakse taas intensiivselt. Jälgitakse, kumba proovi sisaldavas katseklaasis muutub segu häguseks ja tehakse järeldus lipiidi sisaldumise kohta.

1.3.3 Akroleiiniproov Glütserooli (propaantriooli) kuumutamisel, eriti vett siduvate ainete juuresolekul, tekib terava lõhnaga küllastamata aldehüüd propenaal ehk akroleiin. Sama reaktsiooni annavad rasvad ja glütserofosfolipiidid, kuid ei anna glütserooli mittesisaldavad lipiidid (vahad, sfingolipiidid jt). Seega võimaldab akroleiini moodustumine otsustada, kas tegemist on glütserooli sisaldava või mittesisaldava lipiidiga.

29

Töö käik

Kahte kuiva katseklaasi kantakse ~1g KHSO4 või NaHSO4 ja lisatakse mõni tilk kahest erinevast uuritavast materjalist (tähistatud akroleiinitesti proovid 1 ja 2). Katseklaase kuumutatakse tõmbekapis gaasipõleti kohal kuni soola sulamise ja proovi tumenemiseni. Viimane annabki märku reaktsiooni toimumisest ja akroleiini moodustumisest. Nuusutatakse ettevaatlikult katseklaasidest eralduvat lõhna (NB! Akroleiin on mürgine!), tõmmates käega katseklaasi kohalt õhku enda suunas ja tehakse järeldus, kumb proovidest sisaldas lipiidi, mille koostisse kuulub glütserool.

1.3.4 Küllastumata rasvhapete tuvastamine lipiidides Küllastumata rasvhapete esinemise kindlakstegemiseks lipiidides kasutatakse analoogiliselt süsivesinike uurimisega reaktsiooni halogeenidega. Küllastunud rasvhappeid sisaldava proovi reaktsioonil broomiga viimasele iseloomulik pruun värvus võib küll veidi lahjeneda, kuid ei kao, samas aga küllastumata rasvhapete sisalduse puhul muutub lahus toimuva liitumis-reaktsiooni tõttu momentaalselt värvituks.

Töö käik

Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust orgaanilises lahustis: rasvhappe (stearhappe või palmithappe), taimse rasva ja loomse rasva lahust. Kõigisse katseklaasidesse lisatakse tilkhaaval võrdne kogus (kuni 10 tilka) broomi lahust kloroformis e triklorometaanis, loksutatakse ning jälgitakse toimuvaid muuda-tusi. Rasvhapet sisaldavas katseklaasis peaks broomi lahus säilitama iseloomuliku kollakas-pruuni värvuse, teistes kahes aga toimub värvuse muutus. Tehakse järeldused uuritavate lipiidi proovide küllastumatuse (küllastumata rasvhapete sisalduse) kohta.

1.3.5 Liebermann-Burchard'i kolesterooli määramise test

Kolesterooli reageerimisel äädikhappe anhüdriidiga (CH3CO)2O väävelhappe keskkonnas moodustub tume sinakas-rohelise värvusega reaktsioonisegu. Tegemist on mitmeastmelise reaktsiooniga ja lõpliku värvuse kujunemist võib märgata üle punase ja sinise vaheühendi. Reaktsiooni sinakas-rohelises staadiumis on TMR-meetodil identifitseeritud arvukalt (kuni 20) reaktsiooniprodukte, mis näitavad, et kolesterooli molekulis leiab aset rida transformatsioone: toimub steraanituuma oksüdeerumine, mis viib küllastamatuse suurenemisele ja sulfoneerumine erinevates punktides. Lõppkokkuvõttes tekib kolesterooli polüeensete sulfoonhappe derivaatide segu. Samas aga positsioonis C17 paiknev süsivesinikradikaal reaktsioonis ei osale.

30

Töö käik

Kolme puhtasse ja kuiva katseklaasi valatakse igasse 2 ml erineva lipiidi lahust metüleenkloriidis – kolesteroolilahust, taimse ja loomse rasva (triglütseriidi) lahust. Igasse katseklaasi lisatakse 6...7 tilka värsket äädikhappe anhüdriidi ja 4...5 tilka kontsentreeritud väävelhapet ning loksutatakse hoolikalt. Jälgitakse katseklaasides toimuvaid värvuse muutusi ning reaktsioonisegu lõpliku värvuse kujunemist. Tehakse järeldused kolesterooli sisalduse kohta uuritavates proovides.

Kontrollküsimused

1. Kirjutage rasva, glütserofosfolipiidi, vaha ja steroidi üldvalemid.

2. Millest on tingitud lipiidide hüdrofoobsus ja millised läbiviidud reaktsioonidest

näitasid seda?

3. Mida tähendab amfifiilsus ja millised lipiidid on amfifiilsed?

4. Millised lipiidid kuuluvad bioloogiliste membraanide koostisse?

5. Millise reaktsiooniga saab kindlaks teha, kas lipiid sisaldab küllastumata rasv-

happeid? Esitage reaktsiooni kemism.

6. Valige lipiidid, mille lahuses Br värvus kaob: stearhape, päevalilleõli, linoleen-hape,

palmithape, maisiõli. Põhjendus?

7. Millist informatsiooni lipiidi kohta annab akroleiini tekkimine ja millised lipiidid

annavad positiivse akroleiiniproovi?

8. Joonistage steroidide ehituslikuks aluseks olev steraanituum. Millega põhjendate,

et kolesterool on tsükliline alkohol?

Kolesterool

31

9. Liebermann-Burchard’i test annab kolesterooli esinemise korral tumerohelise

värvuse. Kas / miks võivad ka taimeõlide lahused anda rohelise värvusega

reaktsioonisegu?

10. Milliseid reaktiive kasutatakse Liebermann-Burchard’i testi läbiviimiseks?

11. Kuidas teha kindlaks lipiidide esinemist a) tahkes materjalis b) vedelikus?

12. Mis on emulsioon ja mis on emulgaator?

32

2. SEGUDE LAHUTAMINE JA AINETE IDENTIFITSEERIMINE

2. A Kromatograafilised meetodid

Kromatograafia on segu komponentide lahutamise meetod, mis põhineb nende erineval jaotumisel liikuva (= mobiilse) ja liikumatu (= statsionaarse) faasi vahel. Mobiilse faasi agregaatolekust sõltuvalt eristatakse gaasi-, vedelik- ja ülekriitilise fluidumi kromatograafiat. Statsionaarse faasina võib kasutada adsorbenti, ioniiti, biospetsiifilist sorbenti, poorset geeli või kandja pooridesse seotud vedelikku. Sõltuvalt statsionaarse faasi iseärasustest ja lahutatavate ainete ning faaside vahelistest vastasmõjudest erista-takse järgmisi kromatograafia liike:

• jaotuskromatograafia, • adsorptsioonkromatograafia, • afiinsuskromatograafia, • ioonvahetuskromatograafia, • geelkromatograafia.

Kromatograafilisi meetodeid kasutatakse laialdaselt aminohapete, valkude, süsivesikute, lipiidide jt biomolekulide segude lahutamisel.

Kromatograafia liike illustreerivad skeemid

Kromatograafilist protsessi võib realiseerida kinnises süsteemis – kolonnis (kolonn-kromatograafia) ja lahtises süsteemis – paberil või kromatograafilisel plaadil (üldnimetus planaarkromatograafia, kitsamalt paberkromatograafia ja õhukese kihi kromatograafia).

33

34

Jaotuskromatograafia aluseks on lahutatavate ainete jaotumine kahe, teineteisega mitteseguneva vedelfaasi või statsionaarse vedelfaasi ja gaasifaasi vahel tänu ainete erinevale lahustuvusele neis faasides. Statsionaarset faasi pestakse järjest uute mobiilse faasi kogustega, kuni lahutatavad ained jagunevad lahusti erinevatesse portsjonitesse. Tänu segu komponentide jaotuskoefitsientide erinevusele leiabki aset nende eraldumine üksteisest. Segu komponendi A üleminek statsionaarsest faasist mobiilsesse faasi kirjeldub tasakaaluvōrrandiga:

CA stats ↔ CA mob, kus CA

stats – aine A tasakaalukontsentratsioon statsionaarses faasis CA mob – aine A tasakaalukontsentratsioon mobiilses faasis Jaotuskoefitsienti Kd võib defineerida kui selle protsessi tasakaalukonstanti, mis avaldub ühendi A tasakaalukontsentratsioonide suhtena erinevates faasides: CA stats

Kd = CA mob

Aine Kd on antud temperatuuril konstant, mille väärtus sõltub ainest ja faase moodustavatest vedelikest. Kd väärtust ei mõjuta aine kontsentratsioon lahutatavas segus ega teiste ühendite juuresolek. Kuna Kd väärtused jäävad 0 ja 1 vahemikku, siis – mida suurem on komponendi Kd väärtus, seda suurem on tema afiinsus (sugulus) statsionaarse faasi suhtes. Kromatograafiasüsteemides kasutatakse tavaliselt mobiilse faasina ühe, vōrdlemisi mittepolaarse lahusti (näiteks n-butanooli) küllastatud lahust mōnes temast polaarsemas lahustis (näiteks H2O-s). Kui niisugust lahustite segu sunnitakse liikuma üle paberi, kromatograafilise plaadi vōi läbi kolonni täidise, siis segu polaarne komponent (H2O) adsorbeerub üliõhukese kelmena kandjana kasutatavale materjalile (silikageelile õhukese kihi kromatograafias) ja moodustab statsionaarse faasi. Kandjaga seotud polaarset statsionaarset faasi uhutakse pidevalt mööduva, vähempolaarse mobiilse faasiga (n-butanool). Sel viisil luuakse miniatuurne jaotuskromatograafia süsteem. Kolonnkromatograafia vōimaldab lahutada suuremaid ainehulki. Tahke materjaliga (tselluloos, tärklis vm), millele saab kanda statsionaarset faasi, pakitud kolonni sisestatakse uuritav proov, mille komponente soovitakse üksteisest lahutada. Kolonni voolutatakse lahustite seguga, mida nimetatakse voolutiks e eluendiks. Kui proovis sisalduvate ühendite lahustuvused mobiilses ja statsionaarses faasis on erinevad, st jaotuskoefitsiendid on erinevad, siis liiguvad nad kolonnis erinevate kiirustega ja väljuvad kolonnist erinevatel aegadel. Kogudes kolonnist väljuvat vedelikku – eluaati – üksikute fraktsioonidena on võimalik segu komponendid üksteisest lahutada.

35

Kolonnkromatograafia hōlmab ka meetodeid, mille abil uuritav segu lahutatakse komponentideks vastavalt nende erinevale liikuvusele poorses, vees lahustumatus keskkonnas ehk maatriksis. Tänu komponentide erinevale afiinsusele tahke maatriksi ja mobiilse faasi (vedelik, gaas) suhtes toimub nende lahutumine. Nähtusteks, mis kutsuvad esile afiinsuse statsionaarse faasi suhtes, on adsorptsioon ja ioonvahetus. Adsorptsioonkromatograafia on kõige vanem kromatograafia liik ning baseerub lahutatava segu komponentide erinevale seostumisvõimele tahke adsorbendiga (statsionaarne faas), milleks on mõni peeneteraline materjal – alumiiniumoksiid, silikageel, tärklis, tselluloos, tseoliit, aktiivsüsi vmt. Ainete suhteline afiinsus adsorbendi suhtes sōltub ühendi enda, solvendi ja adsorbendi keemilisest koostisest. Lahutumine toimub tänu segu komponentide korduvale sorptsioonile ja desorptsioonile. Tüüpilisteks voolutiteks on heksaan, benseen, eeter, kloroform, mitmesugused alkoholid ja ketoonid ning mitmed vesilahused kombinatsioonis orgaaniliste lahustitega. Adsorptsioonkromatograafiat kasutatakse eriti lipiidide, sh steroidide, karotenoidide, samuti klorofüllide ja nende sünteesi lähteühendite segude lahutamiseks. Ioonvahetuskromatograafia baseerub lahutatavas segus sisalduvate ioonide pöörduval vahetumisel statsionaarse faasina kasutatava polümeerse vaigu (ioonvahetaja e ioniidi) ioonide vastu. Selle kromatograafia meetodi aluseks on statsionaarse faasi ja lahutatava segu ioonide elektrostaatiline vastastoime. Lahutumine sõltub laetud molekulide (= ioonide) erineva tugevusega seostumisest vastasmärgilise laenguga ioonvahetajale ja sellest tingitud difusioonikoefitsientide erinevusest. Kationiidid on happelise iseloomuga ioonvahetajad, mis sisaldavad, näiteks, karboksüül- või sulforühmi, mille prootonid võivad vahetuda segus olevate katioonidega. Anioniidid sisaldavad aluseliste omadustega rühmi, näiteks erineva asendusega aminorühmi. Kuna aminohapped ja valgud esinevad vesilahustes ioonidena, siis kasutataksegi ioon-vahetust sageli nende segude lahutamiseks. Ka automatiseeritud aminohapete analüsaatorid on ioonvahetuskromatograafid. Geelkromatograafia meetoditest on kõige tuntum geelfiltratsioon ehk molekulaarsõelte meetod. See on ainete lahutamise, puhastamise ja analüüsi meetod, mis baseerub segus olevate ainete molekulmasside erinevusele. Selle meetodi täpsem iseloomustus on toodud laboratoorses töös nr 2.2. Afiinsuskromatograafia on kromatograafia liik, mille puhul segu lahutamine toimub tänu kitsalt spetsiifilistele interaktsioonidele, nagu antigeen-antikeha, ensüüm-substraat või retseptor-ligand vastastoime. Afiinsuskromatograafiat kasutatakse mingi komponendi väljapuhastamiseks segust puhverlahusesse ja kontsentreerimiseks, mingi komponendi

36

sisalduse vähendamiseks segus või ligandide otsimiseks. Statsionaarse faasina kasutatakse tavaliselt geelimaatriksit (enamasti agaroosi), kuhu on kinnitatud ligand, millele seostub spetsiifiliselt mingi uuritava segu komponent. Kõige laialdasemalt kasutatakse kahte afiinsuskromatograafia liiki:

• immuunoafiinsuskromatograafiat, • metallkelaat-afiinsuskromatograafiat.

Immuunoafiinsuskromatograafia puhul on statsionaarseks faasiks kandjale seotud antigeen, mida kasutatakse antikehade eraldamiseks, näiteks, vereseerumist. Metallkelaat-afiinsuskromatograafia ehk immobiliseeritud metalliiooni afiinsuskromato-graafia (IMAC, immobilized metal ion affinity chromatography,) põhineb aminohapete tugevale interaktsioonile metalliioonidega koordinatiivsete sidemete tekkimise kaudu. Statsionaarseks faasiks on kandjale seotud kelaadi vormis metalliioonid. Enamkasutatavad on nikkel, koobalt ja vask histidiini sisaldavate valkude puhastamiseks ning raud, tsink või gallium fosforüülitud valkude ja peptiidide puhastamiseks. Reeglina on kromatografeerimisprotsessid aeglased ja labiilsete komponentide koostises võivad toimuda muutused. Samuti on oht proovi komponentide hajumiseks kolonni läbimise vältel, mistõttu lahutusvõime langeb. Kaasajal kasutatakse laialdaselt kõrgsurve-vedelikkromatograafia meetodit (HPLC, high-performance liquid chromatography). Sellega saavutatakse kõrge lahutusvõime tänu väga väikeste (3–5 µm), sfääriliste ja võimalikult ühesuuruste kandjaosakeste kasutamisele, mille puhul vedeliku kolonnist läbisurumiseks rakendatakse rõhku suurusjärgus 50–700 atm. Mõistetavalt kasutatakse HPLC-s tugevaid metallkolonne. Tulemuseks on segu komponentide väga hea lahutumine ja protsessi kiirenemine tundidelt minutiteni.

Üheks kolonnkromatograafia edasiarenduseks on kapillaarkolonnide kasutuselevõtmine. Kapillaarkolonn on täidiseta pikk metall-, klaas- või kvartstoru läbimõõduga 0,2–0,6 mm, mille sisepinnale on kantud õhuke vedelikukiht, milles toimub ainete lahutumine. Siit tuleneb ka meetodi nimetus – kapillaarkormatograafia. Kapillaarkromatograafia meetod võimaldab kiiremat, efektiivsemat ja kõrgema saagisega lahutamist võrreldes traditsiooni-liste kolonnkromatograafia meetoditega. Peale kromatograafiakolonni voolutamist analüüsitakse lahutunud aineid sobival meetodil. Ainete kvantitatiivset analüüsi eluaadi fraktsioonides vōib läbi viia mitmel meetodil:

Ø mõõtes optilist tihedust nähtavas e visuaalses (VIS) või ultraviolettkiirguses (UV), Ø mõõtes murdumisnäitajat (RI - refractive index), Ø kasutades keemilise analüüsi meetodeid erinevate ainete identifitseerimiseks, Ø kasutades immunoreaktiivseid meetodeid.

37

Paber- ja õhukes kihi kromatograafia puhul võib: Ø mōōta laikude värvuse intensiivsust VIS/UV-kiirguse piirkonnas otse kromato-

graafilisel plaadil, kasutades vastavaid seadmeid, Ø elueerida ühendi laigu kromatograafiliselt plaadilt või paberilt ja analüüsida seda

mistahes sobival meetodil.

Valik kromatograafiaalaseid mõisteid

• Adsorptsioon – pinnanähtus, mille puhul aine molekulid kogunevad nõrkade van der Waalsi jõudude toimel tahke aine (adsorbendi) pinnale; vastupidine protsess on desorptsioon.

• Eluent ehk vooluti – lahusti või lahustite segu lahutatavate ainete proovi kolonnist läbivoolutamiseks.

• Eluaat – kolonnist väljuv vedelik, reeglina kogutakse fraktsioonidena. • Kromatograaf – kompleksne seade, mida kasutatakse ainete segu

kromatograafiliseks lahutamiseks koos tulemuste registreerimisega. • Kromatografeerimine – ainete lahutamise protsess mingi kromatograafilise

meetodi abil. • Kromatograafiline kolonn – metallist, klaasist või kvartsklaasist kolonn, milles on

liikumatu faas ja milles toimub segu komponentide lahutumine. • Kromatogramm – kromatografeerimisprotsessi visuaalne väljund, reeglina

kolonnist väljuvate komponentide kontsentratsioonide ja retentsiooniaja vaheline sõltuvus; geelkromatograafias ainete kontsentratsioonide ja eluaadi mahu vaheline sõltuvus.

• Liikumatu faas ehk statsionaarne faas – kromatograafilise kolonni tahke peeneteraline täidis või täidisele (kandjale) kantud vedelik

• Liikuv faas ehk mobiilne faas – lahutatava ainete segu kolonnist läbijuhtimiseks kasutatav gaas (kandegaas), vedelik või ülekriitiline fluidum.

