Biosintesis tanase dan Penentuan Simultan Fenolik Senyawa di Aspergillus niger Fermentasi Paddy Straw dengan HPLCAbstrak: Produksi tannin asil hidrolase oleh Aspergillus niger dalam fermentasi solid state menggunakan jerami padi sebagai substrat diselidiki. Maksimum produksi tanase dari 43 U / g / menit diamati pada 96 jam inkubasi pada 30 C. Pemurnian tanase dengan amonium sulfat dan kromatografi kolom yang meningkatkan aktivitas enzim. Senyawa fenolik dalam jerami padi fermentasi dianalisis dengan HPLC. Isi dalam substrat fermentasi adalah asam galat 0 434 mg / g, Rutin 0 124 / g dan Quercetin 0 202 mg / g massa basah.Pendahuluanberbagai sumber daya biomassa yang tersedia di planet kita untuk konversi ke bioproducts. Ini mungkin termasuk seluruh tanaman, bagian tanaman (misalnya biji, batang), konstituen tanaman (misalnya pati, lipid, protein dan serat), pengolahan produk sampingan (biji-bijian penyuling, terlarut jagung), bahan laut asal dan hewan produk sampingan, limbah kota dan industri [1] dan juga limbah pertanian (sumber daya ini dapat digunakan untuk membuat biomaterial baru dan ini akan membutuhkan pemahaman yang mendalam tentang komposisi bahan baku apakah seluruh tanaman atau konstituen, sehingga unsur-unsur fungsional yang diinginkan dapat diperoleh untuk bioproduk produksi [2] Beberapa produk samping pertanian alami yang digunakan untuk persiapan enzim dalam fermentasi solid state seperti dedak gandum, kelapa kue minyak, bungkil kacang tanah minyak, dedak padi, gandum dan jerami padi, gula beet pulp, tongkol, serbuk gergaji, dedak jagung , beras bubuk sekam, lambung kedelai, hampas sagu, limbah anggur, sabut kelapa empulur, limbah pisang, ampas teh, onggok, pulp aspen, manis sorgum bubur, apel pomace, makan kacang dll.Tanase merupakan enzim yang penting. Tanase digunakan dalam sejumlah aplikasi industri termasuk pembuatan teh instan, anggur dan asam galat [3] dan solubilisasi teh krim dalam pengolahan teh instan [4]. Salah satu aplikasi komersial utama dari tanase adalah hidrolisis asam tanat menjadi asam gallic, kunci menengah diperlukan untuk sintesis obat antibiotik, trimetoprim [5]. Produksi enzim dengan menggunakan limbah pertanian di substrat fermentasi padat (SSF) yang lebih murah, kurang berorientasi teknologi dan juga ekstraksi enzim lebih mudah dengan merilis jumlah diabaikan limbah cair dan dengan demikian menghasilkan lebih sedikit polusi dibandingkan dengan metode lain.Asam galat ditemukan di hampir semua tanaman. Tanaman yang dikenal atas konten-konten asam galat tinggi termasuk gallnuts, anggur, teh, hop dan kulit kayu ek. (1 (asam Galia (asam benzoat 3,4,5-trihidroksi) adalah senyawa fenolik dan menemukan aplikasi di berbagai bidang. Penggunaan yang paling penting adalah untuk pembuatan trimethoprim (TMP), agen antibakteri digunakan dalam kombinasi dengan sulfonamida [5] . Hal ini juga digunakan dalam industri kulit, dalam pembuatan ester galat asam, misalnya, gallate propil yang digunakan sebagai antioksidan, dalam pembuatan pirogalol. Pyrogallol digunakan dalam pewarnaan bulu, kulit dan rambut dan juga sebagai pengembang fotografi [6] produksi asam Galia telah dilaporkan dari myrabolan, tara [7] sumac [8] dan tanin Cina beberapa sumber yang kaya tannin dan beberapa mikroorganisme [9]:.. Kar, et al [10] Mukherjee, Banerjee, [11] Belmares-Cerda, [12] telah digunakan untuk produksi asam galat dan enzim hidrolitik yang bertanggung jawab untuk produksi adalah tanase atau tannin acylhydrolase. Dalam penelitian ini jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase oleh Aspergillus niger dan menentukan asam galat dan senyawa fenolik lainnya di substrat fermentasi dengan menggunakan HPLC.BAHAN DAN METODE penggunaan kultur dan Persiapan inokulum: jamur Aspergillus niger yang digunakan dalam penelitian ini diisolasi dari tanah dan dipelihara di Potato dextrose agar miring dan disubkultur setiap 15 hari. Inokulum dibuat dengan menambahkan air suling steril untuk miring budaya dan membubarkan spora dengan menggunakan lingkaran steril dan diinokulasi ke medium.

