Upload
others
View
22
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Electroforesis en gel de agarosa
Bioquímica Experimental
2020-1
Q.A. Moisés Méndez Ramírez
Principio
Las moléculas (carga -) son separadas de acuerdo al tamaño cuando se someten a un campo eléctrico.
Estas migran a través de la matriz del gel al ánodo (carga +).
Cátodo
Ánodo
CARGA
PO4-
La electroforesis en gel de agarosa es una técnica que nos permite separar moléculas de ácidos nucleicos (DNA y RNA).
Electroforesis de campo pulsadoEsta técnica nos permite separar moléculas grandes de DNA (cromosomas, i.e >25 kb.), mediante la aplicación de pulsos eléctricos en posición ortogonal.
Las moléculas de reorientan cada que cambia la dirección del campo, provocando una migración en zig-zag.
Cromosomas de levadura
Procedimiento experimental
Video “DNA electrophoresis sample loading”
https://www.youtube.com/watch?v=tTj8p05jAFM
Elaboración del gel
Preparación de cámara de electroforesis
Preparación y adición de
muestra
Corrimiento electroforético
Visualización
Preparación del gel Agarosa es un polímero aislado de algas del genero Gellidium y Gracilaria que consiste en subunidades repetidas de L- y D-galactosa
Los geles de agarosa permiten separar fragmentos de entre 100 bp y 25 kb dependiendo de su concentración.
La agarosa funde de <90 a ≤50 °C dependiendo del tipo.Puede fundirse en calentamiento directo, baño o microondas.
Preparación de muestras
Para adicionar la muestra se usa solución de carga.
▪Colorantes azul de bromocresol y xylen cyanol.Monitorean el progreso de la electroforesis.
▪Glicerol (5-10%)Aumenta la densidad y permite que se mantenga en el pozo.
▪EDTA. Agente desnaturalizante que detiene reacciones enzimáticas. (Opcional).
La concentración de la muestra va de 1-10 ng de DNA por banda y no debe exceder 10 µg ya que se satura la señal.
La muestra se adiciona una vez colocado el gel en la cámara con el buffer de corrida
Preparación de la cámara y corrimiento
TIPOS DE BUFFER DE CORRIDA:
▪TAE (Tris-acetato EDTA)
Buena resolución. Bajo voltaje
▪TBE (Tris-borato EDTA)Resolución fragmentos < 3kb
▪SB (Borato de sodio)Baja conductividad. Alto voltaje
Una alta concentración de sales y una corriente elevada, producirán resistencia y calentarán el medio, afectando la resolución de las bandas en el gel.
Para correr la muestra se coloca un buffer de corrida a una concentración 1X en la cámara. Contiene sales que proporcionan fuerza iónica, facilitando la migración de las cargas.
Variables en la metodologíaHay algunas variables que pueden modificar la movilidad del DNA en los geles durante la electroforesis
▪Composición del gel de agarosa: 0.5-2.0 % agarosa
▪Buffer de corrida: TAE y TBE 1X
▪Campo eléctrico: 0.5-10 V/cm
Visualización: tinción del gelTinción con Bromuro de etidio.
Agente fluorescente que absorbe en la región de UV (300-360 nm) y puede intercalarse entre las bases del DNA.
Detección límite: 0.5-5.0 ng DNA/banda.
Usualmente se añade al gel a una concentración 0.5 µg/mL
(Mutagénico)
Visualización con otros colorantesExisten otros marcadores que permiten observar el DNA que varían en la sensibilidad y pueden ser más seguros ya que no intercalan en el DNA.
(Haines, A. et. Al. Electrophoresis 2015, 36, 941-944.)
Cosas que pueden salir mal
Voltaje inadecuado Insuficiente concentración de Iones
• Picar el pozo al cargar la muestra.
• Contaminar la muestra.• No colocar marcador.• Mala calidad de la muestra• Elevado tiempo de corrida.
(Se te fue tu muestra del gel).• Concentración errónea de
Buffers de corrida. • Exceso en la concentración
DNA.
Muestra degradada
Aplicación. Expresión cualitativa de un gen
Tres especies de TrichodermaT. atrovirideT. virens T. asperellum
Control
T. atroviride
T. asperellum
T. virens
Modificación de la arquitectura de la raíz
en maíz
¿Qué pasa en la parte aérea?Medición de expresión de transportadores SWEETs
Obtención RNA
C. Control, Ta T. asperellum, Tv T. virens y Tat T. atroviride.
RT-PCR de SWEETsde hoja
Producción cDNA
Análisis de expresión