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Dott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDott. Giorgio PorteraDipDipDipDip. di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le . di Biologia e Genetica per le
Scienze MedicheScienze MedicheScienze MedicheScienze MedicheUniversitUniversitUniversitUniversitàààà degli Studi di Milanodegli Studi di Milanodegli Studi di Milanodegli Studi di Milano
““““Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla tracciaforense, dalla tracciaforense, dalla tracciaforense, dalla traccia
biologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR'sbiologica allo studio dei polimorfismi STR's””””
Laboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia ForenseLaboratorio di Biologia Forense
• Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capellicapellicapellicapelli………….).).).)
• Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio)
• Quantificazione (Quantificazione (Quantificazione (Quantificazione (rtrtrtrt----pcrpcrpcrpcr))))
• Amplificazione (Amplificazione (Amplificazione (Amplificazione (multiplexmultiplexmultiplexmultiplex))))
• Tipizzazione (310Tipizzazione (310Tipizzazione (310Tipizzazione (310----3130XL)3130XL)3130XL)3130XL)
PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA DINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSADINAMICA DELITTUOSA
Tipologia dei repertiTipologia dei repertiTipologia dei repertiTipologia dei reperti
Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti Vestiti con evidenti tracce ematichetracce ematichetracce ematichetracce ematiche
Vestiti con minime Vestiti con minime Vestiti con minime Vestiti con minime tracce ematichetracce ematichetracce ematichetracce ematiche
Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti Ricerca di tracce ematiche da reperti ripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimineripuliti dopo il crimine
Indumenti usati per Indumenti usati per Indumenti usati per Indumenti usati per travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati travisare il viso,investigati per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e per la ricerca di saliva e
residui epitelialiresidui epitelialiresidui epitelialiresidui epiteliali
Ricostruzioni parentali daRicostruzioni parentali daRicostruzioni parentali daRicostruzioni parentali da
resti cadaverici o osseiresti cadaverici o osseiresti cadaverici o osseiresti cadaverici o ossei
TEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIETEST GENERICI E DI SPECIE
Utili nellUtili nellUtili nellUtili nell’’’’identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di identificazione del tipo di fluido biologico in fase di
ispezioneispezioneispezioneispezione
TEST GENERICITEST GENERICITEST GENERICITEST GENERICI
• comburcomburcomburcombur test test test test ���� sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)sangue (test colorimetrico)
• amilasi amilasi amilasi amilasi ���� saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)saliva (test colorimetrico)
• psapsapsapsa ���� sperma (sperma (sperma (sperma (immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))
TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE TEST DI SPECIE
• obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate obti test: specifico per sangue di primate ((((immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))
• semelogeninasemelogeninasemelogeninasemelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in : specifico per sperma umano (proteina secreta in
vescicole seminali, vescicole seminali, vescicole seminali, vescicole seminali, immunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatograficoimmunocromatografico))))
COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST ---- ComburComburComburCombur3333 TestTestTestTest®®®®EEEE (ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)
Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine,
saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine
e eritrocitie eritrocitie eritrocitie eritrociti
sostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidinasostanza: tetrametilbenzidina
il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza
di attivitdi attivitdi attivitdi attivitàààà perossidasica dellperossidasica dellperossidasica dellperossidasica dell’’’’emoglobinaemoglobinaemoglobinaemoglobina
FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali,
ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.ruggine, ossidanti vari, ecc.
COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST COMBUR TEST ---- ComburComburComburCombur3333 TestTestTestTest®®®®EEEE (ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)(ROCHE)
AMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TEST
test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della test per diagnosi clinica della pancreatitepancreatitepancreatitepancreatite acutaacutaacutaacuta
• sostanza: 2sostanza: 2sostanza: 2sostanza: 2----clorocloroclorocloro----4444----nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a nitrofenolo legato a
maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce
con lcon lcon lcon l’’’’α----amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si amilasi della saliva,in presenza di saliva si
colora di giallocolora di giallocolora di giallocolora di giallo
• FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporeiFALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei
AMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TESTAMILASI TEST
PSA TESTPSA TESTPSA TESTPSA TEST
• test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, delltest per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell’’’’iperplasia iperplasia iperplasia iperplasia
prostatica benigna (prostatica benigna (prostatica benigna (prostatica benigna (bphbphbphbph) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio ) e delle infezioni alla prostata; saggio
immunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dellimmunologico semiquantitativo per la determinazione dell’’’’antigene antigene antigene antigene
specifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasmaspecifico prostatico nel sangue, siero e plasma
•sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi sostanza: anticorpi antiantiantianti antigene antigene antigene antigene psapsapsapsa coniugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidaleconiugati a oro colloidale
utilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di spermautilizzato per identificare tracce di sperma
•falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionafalsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionalililili
OBTI TEST OBTI TEST OBTI TEST OBTI TEST ---- HEXAGON OBTIHEXAGON OBTIHEXAGON OBTIHEXAGON OBTI (HUMAN) : anticorpi anticorpi anticorpi anticorpi antiantiantianti hbhbhbhb umani umani umani umani
coniugati a particelle coniugati a particelle coniugati a particelle coniugati a particelle cromogenecromogenecromogenecromogene (blu)(blu)(blu)(blu)
utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie utilizzato per la diagnosi specie ---- specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati specifico per il sangue dei primati
superiori.superiori.superiori.superiori.
TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α-
semelogeninasemelogeninasemelogeninasemelogenina ,proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)proteina secreta in vescicole seminali)
TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI TEST SPECIFICI
LAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPELAMPADA CRIMESCOPElampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza dlampada con luce monocromatica a lunghezza d’’’’
onda variabile (415onda variabile (415onda variabile (415onda variabile (415----650 nm)650 nm)650 nm)650 nm)
Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra Principio: differente emissione assorbimento tra fluidi biologici e substratifluidi biologici e substratifluidi biologici e substratifluidi biologici e substrati
SLIP con tracce di SLIP con tracce di SLIP con tracce di SLIP con tracce di spermaspermaspermasperma
FODERA di una giacca FODERA di una giacca FODERA di una giacca FODERA di una giacca con tracce di sudorecon tracce di sudorecon tracce di sudorecon tracce di sudore
Aree positive al Aree positive al Aree positive al Aree positive al test delltest delltest delltest dell’’’’AmilasiAmilasiAmilasiAmilasi
Aree luminescenti Aree luminescenti Aree luminescenti Aree luminescenti Crimescope C16Crimescope C16Crimescope C16Crimescope C16
22R
22 O
22Q
22N
22P
22I
22L
22M
Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree Esempio di un reperto con numerose aree luminescentiluminescentiluminescentiluminescenti
ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA
• FENOLOFENOLOFENOLOFENOLO----CLOROFORMIO CLOROFORMIO CLOROFORMIO CLOROFORMIO –––– solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: solventi organici immiscibili con acqua: si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella organicaorganicaorganicaorganica
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA –––– DNA affine alla DNA affine alla DNA affine alla DNA affine alla resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, resina, rimane legato nella membrana della colonna, successivamente viene eluitosuccessivamente viene eluitosuccessivamente viene eluitosuccessivamente viene eluito
• RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE –––– stessa stessa stessa stessa chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina chimica del precedente metodo, ma la resina èèèè libera in soluzione. libera in soluzione. libera in soluzione. libera in soluzione. Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluitoViene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito
• RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del pHpHpHpH della della della della soluzionesoluzionesoluzionesoluzione
ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON ESTRAZIONE CON RESINA MAGNETICARESINA MAGNETICARESINA MAGNETICARESINA MAGNETICA
• metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che metodo di estrazione del DNA che ne sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativane sfrutta la carica negativa
• metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a metodica veloce e modulabile a seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia seconda del tipo di traccia ((((possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di aumentare il numero di aumentare il numero di aumentare il numero di aumentare il numero dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi dei lavaggi, estrazione da diversi volumivolumivolumivolumi) ) ) )
• estrazione estrazione estrazione estrazione automatizzabileautomatizzabileautomatizzabileautomatizzabile
resina +resina +resina +resina +
DNA DNA DNA DNA ----
resina resina resina resina ----DNA DNA DNA DNA ----
AUTOMAZIONEAUTOMAZIONEAUTOMAZIONEAUTOMAZIONE
ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ATTRAVERSO LATTRAVERSO LATTRAVERSO LATTRAVERSO L’’’’UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT UTILIZZO DI ROBOT
(MICRO(MICRO(MICRO(MICRO----PIPETTATORI)PIPETTATORI)PIPETTATORI)PIPETTATORI)
uniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dalluniche fasi compiute dall’’’’operatore: operatore: operatore: operatore: posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti posizionamento dei campioni e reagenti
