INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGA

EFECTO DE UN PROCESO DE INMOVILIZACIN

POR GELACIN INICA SOBRE LA ACTIVIDAD

PROTEOLTICA DE MEXICANA

T E S I S

PRESENTADA PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

POR:

GRISEL ADRIANA FLORES MIRANDA

INGENIERO EN ALIMENTOS

DIRIGIDA POR:

DR. JORGE YEZ FERNNDEZ

DRA. NORMA GEMES VERA

Mxico, D.F., 2011

ii

ACTA DE REVISIN DE TESIS

iii

iv

Declaracin de originalidad

v

DEDICATORIA

vi

AGRADECIMIENTOS

Al Dr Jorge Yez Fernndez por su amabilidad y disponibilidad durante mi estancia en su grupo,

durante la cual tuve todo el soporte profesional y logstico para alcanzar los objetivos perseguidos. Muchas

gracias por permitirme vivir una experiencia tan importante para mi formacin profesional.

A la Dra Norma Gemes Vera por su apoyo recibido durante mucho tiempo y por haberme encaminado

hacia esta oportunidad tan valiosa.

A mis asesores y revisores Dra Ma. Del Carmen Oliver Salvador, Dr. Gustavo Valencia del Toro y Dr.

Enrique Durn Pramo por las observaciones y contribuciones realizadas las cuales enriquecieron este

trabajo.

A la Maestra Ma. del Carmen Fernndez Martnez por su apoyo y consejos durante mi estancia en la

maestra y a Coque por hacerme pasar momentos agradables cuando visitaba el laboratorio.

A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologa del Instituto Politcnico Nacional (UPIBI-IPN)

por permitirme continuar con mi formacin acadmica.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por otorgarme una beca que me permiti

continuar con mis estudios.

A la Dra. Mara de Jess Perea Flores del Centro de Nanociencias y Micro y Nanotecnologas por el apoyo

y las facilidades otorgadas para el anlisis de las imgenes de las esferas por microscopia confocal.

Al Dr. Eduardo San Martn Martnez del Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa

Avanzada Unidad Legaria por las facilidades otorgadas para el anlisis de las propiedades mecnicas de

las esferas empleadas en este trabajo.

vii

AGRADECIMIENTOS

Doy gracias a Dios, por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazn e iluminar mi

mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compaa durante

todo el periodo de estudio.

A Octavio mi gran amor, mi inspiracin, mi fuente de alegra, que puedo decir si tu eres mi confidente y

mi mejor amigo, has sido para m un gran apoyo en estos 2 aos de maestra, te agradezco haber tenido

que soportar noches de desvelo, lgrimas, alegras, gracias por darme tu comprensin, amor y energa

cuando ms la necesitaba y por supuesto muchas otras cosas que seguramente nos sern recompensadas.

Hoy se realiza un sueo y comienza nuestro verdadero sendero. Que no se te olvide

A mis compaeros de Maestra: Vctor, Roxana, Josefina, Caridad y Luis, por su comprensin, consejos,

amistad y por la gran calidad humana que me han demostrado. Gracias por ser compaeros de camino,

siempre se quedaran en mis recuerdos.

A mis compaeros del Laboratorio de Biotecnologa alimentaria: Marlen, Adolfo, Roberto, Arturo, Valeria,

Anahi y Andrea, un carioso reconocimiento por brindarme su apoyo y consejos en el momento indicado.

Creo que todos hemos aprendido y aprendemos continuamente de todos y de nosotros mismos, tanto

profesional como personalmente, y eso es enriquecedor en ambos mbitos. Que agradable fue compartir

el laboratorio con ustedes.

A Alejandro Muoz y Hctor Molina por todo el apoyo recibido durante la investigacin.

viii

Resumen

En el presente trabajo se realiz el atrapamiento de mexicana con alginato de calcio,

empleando la tcnica de gelacin inica. Por medio de esta tcnica de inmovilizacin se

analiz el efecto de la concentracin de alginato de sodio (Al-Na) y cloruro de calcio

(CaCl2) sobre las propiedades fsicas del sistema de atrapamiento. El comportamiento del

sistema de inmovilizacin de la enzima se analiz por medio de un diseo experimental

central compuesto, teniendo como factores la concentracin de alginato de sodio y

cloruro de calcio para un total de trece corridas con cinco repeticiones en el punto central.

Las respuestas analizadas fueron el tamao, fuerza de compresin, ndice de

inmovilizacin y la actividad proteoltica. Las cpsulas producidas presentaron formas

esfricas con un dimetro entre 1.41 y 2.38 mm as tambin el anlisis de la textura de las

esferas mostr que concentraciones bajas de alginato (1%) y de CaCl2 (0.1 M) generan

esferas ms resistentes. El ndice de inmovilizacin mximo (95.66%) se present a una

concentracin de alginato de sodio de 1.5% y 0.06M de cloruro de calcio, observndose

un efecto significativo en el cambio de esta propiedad debido a la concentracin del

biopolmero y el catalizador (CaCl2). La actividad proteoltica se determin al tiempo cero

ya a los 3 meses de almacenamiento, observndose que despus de este tiempo la

actividad de la enzima inmovilizada fue superior (60 %) respecto la enzima libre (8 %).

Tambin se encontr que la enzima encapsulada fue ms estable en un intervalo de pH

(5.0 10) y a un intervalo de temperatura de 25 C 65 C, con respecto a la enzima libre.

Mediante el uso de microscopa electrnica de barrido (MEB) se observ que al

incrementar la concentracin de alginato de sodio se reduce la rugosidad en la superficie

de las esferas de atrapamiento, por otro lado el empleo de microscopa confocal permiti

demostrar que la enzima se encontraba atrapada en las paredes de la esfera. Para evaluar

la capacidad de reutilizacin de la mexicana se determin la actividad residual de la

enzima inmovilizada mostrando 43% de actividad residual despus de haber sido utilizada

5 veces continuas bajo las mismas condiciones de operacin.

ix

Abstract

Mexicain enzyme was immomobilized by ionic gelation on sodium alginate. Capsules were

prepared in order to develop a biocompatible matrix for enzyme immobilization and the

capsule core was formed by crosslinking sodium alginate with calcium ions (CaCl2.). The

enzyme immobilization system was prepared according to response surface methodology

with a composite central design with five repetitions in the central point with 13 runs. The

following response variables were used: the size capsule, strength, capsulation yield, and

proteolytic activity. The last variable was evaluated periodically within three months of

storage (5C). The capsules were assayed by scanning electronic microscopy and confocal

microscopy. The encapsulation system showed capsules with a diameter of between 1.41

and 2.38 mm and spherical shapes. Strongest capsules were obtained to concentrations of

alginate (1%) and CaCl2 (0.1 M). The immobilized enzymes were more stable in a 5.0 to 10

pH range and a 25 C to 65 C temperature range with respect to the free enzyme. The

immobilized enzymes retained greater activity (60%) than free enzymes (8%). The

reusability of immobilized mexicain showed 43% residual activity after being used 5 times

continuously.

