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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
DEPTO. BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO
LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS
TATIANE KANNO
MARAYSA MELO
“Biologia do Desenvolvimento: mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação do ser”
Alfenas Setembro- 2011
(Magritte, 1936)
A Biologia do Desenvolvimento integra de diferentes níveis da
biologia para a formação do ser
Modelos experimentais utilizados no Estudo em Biologia do Desenvolvimento
“Mosca da fruta” Drosophila melanogaster
“Sapo” Xenopus leavis
“Galinha” Gallus gallus
“Camundongo”
“Peixes” Zebrafish
•Baixo Custo
•Facilidade de obtenção
•Maior parte do Desenvolvimento é Externo
•Permite microcirurgia e manipulação genética
•Embrião transparente nos estágios iniciais
•Desenvolvimento similar a humanos nos estágios iniciais
Galinha como modelo experimental
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm? Para onde vão?
2. O que estas células podem ser?
3. Quando elas decidem o que vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
1. De onde as células vêm? Para onde vão?
2. O que estas células podem ser?
3. Quando elas decidem o que vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
Crista neural dá origem aos Gânglios de Raiz Dorsal
Epiderme
Células migratórias
Notocorda
Células da crista neural
Crista neural
D
V
Neuroectoderme
Crista neural
Epiderme
Nat
ure
Rev
iew
s N
euro
scie
nce
8,
11
4-1
27
, 20
07
GRD
Tubo Neural
c
c
Os Gânglios da Raiz Dorsal ficam dispostos ao longo da coluna vertebral
Gânglios de Raiz Dorsal (GRD)
Medula
D
D
V
V
TN
GRD
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
Imunohistoquímica: localização da proteína
Epítopo (Sítio de ligação específico da proteína – reconhecido pelo Anticorpo)
Anticorpo Primário (reconhece o epítopo)
Anticorpo Secundário (reconhece o Ac primário)
Fluoróforo (conjugado ao Ac secundário)
PROTEÍNA
Tubo Neural – Futura Medula
Gânglio da Raiz Dorsal
Armazena neurônios sensoriais
Gânglio da Raiz Dorsal
Expressão de Miosina Va no desenvolvimento do Sistema nervoso
Pergunta:
A proteína Miosina Va é expressa no
desenvolvimento do sistema nervoso?
Miosina Va é expressa no tubo neural e
no gânglio da raiz dorsal
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Ablação Transplante
Cultura
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
1. De onde as células vêm? Para onde vão?
2. O que estas células podem ser?
3. Quando elas decidem o que vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
O transplante de vesícula óptica para o ectoderma do tronco em anfíbios gera cristalino ectópicos:
O ectoderma do tronco tem potencial de formar cristalino
doador
aceptor
Transplantes de crista neural de codorna para galinha mostraram quais são os derivados de cada porção da crista
1. De onde as células vêm? Para onde vão?
2. O que estas células podem ser?
3. Quando elas decidem o que vão ser?
4. Como ocorre esta decisão?
Perguntas da Biologia do Desenvolvimento
Descrição Expressão Cirurgia
Metodologias utilizadas no estudo da Biologia do Desenvolvimento
- Embriologia clássica Visualização do desenvolvimento
embrionário - Mapa do destino -Imunohistoquímica - Hibridização in situ
Expressão diferencial de genes
determinam a diferenciação
celular
Ablação Transplante
Cultura
Superexpressão de genes através de Eletroporação in ovo De
velo
p. G
row
th D
iffer
. 199
9 41
, 335
–344
GRD
DNA
+ -
Embrião 48 h pós-eletroporação expressando GFP na região truncal
Imunohistoquímica para detecção do GFP em criocorte retirado da região truncal de embrião HH25
HH19
Em Resumo...
• Origem embrionária das células
• Destino final das células durante o desenvolvimento
• Potencial de diferenciação celular
• Período no qual ocorre a determinação do que as células irão originar
• Quais os fatores moleculares que influenciam a diferenciação destas células
NIH Stem Cell Progress Report 2001
1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão?
2. O que estas células PODEM ser?
3. QUANDO elas decidem o que vão ser?
4. COMO ocorre esta decisão?
Existem várias modalidades de comunicação intercelular:
Por contato direto
Por difusão de proteínas extracelulares
Por matriz extracelular
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
1. SHH se liga ao receptor transmembrana PTCH,
2. inicia-se a sinalização celular que ativa os fatores de transcrição GLI
51
Comprovação: Transplante de notocorda na região lateral induz motoneurônios
NOTOCORDA
TRANSPLANTE DE NOTOCORDA
NOTOCORDA
Moto neurônios
53
COMO que a notocorda determina onde
serão formados os motoneurônios? a) Proteína nuclear? b) Proteína citoplasmática? c) Proteína de membrana? d) Proteína secretada?
54
COMO que a notocorda determina onde
serão formados os motoneurônios? a) Proteína nuclear? b) Proteína citoplasmática? c) Proteína de membrana? d) Proteína secretada?