• Retentsiooniaeg – ainele iseloomulik kolonni läbimise aeg (sisestusest kuni detektorini) antud kromatografeerimise tingimuste juures.

38

2.B Spektroskoopilised meetodid

Kaasajal kasutatakse ainete identifitseerimiseks, struktuuri uurimiseks, kvantitatiivseks analüüsiks ja puhtuse määramiseks väga erinevaid spektroskoopilisi meetodeid, mis kõik on seotud teatud lainepikkusega (või sagedusega) elektromagnetilise kiirguse toimega uuritavale ainele. Elektromagnetilise kiirguse puhul on tegemist laine kujul edasikantava energiaga, mis levib valguse kiirusega ja mille liigid erinevad vaid lainepikkuse ja võnke-sageduse poolest. Kehtib võrrand c = ν ⋅ λ,

kus c – valguse kiirus, ≅ 3 108 m/s; ν - võnkesagedus, s-1 = Hz; λ - lainepikkus, m

Spektroskoopilise meetodi tüüp sõltub ainele toimiva kiirguse lainepikkusest ja mõõdetavast füüsikalisest parameetrist ning vastavalt sellele eristatakse:

• elektronspektroskoopiat (UV/Vis spektroskoopia) , • infrapunaspektroskoopiat (IR-spektroskoopia), • tuumamagnetresonants-spektroskoopiat (TMR), • elektronparamagnetresonants-spektroskoopiat (EPM), • fluorestentsspektroskoopiat, • fotoelektron- ehk fotoemissioonspektroskoopiat, • mass-spektromeetriat (MS) jt.

Spektroskoopia meetodeid, mis baseeruvad elektromagnetilise kiirguse neeldumisele ehk absorptsioonile uuritavas aines tuntakse absorptsioonspektroskoopia nime all. Mõõde-tavaks parameetriks on absorptsioonspektroskoopia puhul aines absorbeerunud energia intensiivsus (= tugevus). Eristatakse omakorda aatomabsorptsioonspektroskoopiat ja molekulaarset spektroskoopiat, mille liikideks on:

• infrapunaspektroskoopia (IR-spektroskoopia), • ultraviolett-nähtava valguse spektroskoopia (UV/Vis-spektroskoopia), • mikrolaine-spektroskoopia.

Biokeemia praktikumi raames leiab kasutamist UV/Vis-spektroskoopia, mida rakendatakse ühendite identifitseerimisel, segude analüüsil ja reaktsioonide kineetika uurimisel. Energia absorbeerumisega kaasneb süsteemi (molekuli, aatomi) üleminek energeetilisest miinimumolekust – normaalolekust (ground state) kõrgema energiaga ergastatud olekusse (excited state). Viimane on lühiajaline ja üsna pea vabastab süsteem energia, pöördudes madalamale energianivoole tagasi. Energia vabaneb kas soojusena, mis kandub naabermolekulidele, või valgussähvatusena (fluorestsentsina). Kui emiteeruv energia on

39

piisavalt suur, võib aset leida keemilise sideme katkemine või elektroni lahkumine ja iooni tekkimine.

Molekulid neelavad energiat valikuliselt – neelduvad need valguskvandid, mille energia võrdub normaal- ja ergastatud oleku orbitaalide energiate vahega. Mida väiksem on see erinevus, seda pikalainelisem kiirgus aines neeldub, mida suurem – seda lühilainelisem. Suurimat energiat nõuab s-elektronide üleminek. Molekuli võime kiirgust neelata tuleneb summaar-selt kõigist molekulis olevatest sidemetest, kuid kiirguse valikulist neeldumist, s.t teatud

lainepikkusega kiirguse eriti intensiivset absorptsiooni, põhjustavad molekuli teatud struktuursete fragmentide, nn kromofooride elektronide üleminekud. Kromofoorideks on süsinikuaatomite vahelised kordsed sidemed (>C=C<; -C≡C-) ja paljud funktsionaalsed grupid, kus jaotumata elektronpaari omav aatom on seotud naaberaatomiga kordse sidemega (-COOH, >C=O, >C=S, >C=N, -C≡N). Need ühendid, mis sisaldavad ainult s-elektronide paari poolt moodustatud σ-sidemeid (alifaatsed alkaanid ja tsükloalkaanid), ei neela kiirgust UV/Vis-spektroskoopias üldkasutatavate seadmete tööpiirkonnas 200–800 nm, mistõttu nad sobivad kasutamiseks lahustitena.

40

Absorptsioonspektroskoopia baseerub Lambert’i ja Beer’i seadustele, mida kirjeldavate võrrandite kombineerimisel on saadud järgmine võrrand:

I = Io ⋅10 - ε⋅c⋅l , kus

I – proovi läbinud valguse intensiivsus, Io – langeva valguse intensiivsus. Selle võrrandi teisendamise ja logaritmimise teel on saadud Lambert-Beer’i võrrand üldtuntud kujul:

A = log Io / I = l ⋅ c⋅ ελ, kus

A – absorbtsioon, dimensioonita suurus NB! Nimetatakse ka optiline tihedus (tähis D või OD), kuid soovitatav on kasutada terminit absorbtsioon. l - uuritava aine lahuse kihi paksus ehk optilise tee pikkus (küveti paksus), cm c - aine kontsentratsioon lahuses, M ελ - uuritava aine ekstinktsioonitegur lainepikkusel λ. NB! Tähistatakse ka Ε λ1cm. Ekstinktsiooniteguri ελ (või Ε λ

1cm) dimensioon sõltub aine kontsentratsiooni väljendamisel kasutatavast ühikust. Molaarse kontsentratsiooni (M) ja 1 cm lahuse kihi (küveti paksuse) korral on ühikuks M-1⋅cm-1 ja tegurit nimetatakse molaarseks ekstinktsiooniteguriks e molaarseks ekstinktsioonikoefitsiendiks. Molaarne ekstinktsioonitegur näitab uuritava aine 1-molaarse lahuse absorptsiooni lainepikkusel λ, kui lahuse kihi paksus on 1cm. Mõõtes kiirguse neeldumist sōltuvusena lainepikkusest λ moodustub absorptsiooni- ehk neeldumisspekter. Aine neeldumisspekter märgitakse üles lainepikkuse λ ja absorptsiooni A vahelise sõltuvusena või ka lainepikkuse λ ja ekstinktsiooniteguri ελ vahelise sõltuvusena. Kõige üldisemal juhul saadakse neeldumisspekter sel viisil, et uuritava aine lahus (= proov) asetatakse kiirgusallika ja vastuvõtja vahele ja viimane registreerib proovi läbinud valguse intensiivsust (I), võrreldes seda proovile langeva valguse intensiivsusega (I0). Täpsete mõõtmistulemuste saavutamiseks muundatakse proovi läbinud kiirgus elektrivooluks.

41

Elektromagnetkiirguse UV (200–400 nm) ja Vis osas (400–800 nm) mõõdetud neeldumisspekter kannab ka elektronspektri nime. Nende lainepikkuste piirkonnas on valgusenergia sedavõrd suur, et üheaegselt aatomite elektrontiheduse ümberjaotumisega kutsub ta esile ka nende võnkeid ja pöörlemist, mistõttu neeldumisspektris on kitsaste joonte asemel näha laiu triipe.

Spektril eristuvaid neeldumismaksimume („tippe“) iseloomustatakse absorptsiooni (A) või ekstinktsiooniteguri (ε või Ε) väärtusega ja lainepikkusega (λmax). Kuna igal ainel on unikaalsed neeldumismaksimumid, saab neeldumisspektreid kasutada ka ainete identifitseerimiseks.

42

Kasutatavad instrumendid

Spektroskoopilisteks uuringuteks kasutatavate seadmete üldnimetuseks on spektromeeter, kuid seadmeid, mis võimaldavad mõõta valguse intensiivsust (fotomeetrid) funktsioonina lainepikkusest, nimetatakse spektrofotomeetriteks. Spektrofotomeetrite oluliseks karakteristikuks on mõõtmiseks kasutatava kiirguse lainepikkuste intervall (riba laius) ja absorbtsiooni mõõtmise lineaarne piirkond (ulatus).

Ained, mille neeldumismaksimum(id) on nähtava valguse piirkonnas, st 400–800 nm, näivad silmale värvilised ja absorptsiooni mõõtmiseks selliste ainete lahustes võib kasutada lihtsaid spektrofotomeetreid, mida nimetatakse kolorimeetriteks (color – värvus). Neis seadmetes eraldatakse mõõtmiseks kasutatav spektririba valgusallikast lähtuvast kiirgusest filtrite abil. Proovi läbiva valguse detektorina kasutatakse fotoelementi, milline genereerib elektrivoolu, mis on proportsionaalne talle langeva valguse intensiivsusega. Voolutugevust mōōdetakse galvanomeetriga, mis on logaritmiliselt kaliibritud absorbtsiooni (optilise tiheduse) ühikutes.

Täiuslikumad spektrofotomeetrid võimaldavad töötada elektromagnetkiirguse spektri erinevates osades – nii nähtava-, ultraviolett- kui ka lähis-infrapunase kiirguse piirkonnas. Nad sisaldavad monokromaatorit (prisma või difraktsioonivõre), mis suunab mõõtesüsteemi vaid kitsa sagedusriba, mille keskväärtus on arvuliselt mõõdetav. Nähtava valguse piirkonnas töötamisel on valgusallikaks hõõglamp ning töötada võib klaasküvettidega. Ultraviolett-piirkonnas töötamisel on kiirgusallikaks deuteeriumlamp ja kasutatakse kvartsküvette, kuna harilik klaas neelab tugevalt kiirgust lainepikkustel alla 330 nm. Läbiva valguse intensiivsuse detekteerimiseks kasutatakse spektrofotomeetrites fotokordistit vōi fotolampi. Järgneb signaali elektrooniline vōimendamine. Lōplik signaal registreeritakse absorptsiooni ühikutes kas mōōteriista osuti kõrvalekaldena, kaasaegsetes seadmetes aga digitaalsel kujul või väljatrükituna. Ehituselt jagunevad spektrofotomeetrid ühe- ja kahekiirelisteks seadmeteks. Ühekiirelistel spektrofotomeetritel paigutatakse valgusallikast lähtuva kiire teele vaheldumisi kontroll- ehk võrdlusproov ja uuritav(ad) proov(id). Kahekiirelistel riistadel on ühest valgusallikast lähtuv kiir jaotatud kaheks, mis võimaldab mõõta proovi optilist tihedust otseselt kontroll- ehk võrdlusproovi suhtes. Kahekiirelised seadmed on sobivamad ainete neeldumisspektrite võtmiseks. Siintoodud joonisel on esitatud ühekiirelise spektrofotomeetri optilise süsteemi skeem.

43

Tüüpilise spektrofotomeetri välimus

Ühekiirelise spektrofotomeetri optiline süsteem

NB! Enne tööleasumist tuleb alati tutvuda konkreetse spektrofotomeetri tööpõhimõttega ja omandada seadme kasutamiseks vajalik vilumus.

Aine kontsentratsiooni spektrofotomeetrilise määramise üldpōhimōtted

Spektrofotomeetria on ülimalt tundlik meetod väikeste ainekoguste tuvastamiseks, identifitseerimiseks ja kvantitatiivseks määramiseks. Neeldumisspektri kuju iseloomustab aine molekuli ehitust ja on seega ainele tunnuslik. Absorptsiooni (A) väärtus teatud lainepikkusel võimaldab määrata aine kontsentratsiooni lahuses.

44

Lihtsustatult võib öelda, et kiirguse neeldumine (absorptsioon) spektri pikalainelises osas suureneb konjugeeritud kaksiksidemete, aromaatsete tuumade ja vabu elektronpaare omavate aatomite sisalduse puhul molekulis. Elektrolüütiliselt dissotseeruvate ainete spektrid sõltuvad oluliselt ka lahuse pH väärtusest. Selleks, et teada saada aine kontsentratsiooni uuritavas lahuses (ctundm) võib toimida mitmeti.

• Mõõdetakse lahuses sisalduva tundmatu kontsentratsiooniga aine absorptsiooni väärtus A lainepikkusel λ. Teatmekirjandusest leitakse lahuses sisalduva aine molaarse ekstinktsiooniteguri väärtus ελ (Ελ) samal lainepikkusel. Aine kontsent-ratsioon lahuses arvutatakse lähtuvalt Lambert-Baar’i võrrandist

A = c · l · ε c = A / (l · ε)

Reeglina l = 1cm, seega c = A / ε

• Kui lahuses sisalduva, tundmatu kontsentratsiooniga (ctundm) aine ekstinktsiooni-

teguri väärtus pole teada, siis võib ctundm leidmiseks kasutada võrdlusmeetodit. Sel puhul vōrreldakse teatava lainepikkusega λ valguse absorptsiooni uuritavas lahuses ja sellises lahuses, milles vaadeldava aine kontsentratsioon on teada (nn standard-lahus). Kuna Beer'i seadusest tulenevalt kehtib sõltuvus

Atundm / Ast = ctundm / cst, siis saab aine kontsentratsiooni uuritavas lahuses arvutada sõltuvusest

ctundm = (Atundm / Ast ) • cst

Täpsemate tulemuste saamiseks ei piirduta sageli ühe standardi absorptsiooni mōōtmisega, vaid valmistatakse tuntud kontsentratsioonidega standardlahuste seeria (3–4 lahust) ja mõõdetakse nende absorptsiooni väärtused. Mõõtmistulemuste alusel ehitatakse kaliibrimissirge A = f(cst), mis vōimaldab ühtlasi kontrollida, kas Beer'i seadus on uuritava süsteemi jaoks rakendatav (kas A ja c vahel valitseb lineaarne sõltuvus). Kui sõltuvus on lineaarne, siis võimaldab kaliibrimissirge uuritava lahuse absorbtsiooni väärtuse Atundm järgi teada saada sellele vastava aine kontsentratsiooni ctundm (joonisel näidatud punaste nooltega).

Kontsentratsioon, c

45

NB! Spektrofotomeetriliselt mõõdetavad lahused peavad olema optiliselt selged. Lahuses olevad osakesed hajutavad osa valgusest ja nii osutub, et proov neelab tegelikust rohkem valgust. Hajutamise ulatus oleneb valguse lainepikkusest – lühema lainepikkusega kiirgus on rohkem hajutatav.

Kaliibrimissirge näidis

Abs

orpt

sioo

n, A

0

0,

1

0,2

0

,3

0,4

0

,5

46

2.1 AINETE SEGU LAHUTAMINE GEELKROMATOGRAAFIA MEETODIL

Teooria

Geelkromatograafia e geelfiltratsioonkromatograafia on üks kromatograafia meetoditest, mille põhimõtteks on lahuses sisalduvate ainete lahutamine e fraktsioneerimine nende molekulmassi suuruse järgi. Meetodit tuntakse ka molekulaarsōelte, aga samuti eksklusioonkromatograafia nime all. Lahuses sisalduvad, erineva molekulmassiga ained liiguvad läbi peeneteralise, võimalikult ühesuguse poorsusega geeli erineva kiirusega. Geelkromatograafiat kasutatakse makromolekulide (bio- või tehispolümeerid) lahutamiseks, lisandite eemaldamiseks, soolade eraldamiseks või puhvri vahetamiseks, kusjuures proov transporditakse läbi kolonni vesilahuse abil.

Segu geelkromatograafilise lahutamise põhimõte

Geelkromatograafias viiakse protsess läbi kinnises süsteemis – kolonnis (vt Kromatograafilised meetodid), mis on täidetud pundunud geeligraanulitega, mille pooride mõõtmed on samas suurusjärgus lahuses sisalduvate makromolekulide dimensioonidega. Kuna geeligraanuli pooride suurust ületavate mõõtmetega molekulide tungimine graanulitesse on välistatud (inglise k excluded), siis siit ka nimetus eksklusioon-kromatograafia.

47

Geelkromatograafias kasutatavad geelid koosnevad kas dekstraanist (glükoosi polümeer, mida sünteesib bakter Leuconostoc mesenteroides), agaroosist (lineaarne punavetikate polüsahhariid, mis koosneb D-galaktoosist ja 3,6-anhüdro-L-galaktoosist) vōi polüakrüülamiidist. Viimane on kopolümeer, mille akrüülamiidist (CH2=CH-CO-NH2) koosnevate lineaarsete ahelate vahele on tekitatud ristsidemed N,N'-metüleen-bis-akrüülamiidi (CH2=CH-CO-HN-CH2-NH-CO-CH=CH2) abil. Kõige enam kasutatavate geelfiltratsioonimaterjalide iseloomustus on toodud juuresolevas tabelis. Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad järgmised mahud (vt joonist):

Ø kolonni vaba maht ehk graanulitevahelise vedeliku maht (Vv), Ø graanulitesisese vedeliku maht (Vs), Ø geelimaterjali ehk maatriksi maht (Vg), Ø täidise kogumaht ehk üldmaht (Vt).

Seega: Vt = Vv + Vs + Vg

Geelfiltratsioonimaterjalide iseloomustus

Materjal Mark Fraktsioneerimispiirkond, daltonit (D)

Dekstraan

Sephadex

G-10 50–700

G-25 1000–5000

G-50 1000–30000

G-75 3000-80000

G-100 4000–150000

G-200 5000–600000

Akrüülamiid

Bio-Gel

P-2 100–1800

P-6 1000–6000

P-10 1500–20000

P-30 2400–40000

P-100 5000–100000

P-300 60000–400000

Agaroos

Sepharose

6B 10 000–4 • 106

4B 60 000–20 • 106

2B 70 000–40 • 106

48

Kui läbi geelkromatograafia kolonni juhtida erineva molekulmassiga ainete segu, siis molekulid lahutuvad üksteisest vastavalt nende suurusele, st vastavalt molekulide võimele difundeeruda geeli pooridesse. Selleks, et uuritavat ainete segu läbi kolonni transportida ja et erineva molekulmassiga ained saaksid üksteisest eralduda, voolutatakse (elueeritakse) kolonni sobiva vesilahusega (puhver, soolalahus vm) ja kolonnist väljuvat lahust ehk eluaati kogutakse kindla mahuga fraktsioonide kaupa. Fraktsioonides sisalduvate ainete kontsentratsiooni kindlakstegemiseks kasutatakse mitmeid füüsikalisi ja keemilisi analüüsi meetodeid. Iga ainet, mis uuritavas segus sisaldub, iseloomustab elueerimis- ehk väljumismaht Vx, mille arvväärtus sõltub aine molekulmassist ja kasutatava kolonni parameetritest. Erineva molekulmassiga ainete väljumismahte tähistatakse vastavalt Vx1, Vx2, Vx3 jne.