x

NDICE GENERAL

DECLARACIN DE ORIGINALIDAD........................................................................................................... IV

RESUMEN....................................................................................................................................... VIII

ABSTRACT ........................................................................................................................................ IX

ndice general .................................................................................................................................X

ndice de figuras .......................................................................................................................... XIII

ndice de cuadros ......................................................................................................................... XV

ndice de ecuaciones ................................................................................................................... XVI

1 INTRODUCCIN.......................................................................................................................... 1

2 ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 3

2.1 Enzimas .......................................................................................................................... 3

2.1.1 Enzimas Proteolticas .............................................................................................. 3

2.2 Proteasas de plantas mexicanas...................................................................................... 6

2.2.1 Jacaratia mexicana ................................................................................................. 6

2.3 Inmovilizacin de enzimas .............................................................................................. 9

2.3.1 Clases de inmovilizacin ........................................................................................ 10

2.4 Soportes de inmovilizacin ........................................................................................... 12

2.4.1 Caractersticas de los soportes para inmovilizacin ............................................... 13

2.4.2 Alginato de sodio como soporte de inmovilizacin ................................................ 13

2.5 Efectos de la inmovilizacin .......................................................................................... 15

2.5.1 Efectos en la actividad enzimtica ......................................................................... 16

2.6 Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas .................................................................... 17

2.6.1 Aplicaciones en la Industria Alimentaria ................................................................ 17

3 JUSTIFICACIN ......................................................................................................................... 18

xi

4 OBJETIVOS .............................................................................................................................. 19

5 MATERIALES Y MTODOS .......................................................................................................... 20

5.1 Material de estudio ...................................................................................................... 20

5.2 Preparacin y caracterizacin del soporte de inmovilizacin ......................................... 22

5.2.1 Preparacin del soporte de inmovilizacin ............................................................ 22

5.3 Anlisis de tamao de partcula .................................................................................... 23

5.4 Humedad ...................................................................................................................... 23

5.5 Prueba de compresin .................................................................................................. 23

5.6 Volumen medio unitario ............................................................................................... 24

5.7 Determinacin de la porosidad del lecho ...................................................................... 24

5.8 Anlisis de imgenes de las esferas ............................................................................... 25

5.8.1 Microscopa ptica ................................................................................................ 25

5.8.2 Microscopa estereoscpica .................................................................................. 25

5.8.3 Microscopa confocal ............................................................................................ 25

5.8.4 Microscopia electrnica de barrido ....................................................................... 26

5.9 Inmovilizacin de la mexicana ...................................................................................... 26

5.10 Parmetros determinados en la enzima libre y en la enzima inmovilizada ..................... 28

5.10.1 Determinacin de protena ................................................................................... 28

5.10.2 Determinacin de la actividad proteoltica ............................................................ 28

5.10.3 Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteoltica de la mexicana ........... 29

5.10.4 Determinacin de las constantes cinticas ............................................................ 30

5.11 ndice de inmovilizacin ................................................................................................ 30

5.12 Rendimiento de produccin .......................................................................................... 31

6 RESULTADOS Y DISCUSIONES ...................................................................................................... 32

6.1 Caracterizacin del soporte de inmovilizacin............................................................... 32

6.2 Produccin de esferas de alginato ................................................................................ 33

6.2.1 Caracterizacin fsica de las esferas producidas ..................................................... 34

6.2.2 Anlisis de imgenes de las esferas ....................................................................... 36

6.3 Parmetros determinados en la enzima libre y en la enzima inmovilizada ..................... 42

xii

6.3.1 Efecto del pH en la actividad proteoltica de la mexicana...................................... 42

6.3.2 Efecto de la temperatura en la actividad proteoltica de la mexicana ................... 43

6.3.3 Determinacin de las constantes cinticas ............................................................ 45

6.4 Eficiencia de encapsulacin y rendimiento de produccin ............................................. 47

6.5 Anlisis de la inmovilizacin de mexicana en alginato de calcio .................................... 48

6.5.1 Tamao de las esferas ........................................................................................... 49

6.5.2 Prueba de compresin .......................................................................................... 51

6.5.3 ndice de inmovilizacin ........................................................................................ 53

6.5.4 Actividad proteoltica (AP)..................................................................................... 55

6.6 Reusabilidad de la mexicana inmovilizada .................................................................... 58

7 CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 60

8 REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................................................... 62

xiii

ndice de figuras

Figura 1. rbol de Jacaratia mexicana. ........................................................................................... 7

Figura 2. Representacin esquemtica del monmero de mexicana. El sitio activo Cis 25 esta

enlazado al inhibidor E-64. ............................................................................................................. 8

Figura 3. Principales mtodos de inmovilizacin de enzimas ........................................................ 11

Figura 4. Estructura del alginato, (a) y (b) monosacridos, cido--D-manurnico y cido -L

gulurnico, respectivamente, y (c) y (d) unidades que se repiten en cadena................................. 14

Figura 5. Mecanismo de gelificacin del alginato en presencia de cationes de calcio. ................... 15

Figura 6. Etapas de la fase experimental. ..................................................................................... 21

Figura 7. Representacin esquemtica de la tcnica de inmovilizacin por gelacin inica........... 26

Figura 8. Micrografa de microscopa ptica para esferas de alginato de calcio al 1%.................... 36

Figura 9. Micrografa de microscopa estereoscpica (32X) para esferas de alginato de calcio al 1%

.................................................................................................................................................... 36

Figura 10. Micrografa de microscopa confocal. Corte transversal de la esfera de alginato de calcio

al 1%. ........................................................................................................................................... 37

Figura 11. Micrografas de microscopa confocal. A) Testigo. B) Esfera de alginato al 1% con

mexicana. C) Esfera de alginato al 1% con mexicana y marcada con FITC. ................................... 38

Figura 12. Microscopa electrnica de barrido de las esferas obtenidas a diferentes

concentraciones de alginato de sodio (A) 1.0%, (B) 1.5% y (C) 2.0%. ............................................. 40

