Extraccin del ADNOriginal de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemticas (AlACiMa)

Relevancia del Aislamiento del ADN

La extraccin de ADN es el primer paso en la tecnologa del ADN. Determinacin del perfil de ADN

Clonacin

Diagnstico de enfermedades

Determinacin de secuencias de ADN

Transferencia gnica: Organismos Modificados Genticamente (OMG), agricultura, farmacutica

Pruebas ambientales, bioterrorismo

Cules son las estructuras de una clula?

Tipos de Clulas

Tipos de Clulas

Tipos de Clulas

Resumen del Protocolo: Extraccin de ADN GenmicoUtilizacin de agua como enjuague para la recogida de las clulas bucales

Aadir el bfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear

Utilizacin de la proteasa para digerir las protenas celulares

Precipitacin del ADN con alcohol fro y alta concentracin de sal.

Extraccin de ADN : Paso-a-Paso

Extraccin y Precipitacin de ADN

Listado de Materiales

4 Estudiantes/Puesto de trabajo para un total de 36 EstudiantesPuesto comn (Puesto del Maestro)

Bao a 500C

Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo

Puesto de trabajo de los alumnos Nmero(4 Estudiantes/Puesto de trabajo )

Tubos de15 ml con 3 ml de agua4

Microtubo rosa marcado prot, con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal1

Tubo de 15 ml tubo marcado lisis con 10 ml de bfer de 1

Pipetas de plstico6

Gradilla de hule espuma para los tubos 1

Marcador de tinta indeleble1

Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1tubos de 15 ml y la subsiguiente coleccin de basura

Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml1

Gua rpida1

Es de vital importancia realizar una abundante recogida de clulas.

Para mejores resultados, asegrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las clulas de la mucosa bucal.

Pueda que la coleccin de muestra en el tubo de 15 mL sea difcil. Puede utilizar un vaso pequeo para dispensar y coleccionar la muestra.

Protocolo de Prctica de Laboratorio

Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales.

2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. No sirve de nada sacar sangre!

3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos.

4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.Pasos 1 4

Protocolo de Prctica de Laboratorio

5. Obtenga el tubo de bfer de lisis del puesto de trabajo y aade 2 mL de bfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular.

6. Cierre el tubo e invirtalo suavemente para mezclar los componentes. (No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo Ve algunos cambios? Antelos.

Pasos 5 6

Protocolo de Prctica de Laboratorio

7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado prot) de su puesto de trabajo. Aade 5 gotas de proteasa a su tubo.

8. Cierre el tubo y voltelo suavemente varias veces.

9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el bao de agua y djelo incubar por 10 minutos a 50C.

Pasos 7 9

Extraccin y precipitacin de ADNPor qu se lleva a cabo cada paso?

Coleccin de clulas

El mordisqueo del interior de la boca, en combinacin con el enjuague de agua funciona para separar las clulas del epitelio alineando la boca.

Es crtico recoger la cantidad suficiente de clulas.

2. Bfer de Lisis

Qu es el Bfer de Lisis?

50 mM Tris-HCI, pH 8.0 1% SDSBfer deTris para mantener el pH de la solucin en el cual ADN se mantiene estable

1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que el ADN quede libre en la solucin.

El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las protenas dejndolas accesibles para las proteasas.Na+

3. Por qu utilizamos la proteasa?La proteasa se utiliza para destruir las protenas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmticas que degradan y destruyen el ADN.

El tratamiento con proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extrado.

4. Adicin de la solucin salina La solucin de proteasa ya contiene sal.

Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las molculas de ADN, neutralizando las cargas elctricas del ADN.

La adicin de NaCI permite que las molculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitacin del ADN de la solucin al aadir el alcohol.

La Estructura del ADNSlo se muestra una cadena de ADN.

5. Precipitacin del ADN con alcohol fro El ADN no se disuelve en alcohol.

El aadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solucin.

Las molculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraa.

Las burbujas microscpicas de oxgeno, que se generan al mezclar, se agregan al precipitarse el ADN.

Las burbujas visibles ms grandes, levantan el ADN fuera de la solucin y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgnica (fase del alcohol).

Protocolo de Prctica de Laboratorio

10. Lentamente aade 10 ml de alcohol fri manteniendo el tubo a un ngulo de 45. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable.

11. Deje el tubo en posicin vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos Que ve?

12.Cierre el tubo y voltelo de lado y de regreso en posicin vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solucin. Pasos 10 12

Preparacin de los tapones para los collares1. Remueva el tapn de plstico del frasco de vidrio.

2. Recorte las orejas de dos lados del tapn de plstico.

3. Regrselo al frasco para crear los collares ms tarde.

Porque? Para que el tapn no cree una bolsa de aire que prevenga que el frasco quede correctamente cerrado

Preservando la muestra de ADN: Preparacin del collar de ADN

Utilizando una pipeta desechable, transfiera las fibras de ADN que ha extrado al pequeo frasco de vidrio.

Transfiera la mayor cantidad de ADN con la menor cantidad de alcohol posible.

El frasco se debe rellenar dejando por lo menos 2 mm de espacio suficiente para el tapn de plstico.

