BIOPROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ENZIMAS DE ... · BIOPROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ENZIMAS DE INTERESSE INDUSTRIAL ... para descoberta de ... de enzimas

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Interbio v.10 n.1, Jan-Jun, 2016 - ISSN 1981-3775

LUZ, Bárbara Dutra da Silva; BICAS, Juliano Lemos; SARROUH, Boutros; LOFRANO, Renata Carolina

Zanetti

BIOPROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE ENZIMAS DE

INTERESSE INDUSTRIAL REALIZADA NO PARQUE ESTADUAL SERRA DO

OURO BRANCO, BRASIL

BIOPROSPECTING MICROORGANISMS ENZYMES PRODUCERS OF INDUSTRIAL

INTEREST HELD ON SERRA DO OURO BRANCO STATE PARK, BRAZIL

LUZ, Bárbara Dutra da Silva 1; BICAS, Juliano Lemos 2; SARROUH, Boutros

3; LOFRANO,

Renata Carolina Zanetti 4

Resumo

As enzimas se apresentam como um alvo da pesquisa biotecnológica, devido principalmente a sua grande

aplicabilidade nos processos industriais. Dessa forma, a bioprospecção de bactérias produtoras de enzimas se

mostra como uma tarefa essencial para descoberta de potenciais produtores. Assim, 36 bactérias isoladas de

amostras do Parque Estadual Serra do Ouro Branco Ouro Branco, Minas Gerais, Brasil, foram analisadas para

avaliar seus potenciais quanto à produção de celulases, amilases, proteases e tanase. Foi utilizado o método de

difusão em Ágar suplementado com substratos específicos para cada enzima. Das bactérias estudadas, 44%

apresentaram atividade celulolítica, 53% atividade amilásica, 50% atividade proteolítica e nenhuma apresentou

atividade da enzima tanase.

Palavras-chave: biodiversidade microbiana, Cadeia do Espinhaço, amilases, tanases, proteases, biotechnologia.

Abstract

Enzymes present themselves as a target of biotechnology research, mainly due to its wide applicability in

industrial processes. Thus, the bioprospection of new microrganisms has proved to be an essential task for

finding potential industrial enzymes producers. Thus, 36 bacteria were isolated from the Serra do Ouro Branco

State Park, Minas Gerais, Brazil, were analyzed to assess its potential for the production of cellulase, amylase,

protease and tannase. The method of diffusion in agar supplemented with substrates specific for each enzyme

was used. Obtained results have shown that 44% of the bacteria isolated expressed cellulolytic activity, whereas,

53% presented amylase activity and 50% proteolytic activity. On the other hand, tannase enzyme activity was

not detected in the isolated bacteria.

Key-words: microbial biodiversity, Espinhaço Range, amylase, tannases, proteases, biotechnologia.

1 Universidade Federal de São João Del-Rei/UFSJ

2 Universidade Estadual de Campinas/UNICAMP

3 Universidade Federal de São João Del-Rei/UFSJ

4 Universidade Federal de São João Del-Rei/UFSJ. e-mail: [email protected]

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Zanetti

Introdução

O termo “bioprospecção” é

frequentemente utilizado para descrever a

coleta e triagem de materiais biológicos para

fins comerciais. Devido ao uso da

biodiversidade ser de suma importância para

atender demandas nas áreas de alimentação,

saúde e outras necessidades da crescente

população mundial, essa se tornou uma

atividade bastante comum na atualidade

(ARTUSO, 2002). Segundo Azevedo (2003)

um consiste na pesquisa de material

biológico com a finalidade de explorar os

recursos genéticos garantindo seu uso de

forma sustentável, com a utilização de

estratégias de conservação, garantindo a

distribuição justa e equitativa dos benefícios

advindos de sua utilização e a promoção e

regulamentação de novas tecnologias, uma

vez que este material biológico tornou-se

um recurso e a informação genética tem

valor de mercado.