VANTAGGIVANTAGGIVANTAGGIVANTAGGI
• possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h di estrarre in meno di 2h fino a 96 traccefino a 96 traccefino a 96 traccefino a 96 tracce
•riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori riduzione rischio di errori delldelldelldell’’’’operatoreoperatoreoperatoreoperatore
•alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei alta precisione nel dosaggio dei reagentireagentireagentireagenti
TRACCIABILITTRACCIABILITTRACCIABILITTRACCIABILITÀÀÀÀ DEI CAMPIONIDEI CAMPIONIDEI CAMPIONIDEI CAMPIONI
• possibilitpossibilitpossibilitpossibilitàààà di poter attribuire un di poter attribuire un di poter attribuire un di poter attribuire un indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o indicativo (codice a barre classico o bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del bidimensionale) dalla prima fase del prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla prelievo della traccia alla conservazione dellconservazione dellconservazione dellconservazione dell’’’’estrattoestrattoestrattoestratto
• i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione i codici delle diverse fasi di lavorazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione (ispezione, estrazione …………) vengono ) vengono ) vengono ) vengono collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici collegati attraverso lettori ottici
CODICE A BARRE
COLLEGAMENTO CON LETTORE OTTICO
QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME
• I campioni vengono quantificati con STANDARD con DNA noto e privo di inibizione (da 50ng/µl a 23 pg/µl)
• importanza dell’IPC nella lettura della quantificazione dei campioni per valutare la qualità del DNA estratto (eventuale PURIFICAZIONE)
INIBIZIONE: non è possibile valutare la presenza o
assenza di DNA
PURIFICAZIONE
RealRealRealReal ----TimeTimeTimeTime
IPC campioni + standard, curva molto simile
IPC inibito
0.9 ± 30%45 ± 30%25 ± 30%Condom6-int
--124 ± 10%Condom6-ext
0.9 ± 10%1633 ± 10%1534 ± 10%Condom5-int
1.9 ± 10%201 ± 10%390 ± 10%Condom5-ext
0.4 ± 10%12060 ± 10%4239 ± 10%Condom4-int
4.5 ± 30%13 ± 30%59 ± 20%Condom4-ext
1.2 ± 10%18572 ± 10%21364 ± 10%Condom3-int
0.5 ± 10%348 ± 10%180 ± 10%Condom3-ext
110 ± 30%10 ± 30%Condom2-int
3 ± 30%15 ± 30%44 ± 30%Condom2-ext
0.6 ± 30%69 ± 20%44 ± 30%Condom1-int
1.5 ± 20%60 ± 20%91± 20%Condom1-ext
Ratio H/YY Maschile (pg/ul)
Umano (pg/ul)REPERTO
POSSIBILITPOSSIBILITPOSSIBILITPOSSIBILITÀÀÀÀ DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA DI QUANTIFICARE NELLA STESSA REAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILEREAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILE
• Amplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare lAmplificare e tipizzare l’’’’intero intero intero intero genomagenomagenomagenoma sarebbe improponibile sarebbe improponibile sarebbe improponibile sarebbe improponibile per costi e tempoper costi e tempoper costi e tempoper costi e tempo
• Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:con le seguenti caratteristiche:
1.1.1.1. POLIMORFICI POLIMORFICI POLIMORFICI POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso marcatore deve presentare diverse varianti nella popolazione)
2.2.2.2. STABILISTABILISTABILISTABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers)
3.3.3.3. EQUILIBRIOEQUILIBRIOEQUILIBRIOEQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg
4.4.4.4. INDIPENDENTIINDIPENDENTIINDIPENDENTIINDIPENDENTI
AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE AMPLIFICAZIONE caratteristiche di un marcatore forense
MicrosatellitiMicrosatellitiMicrosatellitiMicrosatelliti STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)STR (Short Tandem Repeat)
•GATA è la sequenza del core-repeat
•Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico
•Le varianti (allelialleliallelialleli) hanno un numero diverso di repeat
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
8 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
9 ripetizioni
...ACAGAT GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...
10 ripetizioni
STRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STRSTRUTTURA DI UN STR
...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT..
Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base al numero di repeat
NOME DEL MARCATORE
POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT
SCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STRSCELTA DEGLI STR
Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci specifici marcatori STR, denominati Loci CodisCodisCodisCodis
CSF1PO
D5S818
D21S11
TH01
TPOX
D13S317
D7S820
D16S539 D18S51
D8S1179
D3S1358
FGA
VWA
AMEL
AMEL
Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci Studi di popolazione 13 Loci CodisCodisCodisCodis
MULTIPLEX
• I 13 loci Codis vengono amplificati in un’unica reazione di PCR, spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere discriminante
• gli attuali kit di amplificazione caratterizzano contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex)
• le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di estratto inferiori ai 50 pg/µl
• DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl
20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!20 cellule x reazione!!!
TIPIZZAZIONE
I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico
(310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che discriminano i frammenti overlappanti
RAW DATA – DATO GREZZO
PROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATOPROFILO GENETICO ELABORATO
•un profilo secondo gli standard FBI (codis) e’ formato da 13 marcatori
•poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e’ pari a 0,1
nella popolazione di riferimento
•poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i
cromosomi (omozigosi)
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e’ pari a
0,1*0,1=0,01
•la probabilita’ di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e’
0,01*0,01*…0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di
individui……..
DIMOSTRAZIONE D’IDENTITA’’’’
IL PROFILO PUO’ ESSERE RITENUTO UNICO
VIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALEVIOLENZA SESSUALE
RepertiRepertiRepertiReperti Foto vetrinoFoto vetrinoFoto vetrinoFoto vetrino
indiziato
vittima
sperma vestaglia
tampone vaginale
tampone vaginale
indiziato
vittima
vestaglia
tampone vaginale
indiziato
vittima
vestaglia
tampone vaginale
indiziato
vittima
vestaglia
Nuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitNuove applicazioni e possibilitàààà di sviluppo in di sviluppo in di sviluppo in di sviluppo in biologia forensebiologia forensebiologia forensebiologia forense
• Studio DNA degradato (“tracce stressate” e residui epiteliali)
• Ricerca mRNA su tracce forensi
La cLa cLa cLa caratterizzazione di ampliconi più corti (loci Mini-STR), permette di analizzare estratti molto degradati come quelli di sudore e residui epiteliali
Tracce attaccate da batteri, muffe, stress ambientale
DNA DEGRADATODNA DEGRADATODNA DEGRADATODNA DEGRADATO
miniSTR
Primers per STR
Primers per miniSTR
DegradazioneDegradazione
Locus
Amplificazione con kit Identifiler (16 sistemi STR)
25pg/ul
Amplificazione con kit Minifiler (9 sistemi
mini-STR)
300<x<350300<x<350300<x<350300<x<350
80<x<13080<x<13080<x<13080<x<130
250<x<300250<x<300250<x<300250<x<300
140<x<190140<x<190140<x<190140<x<190
110<x<180110<x<180110<x<180110<x<180
70<x<12070<x<12070<x<12070<x<120
300<x<350300<x<350300<x<350300<x<350250<x<300250<x<300250<x<300250<x<300
10 cellule
Possibilità di DATARE la traccia in base alla quantità di messaggero ancora presente, ma soprattutto stabilire l’ORIGINE TISSUTALE, in modo da eliminare i limiti delle diagnosi specifiche e generiche e valutazioni ispettive.
Esempio: luminescenza alla crimescope di urina molto simile a secrezioni vaginali, distinzione tra perdite ematiche da trauma o perdite sangue mestruale
RICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSIRICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSI
In passato la diagnosi di sangue mestruale veniva fatta attraverso la ricerca microscopica di cellule dell’endometrio, dosaggio ormonale o rapporto tra degradazione fibrina/fibrinogeno.
SVANTAGGISVANTAGGISVANTAGGISVANTAGGI
• necessità di elevate tracce di sangue
• non applicabilità in tracce forensi (sporche e non sempre ben repertate)
• in alcuni casi di violenza sessuale o omicidio è importante determinare l’origine delle tracce ematiche
PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?
INDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALEINDAGINI SU SANGUE MESTRUALE
CASEWORK CASEWORK CASEWORK CASEWORK scomparsa e rinvenimento cadavere di una donna di circa 30 anni
• il sopralluogo dell’abitazione consente di rinvenire un lenzuolo con consistenti tracce ematiche, poi tipizzate ed appartenenti alla donna
• viene accusato di omicidio il marito, che giustifica le abbondanti tracce ematiche del lenzuolo come perdite mestruali
…. vengono raccolti vari campioni:
• campioni autoptici di vari tessuti, tra cui cellule della mucosa dell’endometrio
• sangue mestruale di volontarie
• sangue da traumi vari
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