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Biotecnologia Médica I. Aula teórica IV. Biotecnologia. “Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou derivados destes, produzindo ou modificando processos para um uso específico”. – CDB 92. Conhecimento. Genética; Bioquímica; Microbiologia; - PowerPoint PPT Presentation
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Biotecnologia Médica I
Aula teórica IV
Biotecnologia
• “Qualquer aplicação tecnológica que usa sistemas biológicos, organismos vivos ou derivados destes, produzindo ou modificando processos para um uso específico”. – CDB 92.
Conhecimento
– Genética;– Bioquímica;– Microbiologia;– Biologia Molecular;– Fisiologia;– Imunologia;– Ciências do materiais;– Ciências da computação;– Engenharia química.
Técnicas
– Engenharia de proteínas;– Engenharia de tecidos;– Engenharia genética;– Tecnologia do bioprocessamento;– Tecnologia de biosensores;– Tecnologia do antisenso;– Tecnologia dos anticorpos monoclonais;– Tecnologia de chip de DNA;– Tecnologia de cultura de tecidos e células;
Aplicações:
– Monitoramento ambiental– Biorremediação– Prevenção da poluição
– Rendimento de safras– Qualidade de alimentos– Saúde animal
– Diagnósticos– Terapias– Vacinas
Meio ambiente
Agricultura
Medicina
Biotecnologia Industrial e ambiental – Escalas comerciais e industriais
Biotecnologia Agrícola – Produção e saúde animal e vegetal
Biotecnologia Médica – Saúde humana
Biotecnologia e a importância mundial
• Índice de desenvolvimento humano – 2001;
• HIV/AIDS, tuberculose e malária, revolução verde;
• Bio-economia– Produção de colheita, produção animal, silvicultura etc;– Agroquímicos, sementes, energia, alimentos, farmacêutica e assistência médica.
• Impacto ambiental;
• 2001 – US$ 34,8 bilhões – 200 mil empregos;
• P&D e inovação tecnológica;
• 97 % - EUA, Canadá e Europa. Principalmente área médica.
Histórico• 1797: Jenner e a vacina da varíola;• 1857: Pasteur propões que micróbios fermentam;• 1928: Flemming e a penicilina;• 1944: DNA carrega a informação;• 1953: Dupla hélice do DNA;• 1967: Primeira sequencia proteica;• 1970: Enzimas de restrição;• 1973: Bacteria com DNA recombinante;• 1977: Expressão de proteína humana em bactéria;• 1980: Pedido de patente para clonagem;• 1982: FDA aprova primeira droga recombinante;• 1983: PCR;• 1986: Vacina recombinante;• 1988: Animal modificado geneticamente;• 1990: Início do projeto genoma humano;• 1994: Dnase para fibrose cística;• 1997: Animal clonado de uma célula adulta – Dolly;• 2002: Genoma humano publicado.
Biotecnologia Médica
• Entendendo a causa de doenças;
• Identificando marcadores diagnósticos;
• Identificando potenciais alvos para intervenção médica;
• Provendo novas formas de terapias.
Entendendo a causa da doença
• Utilizações:
– Papel do gene em indivíduos saudáveis: ex. camundongos nocauteados para enzimas de reparo de DNA no estudo de câncer;
– Papel do gene nos patógenos: ex. proteínas de membrana envolvidas na invasão de células.
Nocaute gênico: ruptura direcionada de genes específicos.
Identificando marcadores diagnósticos
• Conhecimento das características de uma doença para fazer um prognóstico sobre a evolução e possibilitar uma intervenção.
• Diagnóstico molecular – técnicas de biologia molecular para o estudo do DNA/proteínas de:– Gravidez;– Doenças infecciosas;– Câncer;– Doenças Genéticas.
Doenças infecciosas
Detecção do microrganismo
X
Detecção da resposta imune
Detecção do microrganismo
• Genoma
– PCR, Hibridização;– H1N1, Helycobacter etc.
Detecção do microrganismo
• Proteínas
– Aglutinação, ELISA;– HIV/AIDS, leptospirose.
Detecção do microrganismo
• Visualização direta
– Técnicas de coloração, imunofluorescência;
– Tuberculose etc.
Detecção do microrganismo
• Isolamento em cultura:
– Cultura direta– Cultura de células– Doenças virais – efeito citotóxico, tuberculose etc.
DIAS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 21 30 60 90 120 130 140 150 160 170 180 210 240 270 300
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20
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70
IgM
IgG
Detecção da resposta Imune
• Fase da infecção;• Primária ou secundária;• HIV/AIDS, toxoplasmose, sífilis etc.