Figura 13. Micrografas obtenidas por MEB. Efecto de la concentracin de alginato de sodio en la

morfologa de la superficie: (A-B) 1.0%, (C-D) 1,5%, (E-F) 2,0%. Concentracin de cloruro de calcio

0.10 M. ........................................................................................................................................ 41

xiv

Figura 14. Efecto del pH en la actividad de la mexicana sobre casena al 1% en regulador de

fosfatos 0.05 M, a 35C. ............................................................................................................... 42

Figura 15. Efecto de la temperatura en la actividad de la mexicana sobre casena al 1% en

regulador de fosfatos 0.05 M, a 35C. .......................................................................................... 44

Figura 16. Superficie de respuesta para el tamao de la esfera con respecto a la concentracin de

cloruro de calcio y alginato de sodio. ........................................................................................... 51

Figura 17. Superficie de respuesta para la fuerza de compresin con respecto a la concentracin de

cloruro de calcio y alginato de sodio. ........................................................................................... 52

Figura 18. Superficie de respuesta para el ndice de inmovilizacin de la mexicana con respecto a

la concentracin de cloruro de calcio y alginato de sodio. ............................................................ 54

Figura 20. Superficie de respuesta para la actividad proteoltica de la mexicana inmovilizada

evaluada al tiempo cero. .............................................................................................................. 56

Figura 21. Superficie de respuesta para la actividad proteoltica de la mexicana inmovilizada

evaluada despus de 3 meses de almacenamiento. ..................................................................... 57

Figura 22. Reusabilidad de la mexicana inmovilizada en esferas de alginato de calcio.................. 59

xv

ndice de cuadros

Cuadro 1. Proteasas disponibles comercialmente........................................................................... 4

Cuadro 2. Diseo central compuesto para la inmovilizacin de mexicana. ................................... 27

Cuadro 3. Caracterizacin fsica y reolgica de las soluciones de alginato de sodio. ...................... 32

Cuadro 4. Efecto de la concentracin de alginato de sodio y cloruro de calcio sobre el dimetro de

la esfera. ...................................................................................................................................... 33

Cuadro 5. Efecto de la concentracin de alginato de sodio sobre la humedad, el volumen medio

unitario y la porosidad del lecho en esferas de alginato de calcio. ................................................ 34

Cuadro 6. Constantes cinticas de la mexicana sobre BAPNA ...................................................... 46

Cuadro 7. Efecto de la concentracin de alginato de sodio sobre la eficiencia de encapsulacin y el

rendimiento de produccin. ......................................................................................................... 48

Cuadro 8. Matriz de los experimentos para los resultados de las respuestas medidas. ................. 49

xvi

ndice de ecuaciones

Ecuacin 1 ................................................................................................................................... 24

Ecuacin 2 ................................................................................................................................... 24

Ecuacin 3 ................................................................................................................................... 30

Ecuacin 4 ................................................................................................................................... 31

Ecuacin 5 ................................................................................................................................... 45

Ecuacin 6 ................................................................................................................................... 49

Ecuacin 7 ................................................................................................................................... 53

Ecuacin 8 ................................................................................................................................... 54

Ecuacin 9 ................................................................................................................................... 55

Ecuacin 10 ................................................................................................................................. 56

1

1 INTRODUCCIN

En los ltimos aos la biotecnologa ha experimentado grandes avances y, paralelamente

sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos qumicos, en la industria

alimentaria y farmacutica. Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada

da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores

convencionales no biolgicos. A pesar de esto, el empleo de enzimas no se ha

generalizado en los procesos industriales debido a que la mayora de estas no son estables

en las condiciones de trabajo (Arroyo, 1998), adems del alto costo de aislamiento y

purificacin de la enzimas, la inestabilidad de sus estructuras una vez que son aisladas de

su entorno natural, y su sensibilidad a las condiciones del proceso ocasionan una corta

vida operativa (Bullock, 1995, Woodley, 1992). Asimismo, al ser solubles en agua, su

separacin de los sustratos y productos es difcil, y por tanto no se pueden reutilizar

(Arroyo, 1998).

Con la inmovilizacin de enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, de

ah la importancia en una amplia gama de aplicaciones industriales en particular en la

industria farmacutica, en conversiones bioqumicas y biorremediacin permitiendo que

los procesos biotecnolgicos sean econmicamente rentables (Wang y Fan, 2004).

La inmovilizacin se logra mediante la fijacin de las enzimas en soportes slidos, como

resultado se obtienen sistemas heterogneos de enzimas inmovilizadas As, en

comparacin con las enzimas libres en solucin las enzimas inmovilizadas son ms

resistentes a los cambios ambientales. Ms importante an, la heterogeneidad de los

sistemas de enzimas inmovilizadas permite una fcil recuperacin de enzimas y de

productos, la reutilizacin, la operacin continua de los procesos enzimticos, la

terminacin rpida de reacciones y una mayor variedad de diseos de biorreactores

(Bedford, 1991).

2

En este sentido, esta investigacin pretende establecer las condiciones para la

inmovilizacin de mexicana por el mtodo de gelacin inica y conocer el efecto que

tiene la concentracin de alginato de sodio y cloruro de calcio sobre el comportamiento

de la actividad proteoltica con respecto al tiempo, y proponer este mtodo como una

forma de prolongar la vida til de la enzima.

3

2 ANTECEDENTES

2.1 Enzimas

Las enzimas son protenas de estructura tridimensional sumamente compleja, son bio-

catalizadores cuya funcin es acelerar ciertas reacciones bioqumicas especficas que

forman parte del proceso metablico de las clulas. Aceleran en el organismo (en

ocasiones hasta un milln de veces), diversas reacciones qumicas que en condiciones

normales slo tendran lugar muy lentamente o no se produciran en absoluto (Bedford,

1991).

2.1.1 Enzimas Proteolticas

Las enzimas que hidrolizan las uniones peptdicas se llaman enzimas proteolticas,

peptidasas, proteasas o proteinasas. Sin embargo, peptidasa es el trmino avalado por la

Comisin de Enzimas (EC). Las proteasas forman parte del grupo de las hidrolasas y se

clasifican de acuerdo con la fuente de la que proceden (animal, vegetal, bacteriana o

fngica), su accin cataltica (endopeptidasas y exopeptidasas) o por la naturaleza del sitio

cataltico (Barret, 1994; Benitez y col., 2008).

Se ha reportado que las primeras enzimas utilizadas en la industria alimentaria fueron

proteasas pancreticas de origen animal como la tripsina, pepsina y renina, de origen

vegetal como la papana, aunque en la actualidad cada vez estn adquiriendo mayor

importancia las de origen bacteriano o fngico (Camacho y col., 1992). En el Cuadro 1 se

presentan algunas de las proteasas comerciales disponibles en el mercado y se indica la

especificidad de parte de ellas.