O desenvolvimento sustentável é

aquele capaz de suprir as necessidades da

geração atual, sem comprometer a

capacidade de atender as necessidades das

futuras gerações. É o desenvolvimento que

não esgota os recursos para o futuro. Assim,

sendo atividades de bioprospecção podem

teoricamente, contribuir para o

desenvolvimento sustentável fornecendo

incentivos para a conservação da

biodiversidade enquanto melhoram o

desenvolvimento das capacidades

tecnológicas promovendo oportunidades de

longo prazo em termos de crescimento

econômico (SYNNES, 2007).

O conhecimento da biodiversidade e

a bioprospecção de novos organismos

tornaram-se uns dos focos principais da era

biotecnológica, visto que a utilização de

microrganismos pode apresentar soluções

nas áreas de alimento, saúde, meio ambiente

e indústria, e vem crescendo de forma

acelerada cenário mundial (OLIVEIRA et

al., 2006).

De proporções continentais que

atingem diferentes zonas climáticas, o Brasil

apresenta uma imensa diversidade de

paisagens e ecossistemas. A diversidade de

pastagens reflete a grande riqueza de

espécies, o que confere destaque ao Brasil

no conjunto de 17 países megabiodiversos,

que juntos detêm mais de 70 % da

biodiversidade do planeta (SPINHA, 2015).

Desta forma, apresenta grande

potencial para a descoberta de produtos

naturais, visto que sua biodiversidade

microbiana é uma das maiores do planeta.

Nesse contexto, o país vem passando por um

período de expansão do seu setor

biotecnológico, onde estão sendo criadas

novas empresas em busca de

competitividade internacional. Assim, a

comunidade científica se revela com grande

importância na busca de novas fontes para

produção e exportação de enzimas

(ZIMMER et al., 2009).

A Cadeia do Espinhaço é

considerada uma das regiões mais

importantes para a conservação da

biodiversidade brasileira, isso se deve ao

bom estado de conservação de grande parte

da biota original, a alta riqueza de espécies

endêmicas e a inserção em áreas de três

biomas brasileiros (Caatinga, Cerrado e

Mata Atlântica) (LEITE et al., 2008).

Reconhecida como uma das regiões com

maior diversidade florística na América do

Sul, com mais de 30% de espécies

endêmicas, a Cadeia do Espinhaço recebeu

o status de Reserva da Biosfera pela

Organização das Nações Unidades para a

Educação, a Ciência e a Cultura. Sua alta

diversidade contrasta com as graves

condições edafoclimáticas típicas de

afloramentos em geral, tais como elevada

intensidade de raios ultravioleta, variações

térmicas diárias do substrato que podem

atingir 45ºC, a perda de água acelerada e a

cobertura do solo pouco desenvolvida, o

qual, no caso de pedras de ferro são ainda

agravados por um elevado teor de metais

pesados (JACOBI E CARMO, 2008;

ALVES et al., 2007). Devido a essas

características peculiares dos locais como

condições edafoclimáticas típicas de

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Zanetti

afloramentos em geral, a Serra de Ouro

Branco constitui um excelente local para

estudos ecológicos, evolutivos e

biogeográficos (ESGARIO et al., 2008).

Parque Estadual Serra do Ouro Branco

O Parque Estadual Serra do Ouro

Branco, localizado no município de Ouro

Branco/ Minas Gerais representa o marco

inicial sul da Cadeia do Espinhaço, sua

vegetação é classificada, em sua maior

parte, como Campos Rupestres, sendo

considerada de extrema importância

biológica, apresentando um dos maiores

endemismos de toda a Cadeia do Espinhaço

(ARAÚJO et al., 2005; IEF, 2009;

RODRIGUES, 2010).

Enzimas Industriais

Enzimas são catalisadores

biológicos, em sua maioria de origem

proteica que catalisam a maioria das reações

em organismos vivos (MONTEIRO e

SILVA, 2009; SAYALI et al., 2013). A

vantagem da utilização de enzimas como

catalisadoras em processos é que estas

geralmente tornam os processos mais

rápidos, eficientes e ambientalmente

sustentáveis (MONTEIRO e SILVA, 2009).

Os microrganismos se mostram atualmente

como as principais fontes de produção de

enzimas usadas industrialmente, devido a

algumas características interessantes para

produção de enzimas como a grande

quantidade de produto em tempo

relativamente curto, a não dependência de

condições ambientais e geográficas

apropriadas e gasto reduzido no uso de

matérias primas (ZIMMER et al., 2009).

