Утицај корозије 316АИСИ Л производа у ин витро формирањекостију

Прилог

Kоштана срж ћелије пацова која је гајена у експерименталним условима који фаворизују ширење и одвајање од остеобластицијалних

( . 2.52] , -10 ћелија тј мол Л аскорбинска киселина мол Л Б и ~ 8. ~ 1) глицерофосфат МОЛ Л дексаметазон у одсуству и у присуству

корозије нерђајућег челичног , 18 . производа за период од дана АИСИ 316 Л са премазом од нерђајућег челика ( ) СС је добијен електрохемијским средствима и концентрацијом главних металних

, јона који су утврђени атомском апсорпционом спектрометријом, били 8.78] 10 3. ~ ~ 1 , 4.31] 10 ~ 3 ~ 1 2,56] 10 ~ 3 мол Л од Фе мол Л од Цр и мол Л ~~~ 1. . 0,01, 0,1 1% В Ни Коштане сржи ћелије су изложене и од СС и на

, крају периода инкубације контролне и третиране културе оцењене су хистохемијским тестовима ради идентификације присуства алкалне

фосфатазе као и остатака калцијума и фосфата. Примерци су даље посматране скенирањем . електронске микроскопије Нивои укупног и јонизованог калцијума и фосфора у прикупљеним примерцима су квантификовани. Хистолошко становиште је показало да на те

промерке јако делује присуство алкалне фосфазе настањене остатке калцијума и фосфата 0,01% Присуство СС није изазвало никаква

мерљива биолошке понашања у овим примерцима, 0,1% СС изазива остеобластична понашања, 1% СС је резултирало смрћу ћелије. У

, одсуству коштаних ћелија нивои укупног и јонизованог калцијума и фосфора у контролним примерцима и металима дода ли су средину која

је слична оној која траје током целог периода инкубације. Значајан пад нивоа јонизованог калцијума и фосфора је уочен у средини контролних

примерака и у примерцима 0.01% изложеним СС након две недеље , инкубације што доводи до -минералних наслага калцијум фосфатних у

овим примерцима. У примерцима гајеним 0,1 1% у присуству и СС , корозионих производа нивои калцијума и фосфора су слични онима

које .посматрамо у одсуству ћелија

1. Увод

Целуларних догађаји који се одвијају у додиру кости и материјала може бити одлучујући фактор за успех на дугорочне перформансе

импланта[1-4]. Постоји брига у вези употребе металних биоматеријала , у ортопедској хирургији због ослобађања шута из имплантата и

металних јона у ткивима који се налазе у близини имплантакоји се даље дистрибуирају поцелом телу преко системске циркулације [5, 6].

Неколико студија су показале (високе концентрације метала у телесним течностима укључујући

) серум и урин пацијената који имају протезе колена и кука те су други инжењери су даље нагласили потенцијалну улогу јона и честица

ослобођених од металних имплантата у разним патолошким болестима [7-12].кости и ткива

Добре карактеристике остеобласт их ћелијских култура су коришћене као погодан ин витро модел за проучавање интеракције биоматеријала

и њихов их продуката деградације са коштаним ћелијама ткива на додиру костију и биоматеријала [13-16]. Претходно деловање обавља се

у остеогенским ћелијским културама и указују на акутне и дугорочне ефекте , металних јона пронађених у најчешће коришћеним ортопедскихим имплантатима [17-21].

Пројекти корозије 316 АИСИ Л од нерђајућег челика који су добијени електрохемијским путем су предмет интензивног истраживања у

лабораторијама. Обе ин витро и ин виво студије показале су штетне ефекте од корозионих производа импланата који су направљени од

[21-26]. ,нерђајућег челика у неколико органа и ткива У овом раду коштана срж пацова добијена у експерименталним условима који

фаворизују ширење и деорјентацију остеобласких ћелија које су гајене 316 . у присуству АИСИ Л од нерђајућег челика Контроле и третиране

културе оцењене су од стране хистохемијских тестова за идентификацију присуства алкалне фосфатазе и калцијума и фосфата

чије се таложење и испитује скенирањем електронске микроскопије ( ); СЕМ ниво укупног и јонизованог калцијума и фосфора.

Концентрације великих металних јона присутних у СС су биле у , распону од гвожђа хрома и никла нивоима који се налазе у ткивима

који се начазе у близини [27].нерђајућег челика имплантата

2. Материјал и иметоде

Металне композиције

Метал премаза 316 АИСИ Л од нерђајућег челика анодирано растворен у Ханксовој средње сланој средини ( ) ХБСС наметањем константног

потенцијала. од 4(V) 5 , током часова а резултат концентрације великих металних јона

је одређена атомска апсорпциона спектрометрија. pHПосле корекције (7,4 додавањем воденог раствора натријум хидроксида) и стерилизације

, у аутоклаву даља решења су добијена .узастопним разређења

Ћелијска култура

Примарна култура остеобласт ских , ћелија је објасвљена користећи младу коштану срж одраслих мушких Вистар пацова суспензије

. [28]. , добијене у складу са методомМаниатопоулос ет ал Укратко фемур је асептично исечен, , 2 очишћен од меких ткива и прошао кроз прања у

средини који садржи антибиотик антимикотик. , Затим епипхисес су, уклоњени а срж испрана користећи 10 20 млшприц са иглом и г садржи

- . културе ми диум Ћелија добијена суспензија је достављена, након, хомогенизације кроз три боце од по 50 мл културе које су на инкубацији

37°C , 5% CO2 95% . на у атмосфери која садржи хумидифиед и ваздухаСредина је промењена 24 часа касније да би се уклонил е не адхерентне