Substrat dan Fermentasi Medium: Substrat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Jerami padi, yang pertanian-produk. Substrat dicampur dengan larutan garam. Komposisi larutan garam adalah NH NO 0 5 4 3%, NaCl 0 1%, MgSO4 7H2O 0 1% dan asam Tannic 4% pada pH = 5. 5. Isi disterilisasi dengan autoklaf pada 121C; 15lbps selama 20 menit. Didinginkan disterilkan substrat padat diinokulasi dengan 1 ml inokulum spora, dicampur dengan benar dan diinkubasi pada suhu 30 C selama 120 jam.Ekstraksi dan Pemurnian: Setelah 96 jam inkubasi 0 05 M buffer sitrat, (pH 5.0) ditambahkan ke substrat fermentasi dan dihomogenisasi dengan mortar dan alu. Enzim mentah dipisahkan dari materi fermentasi dengan sentrifugasi pada 8000 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit. Ekstrak kasar diendapkan dengan amonium sulfat padat (80%) dan mengumpulkan endapan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm pada suhu 4 C selama 20 menit. Endapan didialisis terhadap buffer sitrat (0 05 M, pH = 5) pada 4 C. Sampel didialisis menjadi sasaran kolom Chromatography (DEAE Sephadex A-50 kromatografi) dan mengumpulkan pecahan. Kegiatan tanase diperkirakan dalam setiap langkah pemurnian. Tanase Assay: tanase diuji berikut Sharma et al. [13] metode menggunakan asam galat sebagai standar Warna merah muda dikembangkan dibaca pada 520 nm menggunakan spektrofotometer (Shimadzu UV-160A). Satu unit aktivitas tanase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk membebaskan satu mikromol asam gallic per menit pada kondisi reaksi didefinisikan. Hasil enzim dinyatakan sebagai unit / gram substrat (U / gram / menit).

A520 = (atest-Ablank) - (Acontrol-Ablank)

Penentuan fenolik Senyawa dengan HPLC Standar Persiapan: larutan stok standar dari tiga senyawa fenolik disiapkan dalam metanol, pada konsentrasi 0.420, 0.434, 0.400, 0.402 dan 0.402 mg. mL untuk GA, RU dan QU masing-masing Semua solusi standar disaring melalui 0 45 mm filter membran (Millipore) dan disuntikkan oleh autosampler.Preparasi Sampel: Sampel disiapkan sesuai dengan prosedur El Sohafy et al. [14]. Jerami padi yang difermentasi (0,5 g) diekstraksi dengan mendidih selama 5 menit dengan 5 mL air, menyesuaikan volume untuk 5 mL dan penyaringan. 5 mL filtrat ini dihidrolisis dengan menambahkan 0 5 ml 25% HCl dan pemanasan dalam bak air mendidih selama 25 menit. Campuran tersebut kemudian diekstraksi dengan empat berturut-turut 4 ml porsi n-butanol. Dikombinasikan ekstrak n-butanol dikeringkan di bawah tekanan dan dilarutkan kembali dalam 2 ml metanol. Kondisi HPLC: Flavonoid dianalisis menggunakan sistem Shimadzu HPLC (Shimadzu Corp, Kyoto, Jepang) yang terdiri dari pompa LC-10AD, SCL 10A sistem pengendali dan SPD-M 10A fotodioda detektor array. Kromatografi asam fenolik dicapai dengan menggunakan prepacked LiChrospher 100 RP C-18 olumn (4'250 mm, 5 m; Merck). Fase gerak terdiri asam air asetonitril-asetat (88: 10: 2; v / v / v) [15] dan disampaikan pada tingkat 1 mL / menit. Deteksi dipantau pada 280 nm. Semua hasil karya ini adalah rata-rata dua penentuan independen.Tiga senyawa fenolik, GA, RU dan QU, adalah molekul polar. Gradien elusi pelarut A [air-asam asetat (25: 1 v / v)] dan pelarut B (metanol) memiliki pengaruh yang signifikan terhadap resolusi senyawa. Akibatnya, gradien pelarut dibentuk, menggunakan sistem pompa ganda, dengan memvariasikan proporsi pelarut A [asam air asetat (25: 1, v / v)] pelarut B (metanol). Solvent B meningkat menjadi 50% di 4 menit dan kemudian meningkat menjadi 80% dalam 10 menit pada laju alir 1 0 mL / menit. Deteksi panjang gelombang adalah 280 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN Produksi tanase oleh A. niger pada jerami padi dipelajari dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1 maksimum produksi tanase diamati pada 96 jam inkubasi pada 30 