Dentre as enzimas de importância

industrial, produzidas por microrganismos,

foram abordadas neste estudo as celulases,

amilases, tanases e proteases.

Celulase é o nome dado a um

complexo de enzimas capaz de formar

glicose a partir da hidrólise de celulose.

Dessa forma, são classificadas de acordo

com o local de atuação da enzima no

substrato celulósico, sendo estas: as

endoglucanases, as que clivam ligações

glicosídicas β-1,4 internas da fibra

celulósica; as exoglucanases, as que atuam

na região externa da celulose; e as β-

glicosidases, que hidrolisam celo-

oligossacarídeos solúveis em glicose

(CASTRO e PEREIRA, 2010). Possuindo

uma ampla faixa de aplicações, as celulases

são utilizadas nas indústrias de alimentos em

processos de extração de suco de frutas,

óleos de sementes e clarificação de sucos;

na produção de rações animais, aumentando

assim sua digestibilidade; em indústrias

têxteis para desfribilação de tecidos e

desbotamento de brim; e nas indústrias de

papel e celulose (BHAT, 2000).

As amilases, ou enzimas amilolíticas,

são capazes de degradar o amido. Segundo

Gupta et al., (2003), estas enzimas são

divididas em dois grupos: i) as

endoamilases, que catalisam a hidrólise de

ligações glicosídicas α-1,4 de forma

aleatória no interior da molécula de amido,

ii) as exoamilases, que hidrolisam

exclusivamente ligações glicosídicas α-1,4

das extremidades não-redutoras, como a β-

amilase, ou ambas as ligações α-1,4 e α-1,6

terminais, como amiloglicosidase e

glicosidase. Há ainda as chamadas enzimas

desramificantes (isoamilase e pululanase),

que atuam apenas sobre as ligações

glicosídicas α-1,6 do interior da cadeia. Essa

classe de enzimas é bastante utilizada nas

indústrias de têxteis, papel e celulose, de

couro, detergentes, cervejas, bebidas

destiladas, panificação, cereais para

alimentação infantil, liquefação e

sacarificação do amido, ração animal,

indústria química e farmacêutica.

Enzimas proteolíticas catalisam a

clivagem de ligações peptídicas de outras

proteínas, hidrolisando-as totalmente.

Constituem um dos grupos mais importantes

de enzimas industriais visto que são a única

classe de enzimas que ocupam uma posição

central no que diz respeito às suas

aplicações em ambos os campos fisiológicos

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Zanetti

e comerciais, representando aproximada-

mente 60 % do mercado total de enzimas

(KUMAR et al., 2005; RAO, 1998).

Comumente conhecida como tanase,

a tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20) é uma

enzima que hidrolisa ligações ésteres e

ligações laterais de taninos hidrolisáveis,

produzindo glicose e ácido gálico. A tanase

tem sua produção induzida na presença de

ácido tânico por fungos, bactérias e

leveduras. Essa enzima possui grande

potencial de aplicação industrial, como no

processamento de chá instantâneo,

fabricação de vinhos, clarificação de sucos,

tratamento de efluentes, produção de ácido

gálico, detanificação de ração animal, entre

outros. No entanto, na literatura são poucos

os casos comerciais evidenciados destas

aplicações, devido essencialmente ao seu

elevado custo de produção (BATESTIN et

al., 2004; LEKHA e LONSANE, 1997).

Em virtude do elevado potencial

microbiológico da Cadeia do Espinhaço, à

crescente aplicabilidade de enzimas na área

biotecnológica e a inexistência de estudos na

literatura, torna-se viável selecionar e

identificar bactérias produtoras de enzimas.

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi

investigar a potencialidade de bactérias

isoladas de diferentes substratos do Parque

Estadual Serra do Ouro Branco para a

produção de enzimas de aplicação industrial.

Mercado global de enzimas

Enzima é um produto muito bem

estabelecido na área de biotecnologia em

que as vendas foram de US$ 1,3 bilhão em

2002, US$ 5,1 bilhões em 2009 para 7

bilhões em 2013 (WALTON et al. 2010,

SAHA, 2004).