4

Cuadro 1. Proteasas disponibles comercialmente

Tipo de proteasa Nombre Fuente Temp

(C)

Intervalo

de pH

Serinproteasa

Animal

Tripsina 30-60 7-9

Quimotripsina Porcino, bovino 45-55 8-9

Elastasa 6-8

Bacteriana

Substilisin. Carlsberg Bacillus licheniformis 50-60 6-10

Alcalasa

Subst. BPN Bacillus 40-55 6-10

Substilisin Novo amyloliquefaciens

Cisteinproteasas

Plantas

Papana Papaya 40-75 5-8

Bromelaina Pia 20-65 5-8

Ficina Latex de Ficus 5-8

Aspartatoproteasas Animal

Pepsina Porcino, bovino 1-4

Quimosina Becerro 4-6

Fngica

Aspergilopeptidasa A Aspergillus saitoi 35-50 2-5

Newlasa Rhizopus sp. 40-50 3-6

Metaloproteasas Animal Carboxipeptidasa A Pancreas 7-8

Bacteriana

Neutrasa Bacillus

amyloliquefaciens

40-55 6-7.5

Termolisina B. thermoproteolyticus 7-9

Fuente: Qi y He, 2006; Adler, 1986.

La diferencia de las proteasas con respecto a otras enzimas es debida a la dificultad para

definir su especificidad respecto al sustrato. Existe una clasificacin de las mismas basada

en las caractersticas de los respectivos mecanismos catalticos, diferencindose as cinco

grupos de proteasas (Barret, 1994):

a) Proteasas serinicas: tienen un residuo de serina en el sitio activo, as como una

histidina y un acido asprtico.

b) Proteasas cistenicas: tienen un residuo de cistena en el sitio activo.

c) Proteasas treonnicas: poseen un residuo de treonina en el sitio activo.

d) Proteasas asprticas: presentan dos residuos de acido aspartico en el sitio activo.

5

e) Metaloproteasas: poseen un residuo de acido glutmico en el sitio activo y

requieren un catin divalente como el zinc, calcio o magnesio para catalizar la

hidrlisis del enlace peptdico.

2.1.1.1 Importancia comercial de las enzimas proteolticas

Adems de sus funciones fisiolgicas dentro de las clulas, las proteasas tienen una gran

importancia desde el punto de vista comercial, ya que estas enzimas son ampliamente

usadas en muchos procesos industriales (Valls y col., 2007). En general la industria de los

alimentos prefiere el uso de enzimas proteolticas de origen vegetal ya que son

consideradas por la Food and Drug Administration (FDA) como Sustancias Generalmente

Reconocidas como Seguras (GRAS) debido a que provienen de partes comestibles de

distintas plantas, como por ejemplo la papana, la ficina, la bromelana y la mexicana

(Martnez, 2006).

Algunas de sus aplicaciones ms sobresalientes dentro de la industria se pueden encontrar

en (Martnez, 2006):

a) Industria alimentaria:

Clarificacin de cervezas.

En el tratamiento de la malta y de la cebada.

Ablandamiento de carnes.

Extraccin de zumos, saborizantes, especias y pigmentos.

En la fabricacin de vinos, y en la clarificacin de jugos de frutas y vinos. (junto

con las celulasas y pectinasas)

Elaboracin y maduracin de quesos

Para la elaboracin de hidrolizados de protena

b) Industria farmacutica

En el tratamiento de quemaduras y pequeas lceras.

En la elaboracin de medicamentos para la digestin de protenas.

6

Existen evidencias que el ltex de las Caricceas contiene una fraccin proteica que

estimula la proliferacin de fibroblastos y clulas epiteliales en mamferos. Esta nueva

propiedad de actividad mitognica es atribuida a una proteasa cistenica, la que podra

explicar algunas de las acciones teraputicas atribuidas a estas enzimas (Gomes y col.,

2005).

2.2 Proteasas de plantas mexicanas

En el grupo de las proteasas cistenicas encontramos a la mayora de las proteasas de

origen vegetal (papana, ficina, bromelana, mexicana, etc.). Estas enzimas son

endopeptidasas (Cruz y Victoria, 1993; Whitaker, 1994). Las proteasas existen en muchas

plantas monocotiledneas y dicotiledneas, pero en forma abundante slo en escaso

nmero de ellas. El desarrollo de los mtodos de purificacin ha permitido descubrir la

presencia de varias proteasas en el ltex o jugo de frutos. Entre las proteasas mexicanas

ms estudiadas se encuentran las de los frutos de caricceas: la papana y la mexicana

obtenida de los ltex de Carica papaya y de Pileus mexicanus tambin conocida como

Jacaratia mexicana y la hemisfericina obtenida de la Bromelia hemisphaerica (Garduo,

1974; Cruz y Victoria y col., 1974).

2.2.1 Jacaratia mexicana

La familia de Caricceas son plantas que producen grandes cantidades de proteasas,

encontrndose entre ellas la Jacaratia mexicana antes denominada Pileus mexicanus, es

una planta silvestre que crece en las regiones subtropicales de la Repblica mexicana en

los estados de Morelos, Puebla, Guerrero, Campeche y Yucatn. Sus frutos son semejantes

a los de la papaya (Carica papaya) y reciben los nombres comunes de bonete, cuaguayote,

papaya orejona y papayn (Alarcn, 2009).

La Jacaratia mexicana es un rbol que llega a medir hasta 15m de altura y puede tener

hasta un dimetro de 40cm. Presenta un tronco cnico muy frgil, el cual se ramifica en la

punta, lo que lo hace muy caracterstico. Florece y fructifica en poca de sequa y es una

7

especie caracterstica del bosque tropical caducifolio. El fruto es una baya ovoide

generalmente de 13 a 18 cm de largo por 4-6 cm de ancho, las semillas son ovoides de 6-7

mm de largo por 4.5 mm de ancho aproximadamente. Su tallo es grueso, inerme, de

corteza parda y medula porosa. La planta produce ltex tanto del tallo como de los frutos

en mayor cantidad cuando estos se encuentran inmaduros (Figura 1). Los principales usos

hasta ahora conocidos son de tipo comestible tanto del fruto como del tallo (Moreno,

1980; Lomeli-Sension, 1998).

Figura 1. rbol de Jacaratia mexicana.