Uuritavas segus sisalduva aine x väljumis- ehk elueerimismaht Vx on selline eluaadi maht, mille juures kolonnist väljub fraktsioon, milles vastava aine kontsentratsioon on maksimaalne.

Kui segus leidub molekule, mis on liiga suured mahtumaks kolonni täitva geeli pooridesse, siis väljuvad nad kolonnist esimesena (kõige kiiremini), st minimaalse elueerimismahuga Vx

min, mis on võrdne kolonni vaba mahu ehk graanulitevahelise vedeliku mahuga. Vx min = Vv

Ained, mille molekulmass on küllalt väike, et täielikult difundeeruda geeli pooridesse, liiguvad kolonnis kõige aeglasemalt ja väljuvad maksimaalse elueerimismahuga Vx

max, milline on arvväärtuselt lähedane kasutatava kolonni kogumahule Vt.

Geelkromatograafia kolonni iseloomustavad mahud

49

Seega võib kromatografeerimise protsessi lugeda lõpetatuks, kui kolonnist väljunud vedeliku (eluaadi) üldmaht võrdub ligikaudu kolonni kogumahuga.

Vxmax ≅ Vt

Kui geelimaatriksi maht Vg on teada, siis vōib maksimaalse elueerimismahu Vx

max ka arvutada.

Vx max = Vt – Vg

Seega – kasutatava geelkromatograafia kolonni iseloomustamiseks on vaja teada kahte olulist parameetrit:

Ø kolonni vaba mahtu Vv (= Vxmin), s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad

molekulid, mis antud geeli pooridesse ei mahu, Ø maksimaalset elueerimismahtu Vx

max, s.o eluaadi mahtu, millega väljuvad need molekulid, mis antud geeli graanulitesse täielikult sisenevad.

Neid aineid, mille molekulid suudavad difundeeruda kasutatava geeli pooridesse ja mille elueerimismaht Vx vaadeldavas kolonnis on kindlaks määratud, iseloomustatakse liikuvusteguriga Rf, mis arvutatakse vastavalt valemile:

Rf arvväärtused jäävad vahemikku 0....1 (0 < Rf < 1).

Eluaadi fraktsioonides sisalduva aine kontsentratsiooni ja eluaadi mahu vahelist graafilist sõltuvust nimetatakse kromatogrammiks. Kui kromatografeerimissüsteemi kuulub

automaatse töörežiimiga analüsaator koos isekirjutajaga, siis saadakse kromato-gramm isekirjutajalt. Antud töös tuleb kromatogramm katseandmete alusel käsitsi koostada.

Allpool on toodud näidiskromatogramm kolmekomponentsele segule, millel on näha suurte, geeli pooridesse mitte-mahtuvate (aine 1), geeli pooridesse osaliselt difundeeruvate (aine 2) ja pooridesse täielikult difundeeruvate (aine 3) molekulide elueerumisprofiilid.

Rf = (Vx – Vx

min) / (Vxmax – Vx

min)

50

Ainete väljumis- ehk elueerumismahtusid näitavad nende fraktsioonide elueerumis-mahud, milles vastava aine kontsentratsioon on kõige kõrgem („tipule” vastav maht).

Tüüpiline kromatografeerimissüsteem koosneb kolonnist, eluendi reservuaarist ja automaatsest fraksioonikogurist ehk kollektorist (vt joonis). Kolonni ülaosa on suletud korgiga, mida läbib klaastoru, mis ühendatakse kolonnist kõrgemal asetseva eluendi reservuaariga. Sellisel juhul algab kolonni väljavoolukraani avamisel kohe eluendi pealevool kolonni täidisele ja fraktsioonikoguri käivitamisel ka automaatne fraktsioonide kogumine. Kuna antud praktikumis viivad segude geelkromatograafilist lahutamist korraga läbi mitu üliõpilast, siis pole automaatse kromatografeerimissüsteemi kasutamine otstarbekas.

Tüüpiline kromatografeerimissüsteem.

Praktikumis kasutatakse klaaskolonne, mis juba eelnevalt on täidetud pundunud dekstraangeeliga Sephadex. Meie töös uuritavate ainesegude lahutamiseks sobivad reeglina väiksema poorsusega (tihedamad) Sephadex’i margid, mis on samas ka mehaaniliselt tugevamad ja võimaldavad kolonni kiiret voolutamist. Vältimaks täidise väljavoolamist on kolonni alumine, kooniline osa täidetud klaasvillaga. Kolonn on kinnitatud statiivi külge sellisele kõrgusele, et selle alla mahuks katseklaas. Täidise kōrgus

51

kasutatavates kolonnides on tavaliselt 25–30 cm, täidise kohal on reeglina 3–4 cm paksune vaba eluendi kiht. Eluendi lisamine kolonni ja eluaadi fraktsioonide kogumine toimub käsitsi. Ainete kontsentratsioonide kindlakstegemiseks eluaadi fraktsioonides kasutatakse käesolevas töös spektrofotomeetrilist meetodit (vt 2B. Spektroskoopilised meetodid).

Töö käik

Kolonni iseloomustamine ja ettevalmistamine

• Kontrollitakse kolonni vertikaalsust ja vajadusel korrigeeritakse kolonni asendit. • Märgitakse üles kasutatava kolonni täidiseks oleva Sephadex’i mark ja seda ise-

loomustav tegur k, mille väärtus sõltub kasutatava geeli pundumisastmest. • Mõõdetakse geelisamba (täidise) kõrgus L ja ja diameeter d, kasutades sobivat

joonlauda. NB! Täidise diameetri mõõtmine eeldab kolonni sisediameetri võimalikult täpset määramist nihkkaliibri või joonlaua abil.

• Arvutatakse täidise kogumaht Vt. • Arvutatakse geelimaatriksi maht Vg = k • Vt ja sellest lähtuvalt kolonni iseloomustav

maksimaalne elueerimismaht Vxmax = Vt – Vg.

• Arvutatakse fraktsioonide üldarv n, arvestades ühe fraktsiooni mahuks 2 ml; seega n = Vx max / 2.

• Katseklaasistatiivi asetatakse fraktsioonide arvule vastav hulk kindla mahu järgi (2ml) kaliibritud katseklaase ja nummerdatakse.

• Kolonni lähedusse paigutatakse voolutuslahuse (eluendi) pudel ja märgitakse üles voolutuslahuse koostis. Varutakse sobiva mahuga (20 ml, 25 ml) pipett, millega voolutuslahust kolonni viia.

• Varutakse väike (50 ml) keeduklaas või seisukolb, kuhu kogutakse kolonni täidise pinnal olev eluent, mis enne uuritava segu sisestamist tuleb kolonnist välja lasta.

Segu komponentide lahutamine.

Kui ülalkirjeldatud ettevalmistused on tehtud, avatakse ettevaatlikult kolonni väljavooluava ja täidise kohal olev voolutuslahus hakkab aeglaselt kolonni alla asetatud anumasse tilkuma. Samal ajal reguleeritakse kolonni voolukiirus reguleerimisklambri abil piiridesse 0,7–1,0 ml/min, mis tähendab, et iga 2-milliliitrise fraktsiooni kogumise ajaks peaks kujunema 2–3 minutit. NB! Voolukiirus peab olema optimaalne, et tsooni laienemist põhjustava massiülekande ja difusiooni mõju lahutuvusele oleks võimalikult väike.

52

Kui vedeliku tase kolonnis langeb täidise pinnani, suletakse kiiresti kolonni väljavooluava ja kolonn on valmis uuritava proovi sisestamiseks. Kogutud lahust pole vaja säilitada ega selle mahtu mõõta. NB! Mingil juhul ei tohi lasta kolonni kuivaks joosta, st. tuleb vältida , et vedeliku nivoo ei langeks geelipinnast allapoole ja ōhk ei tungiks geelikihti! Proovi sisestamine Uuritava segu doseerimiseks ja kolonni sisestamiseks kasutatakse sobiva mahuga (1 ml) mõõtpipetti või süstalt, mille otsas on tükike peenikest voolikut. Pipeti või süstlaga võetakse juhendaja poolt soovitatud kogus (reeglina 0,5 või 1 ml) uuritavat proovi ja see viiakse kolonni, juhtides pipeti otsa vastu kolonni seina või jättes umbes 5 mm kaugusele geeli pinnast. Proov lastakse voolata (tilkuda) geeli pinnale nii, et see seal võimalikult ühtlaselt jaotuks. NB! Proovi sisestamise ajal hoitakse kolonni väljavooluava suletuna! Hea lahutuvuse saavutamiseks tuleb silmas pidada järgmist:

• Enne proovi pealekandmist peab kolonn olema tasakaalustatud puhvriga, milles segu lahutamine läbi viiakse. Antud praktikumis on kolonnid eelnevalt tasakaalus-tatud.

• Proovi optimaalne maht on 0,5–5% täidise koguruumalast. • Geelkromatograafia meetodi puhul proov lahjeneb lahutamise käigus.

Uuritavad segud

Reeglina koosnevad segud 3–4 erineva molekulmassiga komponendist, mis on lahustatud destilleeritud vees, sobivas puhvris või nõrgas NaCl lahuses. Meie praktikumis uuritavates segudes on kas kõik või enamik aineid värvilised, et segu komponentide lahutumine kolonnis oleks ka visuaalselt jälgitav ja geelkromatograafia põhimõte arusaadavam. Ühe komponendina sisaldavad praktikumis uuritavad segud alati dekstraansinist, mis elueerub minimaalse väljumismahuga ja mille järgi saame teada kasutatava kolonni vaba mahu (Vx

min = Vv ). Dekstraansinine on kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2•106), mille külge on kovalentselt seotud sinine värvaine, mistõttu ta omab neeldumismaksimumi λmax lainepikkusel 625 nm. Allpool on toodud mõned uuritavate segude näidisvariandid. NB! Teile uurimiseks antud segu koostis ei pruugi vastata siintoodutele. Selle leiate proovi sisaldava kolvi etiketilt ja see tuleb kindlasti üles märkida.

53

Variant A – kolmekomponentne suure tihedusega proov. 1. Dekstraansinine – kõrgmolekulaarne dekstraan (Mr = 2 • 106), λmax = 625 nm. Soovitatav kontsentratsioon 2,5 mg/ml. 2. Kaaliumkromaat – madalmolekulaarne (Mr = 194) aine, mis täielikult difundeerub geeli pooridesse; λmax = 375 nm. Kontsentratsioon 5 mg/ml. 3. Tsütokroom C – madalmolekulaarne, heemi sisaldav valk (Mr = 12 500), mis tänu heemile on värviline (kromoproteiin), λmax = 550 nm. Kontsentratsioon 3 mg/ml. Proovi lahustina kasutatakse 0,15 M NaCl lahust 0,5 M sahharoosi lisandiga. Sahharoosi (Mr = 342) lisatakse tiheduse suurendamiseks, et proov moodustaks kolonni sisestamisel geeli pinnale vooluti alla õhukese kihi. Kolonni voolutamine toimub 0,15 M NaCl lahusega.

Variant B – kolmekomponentne proov. 1. Dekstraansinine (Mr = 2 • 106), 2 mg/ml 2. Broomfenoolsinine (Mr = 670), 40 µg/ml 3. Uuritav valk, 10 mg/ml Proovi lahustina ja kolonni elueerimiseks võib kasutada 0,15 M NaCl lahust.

Kui kasutatav kolonn on eelnevalt kaliibritud valkudega, milliste molekulmassid on teada, siis on võimalik uuritavas proovis sisalduvat valku molekulmassi järgi kindlaks teha. Olgu näiteks toodud variant, kus uuritava segu lahutamine on läbiviidud Sephadex G-100 kolonnis. Valkude jaoks on selle geeli eksklusioonipiirkond umbes 100 000. Sellisel juhul saab uuritavas segus sisalduva tundmatu valgu identifitseerimiseks kasutada tabelis esitatud andmete alusel ehitatud kaliibrimissirget, mille x-teljel on siintoodud valkude (standardvalkude) Rf väärtused ja y-teljel log Mr.

Valkude jaotumine Sephadex G-100 kolonnis

Valk Molekumass (Mr, kDa) Rf väärtus

Veise albumiin 69 0,21 Ovalbumiin 43 0,32

Kümotrüpsinogeen A 25 0,48 Müoglobiin 16 0,55

Tsütokroom C 12 0,65

54

Uuritavas segus sisalduva valgu Rf väärtuse järgi saab graafikult leida tema molekulmassi ja selle alusel valgu identifitseerida. NB! Kui teie kasutasite oma töös mingit teist marki Sephadex’iga täidetud kolonni, milles standardvalkude Rf väärtused pole määratud, siis antud sõltuvus ei kehti ja valgu identifitseerimine pole võimalik.

Valik tuntud molekulmassiga valke

Valk Molekulmass, Da

Tsütokroom C 11 700 Müoglobiin 16 800 Trüpsinogeen 24 000 Ovalbumiin 45 000 Hemoglobiin 64 000 Veise seerumi albumiin 66 000 Transferritiin 74 000 Immunoglobuliin G 158 000 Fibrinogeen 341 000 Ferritiin 470 000 Türoglobuliin 670 000

Kolonni voolutamine

Peame silmas, et seni, kuni kolonni alaossa jõuab kõige kiiremini liikuv komponent (dekstraansinine), väljub kolonnist puhas vooluti, mis täidab geeliterade poore ja teradevahelist ruumi. Selle kogumine 2 ml-te fraktsioonidena pole otstarbekas. Seetõttu võib selle osa eluaadist (ei sisalda uuritava segu komponente) koguda ühendatud fraktsioonina, milleks enne voolutamise algust asetatakse kolonni väljalaskeava alla 100 ml kuiv kolb. NB! Ärge unustage mōōtmast ühendatud fraktsiooni mahtu! See moodustab osa kogu elueerumismahust ja tuleb kromatogrammi koostamisel arvesse võtta. Mahu mõõtmiseks kasutatakse sobiva suurusega mõõtsilindrit.

Olles proovi eelkirjeldatud viisil geeli pinnale kandnud, avatakse väljavool kolonnist ja eluaati hakatakse koguma ülalnimetatud kolbi. Niipea kui proov on täidisesse sisenenud, viiakse kiiresti (NB! Õhk ei tohi kolonni täidisesse sattuda!) pipeti abil geeli pinnale väike

55

kogus (0,5–1 ml) voolutuslahust ja lastakse täidisesse imbuda. Sama korratakse veel teinegi kord ja alles seejärel, kui olete veendunud, et kogu uuritav proov on kolonni sisenenud, võib geeli pinnale kanda suurema hulga voolutit, nii et moodustuks 4–5 cm kõrgune vedeliku kiht. Samas jälgitakse, kuidas liigub kolonnis esimene värviline riba (dekstraansinine). Kui see läheneb kolonni pōhjale, siis eemaldatakse kolonni alt kolb ühendatud fraktsiooniga ja jätkatakse eluaadi kogumist 2 ml mahuga fraktsioonidena kaliibritud ja eelnevalt nummerdatud katseklaasidesse.

Kogu voolutamise vältel tuleb

Ø jälgida, et kolonni täidise kohal oleks piisavalt eluenti ja seda vastavalt vajadusele juurde lisada,

Ø vahetada õigeaegselt katseklaase, et eluaat saaks kogutud täpselt 2 ml fraktsioonide kaupa.

Elueerimise lõpetamise üle võib otsustada kas eluaadi värvituks muutumise järgi (värviliste proovide korral) või eluaadi summaarse mahu järgi, mis ei tohi olla väiksem kui kolonni kogumaht Vt. Kogutavate fraktsioonide üldarv peab vastama varem väljaarvutatule, võttes seejuures arvesse ka kolbi kogutud ühendatud fraktsiooni mahtu.

Fraktsioonide analüüsimine

Antud töös väljendatakse aine kontsentratsiooni igas fraktsioonis lahuse absorbtsiooni ehk optilise tiheduse väärtusena, mida mõõdetakse aine neeldumismaksimumile vastaval lainepikkusel. Lainepikkused, millel mõõtmine läbi viiakse, sõltuvad uuritavate ainesegude koostisest ja need soovitab praktikumi juhendaja. Absorptsiooni mõõdetakse spektrofoto-meetritel, millega töötamiseks tuleb eelnevalt tutvuda meetodi üldpõhimõttega (vt osa Spektrofotomeetria) ja seejärel seadme tööjuhendiga. Mõõtmist alustatakse, kui on saadud praktikumi juhendajalt luba.

Kuna antud töös uuritakse reeglina värvilistest komponentidest koosnevaid segusid, siis mõõdetakse lahuste absorptsiooni (optilist tihedust) elektromagnetilise kiirguse visuaalses (VIS) piirkonnas. Kui segu sisaldab värvusetuid valke, siis nende detekteerimine toimub ultraviolettkiirguse (UV) abil lainepikkusel 280 nm. Värviliste segude puhul mõõdetakse vaid selliste fraktsioonide absorptsiooni, milles võib silma järgi täheldada vähimatki värvust. Täiesti värvusetute fraktsioonide absorptsiooni väärtused võrduvad 0-ga ja neid fraktsioone pole vaja mõõta. Värvusetute segude lahutamisel mōōdetakse kõigi fraktsioonide optilised tihedused, reguleerides spektrofotomeetri vajalikule lainepikkusele.

Koostatakse 3-veeruline katseandmete tabel, mis on aluseks kromatogrammi koostamisele ja töö tulemuste väljatoomisele. Mõõtmistulemused kantakse tabelisse, fikseerides ka

56

värvusetute fraktsioonide numbrid ja elueerumismahud, märkides nende optilise tiheduse väärtuseks 0. NB! Kuna iga segus sisalduva aine optilise tiheduse väärtust mõõdetakse ainele iseloomulikul neeldumismaksimumi lainepikkusel λmax, siis ei tohi unustada spektro-fotomeetrit vastavale lainepikkusele reguleerida!

Katseandmete tabel

Fraktsiooni nr

Elueerumismaht

V, ml

Optiline tihedus, A

Ühendatud fraktsioon

0

1 2 3 ...

Tulemused ja nende interpreteerimine A. Esitatakse kasutatud kolonni iseloomustavad parameetrid:

Ø täidise materjal ja mark, Ø täidist iseloomustav pundumistegur k, Ø täidise kõrgus ja kolonni sisediameeter, Ø arvutatud täidise kogumaht Vt , Ø arvutatud maksimaalne elueerimismaht Vx

max, Ø arvutuslik fraktsioonide üldarv n.

B. Tuuakse ära mõõtmistulemuste tabel ja selle alusel koostatakse kromatogramm, st graafiline sõltuvus, mille x-teljel on eluaadi maht (V, ml) ja y-teljel aine kontsentratsioon, väljendatuna eluaadi vastava fraktsiooni absorptsiooni (optilise tiheduse) väärtusena (tähis A või D).