A demanda por enzimas industriais

em economias amadurecidas, como os EUA,

Europa Ocidental, Japão e Canadá foi

relativamente estável durante os últimos

tempos, enquanto que as regiões com

economia em desenvolvimento como

Oriente Médio, Ásia-Pacífico, Europa

Oriental e África, emergiram como

mercados que mais crescem para indústrias

de enzimas. O aumento da procura de várias

enzimas especiais, polimerases e nucleases,

juntamente com o crescimento robusto nos

mercados de alimentos para animais, são

susceptíveis de orientar o crescimento no

mercado de enzimas industriais. Estados

Unidos e Europa comandam coletivamente

uma parte importante do mercado mundial

de enzimas industriais. Por outro lado, a

Ásia-Pacífico está pronta para registrar a

taxa anual de crescimento composta de mais

de 8,0 % durante o período analisado

(GUIMARÃES, 2014).

Em relação ao mercado mundial de

enzimas industriais, um relatório recente

publicado pela BBC Research (BBC

RESEARCH, 2014) afirma que o mercado

mundial de enzimas industriais alcançou um

valor de US$ 3,3 bilhões em 2010. A

expectativa é que este mercado atinja 4,4

bilhões de dólares em 2015, uma taxa de

crescimento anual composta (CAGR) de 6%

em relação ao período de previsão de 5

anos.

Enzimas técnicas foram avaliadas em

mais de US$ 1 bilhão em 2010. Esse setor

irá crescer a uma taxa composta de

crescimento anual de 6,6 % (CAGR) para

chegar a US$ 1,5 bilhão em 2015. As

maiores vendas de enzimas técnicas

ocorrem no mercado de couro, seguido do

mercado de bioetanol. Por outro lado, os

segmentos de enzimas alimentares e de

bebidas devem chegar a aproximadamente

1,3 bilhão de dólares até 2015, de um valor

de 975.000 mil dólares em 2010, crescendo

a uma taxa composta de crescimento anual

(CAGR) de 5,1%. Dentro do segmento de

enzimas alimentares e de bebidas, o

mercado de leite e produtos lácteos teve as

maiores vendas, com 401.800 mil dólares

em 2009 (BBC RESEARCH, 2014).

Os principais produtores de enzimas

estão localizados na Europa, EUA e Japão.

Dinamarca está dominando com

empreendedores como Novozymes (45 %) e

Danisco (17 %), seguida por Genencor

(EUA), a DSM (Holanda) e BASF

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Zanetti

(Alemanha) (Saha, 2004). O ritmo de

desenvolvimento em mercados emergentes

sugere que as empresas da Índia e da China

participem deste grupo restrito em um futuro

muito próximo (SAHA, 2004; PANDEY et

al., 2008).

Outro relatório de pesquisa

publicado recentemente no mercado de

enzimas (WALTON et al., 2009) destacou o

fato de que as proteases constituem o maior

segmento do produto no mercado mundial

de enzimas industriais e o mercado de

carboidrases é projetada para ser o segmento

de produtos que mais cresce, com uma taxa

de mais de 7,0 % em relação ao período de

análise

Setores como a indústria

farmacêutica e de bioetanol conseguiram

chamar a atenção significativa dos

investidores e são auto-suficientes na

realização de novas atividades de

desenvolvimento de produtos e no

lançamento de produtos inovadores no

mercado, oferecendo assim novas

oportunidades para os fabricantes de

enzimas industriais. No entanto, segmentos

como produtos químicos de tratamento de

águas residuais e de papel e celulose não

têm recursos suficientes para a realização de

novos desenvolvimentos de produtos

(WALTON et al., 2009).

De acordo com Pitman (2011), um

relatório recente sobre o uso de enzimas na

indústria de cosméticos aponta que para este

segmento é estimado um crescimento de 5

% a cada ano até 2015. Pesquisadores deste

mercado destacam o fato de que as

demandas industriais para enzimas estão

sendo impulsionadas pelas novas

tecnologias e pelo aumento de uso de

compostos orgânicos no lugar de

ingredientes à base de petroquímicos.