2.2.1.1 Mexicana

La mexicana es una proteasa monomrfica de tipo cistenico de gran estabilidad al pH y

la temperatura, fue aislada del ltex de los frutos de J. mexicana por Castaeda-Agull, y

col. (1942). Estudios comparativos bioqumicos y sobre aplicaciones industriales donde se

usa la papana (estabilizacin coloidal de la cerveza, ablandamiento de la carne, hidrlisis

de protenas de pescado y de origen vegetal, as como la modificacin de las propiedades

funcionales de protenas) han demostrado que las proteasas de J. mexicana presentan una

mayor actividad especfica y estabilidad que la papana y que pueden competir

favorablemente en los procesos donde se utiliza dicha proteasa (Briones y col., 1994;

Briones, 1996).

8

En 2004 Oliver y col., informaron que la proteasa conocida hasta entonces como

mexicana estaba constituida por un complejo de cinco proteasas, las cuales poseen pesos

moleculares y puntos isoelctricos similares, por lo que se propuso que no es una enzima

monomrfica como se haba reportado previamente. Las cinco proteasas encontradas en

este estudio fueron identificadas como P-I, P-II, P-III, P-IV y PV, esta ltima presenta

mayor actividad especfica que la proteasa P-IV, sin embargo, a la proteasa P-IV por ser la

ms abundante se le denomino mexicana y fue purificada, caracterizada y cristalizada por

Oliver, (1999).

La mexicana es una enzima que contiene siete residuos de Cis los cuales son comunes en

la familia de la papana. Posee dos dominios que estn separados por un sitio cataltico

formado por residuos de Cis 25 y His 159 uno en cada dominio, el primero es abundante

en estructuras -hlices y el segundo abundante en estructuras -plegadas, como se

muestra en la Figura 2 (Gavira y col., 2007).

Figura 2. Representacin esquemtica del monmero de mexicana. El sitio activo Cis 25

esta enlazado al inhibidor E-64.

9

2.3 Inmovilizacin de enzimas

La inmovilizacin se define como el proceso por el cual el movimiento de las enzimas,

clulas y otras especies se ve restringido total o parcialmente, dando lugar a una forma

insoluble en el medio de reaccin, en donde se presenta una mayor estabilidad como

resultado de este acoplamiento (Cifuentes y Rojas, 2005).

Segn Kilinc y col., (2002), mencionan que la inmovilizacin aporta estabilidad a las

protenas, al restringir el movimiento de la molcula de protena ligndola a un cuerpo

inerte mediante enlaces qumicos. De esta forma, los diversos dominios se mantienen en

la orientacin correcta para conservar la actividad al menos durante un largo perodo de

tiempo, en comparacin con las enzimas en solucin libre. La inmovilizacin puede

efectuarse mediante atrapamiento, interaccin inica, formacin compleja con metal,

enlace covalente, encapsulacin y adsorcin en superficies hidrofbicas o hidroflicas

(Ladero y col., 2000).

Particularmente, la inmovilizacin de enzimas se refiere a enzimas unidas, insolubilizadas,

soportadas o ligadas a una matriz, caracterizndose por aspectos tales como (Arroyo,

1998):

* Aumento en estabilidad de la enzima.

* Posible reutilizacin del sistema inmovilizado, por lo que disminuyen los costos del

proceso.

* Posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a

la aplicacin de enzimas inmovilizadas donde se permiten cargas elevadas de

enzima y uso de procesos continuos.

Pero tambin implica factores que contrarrestan lo anterior, tales como:

* La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo.

* La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas

fracciones de protenas inmovilizadas con diferente nmero de uniones al soporte.

10

* Prdida de actividad de la enzima durante la inmovilizacin.

* El sistema biocatalitico es ms caro que la enzima nativa

2.3.1 Clases de inmovilizacin

Las enzimas pueden ser inmovilizados por una variedad de mtodos, los cuales pueden

clasificarse como fsicos, donde las interacciones dbiles entre el soporte y la enzima

existen, y qumicos, donde se forman enlaces covalentes con la enzima (Bullock, 1995;

Tischer y Wedekind, 1999).

A los mtodos fsicos pertenecen: (i) La contencin de una enzima en un reactor de

membrana, (ii) la adsorcin (fsica, inico) en una matriz insoluble en agua, (iii) la inclusin

(o atrapamiento en un gel), (iv) microencapsulacin con una membrana slida, (v)

microencapsulacin con una membrana lquida, y (vi) la formacin de pelculas

enzimticas de Langmuir-Blodgett (Bullock, 1995).

Los mtodos qumicos de inmovilizacin incluyen: (i) unin covalente a una matriz

insoluble en agua, (ii) entrecruzamiento con el uso de un reactivo multifuncional de bajo

peso molecular, (iii) co-entrecruzamiento con otras sustancias neutras, por ejemplo,

protenas.

Sin embargo, no existe un mtodo nico y un soporte que sea el mejor para todas las

enzimas y sus aplicaciones. Esto se debe a una amplia gama de caractersticas qumicas y

la composicin de las enzimas, las diferentes propiedades de los sustratos y productos, y

los diferentes usos a los que el producto se puede aplicar. En consecuencia, las

condiciones ptimas para la inmovilizacin de una enzima elegida y sus aplicaciones se

encuentran empricamente mediante un proceso de prueba y error en la manera de

garantizar la retencin ms alta posible de la actividad de la enzima, su estabilidad

operacional y durabilidad. Un esquema general de esta clase de tcnicas es expuesto en la

Figura 3 (Arroyo, 1998; Wiseman, 1985).

11

Metodos de inmovilizacin

Atrapamiento

En geles

Bolas

Fibras

Separacion de membranas

Microencapsulacin

Reactor de

membrana

Unin al soporte

Unin covalente

Al soporte

Entrecruzamiento

Unin inica

Al soporte

Agregacin

Adsorcin

Figura 3. Principales mtodos de inmovilizacin de enzimas

2.3.1.1 Inmovilizacin por gelacin inica

Es un proceso que se desarroll para inmovilizar enzimas, donde se utiliza principalmente

alginato como componente de la membrana y la combinacin con iones divalentes como

el calcio, para inducir la gelificacin (King, 1988). En esta interaccin tiene lugar un

entrecruzamiento inico entre los iones de calcio y las unidades de cido gulurnico del

alginato, dando lugar a un gel conocido como modelo de caja de huevo.

Estequiomtricamente se requiere de 7.2% de calcio (basado en el peso del alginato de

sodio) para una sustitucin completa, sin embargo con slo 2.2% de calcio se logra la

formacin del gel (Pedroza y col., 1996). Al entrar en contacto con los iones calcio, el

alginato forma un gel instantneamente. Los iones se siguen difundiendo en el, logrando

que el gel se vaya endureciendo con el tiempo (King, 1988).