C. Kromatogrammil näidatakse:

Ø milline on iga segus sisalduva komponendi elueerumisprofiil ja põhjendatakse, miks

komponendid väljusid just niisuguses järjekorras, st selgitatakse, millises oma-vahelises suhtes on komponentide molekulmassid,

Ø milline on eluaadi maht kuni dekstraansinise kōrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vx

min = Vv,

57

Ø milline on eluaadi maht kuni valgu kōrgeima kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vx,

Ø milline on eluaadi maht kolonnist viimasena väljunud komponendi kōrgeima

kontsentratsiooniga fraktsiooni (kaasa arvatud) väljumiseni Vxmax.

D. Viimasena väljunud komponendi elueerumismahtu võrreldakse arvutusliku Vx

max

väärtusega. Töö korrektse läbiviimise korral peaksid need kokku langema. Kui eksperimentaalne Vx

max on oluliselt suurem või väiksem arvutuslikust Vxmax-st, siis

analüüsitakse võimalikke põhjusi.

E. Arvutatakse liikuvusteguri Rf väärtus segus sisaldunud valgu jaoks, kasutades Rf arvutusvalemis kolonni arvutuslikku Vx

max väärtust. Kontrollküsimused

1. Mis on kromatograafia, millel see põhineb ja milliseid kromatograafia liike teate? 2. Selgitage geelkromatograafia meetodi põhimõtet. 3. Milline ühine omadus iseloomustab kõiki geelkromatograafia kolonnide täidisena kasutatavaid materjale? 4. Miks ei tohi kolonnist eluaati koguda liiga kiiresti? 5. Kirjeldage, kuidas määratakse aine x elueerumismaht Vx. 6. Mida näitavad kolonni minimaalne ja maksimaalne elueerumismaht? 7. Mis on liikuvustegur Rf ja kuidas seda geelkromatograafia meetodi puhul arvutatakse? Millised on Rf piirväärtused? 8. Mida mõistetakse neelduvuse ehk optilise tiheduse (A ehk D) all? 9. Millistest teguritest sõltub teatava lainepikkuse juures mõõdetud optilise tiheduse väärtus (avaldis vastavalt Beer’i seadusele)? 10. Mis on kromatogramm ja millist informatsiooni see annab uuritava segu koostise kohta?

58

2.2 KAROTENOIDIDE IDENTIFITSEERIMINE JA SISALDUSE MÄÄRAMINE

Teooria

Taimerakkude kloroplastides ja kromoplastides, aga ka mõningates teistes foto-sünteesivates organismides (vetikates, mõnedes seentes ja bakterites) sisalduvad fotosünteesi abipigmentidena karotenoidid. Viimased absorbeerivad valgust klorofüllist mõnevõrra erinevatel lainepikkustel ja on seega täiendavateks kiirguse retseptoriteks.

Karotenoidid on väga arvukas (> 600) ühendite rühm, milliseid keemilise ehituse poolest klassifitseeritakse kui tetraterpenoide (sisaldavad 40 süsiniku aatomit). Struktuurilt on nad polüeensed ahelad, mille ühes või mõlemas otsas on reeglina 6-liikmelised ionoon-tsüklid. Kõige pikema ahelaga karotenoid on lükopeen, milline on ka tähtsaks vaheühendiks paljude teiste karotenoidide sünteesis.Karotenoidide kaks põhigruppi on

• karoteenid – hapnikku mittesisaldavad molekulid, koosnevad ainult süsinikust ja vesinikust; esindajateks on karoteeni α -, β -, γ-, δ-, ζ- jt isomeerid, samuti lükopeen,

• ksantofüllid – hapnikku sisaldavad molekulid; esindajateks luteiin, zeaksantiin jt.

Taimedes täidavad kaotenoidid lisaks põhiülesandele – valguse absorbeerimisele ja klorofüllile edastamisele – ka kaitsvat rolli, neelates liigset valgusenergiat ning kaitstes rakke fotokahjustuste ja vabade hapnikuradikaalide eest.

59

Loomsetele organismidele on neli karotenoidi, α-, β- ja γ-karoteen ning β-krüptoksantiin, vitamiin A eelühenditeks (= provitamiinideks). β-karoteenist tekib kaks, α- ja γ- karoteenist ning β-krüptoksantiinist üks retinaali molekul. Karotenoidide konverteerumine retinaaliks toimub soole mikrofloora poolt produktseeritava ensüümi, karoteeni oksügenaasi, toimel. Vitamiin A-aktiivsust omavad lisaks retinaalile ka retinool, retineenhape ja retinooli estrid.

Vitamiin A (retinaali vormis) esmaseks funktsiooniks on nägemisprotsessi tagamine, luues selleks fotokeemilise aluse. Lisaks sellele toimib vitamiin A antioksüdandina, tõkestades loomorganismides lipiidide oksüdatsiooni, samuti kaitstes silmi kahjuliku sinise ja UV-kiirguse eest. Retinooli metabolismi käigus tekkiv retineenhape toimib transkriptsiooni regulaatorina, mõjutades kasvu ja rakkude diferentseerumist.  Hulkraksetes organismides mängivad karotenoidid, eriti lükopeen ja β-karoteen, tähtsat rolli rakkudevahelises suhtluses, stimuleerides valk konnektsiini ekspressiooni. Viimane moodustab rakumemb-raanides aukliideseid (gap-junction), mille kaudu toimub madalmolekulaarsete ühendite ja ioonide rakkudevaheline liikumine. Sellist tüüpi ühendused on tähtsad rakkude diferentseerumise ja kudede homöostaasi tagamiseks. Retinoidide ületarbimine võib täiskasvanutel põhjustada toksilisuse nähte, rasedatel aga loote arenguhäireid. Kuna loomsed organismid ise karotenoide ei sünteesi, siis tuleb neid omastada taimse toiduga. Karotenoidide imendumiseks peavad nad vabanema taimerakkudest ning konjugeeruma sapphapetega. Karoteeni isomeeridest omab suurimat tähtsust β-karoteen. Looduslikest objektidest isoleerituna esineb β-karoteen punakas-oranžide kristallidena, mis sulavad temperatuuril 183–184 ºC. β-karoteen ei lahustu vees ja vesilahustes, ka etanoolis kui polaarses lahustis on karoteeni lahustuvus küllaltki piiratud, kuid apolaarsetes orgaanilistes lahustites, nagu alifaatsed ja tsüklilised süsivesinikud või nende segud (petrooleeter, bensiin), dietüüleeter jt lahustub β-karoteen hästi. Optilist aktiivsust β-karoteen ei oma.

Kõik karotenoidid on värvilised, kusjuures värvus varieerub kollasest üle oranži kuni tumepunaseni. Mida rohkem karotenoid neelab valgust spektri nähtava osa lühematel lainepikkustel ja peegeldab pikematel lainepikkustel, seda intensiivsem on tema punane värvus. Karotenoidide võime neelata valguskiirgust spektri nähtavas osas (~400...~700 nm) tuleneb nende molekuli ehitusest, mida iseloomustab polüeensus, st molekul koosneb pikast, konjugeeritud kaksiksidemeid sisaldavast süsivesinikahelast.

Uuritava materjali karotenoidset koostist ja sisaldust saab objektiivselt iseloomustada lahuse neeldumisspektri järgi. Viimane kujutab endast absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D, OD) sõltuvust uuritavat lahust läbiva valguse lainepikkusest λ. Puhtal β-karoteenil on apolaarsetes lahustites (heksaanis, petrooleetris jt) iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) spektri sinises piirkonnas 425, 450 ja 480 nm juures.

60

Kui proov sisaldab üheaegselt erinevaid karotenoide, võib neeldumisspekter oluliselt muutuda ja neeldumismaksimumid võivad paikneda nimetatuist erinevatel lainepikkustel. Kui proovis sisaldub samal ajal ka klorofüll, siis on täheldatavad neeldumismaksimumid lainepikkuste ~470 ja ~630 nm juures.

Karotenoidide ja klorofüllide neeldumisspektrid (Absorptsiooni sõltuvus valguse lainepikkusest)

61

Käesoleva laboratoorse töö eesmägiks on karotenoidide eraldamine taimsetest materjalidest, saadud karotenoidide (ja klorofülli) segu neeldumisspektri määramine spektrofotomeetril ja selle alusel:

Ø uuritava materjali karotenoidse koostise analüüsimine ja iseloomustamine, Ø uuritavas objektis domineeriva karotenoidi, β-karoteeni või mõne teise, kont-

sentratsiooni kindlaksmääramine, Ø klorofülli olemasolu kindlakstegemine.

Töö käik

Karotenoidide isoleerimine taimsest materjalist Eelpeenestatud taimsest materjalist, nagu toored juur- ja köögiviljad, tsitrusviljad, männiokkad vm) kaalutakse tehnilistel kaaludel sobiva suurusega kaaluklaasis proov 0,5–2,0 g. Proovi suurus oleneb eelkõige objekti niiskusesisaldusest, samuti karotenoidide kontsentratsioonist selles, mistõttu sobiva suuruse soovitab praktikumi juhendaja. Proovi eelpeenestamine viiakse läbi kas noa või riivi abil. Järgneb lõplik peenestamine uhmris. Selleks viiakse väljakaalutud proov kaaluklaasist ilma kadudeta uhmrisse, lisatakse väike kogus pestud liiva kui abrasiivmaterjali ja hõõrutakse uhmri nuiaga kuni ühtlase massi saavutamiseni. Seejärel lisatakse sinnasamasse väikeste portsjonitena (NB! Ilma kaalumata) veevaba Na2SO4, et taimses materjalis sisalduvat vett siduda, jätkates samal ajal massi hõõrumist. Na2SO4 lõplik kogus sõltub proovi veesisaldusest ja võib ületada proovi kaalutist 5–10-korda. Tuleb jälgida uhmerdatava materjali konsistentsi ja lõpetada soola lisamine, kui on moodustunud kuiv, pulbriline mass.

Järgneb karotenoidide ekstraktsioon (=väljalahustamine) proovist sobiva orgaanilise lahustiga (ekstrahendiga) ja ekstrakti filtrimine. Selleks valitakse sobiva suurusega kuiv

62

anum ekstrakti kogumiseks (soobib 25 ml mõõtsilinder), varustatakse see sobiva suurusega lehtriga ja sellele asetatakse kuiv paberfilter. Seejärel alustatakse ekstraktsiooni, lisades uhmris olevale peenestatud massile väikeste koguste (5-10 ml) kaupa ekstrahenti. NB! Esimene lahusti portsjon peaks olema piisavalt suur (~10 ml), et põhja settinud massi pinnalt oleks võimalik lahust dekanteerida, järgmised kogused peaksid olema väiksemad. Materjali segatakse jätkuvalt uhmri nuiaga, sademel lastakse põhja settida ja selle kohal olev ekstrakt kantakse teelusika abil filtrile, püüdes sadet filtrile mitte viia. Seda operatsiooni korratakse (korduvekstraktsioon) kuni sademe kohal olev ekstrakt muutub värvusetuks. Kõik ekstraktid viiakse samasse kogumisnõusse. Lõpuks määratakse kindlaks ekstrakti kogumaht ja töö jätkub neeldumisspektri võtmisega. NB! Kuna karotenoidide ekstraktsioon viiakse läbi kergesti lenduvate apolaarsete orgaaniliste solventidega, siis toimub töö tõmbe all! Juhul, kui töö eesmärgiks on üksnes proovis sisalduvate karotenoidide kvalitatiivne uurimine, piisab ühekordsest ekstraheerimisest sobiva ekstrahendiga.

Neeldumisspektri võtmine ja spektri analüüs Enne tööle asumist tuleb läbi töötada käesolevas juhendis toodud spektroskoopia teooria ja spektrofotomeetrite tööpõhimõtted (vt osa 2.B). Seejärel tuleb tutvuda laboratooriumis kasutatava spektrofotomeetri käsitsemise eeskirjaga ning saada praktikumi juhendajalt luba seadmega töötamiseks. Neeldumisspektri määramiseks sobivad sellised spektrofotomeetrid, mis võimaldavad valitud spektriosas lainepikkust sujuvalt muuta. Karotenoidide neeldumisspekter mõõdetakse lainepikkuste vahemikus 350–650 nm, kasutades võrdluslahusena puhast lahustit (ekstrahenti). Kuna neeldumisspekter mõõdetakse nähtava valguse lainepikkustel, siis võib töötada klaasküvettidega (NB! Spektri UV osas mõõtmisel tuleb kasutada kvarts- küvette). Spektrofotomeetri ekraanile joonistub uuritava lahuse neeldumisspekter, millel kursori nihutamisega näidatakse ära ja märgitakse protokollivihikusse need lainepikkused, kus paiknevad iseloomulikud neeldumismaksimumid (λmax) ja maksimumidele vastavad absorptsiooni (A) e optilise tiheduse (D) täpsed väärtused. Seejärel trükitakse neeldumis-spekter välja ja järgneb spektri analüüsimine.

Spektri analüüsimisel võrreldakse uuritava lahuse neeldumisspektril esinevate neeldumis-maksimumide asukohti (lainepikkusi) teatmeteostes leiduvate andmetega erinevate karotenoidide neeldumismaksimumide paiknemise kohta. Tehakse järeldus, kas tegemist on puhta β-karoteeniga või karotenoidide seguga. Viimasel juhul antakse hinnang, milline karoteeni isomeer või ksantofüll ekstraktis domineerib ning arvutatakse selle sisaldus uuritavas materjalis.

63

Karotenoidi sisalduse arvutamine (kvantitatiivne analüüs) β-karoteeni, mõne teise karoteeni isomeeri või ksantofülli sisalduse määramiseks uurita-vas proovis kasutatakse neeldumisspektri analüüsimisel saadud andmeid – neeldumis-maksimumidele λmax vastavaid absorptsiooni (A) väärtusi. Reeglina võetakse arvutamisel aluseks selline absorptsiooni väärtus, mis vastab neeldumisspektril kõige kõrgemale „tipule“. Arvutus põhineb nimetatud lainepikkusele (λmax) vastava A väärtuse ja samal lainepikkusel mõõdetud ekstinktsioonikoefitsiendi väärtuse suhtele. Teatmekirjanduses leiduvad andmed väga paljude karotenoidide ekstinktsiooni-koefitsientide (Ε1cm

1%) väärtuste kohta, st karotenoidide 1%-liste lahuste absorptsiooni väärtuste kohta. Seega tuleb kirjandusest leida uuritavas lahuses domineeriva karotenoidi Ε1%

1cm väärtus ja seda kasutada arvutusvalemis. Karotenoidi sisaldus (K, mg %) uuritavas proovis arvutatakse vastavalt siintoodud valemile:

A ⋅ V ⋅ d ⋅ 103

K = mg%,

Ε1%1cm ⋅ g

kus A – absorptsiooni väärtus, mis vastab arvutuse aluseks valitud neeldumismaksimumile λmax (kõrgeimale „tipule“ vastav A väärtus), Ε1cm

1% – vaadeldava karotenoidi ekstinktsioonikoefitsient (1%-lise karotenoidi lahuse absorptsioon) sama λmax juures, V – ekstrakti kogumaht, ml, d – kasutatud ekstrahendi tihedus, g/cm3, g – uurimiseks võetud taimse materjali mass, g, 103 – tegur milligrammidele üleminekuks.

Saadud tulemust võrreldakse kirjanduses leiduvate andmetega uuritava materjali karotenoidse koostise ja üksikute karotenoidide sisalduse kohta ning tehakse järeldus töö õnnestumise kohta.

Kontrollküsimused

1. Millistesse gruppidesse võib karotenoidid jaotada ja mille poolest need grupid erinevad?

2. Iseloomustage karotenoidide molekuli ehitust ja sellest tulenevaid omadusi. 3. Millistes rakustruktuurides karotenoidid paiknevad ja milline on nende roll

taimerakkudes?

64

4. Selgitage spektrofotorimeetri tööpõhimõtet. 5. Millises lainepikkuste vahemikus paiknevad karotenoidide neeldumismaksimumid ja

millest on see tingitud? 6. Mis on molaarne ekstinktsioonikoefitsient e -tegur ja millist ekstinktsioonikoefitsienti

kasutasite teie antud töös? 7. Mida tähendab termin „ekstraktsioon“ ja millega põhjendate antud töös kasutatud

ekstrahendi valikut? 8. Millega põhjendate veevaba soola kasutamise vajadust uuritava materjali

ekstraktsiooniks ettevalmistamisel? 9. Selgitage, mida väljendab kasutatav ühik mg% ja milline seos on tal ühikuga %? 10. Millisesse vitamiinde klassi A-vitamiin kuulub?

65

3.BIOKATALÜÜS

3A. Ensüümide toime ja ensüümireaktsioonide kineetika alused

Ensüümid on valgud, mis katalüüsivad (= kiirendavad) rakkudes kulgevaid biokeemilisi reaktsioone. Tuntakse ka ribosüüme ehk RNA-põhiseid ensüüme, mis vastutavad rakkudes mitmete tähtsate funktsioonide täitmise eest, nagu RNA transkriptsioonijärgne töötlus, translatsioon jt, kuid siinkohal piirdume valkensüümide käsitlemisega. Katalüüsitavad reaktsioonid jõuavad tasakaaluolekusse palju kiiremini kui mittekatalüüsitavad, kuid reaktsioonide üldine tasakaal seejuures ei muutu. Kiiruse drastiline suurenemine toimub tänu oluliselt madalamale aktivatsiooni vabaenergia (= aktivatsioonienergia) tasemele siirdeseisundis. Joonisel on esitatud vabaenergia profiilid hüpoteetilisele ensümaatilisele ja mitteensümaatilisele reaktsioonile. Paneme tähele suurt erinevust ensüümireaktsiooni (sinine) ja mittekatalüütilise reaktsiooni (punane) aktivatsioonienergia ΔG‡ väärtustes, samas on mõlema reaktsiooni üldine vabaenergia muut ΔG võrdne.

Vaba

ener

gia,

G

Reaktantide energiatase

Produktide energiatase

ΔG; reaktsiooni vabaenergia muut

ΔG‡; aktivatsiooni vabaenergia

mittekatalüütilisel reaktsioonil

ΔG‡; ensüümireaktsiooni aktivatsiooni vabaenergia

Siirdeseisund

Reaktsiooni kulg

66

Sic! ΔGo suur negatiivne väärtus näitab küll reaktsiooni soodsat tasakaalu produkti(de) tekkimise suunas, kuid ei tähenda hoopiski seda, et reaktsioon kulgeks suure kiirusega. Reaktsiooni kiiruse (v) limiteerijaks on vabaenergia väärtus siirdeseisundis, st aktivatsioonienergia ΔG‡ väärtus – mida madalam on aktivatsioonienergia barjäär, seda kiirem on reaktsioon. Reaktsiooni tasakaal, mida iseloomustab tasakaalukonstandi (Keq) väärtus, on seotud reaktsiooni vabaenergia muuduga ΔGo standardtingimustel (standardtingimused biokeemiliste protsesside võrdlemiseks on: 1M reagentide kontsentratsioonid, temperatuur 25°C, pH = 7,0). Seos kirjeldub võrrandiga

ΔGo = - RT ln Keq , kus

R – universaalne gaasikonstant (8,315 J/mol K), T – absoluutne temperatuur (298 K). Ensüüme kui biokatalüsaatoreid iseloomustab:

• ülikõrge aktiivsus madalatel temperatuuridel ja praktiliselt neutraalsetes lahustes,

• suur spetsiifilisus, • reguleeritavus.