Material e Métodos

Coleta das amostras

Foram coletadas dez amostras, sendo

estas: água, briófitas, solo, terra de

cupinzeiro, folhas e caule de árvores e

bromélias, em nove diferentes pontos,

identificados via Sistema de Posicionamento

Global (GPS), de um local no Parque

Estadual Serra do Ouro Branco onde a

vegetação é caracterizada como Mata de

Galeria.

Isolamento das bactérias

Para o isolamento da população de

microrganismos presentes nas briófitas,

folha, caule de árvore e bromélias, foram

retirados pequenos fragmentos das amostras

que foram colocadas em contato direto com

o meio de cultura em dois tempos de

contato: 0h (adicionar a amostra e remover

imediatamente) e 24 h (de contato da

amostra com o meio) (FUENTEFRIA e

VALENTE, 2005). Para a incubação da

água foi retirada um alíquota de 1 mL da

amostra e esta foi colocada diretamente no

meio sólido; já as amostras de solo e de terra

de cupinzeiro foram inoculadas colocando-

se uma pequena quantidade das mesmas nas

placas contendo o meio. O meio de cultura

utilizado foi o Yest Malt Ágar (YMA) (g/L-

1): extrato de malte, 3; extrato de levedura,

3; peptona, 5; glicose, 10; Ágar, 17. Logo

em seguida as placas foram incubadas a

28ºC até o crescimento das colônias

Após o aparecimento das colônias

fez-se a purificação no mesmo meio, através

da técnica de esgotamento por estrias, para a

obtenção de um único tipo de bactéria. As

bactérias isoladas foram mantidas a 4 ºC, em

tubos de ensaio com Ágar inclinado

contendo o meio YMA, sendo repicados a

cada 30 dias.

Caracterização morfológica dos

microrganismos

Para caracterização morfológica

foram preparadas lâminas a fresco aliadas à

técnica de coloração Gram, identificando as

bactérias mediante suas características

morfológicas e da coloração das células

(MARTINS et al., 1997).

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Zanetti

Teste qualitativo para a produção de

enzimas em mio sólido

As bactérias isoladas foram testadas

quanto à habilidade de produção das

enzimas pela realização do método de

difusão em Ágar. Neste procedimento, cada

micro-organismo isolado foi inoculado com

alça em forma de agulha em meios de

culturas específicos para detecção das

atividades enzimáticas, distribuídos em

placas de Petri. Logo após a inoculação as

placas foram incubadas por 96 horas a 28

ºC. Os resultados positivos foram detectados

pela formação de halos ao redor das

colônias. Foi calculado para cada micro-

organismo o índice enzimático (IE)

considerado como a razão entre os

diâmetros médios dos halos de degradação

dos substratos e os diâmetros médios das

respectivas colônias (HANKIN e

ANAGNOSTAKIS, 1975). Os testes foram

feitos em triplicata.

Atividade Celulolítica

O meio descrito por Nogueira e

Cavalcanti (1996) foi usado para determinar

a atividade celulolítica, sendo este composto

por (g.L-1

): NaNO3, 3,0; (NH4)2SO4, 1,0;

MgSO4, 0,5; KCl, 0,5; FeSO4.7H2O, 10;

Carboximetilcelulose (CMC), 10,0; Ágar,

20,0. Atividade enzimática evidenciada por

halo claro ao redor da colônia após a placa

ser revelada com solução de iodo.

Atividade Amilolítica

A habilidade de degradar amido foi

usada como critério para determinação da

produção de enzimas amilolíticas. Assim o

meio Ágar Nutritivo foi suplementado com

0,2% de amido solúvel e vertido em placas

de Petri. Atividade enzimática evidenciada

da mesma forma que a atividade celulolítica

(HANKIN e ANAGNOSTAKIS, 1975).

Atividade Proteolítica

Para detecção da atividade

proteolítica foi utilizado o meio Ágar-

gelatina-leite (g.L-1

): Ágar, 18,0; Leite em

pó desnatado, 10,0; Gelatina em pó, 10,0

(ORLANDELLI, et al., 2011). A produção

de proteases é observada nas placas de

Ágar-gelatina-leite sem a necessidade de um

revelador, onde o resultado positivo

identificado pela formação de halos claros

ao redor da colônia (SOUSA et al., 2008).

