Bioquímica – L. Stryer, J.M. Berg y J.L. Tymoczko.

Quinta Edición, Editorial Reverté, S.A., Barcelona,

2003.

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Usuario: iib Contraseña: unsam

Clases teóricas: Lunes de 17 a 19 hs. y Martes de 15 a 17

hs., Aula 14, Corona del Tornavías, o en el Auditorio del IIB.

Ejercicios y Problemas: Martes de 17 a 21. 30 hs, Aula 14.

Trabajos Prácticos: Martes de 17 a 21. 30 hs, Salones de

TPs del IIB.

En esta asignatura les daremos un panorama general de cómo

se llevan a cabo los procesos químicos que transcurren en una célula

viva. Veremos las enzimas, catalizadores biológicos que permiten que

muchas reacciones químicas se lleven a cabo al mismo tiempo, sin

producir productos secundarios. Estudiaremos los carbohidratos y el

metabolismo energético, comenzando por la glucólisis, siguiendo con el

ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la cadena respiratoria. Veremos los

lípidos y su metabolismo, lo mismo que la síntesis y degradación de los

aminoácidos; la fotosíntesis y otros procesos biosintéticos, como la

síntesis y luego la degradación del glucógeno en los animales.

Finalmente, estudiaremos los ácidos nucleicos y su papel fundamental en

la conservación de la información genética y en la traducción de esa

información al nivel de las proteínas.

Dado que la inmensa mayoría de los procesos que ocurren en la

célula son ejecutados por las proteínas, empezaremos con el estudio de

estas moléculas, iniciándolo con las unidades que las forman, los

aminoácidos.

LOS AMINOACIDOSUn aminoácido, como su nombre lo indica, es una molécula orgánica pequeña

que contiene un grupo amino y un grupo carboxilo. Todos los aminoácidos

presentes en las proteínas tienen ambos grupos unidos al mismo átomo de C y,

con una excepción, todos presentan isomería óptica y pertenecen a la serie L.

Son L-a-aminoácidos.

Aminoácidos con cadenas laterales alifáticas

Prolina

Aminoácidos aromáticos

Aminoácidos con oxhidrilos alcohólicos y la cisteína con -SH

Aminoácidos básicos

Aminoácidos ácidos y sus amidas en el carboxilo distal

Formas ionicas de la L-

alanina.

Los aminoacidos se

encuentran realmente en

la forma de zwitterion

(Bjerrum, 1923)

Formas iónicas y

curva de

titulación de la

glicina.

Grupos

ionizables

de las

proteínas y

sus valores

de pKa

LAS PROTEINAS:

ESTRUCTURA Y

PLEGAMIENTO

ESTRUCTURA Y FUNCION DE LAS PROTEINAS.

Las proteínas son polímeros de aminoácidos unidos por uniones

amida, llamadas uniones peptídicas.

La cadena polipéptídica constituye la estructura primaria de la

proteína, dada por la secuencia de los residuos de aminoácidos.

Para ser funcional, una proteína globular requiere niveles

superiores de estructura, que la llevan a su forma

tridimensional, esencial para su función. Esos niveles

estructurales son las estructuras secundaria, terciaria y,

eventualmente, cuaternaria (si se trata de un oligómero con

subunidades iguales o diferentes).

NIVELES ESTRUCTURALES EN LAS PROTEÍNAS.

1) Estructura primaria: Secuencia de aminoácidos.

Unión peptídica exclusivamente.

N-terminal C-terminal

Angulos de rotacion del

carbono alfa.

2) Estructura secundaria: Disposición espacial de

residuos de aminoácidos cercanos en la secuencia.

Unión hidrógeno involucrando el N y el O de las

uniones peptídicas exclusivamente. Tres

elementos principales de estructura secundaria:

a-hélice, estructura b (hoja plegada) y giros b.

1 residuo: 1.5 Ǻ, rotación 100º. 3.6 residuos por vuelta de la hélice. Paso de la hélice: 1.5 x

3.6 = 5.4 Ǻ. La hélice forma un cilindro compacto, y los R se disponen hacia afuera.

Las cadenas están extendidas, y la distancia entre residuos contiguos es de 3.5 Ǻ. Los grupos R

van hacia arriba y hacia abajo, alternativamente.

Hojas b paralela y anti-paralela

3) Estructuras supersecundarias: motivos y

dominios.