Aktiivsust ehk katalüütilist jõudu võib iseloomustada katalüütilise ja mittekatalüütilise reaktsiooni kiiruste suhtega, mis on vahemikus 107...1014, enamasti on ensüümid anor-gaanilistest katalüsaatoritest 105...106 korda aktiivsemad. Ensüümide spetsiifilisus avaldub nende võimes katalüüsida teatavat tüüpi reaktsioone ja eristada aineid, millele nad toimivad. Ainet, mis ensüümi toimel reageerib, nimetatakse substraadiks (tähis S). Eristatakse mitmeid substraadispetsiifilisuse aspekte, nagu absoluutne, stereo-, sideme-, geomeetriline spetsiifilisus. Ensüümireaktsioonide kiiruse reguleerimine on rakkude normaalse talitluse aspektist ülimalt oluline. Selleks on väga mitmeid võimalusi, alustades ensüümivalgu kontsentratsiooni reguleerimisest geeni ekspressiooni kaudu, aga ka substraadi ja produktide kontsent-ratsioonide kaudu, erineva toimemehhanismiga inhibiitorite abil, keskkonnategurite (temperatuur, pH jt) toimel jne. Paljud ensüümid täidavad katalüütilist funktsiooni üksnes tänu oma valgulisele koostisele, teised aga vajavad veel ka mittevalgulisi komponente ehk kofaktoreid, milleks võivad olla metallide ioonid või orgaanilised molekulid. Viimaseid nimetatakse koensüümideks. Kofaktorid stabiliseerivad reeglina ensüümi valkosa, kuid osalevad ka substraadi sidumises ja otseselt katalüüsiprotsessis. Enamik koensüüme on vesilahustuvate vitamiinide (B-grupp, C jt) derivaadid.

67

Ensüümireaktsioonide toimemehhanism Biokatalüüs on keeruline mitmeastmeline protsess, mille molekulaarset mehhanismi mõjutavad mitmed efektid. Ensüümireaktsiooni üldskeem ehk üldvõrrand on järgmine:

E + S ↔ ES ↔ ES‡ → EP → E + P

ES – ensüüm-substraat kompleks, mis tekib nõrkade vastasmõjude ehk interaktsioonide toimel, nagu vesiniksidemed, elektrostaatilised ja hüdrofoobsed vastastoimed, van der Waalsi jõud; ES‡ – siirdeseisundi kompleks; S‡ – substraadi siirdeseisundi vorm (aktiveerunud vorm), mida ensüüm seob tugevamini kui substraati, mistõttu saavutataksegi reaktsiooni aktivatsioonienergia ΔG‡ vähenemine. EP – ensüüm-produkt kompleks. ES kompleksi tekkega kaasneb väike vabaenergia vallandumine, mida kutsutakse sidumisenergiaks. Sidumisenergia ongi üheks teguriks, mis vähendab ensüümireaktsiooni aktivatsioonienergia väärtust siirdeseisundis. Ensüümide toimemehhanismi kirjeldavad kaks teineteisega seotud põhiprintsiipi:

• Indutseeritud sobivuse mudel (vt alltoodud skeem). Ensüümi ja substraadi vaheliste nõrkade sidemete formeerumine põhjustab konformatsiooni muutusi ensüümi aktiivtsentris. Selle tulemusena ES kompleks tugevneb ja vallandub väike kogus energiat.

• Siirdeseisundi stabiliseerimise mudel – konfirmatsiooni muutused ensüümi aktiivtsentris lähendavad katalüütiliselt aktiivseid funktsionaalseid rühmi neile keemilistele sidemetele substraadi molekulis, milliseid reaktsioon mõjutab. Kui E ja S seostumine on aset leidnud ja ES‡ kompleks tekkinud, siis siirdeseisundi aktivatsioonienergia langust seletatakse kas ühega või ka mitmega seni tuntud katalüüsimehhanismidest. Üldse tuntakse kuut „barjääri ületamise“ mehhanismi. Siinkohal nimetame järgmisi:

ü katalüüs sideme pingestumise teel, ü katalüüs rühmade täpse orientatsiooni kaudu, ü katalüüs prootoni doonori või aktseptori kaasamise kaudu (hape/alus

katalüüs), ü kovalentne katalüüs.

68

Indutseeritud sobivuse mudelit illustreeriv skeem

Esüümireaktsioonide kineetika alused Kineetika on teadus, mis uurib erinevate faktorite mõju reaktsioonide kiirusele. Reaktsiooni kiirust (v) väljendatakse ajaühikus ära reageerinud substraadi S hulgana või tekkinud produkti P hulgana (mol/s). Ensüümireaktsioonide puhul, erinevalt mittekatalüütilistest reaktsioonidest, suureneb reaktsiooni esmalt mõõdetav kiirus ehk algkiirus (v või vo) substraadi kontsentratsiooni suurenedes, saavutades ensüümi küllastumisel substraadiga maksimaalse väärtuse (Vmax).

Ensüümireaktsiooni kiirus sõltub väga paljudest teguritest, nagu:

• ensüümi E kontsentratsioon, • substraadi S kontsentratsioon, • kofaktori juuresolek ja kontsentratsioon, • inhibiitori või aktivaatori olemasolu ja kontsentratsioon, • keskkonna temperatuur, • keskkonna pH, • keskkonna ioonjõud.

Substraat, S

Ensüüm, E

69

Reaktsiooni kiirus avaldub reageerivate ainete (=substraatide) kontsentratsioonide [S] ja reaktsiooni kiiruskonstandi (k) korrutisena. Monomolekulaarse reaktsiooni (ühest molekulist substraadist tekib üks molekul produkti)

S P kiirus v avaldub alltoodud võrrandiga ja väljendab igas ajaühikus ärareageerinud substraadi hulka:

v = k [S]1 = k [S]

Kiiruskonstant k on vaadeldav proportsionaalsustegurina, mis iseloomustab reaktsiooni kiirust ühemolaarsete kontsentratsioonide puhul antud tingimuste (pH, temperatuuri jne.) juures. Antud juhul on k esimest järku reaktsiooni kiiruskonstant (reageerib 1 molekul substraati, [S] eksponent on 1), mille dimensiooniks on aja pöördväärtus (s-1). Nn pseudo esimest järku reaktsioonid on need, kus teiseks substraadiks on vesi, mille kontsentratsioon reaktsiooni käigus jääb praktiliselt muutumatuks ega mõjuta reaktsiooni kiirust (näiteks, hüdrolüüsi reaktsioonid). Bimolekulaarse reaktsiooni (reaktsioonis osaleb kaks erinevat substraati või osalevad sama substraadi kaks molekuli) puhul on tegemist teist järku reaktsiooniga.

S1 + S2 → P + Q või 2S P + Q Sel juhul on k teist järku reaktsiooni kiiruskonstant, mille dimensiooniks on mol-1 s-1. Kiiruse võrrand omab sel juhul kuju:

v = k [S1]1 [S2]1 või v = k [S]2

Ensüümireaktsioone, milles osaleb üks substraat, nimetatakse monosubstraatseteks. Monosubstraatse reaktsiooni lihtsustatud reaktsiooniskeem on järgmine: k+1 k+2

E + S ↔ ES → E + P k-1 Reaktsiooniskeemilt ilmneb, et kiiruskonstant k+1, millest sõltub ES kompleksi tekkekiirus, on teist järku reaktsiooni kiiruskonstant, dimensioon mol-1s-1, samas aga kiiruskonstandid k-

1 ja k+2, mis määravad ES kompleksi lagunemise kiiruse, on esimest järku reaktsiooni kiiruskonstandid, dimensioon s-1.

Substraadi sidumise staadium

Katalüütiline staadium

70

Analüüsides sellist reaktsiooniskeemi tõid uurijad Michaelis ja Menten välja ensüümi-reaktsiooni algkiiruse (v) võrrandi, mida tuntaksegi Michaelis-Menten'i kiiruse võrrandina.

k+2 [E] [S] Vmax v = =

[S] + Km 1+ Km/[S] kus v – mõõdetav reaktsiooni algkiirus (mol/s), [E] – ensüümi kontsentratsioon, M (mol/l), [S] – substraadi kontsentratsioon, M (mol/l), k2 (ehk kcat) – katalüütiline kiiruskonstant, s-1, Km – Michaelise konstant, mis võtab kokku kõik kolm reaktsiooniskeemis toodud kiiruskonstanti, mis mõjutavad ES kompleksi tekke- ja lagunemise kiirust:

Km = (k-1 + k+2) / k+1. Km dimensiooniks on kiiruskonstantide dimensioonidest tulenevalt mol/l ehk M Vmax – maksimaalne kiirus, mis väljendab maksimaalselt võimalikku reaktsiooni kiirust juhul, kui kogu reaktsioonikeskkonnas olev ensüüm on ES kompleksis, st substraadiga küllastatud. Seega – kuna ES kompleksi maksimaalne kontsentratsioon on määratud reaktsioonikeskkonnas oleva ensüümi kontsentratsiooniga [ES] → [E], siis Vmax avaldub katalüütilise konstandi k2 ja ensüümi kogukontsentratsiooni [E] korrutisena

Vmax = k+2 [E]. Michaelis-Menten'i võrrand näitab, et ensüümireaktsiooni algkiirus v on ära määratud konstantide Km ja Vmax väärtustega ning substraadi kontsentratsiooniga [S]. Samuti ilmneb Michaelis-Menten'i võrrandist, et kui

• [S] = Km , siis v = Vmax / 2, • [S] >> Km, siis v ≅ Vmax.

Michaelis-Menteni kiiruse võrrandi graafiline väljendus ehk küllastuskõver võimaldab määrata Vmax ja Km ligikaudseid väärtusi. Väga kõrgetel substraadi kontsentratsioonidel limiteerivad kiirust ainult ensüümi hulk ja reaktsioonitingimused – temperatuur, pH, ioonjõud. Substraadi suhtes on reaktsioon sellisel juhul „0-järku“.

Kineetiliste konstantide Vmax ja Km väärtuste täpsemaks määramiseks kasutatakse mitmeid Michaeli-Menten’i kiiruse võrrandi lineariseeritud vorme, millistest üks levinumaid on Lineweaver-Berk’i versioon. Selle puhul tuuakse välja kiiruse pöördväärtuse sõltuvus substraadi kontsentratsiooni pöördväärtusest (nn topelt pöördväärtuste sõltuvus):

1/v = Km / Vmax ⋅ 1/ [S] + 1/Vmax

71

Lineweaver-Burk’i koordinaatides 1/v versus 1/[S] esitatud sõltuvus on sirge, mille lõikepunkt kiiruse pöördväärtuse teljega vastab 1/Vmax väärtusele ja lõikepunkt substraadi pöördväärtuse teljega annab Km pöördväärtuse (– 1/Km).

Michaelis-Menten’i kiiruse võrrandi graafiline väljendus

Michaelis-Menten’i kiiruse võrrandi lineariseeritud vorm Lineweaver-Burk’i koordinaatides.

Rea

ktsi

ooni

kiir

us

Substraadi kontsentratsioon

72

Ensüümi aktiivsus ja ensüümipreparaatide uurimine Ensüümi kogust võib väljendada kas molaarse kontsentratsioonina nagu mistahes ainete puhul või mõõta aktiivsuse ühikutes. Mitmetel põhjustel on ensüümi molaarse kontsent-ratsiooni määramine uuritavas preparaadis väga komplitseeritud. Seetõttu väljendatakse reeglina ensüümi kogust aktiivsusena, st tema poolt esilekutsutava katalüütilise efekti järgi ehk ühes ajaühikus produkti(de)ks konverteeritud substraadi moolide arvu või tekkinud produkti moolide arvu järgi. SI süsteemis on ensüümi aktiivsuse ühikuks 1 katal (kat) = 1 mol s-1. 1 katal on selline ensüümi hulk, mis konverteerib 1 sekundi jooksul ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mooli substraati reaktsiooniprodukti(de)ks. Kuna 1 kat on väga suur ühik, siis praktikas kasutatakse ühikuid 1 mkat = 10-3 kat, 1 µkat = 10-6 kat, 1 nkat = 10-9 kat. Levinud on ka aktiivsuse väljendamine rahvusvahelistes ühikutes IU-des (International Units). 1 IU = 1µmol min-1. 1 IU on selline ensüümi hulk, mis katalüüsib 1 minuti jooksul 25°C juures ensüümile optimaalsetel tingimustel 1 mikromooli substraadi konversiooni reaktsiooniprodukti(de)ks. Kui ensüümi toimeks on optimaalne 25°C, siis 1kat = 6 • 107 IU ehk 1 IU = 16,67 nkat Asudes mingi ensüümi aktiivsuse määramisele, tuleb teada:

Ø ensüümireaktsiooni üldvõrrandit kasutatava substraadi puhul,

Ø ensüümi aktiivsuse sõltuvust substraadi kontsentratsioonist,

Ø ensüümile optimaalset keskkonna pH väärtust,

Ø temperatuuripiirkonda, kus ensüüm on stabiilne ja omab kõrget aktiivsust,

Ø ensüümi vajadust kofaktori (metalli ioonid või koensüüm) järele,

Ø analüütilist protseduuri, millega detekteerida produktide sisalduse suurenemist või

substraadi kontsentratsiooni vähenemist keskkonnas ensüümireaktsiooni vältel.

Biokeemia praktikumis tutvutakse kolme ensüümiga, mis omavad olulist füsioloogilist rolli, kuid mis leiavad rakendamist ka tehnoloogilistes protsessides ja/või analüütikas. Invertaasi ja proteaasi (= proteolüütilise ensüümi) puhul on eesmärgiks omandada nende ensüümipreparaatide aktiivsuse määramise meetodid. Glükoosi oksüdaasi aga

73

kasutatakse analüüsi eesmärgil, et sobivas bioloogilises objektis glükoosisisaldust määrata. Aktiivsuse määramise meetodite omandamiseks kasutatakse tehnilisi ensüümipreparaate, millistes ensüümivalgu sisaldus pole määratud. Seetõttu iseloomustatakse preparaadi ensüümisisaldust aktiivsuse järgi, mida tahkete ensüümipreparaatide puhul avaldatakse ensüümi massiühiku (1g, 1mg) kohta, vedela preparaadi puhul ensüümi 1ml kohta. Töödes kasutatakse aktiivsuse määramisel vastavale ensüümile optimaalset pH väärtust ja temperatuuri ning sellist substraadi kontsentratsiooni, mis tagab eksperimentaalselt mõõdetava reaktsiooni algkiiruse (v) sõltumatuse substraadi kontsentratsioonist, st praktiliselt mõõdetakse ensüümi maksimaalset kiirust (Vmax) vaadeldava temperatuuri ja pH juures. Sellisel juhul on reaktsioon [S] suhtes 0-järku, kuid samas on kiirus pro-portsionaalne ensüümi kontsentratsiooniga [E] ([E] suhtes esimest järku reaktsioon; Vmax = k2 [E]). Eksperimentaatoril tuleb etteantud tingimusi rangelt jälgida, et tagada katse õnnestumine.

74

3.1 INVERTAASI AKTIIVSUSE MÄÄRAMINE

Teooria Invertaas, süstemaatilise nimetusega β-D-fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas (EC 3.2.1.26) ehk lihtsamalt β-fruktofuranosidaas, on ensüüm, mis kuulub glükosiidsideme hüdrolaaside ehk glükosidaaside hulka, mis katalüüsivad O-glükosiidsidemete hüdrolüüsi vastavalt reaktsiooni üldskeemile:

Invertaas katalüüsib β-D-fruktofuranosiidide (süsivesikud, mis sisaldavad fruktoosi molekuli jääki furanoosi vormis) hüdrolüüsireaktsiooni, vabastades neist fruktoosi molekule:

β-D-fruktofuranosiid + H2O → β, D-fruktoos + mono- või oligosahhariid

Sahharoos on looduses kõige levinum β-D-fruktofuranosiid ja tema hüdrolüüsireaktsiooni produktideks on β-D-fruktoos ja α-D-glükoos. Invertaasi produtseerivad pärmid, hallitusseened, paljud taimed, aga ka mesilased. Inimese jaoks on invertaas oluline seedeensüüm. Sahharoos hüdrolüüsub peensoole limaskesta rakkude poolt toodetava invertaasi toimel vastavalt reaktsioonivõrrandile:

Oligo- või polüsahhariid

O-glükosiidside

Monosahhariid Lühem oligi- või polüsahhariid

Glükosidaas

Invertaas

75

Ka invertaasi preparaatide aktiivsuse määramisel kasutatakse reeglina substraadina sahharoosi. Invertaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb sahharoosi kui mittetaandava disahha-riidi hüdrolüüsil uuritava invertaasi preparaadi toimel ja vabanenud taandavate suhkrute glükoosi ja fruktoosi summaarse kontsentratsiooni määramisel reaktsioonisegus. Sahharoosi hüdrolüüsi käigus tekkinud produktide glükoosi ja fruktoosi koguse kindlakstegemiseks võib kasutada mitmeid meetodeid. Antud töös leiab kasutamist nn kompleksomeetriline meetod, kus põhireaktiiviks on tugevalt aluselise reaktsiooniga lahus, mis sisaldab vask(II)-triloon B kompleksi. Nimetatud kompleks valmistatakse kõrge Na2CO3 kontsentratsiooniga lahuses, võttes ekvimolaarsetes hulkades (1:1) CuSO4 ja etüleen-diamiintetraäädikhappe dinaatriumi soola (EDTA-Na, tuntud kui triloon B). See reaktiiv täidab vaadeldava meetodi puhul kahesugust rolli:

• tänu tugevalt aluselisele reaktsioonile toimib ta invertaasile, mille pHopt ≅ 4,8, inaktiveerivalt ja lõpetab ensüümireaktsiooni,

• tagab taandavate suhkrute määramiseks vajaliku leeliselise keskkonna ja vask(II)-triloon B kompleksi.