Atividade Tanásica

Para seleção de microrganismos

produtores de tanase foi utilizado um meio

constituído de (g.L-1

): ácido tânico, 10;

NaNO3, 3; KH2PO4, 1; MgSO4, 0,5; KCl,

0,5; FeSO4, 0,1; Ágar, 25 (NADAF e

GHOSH, 2011). A presença de atividade

tanásica é revelada com a formação de um

halo acastanhado ao redor da colônia.

Resultados e Discussão

As dez amostras coletadas (Tabela 1)

tiveram sua localização definida por um

aparelho de localização no Sistema de

Posicionamento Global, esta localização é

importante para continuação de novas

pesquisas na área, visto que isso permite que

outros pesquisadores tenham acesso ao local

no qual as amostras foram coletadas.

Destas dez amostras foram isoladas

36 bactérias. Sendo que destas apenas 28 %

são Gram positivas. Os variados tipos

morfológicos e as cores das colônias são

apresentados na tabela 2. Na maioria das

amostras observou-se a predominância de

bactérias Gram negativas, somente a

amostra de solo apresentou bactérias

exclusivamente Gram positivas.

A utilização de meios sólidos

suplementados com reagentes específicos é

uma metodologia padrão para a seleção de

microrganismos produtores de enzimas.

Assim, as 36 bactérias isoladas inicialmente

em meio YMA foram inoculadas em meios

específicos que continham

carboximetilcelulose, amido solúvel, leite

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Zanetti

em pó desnatado e ácido tânico para seleção

dos produtores respectivamente, das

enzimas celulase, amilase, protease e tanase.

A tabela 3 apresenta os dados da produção

enzimática das bactérias ensaiadas. Destas

86% foram capazes de produzir pelo menos

uma das enzimas estudadas. Diversas

indústrias são favoráveis à seleção de

microrganismos de ocorrência natural pelo

fato destes serem mais facilmente aprovados

para a comercialização do que os

geneticamente modificados (STEELE e

STOWERS, 1991).

Tabela 1 - Amostras coletadas no Parque Estadual Serra do Ouro Branco e

suas respectivas localizações no Sistema de Posicionamento Global (GPS).

Amostras Localizações georreferenciadas

Água 20°28'51,7'' S e 43°43'00,8'' W

Briófita preta 20°28'49,4'' S e 43°43'04,3'' W

Briófita verde 20°28'50'' S e 43°43'03,8'' W

Solo 20°28'49'' S e 43°13'04,4'' W

Terra de cupinzeiro 20°28'48,7'' S e 43°43'04,7'' W

Folha de árvore 1 20°28'50,6'' S e 43°43'04,8'' W

Folha de árvore 2 20°28'49,8'' S e 43°43'04,0'' W

Caule de árvore 20°28'50,6'' S e 43°43'04,8'' W

Bromélia 1 520°28'51,7'' S e 43°43'00,3''W

Bromélia 2 520°28'52'' S e 43°43'00,3'' W

Lealem e Gashe (1994) consideram

um micro-organismo como produtor

potencial de enzimas em meio sólido,

quando este apresenta um índice enzimático

≥ 2,0. Neste contexto, todas as bactérias

testadas produtoras de celulase podem ser

consideradas como produtoras potenciais da

enzima visto que apresentaram índice

enzimático variando de 2,3 a 12,7 cm. Já

para a produção de amilase o índice

enzimático variou de 1,6 a 16,7 cm, com

apenas uma com índice abaixo de 2,0 cm e

para a produção de protease pode observar

que o índice enzimático variou de 1,7 a 4,9

cm com quatro bactérias com índice abaixo

de 2,0 cm. A diferença de intensidade

observada entre os halos dos

microrganismos possivelmente se deve a

quantidade de enzima extracelular excretada

pelos microrganismos (Figura 1).

(a) (b)

Figura 1 - Exemplos de produção de halo de hidrólise para a quantificação de

enzimas (a) com atividade celulolítica e (b) com atividade proteolítica (Fonte:

Original do autor).