C. Nisha K. Rana [16] melaporkan, bahwa hasil total tanase adalah maksimum pada 120 jam untuk SMF dan LSF, sedangkan itu pada 96 jam pertumbuhan untuk proses SSF. Sebelumnya tanase ekstraseluler dan asam galat produksi maksimum tercatat di 96 jam dan 120 jam oleh A. niger dan Rhizopus oryzae [17-19]. Produksi enzim dimulai setelah 48 jam inkubasi dan meningkat dengan waktu mencapai maksimal pada 96 jam. Ini mungkin jamur masuk ke fase eksponensial. Setelah itu, produksi enzim mulai menurun.Pemurnian tanase: Tanase mentah diendapkan dengan amonium sulfat presipitasi kegiatan adalah 26 U / g / menit. Setelah dialisis aktivitas aktivitas spesifik 32 U / g / menit diperoleh. Sampel adalah lebih purifiedthrough DEAE-Sephadex A-50 kromatografi dan fraksi terelusi, yang menunjukkan 43 U / g / menit. (Gbr. 1). Penentuan Galia Asam, rutin dan quercetin di Fermentasi Paddy Straw dengan HPLC: Standar Kromatogram senyawa fenolik Hal ini dapat dilihat dari Gambar 2 bahwa pemisahan yang baik dapat dicapai dalam waktu 15 menit dengan menggunakan kondisi yang dijelaskan. Simetris, puncak tajam dan baik-diselesaikan diamati untuk standar (GA, RU dan QU). Urutan elusi dan waktu retensi untuk GA, RU dan QU yang 3. 325, 5 100 dan 5 867 min masing-masing. Dalam penelitian ini Jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase dengan menggunakan Aspergillus niger. Kuantifikasi sampel dibandingkan dengan standar. Kandungan asam fenolik terdeteksi dalam sampel yang dianalisis ditunjukkan pada Gambar 3 Hasil dinyatakan sebagai mg / g substrat fermentasi. Hasil percobaan menunjukkan bahwa Jerami padi yang difermentasi dengan ekstrak Aspergillus niger mengandung asam galat (0.43mg. / G berat basah), Rutin (0.124 mg / berat basah) dan Quercetin (0.202 mg / g berat basah). Hasil tinggi pemulihan asam galat yang terkait dengan kegiatan tanase tinggi dilaporkan oleh Kar dan Banerjee dan Kar et al. selama fermentasi residu kaya tannin hutan (biji gilo, Caesalpinia digyna) atau bubuk buah chebula Terminalia menggunakan strain jamur Rhizopus oryzae dan Aspergillus foetidus (G. Mukherjee, R. Banerjee, 2006 dan 2004).KESIMPULAN Fermentasi Solid state(keadaan padat) cocok untuk produksi tanase menggunakan pertanian oleh-produk. Dalam penelitian ini Jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase. Analisis HPLC senyawa fenolik yang diperoleh dari jerami padi fermentasi mengandung jumlah tinggi asam galat dibandingkan dengan senyawa lain. Asam galat digunakan dalam pembuatan trimethoprim (TMP), agen antibakteri, dalam industri kulit dan sebagai antioksidan. Beberapa strain jamur dan substrat kaya tannin telah digunakan untuk produksi asam galat.

Slide 1PendahuluanBerbagai sumber daya biomassa seperti bagian seluruh tanaman, konstituen tanaman, pengolahan produk sampingan, bahan laut asal dan hewan produk sampingan, dan lain- lain. Beberapa produk samping pertanian alami yang digunakan untuk persiapan enzim dalam fermentasi solid state diantaranya yaitu, dedak gandum, dedak padi, jerami padi, lambung kedelai, hampas sagu, limbah anggur, sabut kelapa empulur, limbah pisang, ampas teh, onggok dan lain-lain. Slide 2Enzim yang sangat berperan yaitu enzim tanase. Salah satu aplikasi komersial utama dari tanase adalah hidrolisis asam tanat menjadi asam gallic, yang diperlukan untuk sintesis obat antibiotik dan trimetoprim. Dalam penelitian ini jerami padi digunakan sebagai substrat untuk produksi tanase oleh Aspergillus niger dan menentukan asam galat dan senyawa fenolik lainnya di substrat fermentasi dengan menggunakan HPLC.Slide 3Bahan dan Metode Penggunaan kultur dan Persiapan inokulum Substrat dan Fermentasi Medium Ekstraksi dan Pemurnian Uji tenaseSlide 4Penentuan fenolik Senyawa dengan HPLC Standar Persiapan Preparasi sampel Kondisi HPLCSlide 5Hasil dan pembahasanSlide 6kesimpulan