Kindlal ajahetkel reaktsioonisegust võetud proov, mis sisaldab taandavaid suhkruid, viiakse komplekslahusesse. Keemistemperatuuril taandub kompleksis sisalduv Cu(II) suhkrute toimel Cu(I)-ks ja moodustub Cu2O, mis eraldub reaktsioonisegust punase sademena. Lahusesse jääb ekvivalentses koguses vaba triloon B. Keetmisel toimuv reaktsioon on järgmine:

76

Järgneb reaktsioonil vabanenud triloon B koguse määramine tiitrimise teel, kasutades kindlakontsentratsioonilist (0,02 M) vasksulfaadi lahust. Tiitrimise käigus komplekseerub vabanenud triloon B uuesti Cu(II)-ioonidega ja kompleksi taastekkimine on täheldatav lahusesse lisatud indikaatori mureksiidi värvuse muutumise järgi. Tiitrimisel toimuv reaktsioon on järgmine:

Tiitrimiseks kulunud CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse varem koostatud kaliibrimissirgelt taandavate suhkrute kontsentratsioon reaktsioonisegus. Invertaasi aktiivsus avaldatakse vedela ensüümipreparaadi korral mikrokatalites ensüümilahuse 1ml kohta (µkat/ml), tahke preparaadi puhul mikrokatalites 1g kohta (µkat/g). Meenutame, et 1 mikrokatal (1 µkat) on ensüümi aktiivsuse ühik, mille puhul 1 sekundi jooksul 30 ºC juures produtseeritakse 1 mikromool produkti (1 µmol/s), st antud juhul 1 µmol taandavat suhkrut.

Töö käik

Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Vajalik kogus sobiva ensüümi kontsentratsiooniga lahust (nn töölahus) valmistatakse praktikumi juhendaja näpunäidetele järgi. Lahustina kasutatakse atsetaatpuhvrit pH väärtusega 4,8. Tahke invertaasi preparaadi puhul jääb sobiv ensüümi kontsentratsioon lahuses 1 ja 5 mg/ml vahemikku. Kui uuritakse vedelat invertaasi preparaati, siis lahjendatakse seda puhvriga 20 kuni 30 korda. Kui juhendaja on määranud valmistatava töölahuse mahu ja sobiva ensüümi kontsentratsi-ooni (lahjendusmäära), siis arvutatakse välja tahke ensüümi kaalutise suurus või vedela preparaadi vajalik maht. Ensüümipreparaadi kaalumine toimub analüütilistel kaaludel, kasutades kõige väiksemat kaaluklaasi. Väljakaalutud ensüüm viiakse kadudeta (kvantita-

77

tiivselt) lahuse valmistamiseks ettenähtud anumasse (reeglina gradueeritud katseklaasi) ja lisatakse vajalik puhvri kogus. Klaasi sisu segatakse umbes 5 min vältel ettevaatlikult klaaspulgaga kuni ühtlase suspensiooni moodustumiseni. Selget lahust ei teki, kuna uuritakse tehnilist ensüümipreparaati, mis lisaks ensüümivalgule sisaldab muid valke ja täiteaineid. Vedelat ensüümipreparaati doseeritakse sobiva mõõt- või automaatpipeti abil ja viiakse otse lahuse valmistamiseks ettenähtud gradueeritud katseklaasi, kuhu lisatakse sobiva lahjendusmäära saavutamiseks vajalik kogus puhvrit. Katseklaas suletakse korgiga ja lahust loksutatakse kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Ensüümireaktsiooni (sahharoosi hüdrolüüsi) läbiviimine

• Võetakse 50 ml mahuga katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml substraati, milleks on

7%-line sahharoosi lahus atsetaatpuhvris pH väärtusega 4,8. Katseklaas varusta-takse korgiga ja asetatakse umbes 5–10 minutiks vesitermostaati 30±1 ºC juurde soojenema.

• Võetakse kolm koonilist kolbi mahuga 250 ml, kuhu pipeteeritakse 10 ml komplekslahust. Kolbidesse viiakse reaktsioonisegust (=hüdrolüüsisegust) kindlatel aegadel võetud proovid, et neis määrata taandavate suhkrute sisaldust.

• Kui substraat on termostaadis saavutanud temperatuuri 30ºC (u 5–10 min pärast), lisatakse sellele 1ml (või muu kogus vastavalt juhendaja soovitusele) uuritavat invertaasi töölahust, lahus loksutatakse läbi ja katseklaas asetatakse kiiresti termostaati tagasi. Samal ajal fikseeritakse ensüümireaktsiooni alguse aeg kella järgi või käivitatakse stopper.

• Kohe peale reaktsioonisegu läbiloksutamist võetakse sellest kuiva pipetiga 1 ml lahust ja viiakse ühte kolbidest, kus on komplekslahus. See on nn 0-proov, kuna selles määratav taandavate suhkrute sisaldus iseloomustab olukorda hüdrolüüsi alghetkel ja proovi võtmine peab seetõttu toimuma võimalikult kiiresti.

• 10 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võetakse sama pipetiga 1 ml reaktsioonisegu ja viiakse teise komplekslahust sisaldavasse kolbi.

• 20 minutit peale ensüümireaktsiooni algust võetakse veel 1ml reaktsioonisegu ja viiakse kolmandasse kolbi.

Seejärel võib reaktsiooniseguga katseklaasi termostaadist eemaldada. Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

Vastavalt eelpooltoodud reaktsiooniskeemile redutseerub Cu(II) taandavate suhkrute toimel ja formeerub Cu2O punane sade. Samal ajal vabaneb ekvimolaarne kogus triloon B. Reaktsioon toimub keemistemperatuuril.

78

• Kolvid, mis lisaks komplekslahusele sisaldavad nüüd ka erinevatel aegadel reaktsioonisegust võetud proove, asetatakse elektripliidile püstjahutite alla 10 minutiks keema. NB! Aega arvestatakse keemise algusest!

• 10 minuti pärast lõpetatakse keetmine 150 ml destilleeritud vee (mõõdetakse mõõtsilindriga) valamisega kolbi läbi püstjahuti. Sellega suureneb ühtlasi vedeliku maht kolvis ja indikaatori värvuse muutus on tiitrimisel paremini märgatav. Kolb võetakse pliidilt ja jahutatakse kraanivee all toatemperatuurini.

• Kõikidesse kolbidesse lisatakse indikaatorina 0,3 ml ehk 6 tilka mureksiidi vesilahust, mis annab kolvis olevale lahusele violetse tooni.

• Kolbides olevate lahuste tiitrimine viiakse läbi 0,02 M CuSO4 lahusega kuni violetne värvus asendub selgelt täheldatava, püsiva roheka värvusega. Tiitrimise käigus loksutatakse kolvi sisu pidevalt. Et mitte üle tiitrida, tuleb fikseerida titrandi kulu kohe, kui märkate esimest värvuse muutust! Kui roheline toon kaob, siis lisatakse veel ettevaatlikult titranti ja alles seejärel fikseeritakse titrandi lõplik kulu.

Tiitrimiseks kulunud 0,02 M CuSO4 lahuse hulga järgi leitakse kaliibrimisgraafiku (sirge) või vastava tabeli (küsida praktikumi juhendajalt !) järgi taandavate suhkrute sisaldus mg-des 1 ml-s reaktsioonisegust võetud proovis. Invertaasi preparaadi aktiivsus (A) µkat/g arvutatakse valemi järgi:

A = (C2 – C1) • V1 ⋅ V2 • 103 / (T • 180 • V3 • V4 • g) kus:

C1 – taandavate suhkrute sisaldus 0-proovis, mg/ml, C2 – taandavate suhkrute sisaldus ajahetkel T võetud proovis, mg/ml, V1 – reaktsioonisegu (hüdrolüüsisegu) üldmaht, ml, V2 – ensüümi töölahuse üldmaht, ml 103 – tegur üleminekuks mikrogrammidele, T – hüdrolüüsi kestus, s, 180 – glükoosi molekulmass, V3 – proovi maht taandavate suhkrute määramiseks, ml, V4 – ensüümireaktsiooni viidud invertaasi töölahuse maht, ml, G – ensüümipreparaadi kaalutis, g.

Vedela invertaasi preparaadi uurimisel avaldatakse aktiivsus ensüümipreparaadi 1 ml kohta (µkat/ml). Arvutus viiakse läbi vastavalt valemile:

A = (C2 – C1) • V1 • 103 ⋅ L / (T • 180 • V3 • V4) Valemis vastavad kõik muud sümbolid ülaltoodule, kuid L tähistab lahjendusmäära, mida kasutati vedelast ensüümipreparaadist töölahuse valmistamisel.

79

Invertaasi preparaadi aktiivsus avaldatakse kahe aktiivsuse aritmeetilise keskmisena. Selleks arvutatakse katseandmete alusel ensüümi aktiivsus A10, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 10. minutil (T = 10 min = 600 s) võetud proovis ja A20, kus C2 on taandavate suhkrute sisaldus hüdrolüüsireaktsiooni 20. minutil (T = 20 min = 1200 s) võetud proovis. Kui töö on läbi viidud korrektselt, peaksid tulemused kokku langema või erinema teineteisest maksimaalselt 20% võrra. Kui aktiivsuste erinevus on oluliselt suurem, siis tuleb kindlasti analüüsida, kus võis töös viga tekkida.

Kontrollküsimused 1. Millist informatsiooni invertaasi kohta annab tema süstemaatiline nimetus β-D-

fruktofuranosiidi fruktohüdrolaas? 2. Kirjutage invertaasi poolt katalüüsitava reaktsiooni skeem. 3. Skitseerige sahharoosi molekul ja näidake, milline side invertaasi toimel

hüdrolüüsub. 4. Mille toimel lisaks invertaasile võib aset leida sahharoosi hüdrolüüs? (Meenutage

töös 1.2 läbiviidud reaktsioone!) 5. Mis on invertsuhkur? 6. Joonistage Michaelis-Menten’i kineetikaga kirjeldatavale ensüümireaktsioonile

graafiline sõltuvus v versus [S]. Näidake, millises graafiku piirkonnas toimus invertaasi aktiivsuse (reaktsiooni kiiruse) mõõtmine meie töös, kui on teada, et [S] >> Km . Millist kiirust me mõõtsime?

7. Kirjutage Cu(II)-triloon B kompleksi struktuur. Nimetage kaks põhjust selle, tuge valt aluselise reaktsiooniga lahuse kasutamiseks invertaasi aktiivsuse määramisel.

8. Selgitage, mida tähendab invertaasi preparaadi aktiivsus 85 µkat/ml sisuliselt? 9. Kuidas tuleb toimida, et valmistada tahkest invertaasi preparaadist 5,0 ml lahust, milles ensüümi kontsentratsioon on 4,0 mg/ml? 10. Kasutasite töös 7%-list sahharoosi lahust. Milline on sellise sahharoosi lahuse molaarne kontsentratsioon (Mr = 342)? Millises suhtes (suurem/ väiksem/võrdne) on see invertaasi K m väärtusega, kui on teada, et sahharoosi hüdrolüüsil Km = 26 mM?

80

3.2 PROTEOLÜÜTILISE ENSÜÜMI AKTIVSUSE MÄÄRAMINE

Teooria

Proteolüütilised ensüümid ehk proteaasid (EC 3.4.4.; tuntud ka kui proteinaasid või peptidaasid), on ensüümid, mis katalüüsivad peptiidsidemete hüdrolüüsi reaktsiooni valkudes ja peptiidides (= proteolüüsi), produtseerides madalama molekulmassiga peptiide ja vabu aminohappeid. Proteaase leidub kõikides organismides, kuna nad osalevad väga paljude füsioloogiliste funktsioonide täitmises, alustades toiduvalkude seedimisest ja lõpetades väga kõrgreguleeritud ensüümireaktsioonide kaskaadidega (näiteks, vere hüübimise kaskaad). Proteolüütiliste ensüümide arvukad esindajad omavad erinevat toimespetsiifikat. Mõned lõhustavad eelistatult spetsiifilisi, vaid teatud aminohapetega külgnevaid peptiidsidemeid (piiratud proteolüüs), teised toimivad kõikidele peptiidsidemetele (piiramatu proteolüüs).

Piiratud proteolüüsi viivad läbi ja produtseerivad põhiliselt peptiide järgmised proteaasid:

• Trüpsiin (R1= Lys, Arg; R2 ≠ Pro) • Kümotrüpsiin (R1 = Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Val; R2 ≠ Pro) • Pepsiin (R1 = Phe, Leu, ja paljud teised; R2 ≠ Pro)

Samas aga paljud bakteriaalsed proteaasid, nagu subtilisiin, savinaas, alkalaas jt omavad väga nõrka spetsiifikat ja lagundavad valkudes praktiliselt kõiki peptiidsidemeid, produtseerides vabu aminohappeid. Sõltuvalt sellest, kas proteaas toimib polüpeptiidahela kesksetele või otsmistele peptiid-sidemetele, eristatakse endo- ja eksopeptidaase. Kõik ülalnimetatud proteaasid kuuluvad endopeptidaaside rühma. Eksopeptidaaside esindajateks on karboksüpeptidaasid (R2 = C-terminaalne aminohape) ja aminopeptidaasid (R1 = N-terminaalne aminohape), mis lühendavad peptiide, vabastades ühekaupa C- või N-terminaalseid aminohappeid. Ensüümi toimimiseks optimaalse keskkonna pH väärtuse järgi eristatakse hapusid (pH ≅ 2,5), neutraalseid (pH ≅ 7,2) ja leelisproteaase (pH ≅ 9,0).

81

Oluliseks proteaaside klassifikatsiooni aspektiks on aktiivtsentri ehitus (millised amino-happed sellesse kuuluvad) ja sellest tulenev ensüümi toimemehhanism. Siinkohal piirdume vaid nelja peamise rühma nimetamisega, süüvimata nende toimemehhanismide erinevus-tesse: seriin-, tiool-, aspartaat- ja metalloproteinaasid. Ensüümi proteolüütilise aktiivsuse ühikuks 1 µkat loetakse sellist ensüümi hulka, mis põhjustab 1 µmooli peptiidsidemete hüdrolüüsi või 1 µmooli aminohapete vabanemise1 s vältel 30°C juures. Kuna hüdrolüüsunud peptiidsidemete hulk ei ole otseselt mõõdetav, siis ongi üldlevinud, et proteaaside aktiivsus avaldatakse valgu hüdrolüüsil vabanevate produktide, st aminohapete ja peptiidide hulga kaudu. Kuna uuritavad proteaasi preparaadid võivad erineda substraadispetsiifilisuse ja optimaalse pH väärtuse poolest, siis enne tööle asumist informeerib praktikumi juhendaja, millist subst-raati kasutatakse ja millise pH juures toimub uuritava proteaasi aktiivsuse määramine. Neutraalsete ja aluseliste proteaaside aktiivsuse määramisel kasutatakse substraadina reeglina kaseiini. Kaseiin on piima põhivalk, mis koostiselt on fosfoproteiin. Tänu kaseiini molekulide kõrgele hüdrofoobsusele esineb ta piimas mitsellidena. Piimast eraldatud kaseiin vees praktiliselt ei lahustu, küll aga lahustub vees hästi kaseiini Na-sool (Na-kaseinaat). Proteaasi aktiivsuse objektiivseks hindamiseks jälgitakse kaseiini. hüdrolüüsi algstaadiumit, mil valgu polüpeptiidahelas on katkenud vaid üksikud peptiidsidemed. Selles etapis sisaldab reaktsioonisegu peamiselt pika ahelaga peptiide, märgatav osa valgust on hüdrolüüsumata ja on tekkinud ainult vähesel määral vabu aminohappeid ning madalmolekulaarseid peptiide. Proteaasi aktiivsuse määramise meetod põhineb kaseiini hüdrolüüsil uuritava proteaasi toimel ja järgneval trikloroäädikhappega (TKÄ) mittesadenevate hüdrolüüsiproduktide sisalduse määramisel spektrofotomeetrilisel meetodil.

Tervikvalgud ja kõrgmolekulaarsed peptiidid, mille Mr > 10 000, sades-tuvad lahusest TKÄ toimel, mis samas ka inaktiveerib ensüümi ja peatab edasise hüdrolüüsi. Sademe eraldamise järel jäävad lahusesse vabad aminohapped ja madal-molekulaarsed peptiidid, mille kontsentratsiooni iseloomustatakse kaudselt aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete sisalduse

82

alusel. Aromaatset tuuma sisaldavad aminohapped türosiin (Tyr), trüptofaan (Trp) ja fenüülalaniin (Phe) omavad neeldumismaksimume UV- piirkonnas lainepikkustel 270–280 nm ja tänu sellele on nad spektrofotomeetriliselt hõlpsasti detekteeritavad (vt alltoodud joonist). Reaktsioonisegust võetud proovides mõõdetaksegi kindla lainepikkusega valguskiirguse neelduvust (= absorptsiooni = optilist tihedust, tähis A või D) uuritavas lahuses. Ehkki mõõdetav absorptsioon on tingitud kõikidest lahuses olevatest, aromaatset tuuma sisaldavatest aminohapetest, väljendatakse kaseiini hüdrolüüsi produktide sisaldus türosiini kontsentratsioonina mg /ml või µmol /ml (1 µmol = 181µg = 0,181 mg). Kasutades olemasolevat kaliibrimissirget A (D) versus CTyr leitakse absorbtsiooni väärtuste järgi türosiini kontsentratsioon kindlatel aegadel reaktsioonisegust võetud proovides.

Aromaatset tuuma sisaldavate aminohapete neeldumisspektrid.

Töö käik Ensüümipreparaadist töölahuse valmistamine Uuritavast proteaasi preparaadist valmistatakse ensüümile sobiva pH väärtusega puhvris lahus, milles ensüümi kontsentratsioon on vahemikus 1–5 mg/ml. Kui ensüümile sobiv puhver, lahuse täpne maht ja ensüümi kontsentratsioon selles on praktikumi juhendajaga kooskõlastatud, siis arvutatakse välja ensüümipreparaadi kaalutise suurus. Analüütilistel kaaludel kaalutakse sobiva suurusega kaaluklaasi vajalik kogus ensüümipreparaati ja viiakse kadudeta (kvantitatiivselt) lahuse valmistamiseks sobivasse anumasse. Reeglina

Lainepikkus λ, nm

Mol

aarn

e ek

stin

ktsi

oon

E (a

bsor

ptsi

oon)

83

kasutatakse selleks gradueeritud katseklaasi. Lisatakse väike kogus puhverlahust ja segatakse klaaspulgaga u 5 min kuni ensüüm on lahustunud. NB! Preparaadid sisaldavad ka täiteainet, mis ei lahustu ja seetõttu selget lahust ei teki. Seejärel täidetakse klaas puhverlahusega ettenähtud mahuni ja loksutatakse läbi, et ensüümi kontsentratsioon lahuses ühtlustuks. Ensüümireaktsiooni (kaseiini hüdrolüüsi) läbiviimine

• Võetakse 50 ml mahuga suur katseklaas, kuhu pipeteeritakse 25 ml 2%-list kaseiini lahust, mille pH on reguleeritud ensüümile sobivale väärtusele. Klaas kaetakse korgiga ja asetatakse vesitermostaati 30 °C juurde umbes 5–10 minutiks soojenema.