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Zanetti

Tabela 2 - Caracterização fenotípica dos microrganismos isolados na bioprospecção. Microrganimos

Isolados Amostras Cores das colônias

Morfologia celular

Coloração de Gram

1 Bromélia 1 Branco Cocos Gram -

2 Bromélia 1 Amarelo Bastonetes Gram+ 3 Bromélia 1 Laranja Bastonetes Gram+

4 Bromélia 2 Marrom claro Cocos Gram - 5 Bromélia 2 Bege claro Cocos Gram -

6 Bromélia 2 Branco Cocos Gram -

7 Bromélia 2 Laranja Cocos Gram -

8 Bromélia 2 Bege/claro Cocos Gram -

9 Bromélia 2 Laranja Bastonetes Gram+

10 Bromélia 2 Amarelo Cocos Gram -

11 Bromélia 2 Bege/claro Cocos Gram -

12 Bromélia 2 Bege Cocos Gram -

13 Bromélia 2 Laranja/claro Cocos Gram -

14 Bromélia 2 Bege Bastonetes Gram -

15 Briófita verde Bege Cocos Gram -

16 Briófita verde Branco Cocos Gram -

17 Briófita verde Branco Cocos Gram -

18 Briófita verde Bege/claro Batonetes Gram -

19 Folha de árvore 1 Laranja Bastonetes Gram -

20 Folha de árvore 1 Laranja/forte Cocos Gram +

21 Folha de árvore 1 Laranja/forte Cocos Gram -

22 Caule de árvore Branco Cocos Gram -

23 Caule de árvore Amarelo/forte Bastonetes Gram -

24 Terra de cupinzeiro Branco Bastonetes Gram+

25 Terra de cupinzeiro Branco Cocos Gram -

26 Folha de árvore 2 Amarelo Cocos Gram +

27 Água Rosa Cocos Gram -

28 Água Roxo Bastonetes Gram -

29 Água Amarelo Cocos Gram -

30 Água Branco Bastonetes Gram -

31 Água Bege Cocos Gram -

33 Briófita preta Branco Bastonetes Gram+

34 Briófita preta Branco Bastonetes Gram -

35 Solo Branco Bastonetes Gram+

36 Solo Branco Bastonetes Gram+

Após revelar as placas de Ágar

suplementado com CMC e amido com

solução de iodo, a zona clara ao redor das

colônias, correspondente ao halo de

degradação, foi observada, respectivamente

em 44 % e 53 % das bactérias isoladas. Foi

observado que as bactérias que

apresentaram maiores halos de degradação

em meio para seleção de produtores de

celulase foram as bactérias 3 (bromélia 1), 9

(bromélia 2) e 19 (folha de árvore 1)

apresentando índices enzimáticos de 12,7 ±

1,0, 11,8 ± 2,3 e 9,3 ± 0,6 cm,

respectivamente. Quanto às bactérias

produtoras de amilase, as que apresentaram

os maiores halos foram as 3 (bromélia 1), 9

(bromélia 2), e 14 (bromélia 2), com halos

de, respectivamente, 9,6 ± 0,3, 8,0 ± 0,5 e

16,7 ± 1,2 cm (Tabela 3).

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Zanetti

Tabela 3 - Relação de índices enzimáticos da produção das enzimas

pelos microrganismos isolados na bioprospecção.

Microrganimos

Isolados

Índices Enzimáticos (IE)

Celulase** Amilase** Protease**

1 6,0 ± 0,8 1,6 ± 0,2 -

2 - - 4,7±0,2

3 12,7 ± 1,0 9,6 ± 0,3

-

4 2,5 ± 0,3 - 1,7 ± 0,1

5 -

4,0 ± 0,4 -

6 - 4,4 ± 0,1 -

7 - - 1,8 ± 0,2

8 - 3,3 ± 0,1 -

9 11,8 ± 2,3 8,0 ± 0,5 -

10 6,9 ± 0,6 3,9 ± 0,1 -

11 6,8 ± 0,7 4,2 ± 0,2 -

12 7,8 ± 0,4 3,4 ± 0,1 -

13 6,3 ± 0,2 - 1,8 ± 0,1

14 - 16,7 ± 1,2 -

15 - - 2,50 ± 0,02

16 - - 1,9 ± 0,4

17 - - 3,8 ± 0,3

18 - - 4,9 ± 1,1

19 9,3 ± 0,6 7,7 ± 0,2 -

20 7,2 ± 0,2 4,9 ± 1,1 2,7 ± 0,1

21 - 4,0 ± 0,3 4,0 ± 0,8

22 3,8 ± 0,4 3,0 ± 0,2 -

23 - - -

24 3,5 ± 0,1 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,4 25 7,8 ± 0,3 4,4 ± 0,2 -