56
Nature 412, 194-198 (12 July 2001)
Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de motoneurônios no tubo neural
Normal Mutante
Det
ecçã
o de
m
oton
eurô
nio
1. O SHH (sonic hedgehog) precisa da adição de colesterol
2. Quando SHH se liga ao receptor transmembrana PTCH, inicia-se a sinalização celular que ativa os fatores de transcrição GLI
Nature 412, 194-198 (12 July 2001)
Camudongos com deleção para o gene Shh carecem de motoneurônios E TEM DEFEITOS NA CABEÇA
Normal Mutante
Det
ecçã
o de
m
oton
eurô
nio
Isto era para ser
uma cabeça!
61
A interação de Shh, secretado pela notocorda, com receptores das células no tubo neural induz a expressão de genes relacionados a diferenciação de motoneurônios no tubo neural.
Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA APICAL (AER)
As fases desenvolvimento do broto do membro :
1. Definição do campo do membro
2. Crescimento do broto
3. Definição dos eixos
As fases desenvolvimento do broto do membro :
1. Definição do campo do membro
2. Crescimento do broto
3. Definição dos eixos
O membro tem 3 eixos: 1)antero-posterior = dedão- mindinho 2)Dorso-ventral = costas-palma 3)Proximo-distal= ombro-mão
Existe uma região no broto de membro que é responsável pela definição do eixo Antero-Posterior: a Zona Polarizadora
4 3 2 4 3 2 2 3 4
Duplicação da Zona Polarizadora por transplante resulta em duplicação especular dos dígitos
O Shh (Sonic Hedgehog) é expresso na Zona Polarizadora de TODOS os membros Shh: Proteína secretada no meio extracelular
SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE DA ZONA
POLARIZADORA??
OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA A ORDEM DOS DÍGITOS?
A implantação de vírus que secretam Shh no primórdio do membro tem o mesmo efeito que o transplante da região polarizadora
A superexpressão de Shh nos membros causa polidactilia
Son
ic H
edge
hog
Car
tiage
m
Maas e Falon, 2005
Dedos adicionais
SERÁ QUE O SHH É RESPONSÁVEL PELA ATIVIDADE DA ZONA
POLARIZADORA??
OU SEJA, SERÁ QUE O SHH DETERMINA A ORDEM DOS DÍGITOS?
Sim!
Concentrações altas de X induzem a formação de dígitos mais posteriores Que tipo de molécula é X? O Shh é transcrito e traduzido pela Zona Polarizadora e secretado no meio extracelular Altas concentração de Shh = posterior= dedo mindinho Baixas concentração de Shh= anterior= polegar
O esqueleto do membro desenvolve-se no sentido proximo-distal, i.e. estruturas mais proximais surgem primeiro.
Em aves e mamíferos existe um espessamento distal da ectoderme do broto do membro: a PREGA ECTODÉRMICA APICAL (AER)
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
Hipótese: O FGF8 no Prega Ectodérmica Apical é responsável pelo crescimento do broto do membro. ENTÃO…. Se não tiver FGF8 não tem membro??!!
Camudongos mutantes com deleção genômica para FGF8 são normais !!!!
E AGORA????? Jogo a hipótese no lixo?
Boulet et al, 2004
Boulet et al, 2004
Fgf8-/- Fgf4-/- Normal
Camundogos com deleção genômica para FGF8 E FGF4 não apresentam membros
Isto também quer dizer que normalmente, tanto FGF8 quanto FGF4 cooperam para que o plano final se concretize
A mesma via de sinalização tem vários membros da família que agem normalmente em conjunto e podem compensar pela ausência de um membro.
FGF4
FGF8
•FGF (Fibroblast Growth Factor)
•Wnt
•BMP (Bone Morphogenic Protein)
•Ácido Retinóico
•Shh (Sonic Hedgehog)
LABORATÓRIO DE EMBRIOLOGIA MOLECULAR DE VERTEBRADOS Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento – ICB-USP
http://www.biocel.icb.usp.br/~ireneyan/index.html
Edgar Ruiz
Felipe Vieceli
Maraysa Melo
Tatiane Kanno
José Antonio Turri
Orientadora: Profa. Dra. Irene Yan
Aula Prática Biologia do Desenvolvimento in silico
Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL/MG
Maraysa Melo e Tatiane Kanno
Modelos animais:
•Embrião de galinha (Gallus gallus)
•Embrião de camundongo (Mus musculus)
•Embrião de sapo (Xenopus Laevis)
•Embrião de peixe paulistinha (Danio rerio)
Sites:
http://geisha.arizona.edu/geisha/
http://www.emouseatlas.org/emap/home.html
http://www.xenbase.org/common/
http://zfin.org/cgi-bin/webdriver?MIval=aa-ZDB_home.apg
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
Gene: Pax6
Pax6 comanda o desenvolvimento ocular: A expressão de Pax6 em patas cria olhos ectópicos em moscas
Drosophila melanogaster
Superexpressão de Pax6 forma de olhos extras em anfíbios
Xenopus laevis
Normal Visão dorsal
Mutante com mais Pax6
Visão dorsal