ESTRUCTURA DE LA CITRATO SINTASA

Está formada por dos subunidades; cada una de ellas presenta dos

dominios: uno chico, en amarillo, y uno grande en azul. El sitio activo está

en una hendidura entre ambos dominios y queda junto a la interfase entre

las subunidades. Al unirse el oxaloacetato, el amarillo se desplaza y se

aproxima al azul de la otra subunidad. Este cambio conformacional permite

la unión de la acetil-CoA.

4) Estructura terciaria: Disposición espacial de

residuos de aminoácidos lejanos en la secuencia.

Interacciones hidrofóbicas, fuerzas de Van der

Waals, puentes de hidrógeno entre restos laterales o

entre ellos y la cadena peptídica, uniones salinas,

puentes disulfuro.

5) Estructura cuaternaria: Disposición espacial de

las subunidades en proteínas oligoméricas.

Interacciones hidrofóbicas, uniones puente

hidrógeno y salinas.

PUENTE DISULFURO: SOLO EN ESTRUCTURA TERCIARIA

DISTRIBUCION DE LOS RESIDUOS DE AMINOACIDOS EN LA MIOGLOBINA.

Residuos hidrofobicos en amarillo, cargados en azul y el resto en blanco. (B): corte de la

molecula, mostrando que los residuos hidrofobicos se encuentran en buen parte en su interior

MODIFICACION POST-TRADUCCIONAL DE PROTEINAS.

Muchas proteínas no están “terminadas” cuando se completa la traducción,

y requieren “madurar”, a través de modificaciones post-traduccionales.

Estas modificaciones pueden consistir en:

Modificación covalente de residuos de aminoácidos (más de 200).

Proteólisis parcial.

Las modificaciones pueden ser:

Reversibles o irreversibles.

Presentes en todas las moléculas o sólo en algunas.

Enzimáticas o no enzimáticas.

Co-traduccionales, post-traduccionales inmediatas, o post-traduccionales tardías.

Modificacion post-traduccional de las proteinas.

Algunos ejemplos:

PROTEINAS INTRINSECAMENTE DESORDENADAS

(PROTEINAS INTRINSECAMENTE NO ESTRUCTURADAS)

• Desde comienzos del Siglo XXI se han descripto numerosasproteínas que presentan una estructura flexible o un plegamientoazaroso en la mayor parte de su extensión.

• De acuerdo al concepto clásico, estas proteínas no seríanfuncionales; sin embargo, se ha demostrado que proteínas coneste tipo de plegamiento están involucradas en diferentes vías deseñalización, algunas son factores transcripcionales, receptores demembrana, o bien son proteínas abundantes en algunos tejidos dediferentes organismos.

• Los proyectos genoma de eucariotes permiten predecir quealrededor de un 30 % de las proteínas codificadas serían proteínasparcial o totalmente desordenadas.

• Es posible que la flexibilidad estructural no se dé o se dé muchomenos en el ambiente intracelular, comparado con lo que seobserva en solución acuosa.

• A: Ribulosa 1,5-bisfosfato carboxilasa-oxigenasa de espinaca, proteínaglobular

• B: Factor de inicio de la traducción (eIF1A) humano, la mayor parte decuya estructura es desordenada.

En general estas proteínas presentan una composición de

aminoácidos particular. Son proteínas de baja complejidad que

tienen una baja abundancia o carecen de aminoácidos

hidrofóbicos y/o voluminosos (Val, Ile, Met, Phe, Trp, Tyr), que

promueven el plegamiento espontáneo de las proteínas

globulares, y poseen una alta proporción de aminoácidos

cargados o polares (Gln, Ser, Pro, Glu, Lys, Arg) y en algunos

casos tienen una alta abundancia de aminoácidos pequeños (Gly,

Ala).

Se sabe que estas proteínas tienen la capacidad de fluctuar

entre diferentes estados conformacionales en una escala de nano

a micro-segundos. Esta alta flexibilidad por unidad de tiempo les

da la habilidad de interaccionar con distintas moléculas, o de

modos diferentes con la misma molécula. Por ejemplo, las

proteínas p21 y p27 actuando sobre quinasas dependientes de

ciclinas (CDKs), pueden actuar como activadoras o inhibidoras

de las mismas.

PROTEINAS FIBROSAS

Las proteínas fibrosas se dividen en general en tres grupos, dependiendo

de la estructura secundaria de las moléculas individuales: las a-hélices

super-enrrolladas, la triple hélice del colágeno, y las hojas b en las fibras

amiloides y las sedas.