26 - 3,1 ± 0,5 2,7 ± 0,5

27 - - 2,1 ± 0,2

28 7,6 ± 1,5 - 2,4 ± 0,4

29 - - -

30 - - -

31 - - -

33 - - 2,7 ± 0,3

34 - - -

35 2,3 ± 0,2 2,9 ± 0,7 3,3 ± 0,7

36 4,8 ± 0,4 2,3 ± 0,3 2,1 ± 0,2 * Índice enzimático: razão entre os diâmetros médios dos halos de degradação dos

substratos e os diâmetros médios das respectivas colônias.

** Média dos testes em triplicata.

A produção da enzima tanase não foi

detectada em nenhuma das bactérias

isoladas. Em geral as bactérias são muito

sensíveis à presença de ácido tânico, sendo

os fungos filamentosos os microrganismos

mais estudados quanto à produção de tanase

e degradação do ácido tânico (LEKHA e

LONSANE, 1997). Dessa forma, uma forma

mais eficiente de isolar bactérias produtoras

de tanase é a bioprospecção em áreas onde é

22



Zanetti

rica a presença de taninos, como no estudo

feito por Peter et al. (2009) no qual foram

isolados 6 bactérias produtores de tanase de

ambientes próximos a efluentes de curtume.

Quanto à atividade proteolítica, foi

observada em 50 % dos isolados. Resultado

este superior ao percebido por Sanomiya e

Nahas (2003) que obtiveram 38 % de

bactérias produtoras de proteases,

selecionadas de solo cultivado com

braquiária. As bactérias que apresentaram

maiores halos quanto à produção de protease

foram 2 (bromélia 1), 18 (briófita verde) e a

21 (folha de árvore 1), apresentando halos

de 4,7 ± 0,2, 4,9 ± 1,1 e 4,0 ± 0,8,

respectivamente (Tabela 3).

A riqueza de bactérias isoladas

produtoras de enzimas possivelmente se

deve ao fato de a Serra de Ouro Branco ser

caracterizada por abrigar um tipo de

ecossistema bastante variado e peculiar,

onde os microrganismos ali inseridos muitas

vezes apresentam diversidade relacionada às

necessidades adaptativas em relação ao

ambiente (RODRIGUES, 2010).

Conclusões

As pesquisas em áreas naturais são

necessárias para se mapear novas fontes de

biodiversidade. Na bioprospecção realizada

no Parque Estadual Serra de Ouro

Branco/MG das 10 amostras coletadas,

foram obtidos 46 diferentes micro-

organismos. Assim sendo, consideramos que

essa localidade é altamente promissora em

termos de bioprospecção de novos

microrganismos.

As técnicas de isolamento adotadas,

bem como, as fontes das amostras de

microrganismos mostraram-se eficientes

para a obtenção de bactérias produtoras das

enzimas celulase, amilase e protease. Sendo

que 86 % das bactérias testadas

apresentaram atividade em relação a um dos

substratos testados, confirmando o potencial

das bactérias de origem natural do Parque

Estadual Serra do Ouro Branco como

secretoras de enzimas de aplicabilidade

industrial.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Instituto

Estadual de Florestas da Secretaria de

Estado de Meio Ambiente e

Desenvolvimento Sustentável do Governo

do Estado de Minas Gerais pela autorização

para a coleta e transporte de material

botânico para fins científicos no Estado de

Minas Gerais. Autorização COL: 006/13 e

Processo SIGED – IEF/DPBIO/GPROP:

0000003821012013-15; e à Universidade

Federal de São João Del Rei/UFSJ pela

bolsa concedida.

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