Epigenetika, genomo abėcėlės diakritiniai ženklai

Saulius Klimašauskas

Vilniaus universiteto Biotechnologijos institutas

2013 m. spalio 11 d. Lietuvos mokslų akademija

BIOTECHNOLOGIJOS IR GENETIKOS PASIEKIMAI

Epigenetika

Epigenetika – (επί graik. virš) mokslas apie genų veiklos pokyčius

vykstančius be pasikeitimų pirminėje DNR sekoje.

DNR metilinimas Citozino bazių metilinimas (Me arba -CH3 grupės prijungimas) Paprastai lemia genų slopinimą

Histonų modifikacijos Histonų “uodegose” prijungtų cheminių grupių kombinacijos Lemia įvairius genų veiklos pakitimus

Chromosoma

Histonai

Histonų uodegos

Chromatinas

Nukleosoma

Nukleosomos struktūra

Kertiniai epigenetinio kodo elementai

Histonų uodegos

Histonai

DNR

DNR

Histonų kodas

Histonų kodas – histonų uodegos gali turėti skirtingus cheminių modifikacijų rinkinius

Modifikacijos įtakoja viena kitą ir vaidina svarbų vaidmenį su chromatinu susijusių procesų reguliacijoje.

5

vykdo fermentai metiltransferazės (MTases)

NNNNNXXXXXNNNNN

O

S

HO OH

N

N

N

NH2

N

CO2HH2N

H3C

NNNNNXXXXXNNNNN

CH3

AdoMet

MTase

Biopolymer

Sequence-specific methylatedbiopolymer

O

S

HO OH

N

N

N

NH2

N

CO2HH2N

AdoHcy

Taikiniai:

DNR

nukleobazės

RNR (tRNA, rRNA)

nukleobazės, ribozė

Baltymai (histonai)

Arg, Lys, His, Asp

Glikanai, lipidai ir kt.

SAM

Biopolimeras

Tikslingai metilintas biopolimeras

Biologinis metilinimas

S-Adenozil-L-metioninas

Biologinis DNR metilinimas

5-metilcitozinas (m5C)

Hotchkiss, 1948

N4-metilcitozinas (m4C)

Janulaitis ir kt., 1983

N6-metiladeninas (m6A)

Dunn ir Smith, 1956

5-metilcitozinas (m5C)

Hotchkiss, 1948

N4-metilcitozinas (m4C)

Janulaitis ir kt., 1983

N6-metiladeninas (m6A)

Dunn ir Smith, 1956

Biologinis metilinimas mikroorganizmų DNR

8

Klimašauskas, S., Kumar, S., Roberts, R. J. & Cheng, X. (1994) Cell, 76, 357-369.

DNR bazės išsukimas metiltransferazės reakcijos eigoje

Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse

5’-CG-3’

3’-GC-5’

5’-CG-3’

3’-GC-5’

5’-CG-3’

3’-GC-5’

nemetilinta DNR

CH3

3

de novo metilinimas

DNR replikacija

Palaikantysis metilinimas

metilinta DNR hemetilinta DNR CH3

CH3

Citozino-5 metilinimas (m5C)

Paprastai randamas CG dinukleotiduose

(~70% CG sekų metilintos žmogaus DNR)

Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse

5’-CG-3’

3’-GC-5’

CH3

CH3

Citozino-5 metilinimas (m5C)

dažniausiai slopina genų raišką

Biologinis DNR metilinimas žinduolių ląstelėse

5’-CG-3’

3’-GC-5’

CH3

CH3

Genominiai m5C profiliai

• skirtingi skirtinguose audiniuose, ląstelėse,

organizmuose

•kinta ląstelių diferenciacijos, organizmo vystymosi

eigoje, veikiant aplinkos faktoriams

•dideli pokyčiai stebimi daugelio lėtinių neinfekcinių

ligų atveju (vėžys, diabetas, psichiniai sutrikimai)

Epigenomo tyrimai svarbūs ligų diagnostikos,

prognozės ir terapijos požiūriu

5’-CG-3’

3’-GC-5’

Epigenetinė vėžio terapija

• DNR metiltransferazių inhibitoriai

5-azacitidinas

decitabinas (5-aza-2’-dezoksicitidinas)

•Histonų deacetilazės inhibitoriai

Metodai DNR metilinimo tyrimams

5-metilcitozino analizės principai:

Selektyvus cheminis nemodifikuoto citozino modifikavimas į uracilą

DNR kirpimas metilinimui jautriomis restrikcijos endonukleazėmis;

metilintos DNR praturtinimas 5mC-surišančių baltymų (pvz. antikūnių) pagalba

DNR metilinimo analizė bisulfitiniu metodu

m

3'

A-

C-

G-

C-

G-

T-

T-

5'

5'

T

G

C

G

C

A

A

3'

m

metilinta DNR

modifikacija

natrio bisulfitu

3'

A

G +

G

T

T

5'

5'

T

G

G

A

A

3'

U

U

C

Cm

AT

3’A

G

GTT5’

C->T

C(=5mC)

Paveikus bisulfitu, citozinas yra konvertuojamas į uracilą C U 5-metilcitozinas yra nejautrus šio reagento poveikiui 5mC 5mC

sekoskaita

Nauja DNR modifikacija žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas

• 5-hidroksimetilcitozinas (hmC) seniai žinomas bakteriofagų DNR.