Preservando la muestra de ADN: Preparacin del collar de ADN

2. Introduzca el tapn de plstico recortado en el cuello del frasco y presione con firmeza para cerrarlo

3. Deslice el cordn encerado a travs del tapn de plata

4. Aplique una pequea gota de pegamento en el interior del tapn de plata.

Preservando la muestra de ADN: Preparacin del collar de ADN

Coloque el tapn de plata sobre la boca del frasquito y presione con firmeza durante 30 segundos. Deje que el pegamento se seque durante 10-15 minutos y despus compruebe que el frasquito est completamente sellado.

Cuando el pegamento se haya secado, ate el cordn encerado.

Genes en un FrascoFelicidades!

Has creado un collar con tu propio ADN!

Cunto tiempo dura el collar de ADN?El ADN puede durar aos en el frasquito de vidrio. Con el tiempo puede aadir ms alcohol si la cantidad original se ha evaporado

Genes en un Frasco Componentes del kitDNA ExtractionModule (166-2000EDU):(contains enough material for 36 students)

Lysis buffer, 150 ml

Powdered protease + salt, 1.5 g

15 ml tubes, 50

Clear, flip-top microtubes, 60

Multicolor, flip-top microtubes, 60

Disposable plastic transfer pipets, 60

Foam microtube holders, 10

Curriculum, including a teachers guide, a graphic quick guide, and separate student instructions for basic and advanced-level instruction

DNA Necklace Module (166-2200EDU): (contains enough material for 18 DNA necklaces; order 2 modules for a classroom of 36 students)

Glass vials, 18Silver caps, 18Plastic plugs, 18Waxed string, 18Super glue gel, 1 tubeInstruction manualRequired Accessories Not Included in Kit:91% isopropanol (available from drugstores) or 95% ethanol, 360 mlContainer of ice, 1Permanent marker, 18

Recommended (Optional) Accessories:

Water bath with thermometer 166-0504EDU(166-2300EDU)Materiales para 36 Estudiantes

Above Kit Contains:(1) DNA Extraction Module (166-2000EDU)

(2) DNA Necklace Modules (166-2200EDU)

DNA extraction is one of the first steps to many research, forensic or clinical analyses. Extracting one's own DNA and making it visible by precipitation is a visible and tangible way to explore DNA.

This experiment fits well into exploring cell structures: Where is the DNA located? What properties of cell membranes allow us to break them open with detergents? Why is protease used to assist in extraction of DNA? Further discussion later in workshop.Examples of cell typesLysozomeChloroplasts in a plant cell. The dark, oval shapes are starch granules within the chloroplasts.Overview of main steps in experiment.Graphic overview chartFor efficient time management, begin the extraction protocol and discuss experiment during incubation times. The student workstations have the indicated items for a group of 4 students per workstation.The protease must be rehydrated before use; once rehydrated, the protease will remain active for several weeks if stored at 4oC. This step cannot be stressed enough. Best results happen when class collects cells as a group, with one person keeping time. The instructor can "cheerlead" to encourage ample cells are collected. For teachers that have done DNA extraction from strawberry or thymus, fewer cells collected in this experiment. It is imperative that sufficient cells are collected.After everyone labels a 15 ml tube containing water with their initials (use permanent marker and label the tube on its side), begin collecting as a group.The hardest part of this exercise will be to expel the mouth wash back into the 15ml tube. You may wish to collect the mouth wash into a cup and then pour the mouth wash into a 15 ml tube instead.If anyone ends up with a lot more than 5 mls (7 mls or more), they need to remove the excess and discard it. DNA precipitation may not occur optimally if much more than 5 mls of cell lysates are present when alcohol is added during the precipitation step.Its important NOT to shake the lysed cells this will shear the DNA (break it into small fragments) and shorn DNA will not precipitate well.Its important NOT to let students shake the tubes the DNA will shear, and DNA will not precipitate well if its shorn.Epithelial cells are constantly being sloughed off an provide an easily accessible cell supply.Note: eating food, chewing gum, or dental work just prior to the exercise may affect ample cell collection. To achieve maximum success (largest DNA precipitates), its recommended that people dont engage in these activities just prior to performing this exercise.Can talk about lipid bilayer model of cell membranes and how detergents work.Histones, which cause DNA to supercoil (compact) in the chromosome, are proteins. Graphic showing Na+ ions associating with negatively charged phosphate groups on DNA backbone.It is important to add the alcohol gently and keep tube at a 45 degree angle. After a few minutes, they should see small bubbles with DNA strands attached. If they see a nice clump of DNA, they can remove it to necklace vial before inversion. Alternatively, they can gently mix/tilt their test tube to see the DNA come out of solution and then make a necklace. It's important NOT to shake and dissociate the DNA that is precipitating.First, remove the plastic stopper from the vial (you will replace the stopper after transferring your DNA). Dont lose the stopper! Its small and hard to see.Next, using a disposable transfer pipet, carefully transfer the DNA strands to the glass amulet. Dont overfill the amulet; the stopper will be difficult to seal on the vial if there is too much liquid inside.

Necklace preparation is a little "fiddly" and may be done the next day if class time is limited. Place student samples in refrigerator until next class period if time is limiting.People have a tendency to keep pushing and then pulling on the cap to see if it has dried. I encourage folks to leave their necklaces alone for several minutes without continuously pushing down. It will dry