12

El proceso consiste en suspender el compuesto que se va a inmovilizar en una solucin

acuosa de CaCl2 que se encuentra sometida a una velocidad de agitacin adecuada. Al

entrar la gota de alginato sdico en contacto con Ca+2 se produce la gelificacin

instantnea de la misma, obtenindose una membrana o cubierta de alginato clcico que

es insoluble en agua pero permeable (Yez, 2007). La reaccin que tiene lugar es:

2Na Alginato + Ca 2 Ca Alginato + 2Na+

Cabe mencionar que es posible manipular la dureza del gel formado modificando las

condiciones de elaboracin (pH, concentracin de iones, concentracin de alginato, etc.)

(Pedroza, 2002).

2.4 Soportes de inmovilizacin Al considerar un soporte para un enzima se deber tener en cuenta factores tales como el

pH, la temperatura, la fuerza inica, la presin, agitacin, la conjugacin de cofactores y el

proceso de separacin del sustrato del producto (Ghose, 1978). Los soportes pueden

variar de forma (lminas, tubos, cilindros, esferas), tamao, propiedades fsicas o

qumicas, encontrndose una gran variedad de compuestos clasificndose en (Arroyo y

col., 2000):

Soportes inorgnicos

Naturales: arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice.

Manufacturados: xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no

poroso, almina, cermicas, gel de slice.

Soportes orgnicos

Polmeros naturales

Polisacridos: celulosa, almidn, dextranos, agarosa, alginatos, quitosano.

Protenas fibrosas: colgeno, queratina. (Cruz, 2007).

Polmeros sintticos

13

Poliolefinas: poliestireno

Polmeros acrlicos: poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos.

Otros tipos: alcohol polivinlico, poliamidas (Arroyo y col., 2000).

2.4.1 Caractersticas de los soportes para inmovilizacin

Aunque no existen soportes universales, hay algunos principios para su seleccin, entre

los cuales se encuentran:

* El material debe estar disponible en abundancia y a un bajo precio.

* El proceso de inmovilizacin tiene que ser simple y efectivo con la consideracin

de retencin de la actividad enzimtica.

* La capacidad y eficiencia de las enzimas inmovilizadas tiene que ser alta.

* El diseo del reactor con respecto al mecanismo manejado del biocatalizador tiene

que ser simple (Cifuentes y Rojas, 2005).

Adems de lo anterior un soporte ideal para una aplicacin dada es aquel que aumente la

interaccin con el sustrato, disminuya la inhibicin por el producto, cambie el pH aparente

ptimo hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fcilmente

recuperable para poder volverlo a utilizar . El soporte debe ser estable en solucin y no

debe deteriorarse en las condiciones de reaccin, debe ser rgido mecnicamente, por lo

que se deben precisar necesidades tcnicas y econmicas (costo, calidad, funcionalidad, y

seguridad) para definir un buen catalizador en trminos de eficiencia e integracin del

costo efectivo (Cheetan, 1998).

2.4.2 Alginato de sodio como soporte de inmovilizacin

El alginato es uno de los polmeros ms utilizados como soporte de inmovilizacin en

productos alimenticios y farmacuticos, los usos de alginato en estos productos se deben

a su espesamiento, estabilidad y la formacin del gel y la pelcula (Ghasem y col., 2004).

Es extrado primariamente de tres especies de algas marrones. Estas incluyen Laminaria

14

hyperborea, Ascophyllum nodosum y Macrocystis pyrifera. Los alginatos son una familia de

polisacridos lineales no ramificados, conteniendo cantidades variables de acido 1,4--D-

mannurnico y de acido -L-gulurnico (Figura 4). La composicin y extensin de las

secuencias y el peso molecular determinan las propiedades fsicas de los alginatos

(Rodrguez Llims y col., 2003).

Figura 4. Estructura del alginato, (a) y (b) monosacridos, cido--D-manurnico y cido -

L gulurnico, respectivamente, y (c) y (d) unidades que se repiten en cadena.

2.4.2.1 Mecanismo de formacin del gel de alginato de calcio

Cuando a una solucin de alginato de sodio de concentracin definida se le aade una

solucin de un metal divalente como el calcio a alta concentracin se forma un gel

insoluble de alginato de calcio. Estos geles son usados en procesos de retencin de iones

de metales pesados de las aguas residuales, en la inmovilizacin de microorganismos y de

enzimas.

Las sales del acido algnico estn formadas por tres bloques, bloques M, G y MG. Cuando

dos cadenas de bloque G se alinean se forman sitios de coordinacin debido a la forma de

bucles de estas cadenas, las cavidades permanecen entre ellas y estos tienen el tamao

15

adecuado para acomodar al ion calcio y adems estn revestidos con grupos carboxlicos y

otros tomos de oxigeno electronegativos los cuales son ligandos favorables y permiten

un alto grado de coordinacin de los iones calcio. Por esta razn este modelo es llamado

el modelo caja de huevo (egg-box model), esto se ilustra en la Figura 5. Este modelo fue

propuesto para dar explicacin a las propiedades gelificantes de los alginatos al reaccionar

con sales clcicas (Oliveira, 2003).

Figura 5. Mecanismo de gelificacin del alginato en presencia de cationes de calcio.

2.5 Efectos de la inmovilizacin

Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su

inmovilizacin ya que la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte, hacen que

la estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se haga ms resistente a

la desactivacin trmica o qumica; la proteccin frente a las proteasas cuando se unen al

soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autlisis; se evita la agregacin

intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin

del espacio y por ltimo la alteracin del microentorno ayuda a diferentes enzimas debido

a la interaccin de la enzima con el soporte, este tiene un efecto tamponador de tal

16

manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la

disolucin se produzcan cambios importantes de pH (Arroyo y col., 2000).

Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por

diversas razones: la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al

centro activo est impedido, los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn

aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad

cataltica de la enzima, la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da

lugar a una forma inactiva o las condiciones experimentales del proceso causan la

desnaturalizacin o desactivacin de la enzima (Arroyo y col., 2000).

2.5.1 Efectos en la actividad enzimtica

Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por

diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser debido a que

(Arroyo, 1998):

1. La unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro

activo est impedido.

2. Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte

del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima.

3. La inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una

forma inactiva.

4. Las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o

desactivacin de la enzima.

Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios

(disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a efectos

difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno.