Las fibras en a-hélice de la lana son flexibles, pueden ser estiradas hasta

el doble de su longitud, y son elásticas, retornando a su longitud inicial

cuando se libera la tensión. Las fibras del colágeno son fuertes,

resistentes al alargamiento y relativamente rígidas. Las fibras con hojas b

son fuertes y muy flexibles. Las fibras de la seda de araña son mas

resistentes que un hilo de acero de las mismas dimensiones, pero son

muy flexibles.

PROTEINAS FIBROSAS

Dos o mas a-helices pueden enrrollarse sobre si mismas para formar

“superhélices” muy estables de hasta 1000 Ǻ de longitud. Estas

estructuras se encuentran en proteínas fibrosas como la miosina y la

tropomiosina del músculo, la fibrina de los coágulos sanguíneos y la

keratina del pelo. La interacción entre las a-hélices se hace habitualmente

por interacciones hidrofóbicas, a menudo mediadas por Leu o Ileu.

El colágeno es muy rico en prolina, hidroxiprolina y glicina. Uno de cada

tres residuos es Gly.

El colágeno es una molécula en forma de bastón, de hasta 3000 Ǻ de largo

y sólo 15 Ǻ de diámetro. Es la proteína mas abundante en los mamíferos,

siendo el componente fibroso principal de la piel, los huesos, los cartílagos

los tendones y los dientes. Está formado por una triple hélice, diferente de

la a-hélice (no se mantiene cada hebra por puentes de hidrógeno internos,

sino por la repulsión estérica de Pro y HyPro). Cada hebra de procolágeno

tiene dos “cabezas” globulares, una en cada extremo, necesaria para el

ensamblado de la fibra, que luego se elimina. Por eso al desnaturalizarlo,

no se renaturaliza, y forma gelatina.

EL COLAGENO

LA TRIPLE

HELICE DEL

COLAGENOEn el interior de la triple

hélice no queda espacio

para un aminoácido de

mayor tamaño que la gly.

PROTEINAS DE

MEMBRANA

A diferencia de las proteínas globulares solubles, que concentran

sus residuos hidrofóbicos en su interior, resguardándolos del

agua, las proteínas integrales de membrana tienen la mayoría de

sus residuos hidrofóbicos en su superficie, interaccionando con

los lípidos de la membrana.

PROTEINAS DE MEMBRANA.

Proteínas integrales y Proteínas periféricas

Prostaglandina H2 sintasa-1. Sintetiza la prostaglandina H2 a

partir de ácido araquidónico proveniente de lípidos de la

membrana, en dos etapas.

La aspirina inhibe la síntesis de la prostaglandina H2, acetilando

la Ser 530, lo que bloquea el conducto hidrofóbico e inhibe la

actividad de ciclooxigenasa.

PLEGAMIENTO DE LAS

PROTEINAS.

LA RIBONUCLEASA: EL EXPERIMENTO DE ANFINSEN.

REDUCCION DE LOS PUENTES DISULFURO

La urea desnaturaliza a la ribonucleasa (es decir, deja solo su

estructura primaria) y el b-mercaptoetanol reduce los puentes

disulfuro.

Si se elimina la urea y luego se deja

que los puentes disulfuro vuelvan a

formarse por oxidacion con el aire,

se recupera la estructura nativa. Si

se oxida en presencia de urea, se

obtiene una “ribonucleasa

revuelta”, inactiva, pero esta

recupera su actividad en presencia

de trazas de b-mercapto-etanol.

Hay 105 modos diferentes de

aparear 8 Cys para formar 4

puentes disulfuro, y sólo 1 es el

correcto.

LA PARADOJA DE LEVINTHAL.

Para una proteína pequeña, de 100 residuos de

amino ácidos:

Si cada residuo puede asumir 3 posiciones, el

número total de estructuras posibles será igual a 3100,

lo que es igual a 5 x 1047

Si toma 10-13 seg para convertir una estructura

en otra el tiempo total requerido para el plegamiento

correcto será

5 x 1047 x 10-13 seg = 5 x 1034 seg = 1.6 x 1027

años.

(Paradoja de Levinthal)

El plegamiento puede

pasar a traves de un

intermediario que ya

tiene practicamente

completa la estructura

secundaria (el globulo

fundido). Puede tener un

camino unico o tener

caminos alternativos.