• Võetakse 4 kuiva normaalmõõdus (20 ml) katseklaasi ja nummerdatakse. Igaühte pipeteeritakse 3 ml 5%-list TKÄ lahust.

• Kui kaseiini lahus on 30 °C-ni soojenenud, alustatakse ensüümireaktsiooni – kaseiini hüdrolüüsi. Selleks pipeteeritakse kaseiinile juurde 1 ml valmistatud proteaasi töölahust, reaktsioonisegu loksutatakse kiiresti läbi ja asetatakse termostaati tagasi. Samas fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg kella järgi või käivitatakse stopper.

• Peale ensüümi lisamist võetakse puhta kuiva pipetiga võimalikult kiiresti 3 ml reaktsioonisegu, viiakse esimesse TKÄ-d sisaldavasse katseklaasi (0-proov) ja klaasi sisu loksutades hoolega. Peale proovi võtmist asetatakse reaktsiooniseguga katseklaas kiiresti tagasi termostaati.

• Täpselt 5 minuti pärast võetakse sama pipetiga 3 ml reaktsioonisegu teise katseklaasi ja klaasi sisu loksutatakse hoolega läbi. Sama operatsiooni korratakse 5-minutiliste intervallidega veel kaks korda, s.t ensüümireaktsiooni 10-ndal ja 15-ndal minutil.

Peale viimase proovi võtmist võib reaktsiooniseguga katseklaasi võtta termostaadist välja.

Reaktsiooniproduktide sisalduse määramine ja aktiivsuse arvutamine

• Proovidega katseklaasid jäetakse täielikuks sademe formeerumiseks 10–15

minutiks seisma. Sel ajal pannakse valmis 4 puhast ja kuiva katseklaasi ning varustatakse need sobivate väikeste klaas- või plastlehtrite ning paberfiltritega.

• Proovid, milles sade on põhja settinud, filtritakse kuivadesse katseklaasidesse. Filtrile jäänud sade pole vajalik. Saadud filtraadid peavad olema täiesti selged ja kui mõni neist seda pole, siis tuleb seda lahust uuesti filtrida.

• Spektrofotomeetril määratakse nelja, erineval ajal reaktsioonisegust võetud proovi optilise tiheduse väärtused lainepikkusel λ = 280 nm (D280), kasutades 1 cm läbimõõduga kvartsküvette.

84

NB! Eelnevalt tuleb tutvuda spektrofotomeetria põhimõtetega (vt p.2 B) ja praktikumis kasutatava seadme tööjuhendiga!

• Praktikumi juhendajalt saadud kaliibrimisgraafikult leitakse vastavalt proovide optilise tiheduse väärtustele D280 neis sisalduva türosiini kontsentratsioon (mg/ml või µmol/ml).

• Saadud katseandmete alusel koostatakse graafik, mis väljendab türosiini kontsent-ratsiooni ja reaktsiooni kestvuse vahelist sõltuvust CTyr = f(t).

Kuna proovid on reaktsioonisegust võetud kaseiini hüdrolüüsi protsessi algfaasis, mil produktide kontsentratsiooni ja aja vahel valitseb lineaarne sõltuvus, siis peavad kõik neli punkti katse korrektse läbiviimise puhul langema sirgele. NB! Sirge ei läbi koordinaatide alguspunkti, kuna kaseiinis sisaldub vähesel määral TKÄ-ga mittesadenevaid komponente ja seetõttu ka 0-proov sisaldab veidi türosiini. Katsepunktide hajumise korral viiakse neist läbi kõiki katsepunkte arvestav sirge. Selle järgi leitakse türosiini juurdekasv ΔCTyr valitud ajavahemikus Δt. Ensüümipreparaadi proteolüütiline aktiivsus A (µkat/g) arvutatakse vastavalt valemile:

A = ΔCTyr • 103 • V1 • V2 • 2 / (Δt • 181 • V3 • g)

ΔCTyr – türosiini kontsentratsiooni muutus valitud ajavahemikus (mg/ml), Δt – hüdrolüüsi kestus st valitud ajavahemik (s), V1 – reaktsioonisegu (substraat + ensüüm) üldmaht (ml), V2 – valmistatud ensüümilahuse üldmaht (ml), 2 – TKÄ lahusest tingitud proovi lahjendus (3 ml → 6 ml, seega L = 2), V3 – ensüümi maht hüdrolüüsisegus (ml), g – proteaasi preparaadi kaalutis (g), 181 – türosiini molekulmass.

Kontrollküsimused

1. Kirjutage lõik valgu polüpeptiidahelast ja näidake, millistele sidemetele toimivad proteaasid. 2. Mida mõistetakse ensüümide spetsiifilisuse all ja milliseid proteaaside spetsiifilisuse aspekte eristatakse? 3. Kuidas klassifitseeritakse proteaase optimaalse pH väärtuse järgi ja millisesse rühma kuulus teie uuritud ensüüm?

85

4. Palun iseloomustage proteaasi substraadina kasutatavat ainet kaseiini. Millised reaktsi-ooniproduktid tekivad kaseiini hüdrolüüsi käigus? 5. Kirjutage TKÄ struktuurivalem ja põhjendage TKÄ kasutamise eesmärke antud töös. 6. Skitseerige graafilised sõltuvused a) ensüümi aktiivsus-temperatuur; b) ensüümi aktiivsus-keskkonna pH. 7. Millisel temperatuuril toimus proteaasi aktiivsuse määramine? Kuidas mõjutanuks tulemust temperatuuri tõus termostaadis 25 Co võrra? 8. Millise reaktsiooniprodukti kontsentratsiooni suurenemise järgi arvutasite proteaasi aktiivsuse? Kirjutage selle aine struktuurivalem. 9. Mida spektroskoopias mõistetakse neelduvuse (lahuse optilise tiheduse) all ja millised tegurid seda mõjutavad (Beer-Lambert’i seadus)? 10. Oletagem, et teil tuleb valmistada tahkest ensüümipreparaadist 10 ml lahust kontsent-ratsiooniga 4,5 mg /ml. Kuidas toimite?

86

3.3 GLÜKOOSISISALDUSE MÄÄRAMINE ENSÜMAATILISEL MEETODIL

Teooria Glükoosisisalduse kvantitatiivseks määramiseks bioloogilistes objektides, nagu vereseerum, toiduained, taimne tooraine jm kasutatakse laialdaselt ensümaatilist meetodit, mis põhineb ensüümide glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx) kasutamisel. Tänu GOx-i substraadispetsiifilisusele β,D-glükoosi suhtes võimaldab see meetod määrata

glükoosisisaldust ka teiste suhkrute juuresolekul. GOx-i süstemaatiline nimetus β,D-glükoosi:O2-oksüdo-reduktaas (EC 1.1.3.4) näitab, et ta katalüüsib β,D-glükoosi oksüdeerumist molekulaarse hapniku toimel. Reaktsiooniproduktideks on vesinikperoksiid ja δ,D-glükonolaktoon, mis kiiresti hüdrolüüsudes moodustab D-glükoonhappe.

Nagu juuresolevalt pildilt näha, kujutab GOx endast liit- ehk konjugeeritud valku, flavoproteiini, mis sisaldab mittevalgulise komponendina flaviinadeniindinukleotiidi (FAD), mis toimib koensüümina. GOx-i molekul on dimeerne valk (kaks subühikut, pildil erineva sinise tooniga). Roosaga on näidatud FAD-i molekulid. Ensüümivalku stabiliseerivad polüsahhariidi ahelad (tähistatud rohelisega).

FAD seob glükoosi molekulilt kaks vesiniku aatomit, redutseerudes FADH2-ks ning kannab need molekulaarsele hapnikule, mis sisaldub lahustunult reaktsioonikeskkonnas. Reaktsiooni tulemusena tekib ekvimolaarses koguses D-glükoonhapet ja vesinikperoksiidi.

87

Vaadeldava meetodi järgmises etapis kasutatakse peroksüdaaside perekonna üht esindajat, rõika peroksüdaasi (EC 1.11.1.7), mille süstemaatiline nimetus on doonor:H2O2-oksüdoreduktaas. Ka POx on koostiselt liitvalk, mis sisaldab mittevalgulise komponendina heemi, olles seega hemo- ehk kromoproteiin. POx katalüüsib spetsiifiliste substraatide (elektronide doonorite) oksüdeerumist (= dehüdreerumist), kasutades elektronide aktseptorina teist substraati, H2O2, mille redutseerumisel moodustub H2O.

Kui kasutada substraati, mille oksüdeerumisel tekib värviline produkt (nimetatakse kromogeenseks substraadiks), siis saab POx-i reaktsiooni hõlpsasti jälgida spektrofotomeetriliselt. Värvilise ühendi kontsentratsioon (lahuse värvuse intensiivsus) on võrdelises sõltuvuses uuritava proovi glükoosisisaldusest. Reaktsiooni põhimõtteline skeem on järgmine:

Peroksüdaas

Taandatud substraat + H2O2 → Oksüdeeritud substraat + 2 H2O

Värvusetu Värviline

POx-i toimel oksüdeeruva kromogeense substraadina kasutatakse mitmeid bensidiini derivaate, nagu diaminobensidiini, tetrametüülbensidiini, samuti 2-tolidiini ehk o-tolidiini jt. O-tolidiini oksüdeeritud vorm on helesinine ja detekteeritav lainepikkusel 630 nm.

Lisaks nimetatud orgaanilistele ühenditele võib peroksüdaasi reaktsioonil kasutada substraadina kaaliumheksatsüanoferraati(ll), K4[Fe(CN)6], ajaloolise nimetusega kollane veresool. POx katalüüsib Fe2+ oksüdatsiooni Fe3+-ks, millega kaasnevalt toimub H2O2 redutseerumine veeks. Tekkiv kaaliumheksatsüanoferraat(III), K3[Fe(CN)6] ehk punane veresool annab lahusele kollase värvuse ja on detekteeritav lainepikkusel 410 nm. Reaktsioon kulgeb POx-ile sobivas mõõdukalt happelises keskkonnas pH 6 juures.

Peroksüdaas

2 Fe2+ + H2O2 + 2 H+ → 2 Fe3+ + 2 H2O Käesoleva töö ülesandeks on glükoosisisalduse määramine mingis bioloogilises objektis, nagu mesi, puuviljad vm taimne materjal, mis töö lihtsustamise eesmärgil ei tohiks sisaldada märkimisväärsel hulgal värvaineid. POx-i substraadina kasutatakse antud töös kaaliumheksatsüanoferraat(ll).

+++ 222 HHH222OOO

88

Töö käik

Tööreaktiiv Glükoosisisalduse määramise ensümaatilise meetodi puhul on keskses rollis tööreaktiiv, mis sisaldab eelkirjeldatud ensüüme glükoosi oksüdaasi (GOx) ja peroksüdaasi (POx), kromogeenset substraati kaaliumheksatsüanoferraati(II) ja reaktsioonide kulgemiseks vajaliku keskkonna loomiseks fosfaatpuhvrit pH väärtusega 6,0. Ensüümide kokkuhoiu eesmärgil ei valmista iga üliõpilane tööreaktiivi ise, vaid töötab ettevalmistatud tööreaktiiviga. Kuna ensüümid võivad tööreaktiivi pikemaajalisel säilitamisel aktiivsust kaotada, siis tuleb tööreaktiivi valmistada väikeste portsjonite (25 või 50 ml) kaupa vahetult enne praktikumi. 25 ml tööreaktiivi valmistamiseks võetakse vastav mõõtekolb, millesse viiakse: Ø 2,5 mg glükoosi oksüdaasi; Ø 1,5 mg peroksüdaasi; Ø 16,6 ml 0,2 M fosfaatpuhvrit, pH = 6,0; Ø K4[Fe(CN)6] 0,1%-list lahust koguses, mis on vajalik kolvi täitmiseks kuni lõppmahuni. Kuni tarvitamiseni säilitatakse tööreaktiivi külmkapi temperatuuril. Uuritava lahuse (tundmatu proovi) ettevalmistamine

Uuritavaks lahuseks ehk tundmatuks prooviks, milles glükoosi kontsentratsioon tuleb kindlaks määrata, võib olla

• glükoosi vesilahus, • mee lahus (nn mee tõmmis), • hele puuviljamahl (viinamarja, õuna, sidruni, greibi vm), • mõni füsioloogiline lahus (vereseerum, uriin jne).

Glükoosi vesilahus Kui tundmatuks prooviks on glükoosi vesilahus, siis pole täiendavad protseduurid lahuse ettevalmistamiseks vajalikud. Juhul, kui töö käigus selgub, et mõõdetud optilise tiheduse väärtus väljub koostatud kaliibrimissirge määramispiirkonnast, tuleb uuritavat lahust destilleeritud veega lahjendada, jälgides lahjendamisel väga täpselt soovitatud mahtusid.

89

Mee lahus (mee tõmmis) Mee lahus valmistatakse kuuma (70–80oC) destilleeritud veega, et soodustada suhkrute ja mees sisalduvate kõrgmolekulaarsete süsivesikute lahustumist. Hoolikalt läbisegatud mee proovist kaalutakse analüütilistel kaaludel kaaluklaasi 0,1...0,2 g mett ja viiakse kvantitatiivselt (st kadudeta) 100 ml mahuga mõõtekolbi. Seda tehakse kuuma destilleeritud veega, mida lisatakse väikeste portsjonitena 2–3 korda kaaluklaasi, klaasi sisu segatakse väikese klaaspulgaga ja tekkinud lahus valatakse lehtri abil mõõtekolbi. Kolvi mahust ca 2/3 täidetakse kuuma destilleeritud veega ja kolbi hoitakse veel 15–20 minutit kuumas vesivannis, aeg-ajalt lahust loksutades. Seejärel jahutatakse lahus toatemperatuurini ja pH väärtust kontrollitakse indikaatorpaberi abil. Kui lahus on happeline, neutraliseeritakse seda mõne tilga 10–15% Na2CO3 või NaHCO3 lahuse lisamisega. Peale seda täidetakse kolb külma destilleeritud veega kuni kaelal oleva märgini, suletakse korgiga ja ühtlase kontsentratsiooni saavutamiseks loksutatakse lahus läbi. NB! Lahuse täiendava lahjendamise vajalikkuse ja lahjendusmäära osas tuleb konsulteerida praktikumi juhendajaga!

Mahl või mõni muu vedelik Kui tundmatuks prooviks on naturaalne puuviljamahl või mõni füsioloogiline vedelik, siis igal konkreetsel juhul toimitakse uuritava lahuse ettevalmistamisel ja lahjendusmäära valikul praktikumi juhendaja soovituste järgi. Puuviljamahlade uurimisel lähtutakse reeglina puuviljadest ja pressitakse neist välja väike kogus (2–3 ml) mahla, mida siis vajalikul määral lahjendatakse.

Glükoosilahuste valmistamine kaliibrimisgraafiku koostamiseks

Selleks, et glükoosi kontsentratsiooni tundmatus proovis kindlaks teha, tuleb esmalt koostada kaliibrimisgraafik, mis seob glükoosi kontsentratsiooni lahuse absorptsiooniga (A) e optilise tihedusega (D) lainepikkusel λ=410 nm. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsent-ratsiooni (C, mg/ml) ja y-telg absorptsiooni (= optilise tiheduse) väärtust nimetatud lainepikkusel. Kindlakontsentratsiooniliste glükoosilahuste valmistamisel lähtutakse glükoosi standard-lahusest, mis sisaldab glükoosi täpselt 1,0 mg/ml. Standardlahusest valmistatakse kolm lahjemat glükoosilahust ehk lahjendust, reeglina kontsentratsioonidega 0,25 mg/ml, 0,125 mg/ml ja 0,062 mg/ml. NB! Lahjendamise põhimõte: lahjendamiseks võetud lahuse (standardlahuse) mahus ja lahjendatud lahuse lõppmahus sisaldub üks ja sama ainehulk, st kehtib võrrand

90

Cst ⋅ Vst = Clahj ⋅ Vlahj , kus

Cst ja Clahj tähistavad aine kontsentratsiooni vastavalt standard- ja lahjendatud lahuses, Vst ja Vlahj vastavate lahuste mahtusid. Seega võimaldab toodud võrrand arvutada lahjenduse tegemiseks vajaliku standardlahuse mahu, kui on teada lahjendatud lahuse vajalik maht (antud töös reeglina 10, 15 või 20 ml).

Lahjenduste (= lahjendatud glükoosilahuste) valmistamiseks võetakse kolm puhast, kuiva standardset või kalibreeritud (jaotustega) katseklaasi, kuhu pipeti abil mõõdetakse eelnevalt väljaarvutatud kogus glükoosi standardlahust. Destilleeritud vett lisatakse sobiva mahuga pipetiga niipalju, kui on vajalik lahuse lõppmahu (10 ml, 15 ml vm) saavutamiseks. Kalibreeritud katseklaaside puhul pole destilleeritud vee lisamiseks vaja kasutada pipetti, vaid vett lisatakse pesupudelist kuni vastava mahuni. Katseklaasid suletakse korkidega ja loksutatakse kontsentratsiooni ühtlustamiseks. Teine võimalus lahjendatud glükoosilahuste( lahjenduste) tegemiseks on samm-sammult lahjendamine (vt toodud skeemi). Selleks valmistatakse esmalt standardlahusest kindel maht (meie näites 10 ml) glükoosilahust kontsentratsiooniga 0,25 mg/ml, mida seejärel lahjendaks 2 korda ning saadud teist lahjendust omakorda 2 korda. NB! Iga lahus vajab peale vee lisamist hoolikat loksutamist!

Kaliibrimislahuste valmistamise skeem

Värvusreaktsiooni läbiviimine Reaktsioon tööreaktiiviga viiakse läbi katseklaasides toatemperatuuri juures. Selleks asetatakse katseklaaside statiivi 6 puhast, kuiva katseklaasi ja nummerdatakse. Kontrollkatse ehk 0-proov, mis näitab tööreaktiivist tingitud absorptsiooni, viiakse läbi destilleeritud veega. Uuritava lahusega tehakse kaks paralleelkatset, glükoosi standardlahusest valmistatud lahjendustega igaühega üks katse.