17

2.6 Aplicaciones de las enzimas inmovilizadas

Las aplicaciones ms importantes de las enzimas inmovilizadas se pueden clasificar en

(Arroyo, 1998):

1. Aplicaciones analticas: biosensores

2. Aplicaciones mdicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas

3. Aplicaciones industriales: en la industria qumica, farmacutica, alimentaria y de

tratamiento de residuos

2.6.1 Aplicaciones en la Industria Alimentaria

Son muchas las enzimas que se emplean en el procesado, la preparacin y la conservacin

de los alimentos. Normalmente, las enzimas solubles aadidas son inactivadas por

calentamiento una vez que el tratamiento ha concluido. En ocasiones se permite que

contine su actividad para que los alimentos desarrollen el aroma y la textura deseados,

pero nunca se reutilizan. La inmovilizacin permite que las enzimas puedan ser

reutilizadas repetidamente en operaciones continuas o discontinuas. De todas maneras,

existen limitaciones a su empleo relacionadas con los requisitos econmicos y sanitarios

inherentes al procesado de alimentos (Arroyo, 1998). A continuacin se resumen algunas

de sus aplicaciones:

* En la hidrlisis de protenas

* En la hidrlisis de hidratos de carbono

* Mejora de las caractersticas organolpticas de ciertos alimentos

* Obtencin de edulcorantes y aditivos alimentarios

18

3 JUSTIFICACIN

Adems de la importancia de sus funciones fisiolgicas dentro de las clulas, las enzimas

proteolticas obtenidas de fuentes vegetales tienen una gran importancia desde el punto

de vista comercial, debido a sus mltiples aplicaciones en que potencialmente pueden ser

empleadas, de las cuales destacan la industria farmacutica y la industria alimentaria.

Particularmente la mexicana, una enzima proteoltica aislada del ltex de cuaguayote, se

ha reportado que puede presentar una actividad proteoltica igual o mayor que las

enzimas comerciales, considerndose por tal motivo una enzima con potenciales

aplicaciones prcticas en distintos procesos industria. De forma paralela es importante

analizar el comportamiento de esta enzima en diferentes sistemas, particularmente en

aquellos que pueden ayudar a mejorar o conservar sus propiedades durante su

manipulacin. En este sentido la inmovilizacin de enzimas presenta un reto tecnolgico

importante a resolver en sistemas enzimticos novedosos como el de la mexicana, dado

que se reporta que este tipo de tcnicas permiten en otros sistemas enzimticos, tener un

alto nivel de actividad, mantenimiento su estabilidad contra la interaccin de otras

molculas, previene la agregacin, autolisis, el contacto con otras fases, rotacin contra

esfuerzos de corte por agitacin necesarios para control de pH, etc. Los sistemas de

inmovilizacin tambin podran ayudar a resolver los problemas industriales de

biocatlisis debidos a la recuperacin y estabilidad as como el control de la interaccin

enzima-soporte, con el medio. Debido a lo anterior el propsito de este trabajo es obtener

y analizar un sistema de inmovilizacin que permita conservar un nivel de actividad

proteoltica igual o mejor al de la enzima libre, as como el estudiar su estabilidad durante

el almacenamiento bajo condiciones de refrigeracin.

19

4 OBJETIVOS

Objetivo general

Estudiar el efecto de un proceso de inmovilizacin por gelacin inica empleando alginato

de sodio como soporte sobre la actividad enzimtica de mexicana.

Objetivos especficos

* Obtener un sistema de inmovilizacin para mexicana, empleando alginato de calcio como soporte.

* Evaluar las propiedades fsicas y mecnicas del sistema de inmovilizacin obtenido.

* Estudiar mediante tcnicas de microscopa la estructura de los sistemas de inmovilizacin obtenidos.

* Evaluar la actividad proteoltica de la enzima inmovilizada y la enzima libre, durante el almacenamiento.

20

5 MATERIALES Y MTODOS

La estrategia experimental del presente trabajo se dividi en tres etapas, la primera

consisti en el diseo preliminar del sistema de inmovilizacin mediante la preparacin de

dispersiones de alginato de sodio y su reaccin con cloruro de calcio, tambin se

caracteriz el soporte con respecto a su comportamiento al flujo, densidad y pH.

En la segunda etapa con el soporte caracterizado se elaboraron esferas de inmovilizacin

con alginato de calcio y se evaluaron sus parmetros fsicos como el dimetro, humedad y

la fuerza de compresin, adems se realiz una caracterizacin microscpica de la

estructura y superficie de las esferas.

La tercera etapa consisti en evaluar el efecto del soporte de inmovilizacin y de la

solucin endurecedora sobre la actividad proteoltica de la mexicana, as como el

rendimiento de produccin y el ndice de inmovilizacin. En la Figura 6 se describe de

manera general la estrategia experimental desarrollada en el presente trabajo.

5.1 Material de estudio

La Mexicana fue obtenida de una preparacin enzimtica de los frutos de Jacaratia.

Mexicana, proporcionada por el laboratorio de enzimologa del Centro de Desarrollo de

Productos Biticos (CEPROBI-IPN).

Como sistema de inmovilizacin se emple alginato de sodio grado reactivo (Qumica

Meyer, Mxico) y como agente entrecruzante se empleo cloruro de calcio (J.T.Baker

U.S.A.).

21

Figura 6. Etapas de la fase experimental.

ETAPA II

ETAPA III

ETAPA I Caracterizacin del soporte de inmovilizacin

Preparacin de las micropartculas de alginato

Inmovilizacin de la mexicana

Densidad pH Viscosidad

Dimetro

Humedad

Prueba de compresin

Microscopia ptica

Microscopia confocal

Microscopia Electrnica de Barrido

Caracterizacin fsica

Rendimiento de produccin Actividad proteoltica ndice de inmovilizacin

22

5.2 Preparacin y caracterizacin del soporte de inmovilizacin

5.2.1 Preparacin del soporte de inmovilizacin

Se prepararon dispersiones de alginato de sodio a concentraciones de 1.0%, 1.5% y 2.0%.

El alginato de sodio fue dispersado en agua destilada a una temperatura de 60C en una

parilla (Thermo Scientific, U.S.A) a una velocidad de 125rpm, durante un tiempo de 30

min, posteriormente se enfriaron a temperatura ambiente y se utilizaron inmediatamente

para su caracterizacin.

5.2.1.1 Densidad

La densidad se determin de acuerdo a Cancela y col., (2003) empleando un mtodo

picnomtrico. El picnmetro fue puesto previamente a peso constante en una estufa con

una precisin de 0,05 C, se registr el peso inicial y se adicion la solucin de alginato

de sodio hasta el aforo y se registr el peso final. Mediante una diferencia de pesos se

obtuvo el valor de la densidad. Cada valor fue el promedio de tres mediciones.