Ex. dignóstico molecular de AIDS/HIV
1. Placa com anticorpos anti-proteína da cápsula do vírus HIV;
2. Amostra de soro do paciente é adicionada;
3. Incubação e lavagem – complexo Ac-vírus;
4. Adição de Ac anti-proteína da cápsula do vírus conjugados com uma enzima – complexo Ac-vírus-Ac;
5. Adição do substrato para a enzima – emissão de cor, luz;
6. Detecção da intensidade desta luz/cor (espectofotômetria) e resultado final.
00
ELISA (enzyme-lynked immunosorbant assay)
00
Reação enzima-substarto
Câncer
• Tradicional:– radiografia, tomografia, biópsia etc;
• Problemas:– Estágio avançado;– Testes Invasivos. – exame de próstata, colo do
útero, leucemia.
Câncer
• Molecular:
– Sequenciamento de DNA: oncogenes e supressores de tumor;
– Citogenética: rearranjos cromossomais - FISH;
– Imunohistoquímica – identificação tecidual;
– Proteômica – marcadores tumorais.
Ex. diagnóstico molecular de câncer
FISH (fluorescent in situ hybridization)
1. Lâmina com cromossomo na metáfase fixado;
2. Adição de formamida – desnatura mas mantém a forma;
3. Adição da sonda – sequencia de DNA complementar a uma região do cromossomo marcada com fluorescência;
4. Hibridização da sonda-cromossomo – emissão de fluorescência e visualização do local físico onde hibridizou.
5. Interpretação:- Posição esperada = sem mutação- Posição não esperada = mutação por recombinação e câncer
Doenças genéticas
• Intolerância a lactose, albinismo, predisposição a doenças cardíacas, hemofilia, síndromes etc;
• Aconselhamento genético;
• Testes:– Citogenético: FISH;– DNA: PCR, sequenciamento;– Metabólico: Eletroforese de proteínas.
Ex. diagnóstico de doenças genéticas
SNP (single nucleotide polymorphisms)• Único nucleotídeo mutado altera a proteína;
1. Sequenciamento do gene;
2. Comparação com banco de dados;
3. Identificação do local da mutação e da doença .
Ciência forense• Impressão genética – identificar indivíduos
com base no DNA.• Como?– TR: tandem repeats ou sequencias satélites –
sequencias repetitivas similares entre humanos relacionados mas diferentes entre não relacionados.
PCR Sequenciamento de DNA RFLP AFLP Eletroforese capilar
Fármacos naturais
• Top 5: US$ 37, 3 bilhões – 2006;
• Câncer, HIV/AIDS, cardiovasculares, respiratórias, doenças infecciosas;
• Geralmente moléculas pequenas (63%);
• De onde vem?Digitalis purpurea – doenças cardíacas;
Teixo – câncer de ovário e de mama;
Saliva de carrapatos – anticoagulantes;
Veneno de rãs – analgésico;
Bactérias ambientais – antibióticos.
• Genômica, bioinformática- identificação de potenciais alvos;
• Técnicas de cromatografia - separação e extração de moléculas;
• Eletroforese e HPLC - identificação do peso molecular e da sequencia
proteica;
• Cristalografia, difração de raio-X ou ressonância nuclear magnética
- identificação da estrutura química e espacial da molécula;
• Testes celulares - identificação de propriedades terapêuticas;
Fármacos naturais – como descobrir?
Fármacos naturais – como produzir?
• Pesquisadores coletaram 2400 kg de esponjas para obter 1 mg de droga anti-câncer = desastre ecológico.
• Solução I: cultura de células de esponja.
• Solução II: clonagem dos genes necessários para produzir o composto em uma bactéria/levedura e fazer fermentação desta cultura.
Fármacos endógenos
• Diabetes mellitus, albinismo, hemofilia etc – falta de um metabólito próprio do corpo – erros inatos do metabolismo.
Insulina
Clonagem molecular
Biopolímeros de uso médico
• Polímeros produzidos por organismos.• Superiores aos inôrgânicos – compatibilidade e absorção.
– Articulações e tendões;– Ossos;– Implantes dentários;– Próteses de vasos sanguíneos;– Implantes de seios;– Lentes de contato;– Tratamento de artrite – hialuronato;– Cicatrização;– Antimicrobianos – quitina.
Biopolímeros de uso médico• Vantagens:
– Derivados de fontes de energia renováveis;
– Diminui a emissão de poluentes;– Menor custo;– Biodegradáveis e absorvidos;– Biocompatíveis;
- PLA, PHBV e amidos termoestáveis
Alcaligenes euthrofus
Saccharum
Xenotransplantes• 250 mil transplantes anualmente;
• 1:4 - doadores:pacientes;
• 1963: rim de chimpanzé em humanos;
• Suínos – tamanho, fisiologia, anatomia, baixo custo, crescem rapidamente e técnicas estabelecidas;
• Células bovinas e o Mal de Parkinson;
• Suínos para regeneração de medula óssea.
Problema: rejeição – HAR e AVR.
Alternativa: Transgênese com proteínas inibitórias humanas, retirada de antígenos;