• 2009 m. hmC rastas smegenyse (40 % nuo bendro 5mC kiekio) ir embrioninėse kamieninėse ląstelėse. Kriaučionis ir Heintz Science (2009)

Tahiliani ir kt. Science (2009)

Mokslo premijos užsienio lietuviams 2012 m.

Nauja DNR modifikacija žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas

hmC susidaro TET (ten-eleven translocation) hidroksilazėm modifikuojant 5mC (antrinė epigenetinė modifikacija)

Naujos DNR modifikacijos žinduolių ląstelėse 5-hidroksimetilcitozinas, 5-formilcitozinas ir 5-karboksilcitozinas.

TET hidroksilazės modifikuoja hmC į 5-formilcitoziną (fC) ir 5-karboksilcitoziną (caC).

DNR metilinimas DNR demetilinimas oksidacinio hidroksilinimo būdu

Naujos DNR modifikacijos žinduolių ląstelėse

Biologinis 5-hidroksimetilcitozino vaidmuo: DNR demetilinimo tarpinis produktas, ar atskiras epigenetinis elementas? Dideli hmC kiekiai smegenyse netiesiogiai rodo, kad jis gali dalyvauti atminties mechanizmuose

19

Metiltransferazės – molekuliniai įrankiai tikslingai biopolimerų modifikacijai

NNNNNXXXXXNNNNN

O

S

HO OH

N

N

N

NH2

N

CO2HH2N

H3C

NNNNNXXXXXNNNNN

CH3

AdoMet

O

S

HO OH

N

N

N

NH2

N

CO2HH2N

AdoMetanalogue

NNNNNXXXXXNNNNN

MTase MTase

Biopolymer

Sequence-specific methylatedbiopolymer

Sequence-specific labelledbiopolymer

Klimašauskas & Weinhold, Trends Biotechnol (2007)

Biopolimeras

Tikslingai metilintas biopolimeras

Tikslingai žymėtas biopolimeras

mtase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG)

20

Dviejų žingsnių sekai-specifinis DNR žymėjimas ląstelių lizate

G. Lukinavičius ir kt ACS Chem. Biol. (2013)

21

Individualių DNR molekulių genotipavimas: DNR “fluorokodas”

Bakteriofagas lambda 48502 bp = 215 GCGC taikinių

0.025 mm

1. Dviejų-žingsnių DNR žymėjimas GCGC

sekose fluoroforu

2. Fluoroforų pozicionavimas pavienėse DNR

molekulėse

1 ir 2. Eksperimentiniai fluorokodai sudaryti iš

20 individualių DNR molekulių.

3. Teoriškai apskaičiuotas fluorokodas

R. Neely ir kt., Chemical Science (2010) su Leuveno universitetu, Belgija

1

2

3

Epigenetinių profilių tyrimai žinduolių DNR: Kovalentinis nemetilintų CG sekų surišimas ir praturtinimas

E. Kriukienė et al., Nat. Commun. (2013)

Analizuojamas fragmentas

Nemetilintas fragmentas

Pašalinamas fragmentas

Metilintas fragmentas

Biotiną

surišančios

dalelės

mTAG žymėjimas

biotinu

*

Dr. Artūras Petronis

Psichinės sveikatos ir priklausomybių centras

Toronto, Kanada

Epigenetinių profilių tyrimai žinduolių DNR: Kovalentinis nemetilintų CG sekų surišimas ir praturtinimas

E. Kriukienė et al., Nat. Commun. (2013) licenzijuojama kompanijai ThermoFisher Scientific

Analizuojamas fragmentas

Nemetilintas fragmentas

Pašalinamas fragmentas

Metilintas fragmentas

Biotiną

surišančios

dalelės

05

10

15

Brain mTAG ignal s (Unmethylome)

Ave

rag

e s

ign

al

Promoter 5’ UTR Exons Introns 3’ UTR

*

0.0

0.2

0.4

0.6

H1 MethylC- eq ignal s s (Methylome)

Ave

rag

e s

ign

al

Promoter 5’ UTR Exons Introns 3’ UTR

Nemetilinti rajonai

Metilinti rajonai

mTAG žymėjimas

biotinu

Nauja DNR citozino-5 metiltransferazių katalizuojama reakcija: 5-hidroksimetilcitozino modifikacija tioliais

24 Z. Liutkevičiūtė ir kt., Angewandte Chemie (2011).

Z. Liutkevičiūtė ir kt., Nature Chemical Biology (2009)

Geriausių disertacijų apdovanojimai 2013 m.

Technnologija 5-hidroksimetilcitozino profilių tyrimui žinduolių DNR

25 Z. Liutkevičiūtė ir kt., Angewandte Chemie (2011).

hmTAG

Z. Liutkevičiūtė ir kt., Nature Chemical Biology (2009) licenzijuojama kompanijai ThermoFisher Scientific

Epigenetika

Epigenetiniai faktoriai išplečia genomo koduojamos informacijos kiekį

reguliuoja genų aktyvumą

skirtingi skirtinguose audiniuose, ląstelėse, organizmuose

kinta ląstelių diferenciacijos, organizmo vystymosi eigoje, veikiant aplinkos faktoriam

epigenetinių signalų profilis yra iš dalies paveldimas (perduodamas tarp somatinių ląstelių ir organizmo generacijų)

dideli pokyčiai stebimi daugelio lėtinių neinfekcinių ligų atveju (vėžys, diabetas, psichiniai sutrikimai)

Žmogaus epigenomo tyrimai svarbūs ligų diagnostikai, prognozei ir terapijai

I share 99.9%

of DNA as

Einstein

…but only 0.1% of my epigenetics…