. ћелије Примерак средине се састојао одМЕМ- 10 допуњен са одсто феталног говеђег серума и антибиотске антимикотик а и била је два

пута недељно мењана. Ћелије прве суб ( културе добијена трипсиниса цијом 7 ћелија дана после

) 104 почетка инкубације су посејана у концентрацији од ћелија које су гајене у истим експерименталним условима тако да су исти оним који

се користе у основним примерцима ( контролни примерци), такође у 0,01, 0,1 1% присуству и од премаза од (нерђајућег челика метал но ) 18 . третиране културе за период од дана У , културама средина је

2 мењана свака дана а затим се прикупља и анализира ради .квантификације тоталних и јонизованих калцијума и фосфора На крају

(18 ) инкубационог периода дана контролне и метал но третиране културе оцењени су од стране хистохемијских тестова за

идентификацију присуства алкалне фосфатазе и калцијум и фосфати као ињихово таложење.

Хистолошкеметоде

Светлосне микроскопије

Присуство АЛП позитивних ћелија и фосфатних или калцијумских депозита су визуелно . осветљени хистохемијским мрљама Свака од

хемијских група је обојена другом бојом ради лакшег препознавања . под микроскопом На тај начин се лако може препознатишта је и у којој

.мери заступљено у ткиву

Квантификација укупног јонизованог и тоталног калцијума ифосфата

Слободни и укупни калцијум садржај у ћелијској култури су оцењивани од стране потенциометриј ,а - путем јазз са складу са тим се поступак

[30]. описан на другом месту Потенцијал је праћен помоћу калцијума на Ag / AgCl , селективну електроду и на референтна електрода а вредности

потенцијала забележене су када су очитавања стабилизовала у оквиру 0.10 5 . мВ за мин Калибрационе криве су биле спремне са стандардима

са саставу сличне културе и медија користећи одговарајући скуп концентрација. Треба истаћи и јонску снага од стандардних решења

, калцијума као и узорака које треба . 0,17 одржавати на ца мол која одговара вредности јонске јачине културе медија у циљу одржавања

равнотеже система.

Јонизовани и укупни фосфор

Неоргански (Pi) и укупни (P) фосфор су одређени користећи Фиске и Суббаров поступак. Pi, За квантификацију култура је лечен

трицлороацетицинском киселином талога протеина и липида повезаних фосфатима. Течност која плута је реаговала са амонијум

молибдат у киселом раствору па . се формира пхоспхомолибдате За P, , , квантификацију узорци медијума ћелијске културе су прво варени у

микроталасној рерни ( 65%) са азотном киселином супрапуре са циљем . , да уништи органску материју Затим добијена решења третирани су

Pi као за квантификацију. Све вредности су израчунате на основу стандардне криве које су прочитане .на истој таласној дужини Сви

подаци представљени одговарају средњој вредности, ,најмање преко . три мерења истог узорка

Резултати и дискусија

Претходне студије су показале да култура ћелије пацовске коштане сржи добијена у експерименталним условима које су описане изнад

присутних остеобластских , функција . тј висока активност алкалне фосфатазе и формирање мин ералисед екстрацелуларног матрикса.

Декаметхасоне фаворизује формирање култура остеобласт фенотипа у неколико костију са системима ћелијске културе. , У овом раду пацовске

ћелије коштане сржи су гајене 18 током дана у медијуму културе и контроле у 0,01, 0,1 1% присуству и од СС припремљене као што је

2. , описано у члану На крају инкубационог периода контрол исане и третиране културе оцењене су од стране хистохемијских тестова и . прегледао СЕМ Квантификација укупног и јонизованог калцијума и

фосфора у контроли и додате -метал култур .е

Хистохемијски тестови

Коштана срж културе гајене у контролним условима показа ла је

формирање тродимензионалне структуре које су нодуларне, непрозирне у изгледу и повећане .у величини са временом инкубације Хистохемијски тестови показују јаку позитивну реакцију на присуство

ALP e . - a и за фосфат калцијума таложења Хисто хемијск бојења су углавном повезана са тродимензионалним нодулама. Коштана срж

ћелије гајени у присуству најниже концентрације нерђајућег челичног премаза тестиран , 0,01 ог у експерименту тј показују слично понашање.

0,1 , У присуству одсто СС корозионих производа културе излажу позитивну реакцију за хистохемијска ,присуства алкалне фосфатазе

али калцијумско и фосфатно таложење није примећено.

Скенирање електронскемикроскопије

СЕМ посматрање контроле и метално третираних култура потврдио је резултате добијене на хистохемијским тестовима. Контролне културе

показал е су присуство ћелија и бројних глобуларних депозита кој е су се чиниле да спајају поново регионе . високе густине Овај аспект је у

складу са раније пријављеним другим сличним студијама у култури са топлом водом. 0.01% У присуству СС културе представљени глобуларни депозити слични онима које посматрамо . у контролним културама У

, оба случаја рендгенске микроанализе глобуларних депозита показала су Ca P . присуство и врхова

Закључци

Ова студија је показала да производи корозије од нерђајућег челика , преко одређеног нивоа утичу на неуравнотежено понашање ћелијских

, . култура коштане сржи пацова тј лоше утиче на понашање .остеоблатских ћелија

Метални јони могу да утичу на пролиферацију и деорјентацију остеобласт ких ћелија са утицајем на диференцијацију ћелије. Даља

истраживања су обавезна уколико хоћемо да више сазнамо о утицају .корошионих продуката на околно ткиво у телимаживих бића