AGENTES DESNATURALIZANTES.

1) Extremos de pH. Muchas proteínas se desnaturalizan a valores de

pH < 5 o > 10. Esto puede deberse a la ionización de grupos en el

interior de la proteína (His a pH ácido, Tyr a pH alcalino); a repulsión

electrostática entre grupos de la superficie de la proteína; a la

destrucción de puentes salinos importantes en la estabilización de la

estructura nativa.

2) Agentes desnaturalizantes. Los más usados son la urea y el

clorhidrato de guanidina:

DESNATURALIZACION DE UNA PROTEINA.

PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS IN VITRO E IN VIVO.

In vitro: Plegamiento espontáneo, a muy bajas concentraciones de proteína para evitar

agregados. Buffer redox (GSH/GSSG) para inducir la formación correcta de puentes

disulfuro.

In vivo: Plegamiento a altas concentraciones proteicas, asistido por otras proteínas.

1) Puentes disulfuro: proteína disulfuro isomerasa. Contiene secuencias –Cys-

Gly-His-Cys- y acelera unas 6000 veces el intercambio de puentes disulfuro.

2) Uniones peptídicas X-Pro: Peptidil prolil isomerasa. En vez de ser todas

uniones en trans, como para los demás aminoácidos, un 6 % de las con Pro es cis. La

PPI acelera 300 veces la isomerización cis-trans.

3)Prevención de la formación de agregados moleculares: chaperonas

moleculares. Se unen reversiblemente a zonas desplegadas del polipéptido naciente,

evitan su agregación y facilitan su plegamiento correcto, con consumo de ATP.

PURIFICACION DE LAS

PROTEINAS.

METODOS GENERALES DE PURIFICACION DE PROTEINAS.

1)Ruptura del material y obtención de un extracto libre de células.

2)Precipitación (sales, pH, alta temperatura, solventes orgánicos).

3)Diálisis o ultrafiltración. Concentración.

4)Fraccionamiento cromatográfico.

Principio de separación Tipo de cromatografía

Forma y tamaño Filtración por gel

Carga neta Cromatografía de intercambio iónico.

Punto isoeléctrico Cromatoenfocado

Hidrofobicidad Cromatografía de interacción

hidrofóbica

Cromatografía en fase reversa

Función biológica Cromatografía de afinidad

Antigenicidad Inmunoadsorción

Contenido en carbohidrato Cromatografía con lectinas

inmobilizadas

Grupos sulfhidrilos libres Cromatografía covalente

Capacidad de ligar metales Cromatografía de quelatos metálicos

Eliminación de moléculas chicas por diálisis.

Se requiere, en general, después de una precipitación con sulfato de amonio.

FILTRACION POR GEL

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

CROMATOGRAFÍA DE

AFINIDAD.

Se explota el hecho de que toda

proteína es capaz de

interaccionar con uno o mas

ligandos. Fijándolos a una

matriz, se puede purificar

selectivamente a la proteína en

estudio.

Purificacion s tep TotalPr otein

Total

activity

Specific

Activity

Purification

factor

Yield

Cell-free extract

ConA- Sephar ose

Mono Q

Mono P

mg

227.5

5.6

0.67

0.36

unitsa

56.00

43.75

25.95

14.70

unitsa/mg

0.246

7.81

38.73

40.83

Fold

1

31.75

157.44

165.97

%

100

78.1

46.34

26.25

Tabla de purificacion y determinacion de

homogeneidad proteica.

ELECTROFORESIS.

Es la migracion de una macromolecula (proteina, DNA, RNA) en un

campo electrico.

Electroforesis en gel de poliacrilamida: en condiciones nativas (PAGE) o

en presencia de SDS (SDS-PAGE).

Isoelectroenfocado (IEF): Separación por punto isoeléctrico (pI).

Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida (2D -PAGE): IEF

en una primera dimensión, SDS-PAGE en la segunda.

ISOELECTROENFOCADO: Separación por pI.

Las proteínas se corren en un gradiente de pH preformado, que se obtiene

sometiendo a electroforesis previa una mezcla de polianfolitos (polímeros

pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de pI. En A se carga

la muestra y se aplica el voltaje, con lo cual las proteínas migrarán hasta

llegar al valor de su pI, donde, al no tener carga neta, quedarán

enfocadas, lo que se observa en B.

Electroforesis bidimensional (2D-PAGE)