4×

2×

2×

0,25 mg/ml

2,5+7,5 ml

0,125 mg/ml

5+5 ml

0,062 mg/ml

5+5 ml

Standard-lahus

1 mg/ml

91

¯ Katseklaasi nr 1 pipeteeritakse 1 ml destilleeritud vett (kontrollproov). ¯ Katseklaasidesse nr 2 ja 3 pipeteeritakse 1 ml uuritavat lahust (2 paralleelproovi). ¯ Katseklaasidesse nr 4, 5 ja 6 pipeteeritakse igaühte 1 ml erineva kontsentratsiooniga

glükoosilahust, mis valmistati ülalkirjeldatud viisil (vt. standardlahuse lahjendamine). ¯ Igasse katseklaasi pipeteeritakse 3 ml tööreaktiivi ja loksutatakse kohe, et saavutada

ühtlast kontsentratsiooni. NB! Kuna tööreaktiivi säilitatakse külmikus, tuleb sel enne kasutamist lasta soojeneda toatemperatuurini!

¯ Fikseeritakse reaktsiooni alguse aeg ja katseklaase hoitakse 20 minutit toatemperatuuril. Reaktsiooni aeg peab olema piisav, et jõuaksid toimuda teooria osas kirjeldatud reaktsioonid, mille tulemusena glükoosi sisaldavad lahused värvuvad tekkiva K-heksatsüanoferraat(III) toimel kollaseks.

¯ Olles eelnevalt tutvunud spektrofotomeetria põhimõtetega (vt p 2 B) ja praktikumis kasutatava seadme tööjuhendiga, mõõdetakse lainepikkusel 410 nm lahuste optilise tiheduse väärtused. Võrdluslahusena kasutatakse destilleeritud vett.

NB! Kuna ka kontrollproov võib anda madala optilise tiheduse näidu (tingitud tööreaktiivi komponentidest), siis tuleb kõikide glükoosi sisaldavate lahuste (katseklaasid 2–6) optilise tiheduse väärtusi korrigeerida, lahutades neist kontrollproovi optilise tiheduse väärtuse. Korrigeeritud väärtusi kasutatakse ka kaliibrimisgraafiku koostamisel.

Kaliibrimisgraafiku koostamine ja glükoosi kontsentratsiooni kindlakstegemine

Kaliibrimisgraafik koostatakse standardlahuse lahjendamisel saadud kindla glükoosi kontsentratsiooniga proovide (katseklaasid 4, 5, 6) absorbtsiooni (optilise tiheduse) väärtuste alusel. Graafiku x-telg näitab glükoosi kontsentratsiooni (C, mg /ml) ja y-telg proovi absorptsiooni väärtust (A). Kui kasutatakse nn korrigeeritud absorptsiooni väärtusi ja eksperiment on korrektselt läbi viidud (lahjendused täpselt tehtud), siis kujutab graafik endast koordinaatide alguspunkti läbivat sirget. Glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses leitakse kaliibrimisgraafiku abil paralleelproovide (katseklaasid 2 ja 3) keskmise optilise tiheduse väärtuse järgi. Kui tundmatut proovi (naturaalset mahla vm) lahjendati enne värvusreaktsiooni läbiviimist, siis tuleb arvestada, et graafikult leitakse glükoosi kontsentratsioon uuritava proovi lahjendatud lahuses ja see väärtus vajab lahjendus-teguriga korrutamist.

Glükoosisisaldus massiprotsentides (X, %) proovi kuivaines (mesi vm materjal, mille niiskusesisaldus on teada) arvutatakse vastavalt valemile:

92

C ⋅ V1 ⋅ L ⋅ 10-3 ⋅ 100 X =

V2 ⋅ G ⋅ (1 – W) , kus C – glükoosi kontsentratsioon uuritavas lahuses kaliibrimissirge järgi (mg /ml), V1 – uuritava lahuse üldmaht (ml) L – lahjendustegur, 10-3 – tegur üleminekuks grammidele, V2 – värvusreaktsiooni läbiviimiseks võetud uuritava lahuse maht (ml), G – uuritava materjali (mesi vm) kaalutis (g), W – uuritava materjali niiskusesisaldus massiosana (leitakse teatmekirjandusest).

Kui tundmatuks prooviks oli mahl, mille kuivainesisaldust pole kindlaks määratud, siis aval-datakse glükoosisisaldus massiprotsentides (X,%) naturaalse mahla suhtes. Sellisel juhul piirdub arvutus valemiga:

X = C ⋅ L⋅ 10-3 ⋅ 100 / d , kus C – glükoosisisaldus uuritavas lahuses vastavalt kaliibrimisgraafikule (mg /ml), L – mahla lahjendustegur d – mahla tihedus (g /cm3). Kontrollküsimused 1. Millisesse ensüümide klassi kuuluvad GOx ja POx? 2. Kirjeldage GOx-i ja POx-i poolt katalüüsitavaid reaktsioone. 3. Millist koensüümi vajab GOx ja milles seisneb koesüümi roll? 4. Kuidas avaldub ensüümi substraadispetsiifilisus antud töö puhul? 5. Selgitage lahuse lahjendamise põhimõtet ja kirjeldage, kuidas tuleb toimida, et lahusest, mis sisaldab 1,5 g/l glükoosi valmistada 25 ml lahust kontsentratsiooniga 0,3 g/l? 6. Milline on töös kasutatava tööreaktiivi koostis? 7. Milline roll on K4Fe(CN)6 tööreaktiivis? Kas ja millega võinuks teda asendada? 8. Milline keskkonna pH väärtus on sobiv GOx-i ja POx-i toimimiseks ja kuidas see tagati? 9. Milleks oli antud töös vaja kaliibrimissirget ja kuidas toimisite, et kaliibrimissirget koostada? 10. Oletagem, et glükoosi kontsentratsioon 200 korda lahjendatud viinamarjamahlas on 0,5 mg/ml. Mitu massi% glükoosi sisaldub selles mahlas? Eeldagem, et mahla tihedus d =1,0 g/cm3?

93

Lisa 1

Spektrofotomeetri UV-1601 kasutamise juhend

UV/Vis spektrofotomeeter; kahe kiire seade

Lülita seade vooluvõrku, kasutades vasakul küljel olevat „O / 1” klahvi. Ekraanil on näha kiri Initialize – toimub seadme parameetrite kontroll. Umbes 5...7 minuti pärast, kui kõik ekraanil olevad positsioonid on aktiveerunud (OK), võib alustada tööd.

Kui seadme ekraanile ilmub kiri Mode Menu ja mõõteviiside loetelu (8 erinevat), siis vali numbriklahvide abil vajalik mõõteviis.

1. Photometric – mõõtmine toimub ühel lainepikkusel, vajuta numbriklahvi 1. 2. Spectrum – mõõtmine toimub lainepikkuste vahemikus, vajuta numbriklahvi 2.

Klahvi „MODE” abil on võimalik mõõteviiside loetellu tagasi pöörduda ja mõõteviisi muuta.

Töörežiim Photometric

Kui valisid töörežiimi Photometric, siis näed ekraanil lainepikkust (λ: nm), mida viimati kasutati ja absorptsiooni väärust (Data: ABS). Sic! ABS pole ühik, kuna absorptsioon on dimensioonita suurus, vaid antud seadme puhul neelduvust ehk absorptsiooni (= optilist tihedust) tähistav sümbol (tavaliselt sümbol A).

• Sisesta lainepikkus (λ, nm), mille juures soovid proovi(de) absorptsiooni mõõta.

Selleks vajuta klahvile “GOTO WL”, vali numbriklahvide abil vajalik λ väärtus ja selle sisestamiseks vajuta klahvile “ENTER”. Ekraanil näed valitud lainepikkust.

• Vii läbi seadme nullimine. Aseta mõlemasse küvetihoidjasse küvetid puhta lahustiga

(destilleeritud vesi või muu lahusti), sule küvetikambri kaas ja vajuta klahvile “AUTO ZERO”. Ekraanil näed Data: 0,000 ABS.

• Asu uuritava(te) proovi(de) absorptsiooni (= optilise tiheduse) mõõtmisele. Aseta

küvetihoidja esimesse positsiooni küvett uuritava lahusega, tagumisse positsiooni jäta küvett puhta lahustiga. Sule küvetikambri kaas. Ekraanil näed lainepikkust λ (nm), mille juures toimub mõõtmine ja lahuse absorptsiooni väärtust (Data: ABS). Samal viisil toimi kõikide uuritavate proovidega. Registreeri tulemused protokollivihikus.

• Kui soovid peale kõikide proovide mõõtmist näha ekraanil tulemusi tabeli kujul,

vajuta klahvile “START / STOP”.

• Tabeli trükkimiseks veendu, kas printer on sisse lülitatud – klahv “ON/OFF”. Seejärel vajuta spektrofotomeetri klahvile “PRINT“ ja oota, kuni printeri klahvi “FEED” indikaator on lõpetanud vilkumise, siis lülita välja “ONLINE”-režiim. Seejärel vajuta klahvile “FEED”.

94

Töörežiim Spectrum

Režiim võimaldab mõõta uuritava proovi neeldumis- ehk absorptsioonispektrit, st mõõta absorptsiooni väärtust (ABS; A) lainepikkuse λ funktsioonina sel viisil, et etteantud lainepikkuste vahemikus toimub seadmes proovile langeva valguse lainepikkuse sujuv muutmine.

• Vajuta klahvile „MODE” – ekraanile ilmub mõõtmisviiside valik (8 erinevat). Vali NUMBRIKLAHVI 2 abil mõõtmisviis Spectrum, mis tähendab, et absorptsiooni mõõtmine toimub valitavate lainepikkuste vahemikus skaneerimisrežiimis. Ekraanil näed skaneerimise parameetrite loetelu.

• Sisesta NUBRIKLAHVI 2 abil lainepikkused (λ, nm), milliste vahemikus soovid

absorptsiooni mõõta. Selleks vajuta klahvile “GOTO WL”, vali numbriklahvide abil λ väärtus, millest algab mõõtmine (suurim lainepikkus) ja vajuta selle sisestamiseks klahvile “ENTER”. Samal viisil sisesta λ väärtus, mille juures lõpeb mõõtmine (lühim lainepikkus).

• Vajuta klahvile „START/STOP”. Ekraanil on teljestik: absorptsiooni väärtus (ABS) versus λ, nm.

• Vii läbi seadme nullimine. Aseta mõlemasse küvetihoidjasse küvetid puhta lahustiga (destilleeritud vesi või muu lahusti), sule küvetikambri kaas ja vajuta klahvile “START/STOP”. Ekraanil näed spektri 0-joone tekkimist.

• Mõõda uuritava proovi neeldumisspekter valitud lainepikkuste vahemikus. Selleks

aseta küvetihoidja esimesse positsiooni küvett uuritava prooviga, tagumisse positsiooni jäta küvett puhta lahustiga. Sule küvetikambri kaas ja vajuta klahvile “START / STOP”. Ekraanil näed neeldumisspektri joonistamist valitud lainepikkuste vahemikus. Sic! Kui ABS väärtus neeldumismaksimumis väljub etteantud piiridest või osutub väga madalaks, siis klahvile „RETURN“ vajutamisega pöördu tagasi mõõtmisviiside valikusse (Mode Menu) ja numbriklahvi 3 abil (Rec. Range) muuda y-teljel ABS väärtuste piire. Vajuta uuesti klahvile “START / STOP”. Ekraanil näed neeldumisspektri joonistamist samas lainepikkuste vahemikus, kuid ABS väärtuste muudetud piirides.

• Määra kindlaks neeldumismaksimumide (tippude) täpsed parameetrid: λ, nm ja ABS väärtus. Selleks kasuta kursorklahve ( , ), mille abil saad ekraanil liikuda vasakule ja paremale. Tipu kohale jõudes näed spektri ülaservas täpset λ väärtust ja sellele vastavat absorptsiooni väärtust. Mitme neeldumismaksimumiga spektri puhul toimi samal viisil, et kõikide tippude täpsed parameetrid kindlaks määrata. Vastavad näidud fikseeri protokollivihikus.

• Trüki spekter välja. Selleks toimi režiimi Photometric juures kirjeldatud viisil.

• Mõõtmist lõpetades võta küvetid hoidjast välja ja tühjenda. Pese kõik kasutatud küvetid hoolikalt, loputa ning aseta küvetikarpi. Lülita seade vooluvõrgust välja.

95

Lisa 2

Spektrofotomeetri UVmini-1240 kasutamise juhend

UV/Vis spektrofotomeeter; ühe kiire seade

Lülita seade vooluvõrku, kasutades tagaküljel olevat „O / 1” klahvi. Ekraanil on näha kiri Initialize – toimub seadme parameetrite kontroll. Umbes 5...7 minuti pärast, kui kõik ekraanil olevad positsioonid on aktiveerunud (OK), võib alustada tööd.

Kui ekraanile ilmub kiri Mode Menu ja mõõteviiside loetelu (5 erinevat), siis vali numbri-klahvide abil vajalik mõõteviis.

1. Photometric – mõõtmine toimub ühel lainepikkusel, vajuta numbriklahvi 1.

2. Spectrum – mõõtmine toimub lainepikkuste vahemikus, vajuta numbriklahvi 2.

Klahvi „RETURN” abil saab mõõteviiside loetellu tagasi pöörduda ja mõõteviisi muuta.

Töörežiim Photometric

Kui valisid töörežiimi Photometric, siis näed ekraanil viimati kasutatud lainepikkust (λ´, nm) ja absorptsiooni väärust (Data: ABS). Sic! ABS pole ühik, kuna absorptsioon on dimensioonita suurus, vaid antud seadme puhul kasutatav neelduvuse e absorptsiooni (= optilise tiheduse) tähis (tavaliselt tähis A).

• Sisesta lainepikkus (λ, nm), mille juures soovid proovi(de) absorbtsiooni mõõta. Selleks vajuta klahvile “GOTO WL”, vali numbriklahvide abil vajalik λ väärtus ja sisestamiseks vajuta klahvile “ENTER”. Ekraanil näed valitud lainepikkust.

• Vii läbi seadme nullimine. Aseta küvetihoidjasse küvett puhta lahustiga (destilleeritud vesi või muu lahusti) ja sule küvetikambri kaas. Vajuta klahvile “AUTO ZERO”. Ekraanil näed Data: 0,000 ABS.

• Mõõda uuritava(te) proovi(de) absorptsiooni väärtus(ed). Eemalda lahustit sisaldav küvett ja aseta küvetihoidjasse küvett uuritava lahusega. Sule küvetikambri kaas. Ekraanil näed lainepikkust λ (nm), mille juures toimub mõõtmine ja lahuse absorptsiooni väärtust (Data: ABS). Samal viisil toimi kõikide uuritavate proovidega. Registreeri absorptsiooni väärtused protokollivihikus

• Kui uuritavaid proove on palju ja soovid peale kõikide proovide mõõtmist näha ekraanil tulemusi tabeli kujul, siis vajuta klahvile “START / STOP”.

• Tulemuste trükkimiseks lülita printer sisse – klahv “ON/OFF” ja seejärel vajuta spektrofoto-meetri klahvile “PRINT“. Oota, kuni printeri klahvi “FEED” indikaator on lõpetanud vilkumise ja lülita välja “ONLINE”-reziim ning vajuta klahvile “FEED”.

96

• Mõõtmist lõpetades võta küvett hoidjast välja ja tühjenda. Pese ja loputa kasutatud küvetid hoolega ning aseta küvetikarpi. Lülita seade vooluvõrgust välja.

Töörežiim Spectrum

Režiim võimaldab mõõta uuritava proovi absorptsioonispektrit, st absorptsiooni väärtust (ABS; A) lainepikkuse λ funktsioonina. Etteantud lainepikkuste vahemikus toimub seadmes proovile langeva valguse lainepikkuse sujuv muutmine.

• Fotomeetriliselt režiimilt spektri mõõtmise režiimile üleminekuks vajuta klahvile „RETURN” – ekraanile ilmub mõõtmisviiside valik Mode Menu (5 erinevat). Vali numbriklahvi 2 abil mõõtmisviis Spectrum. See tähendab absorptsiooni mõõtmist valitavate lainepikkuste vahemikus skaneerimisrežiimis. Ekraanil näed mõõtmisparameetrite (6 erinevat) loetelu.

• Sisesta numbriklahvi 2 abil skaneerimise intervall (λ range). Selleks vajuta klahvile “GOTO WL”, vali numbriklahvide abil λ väärtus, millest algab absorptsiooni mõõtmine (suurim lainepikkus) ja vajuta sisestamiseks klahvile “ENTER”. Samal viisil sisesta λ väärtus, mille juures lõpeb mõõtmine (lühim lainepikkus).

• Sisesta numbriklahvi 3 abil spektri vertikaaltelje ühikute piirid (Rec. Range), st absorptsiooni väärtuste mõõtmispiirid.

• Vajuta klahvile „START/STOP”: ekraanile ilmub teljestik ABS väärtus versus λ, nm.

• Vii läbi seadme nullimine. Aseta küvetihoidjasse küvett puhta lahustiga (destilleeritud vesi või muu lahusti), sule küvetikambri kaas ja vajuta klahvile “START/STOP”. Ekraanil näed spektri 0-joone tekkimist.

• Mõõda uuritava proovi neeldumisspekter valitud lainepikkuste vahemikus.Selleks asenda küvett lahustiga teise küvetiga, milles on uuritav proov, sule küvetikambri kaas ja vajuta klahvile “START / STOP”. Ekraanil näed neeldumisspektri joonistamist valitud lainepikkuste vahemikus.

Sic! Kui ABS väärtus neeldumismaksimumis väljub etteantud piiridest või osutub väga madalaks, siis klahvile „RETURN“ vajutamisega pöördu tagasi mõõtmisviiside valikusse (Mode Menu) ja numbriklahvi 3 abil (Rec. Range) muuda y-teljel ABS väärtuste piire. Vajuta uuesti klahvile “START / STOP”. Ekraanil näed neeldumis-spektri joonistamist samas lainepikkuste vahemikus, kuid ABS väärtuste muudetud piirides.

• Määra kindlaks neeldumismaksimumide (tippude) täpsed parameetrid λ, nm ja ABS väärtus. Selleks kasuta kursorklahve ( , ), mille abil saad ekraanil liikuda vasakule ja paremale. Tipu kohale jõudes näed spektri ülaservas täpset λ väärtust ja sellele vastavat absorptsiooni väärtust. Mitme neeldumismaksimumiga spektri

97

puhul toimi samal viisil, et kõikide tippude täpsed parameetrid kindlaks määrata. Vastavad näidud fikseeri protokollivihikus.

• Trüki spekter välja. Selleks toimi režiimi Photometric juures kirjeldatud viisil.

• Mõõtmist lõpetades võta küvett hoidjast välja, tühjenda kõik kasutatud küvetid, pese ja loputa hoolega ning aseta küvetikarpi. Lülita seade vooluvõrgust välja.