5.2.1.2 Viscosidad

La viscosidad de las dispersiones de alginato se determinaron empleando un viscosmetro

Brookfield DV-II + Pro (Brookfield Engineering, U.S.A.), con configuracin de cilindros

coaxiales. El intervalo de velocidad empleado fue entre 25 a 100 rpm, utilizado las agujas

del nmero 3 al 6. Cada determinacin se realiz por triplicado para cada concentracin

de polmero.

5.2.1.3 pH

El pH de las dispersiones se determin de forma directa en un potencimetro (Oakton,

Malasia), para cada concentracin de alginato de sodio utilizado. El valor del pH fue el

promedio de tres mediciones.

23

5.3 Anlisis de tamao de partcula

Se determin el tamao de las esferas de alginato mediante dos mtodos: de forma

manual empleando un vernier, donde la medida fue un promedio de una muestra de 100

esferas y tambin fue evaluado por el paso de las esferas a travs de una batera de

tamices con de mallas de acero inoxidable (No. 8, 10 y 12) que corresponden a 2,38, 1,68

y 1,41 mm, respectivamente.

5.4 Humedad

La humedad se determin empleando una termobalanza (Ohaus Corporation, U.S.A.),

colocando 1 g de esferas sobre la charola previamente tarada de la termobalanza y se

realiz el ensayo a una temperatura constante de 60 C. Este mtodo evapora de manera

continua la humedad de la muestra y el registro continuo de la prdida de peso, hasta que

la muestra se site a peso constante (Kirk y col., 1996).

5.5 Prueba de compresin

Los ensayos texturales fueron realizados utilizando un texturmetro TA-XT2i (Stable Micro

Systems, Inglaterra). Se colocaron 15 esferas de alginato clcico sobre una plataforma

cilndrica plana de aluminio de 3 pulgadas de dimetro y se realiz una prueba de

compresin empleando una sonda cilndrica de aluminio de 2 pulgadas de dimetro (P2),

situada a una distancia constante de la plataforma a la sonda de 3 mm y a una velocidad

de cabezal de 2 mm/s. Esta prueba se realiz por triplicado. Los resultados se analizaron

con el programa Texture Expert para Windows y se basaron en la siguiente relacin:

Fuerza del Gel (g) = Fuerza necesaria para comprimir la muestra y producir el mayor pico

durante la compresin.

24

5.6 Volumen medio unitario

El volumen unitario fue determinado por el mtodo empleado por Mendoza, 1983, en

donde en una probeta de 10 mL que contiene 5 mL de aceite comestible se adicionan

nmero conocido de esferas y se registra el volumen de aceite desplazado, el volumen

registrado de aceite desplazado se refiere al nmero de esferas adicionadas,

obtenindose el volumen promedio unitario de la esfera. La determinacin se realiz 5

veces para cada condicin experimental.

5.7 Determinacin de la porosidad del lecho

La porosidad del lecho fue evaluada por la tcnica de Mendoza (1983). En una probeta de

10 mL se adicionaron en forma continua y lenta un nmero de esferas necesarias para

alcanzar tal aforo. Una vez conseguido el aforo se cuentan las esferas requeridas en tal

operacin, y se procede a calcular el volumen de fraccin vaca empleando la Ecuacin 1 y

posteriormente la porosidad del lecho con la Ecuacin 2.

= . Ecuacin 1

= Ecuacin 2

25

5.8 Anlisis de imgenes de las esferas

5.8.1 Microscopa ptica

Esferas de atrapamiento fueron preparadas como se describe en la Seccin 5.9. Las

esferas fueron cortadas transversalmente y fueron colocadas en un portaobjetos,

posteriormente fueron observadas en un microscopio ptico modelo CX31 (Olympus,

Japn) con un aumento de 40X. Las imgenes fueron capturadas digitalmente.

5.8.2 Microscopa estereoscpica

La morfologa de las esferas se determin por microscopia estereoscpica, la muestra fue

montada en un portaobjetos y observada a diferentes aumentos (1.2X, 2.5X y 3.2X). Se

empleo un microscopio estereoscpico Carl Zeiss y las imgenes fueron capturadas

digitalmente.

5.8.3 Microscopa confocal

Esferas de atrapamiento fueron preparadas como se describe en la Seccin 5.9, a

continuacin fueron sumergidas en una solucin de para-formaldehdo durante 30

minutos, se colocaron en una base de acero inoxidable para ser cubiertas con una solucin

crio-protectora y posteriormente fueron congeladas en un ultracongelador (SANYO,

U.S.A.) a -60 C durante 30 min, posteriormente se colocaron en un criostato para obtener

cortes transversales de la esfera de 40 m de espesor, dichos cortes se colocaron en un

portaobjetos para posteriormente observarlos en un microscopio confocal de barrido

lser modelo LSM710 (Carl Zeiss, Alemania). Las imgenes fueron capturadas

digitalmente.

26

5.8.4 Microscopia electrnica de barrido

Las esferas fueron montadas en un portaobjetos con cinta de carbn ionizada de doble faz

y cubiertas con una pelcula de plata durante 2 min en un sombreador de oro/plata Desk

IV (Denton Vaccum, U.S.A) Posteriormente fueron observadas en un microscopio

electrnico de barrido modelo JSM-6390LV (JOEL, Alemania), a un voltaje de 5, 10 y 20 KV

y aumentos de 200X y 1000X. Las imgenes fueron capturadas digitalmente.

5.9 Inmovilizacin de la mexicana

La mexicana se inmoviliz mediante gelacin inica (Figura 7) empleando como soporte

alginato de calcio. Se prepararon 50 mL de solucin enzimtica con una concentracin de

1 mg/mL en regulador de fosfatos pH 7.6 y 50 mL de solucin de soporte al 1.0, 1.5 y 2.0%

obteniendo un volumen total de 100 mL para cada concentracin de alginato,

posteriormente se mezclaron a temperatura ambiente y agitacin constante a 125 rpm. La

suspensin se paso a travs de una aguja por medio de una bomba peristltica para

formar gotas que al ponerse en contacto con la solucin endurecedora (CaCl2 0.1, 0.2 y 0.3

M) gelificaron de manera instantnea, formndose partculas esfricas. La solucin de

CaCl2 se mantuvo en agitacin constante (125 rpm) para evitar que las esferas se pegaran

entre ellas al momento de caer. El tiempo de maduracin de las esferas fue de 6 h.

Figura 7. Representacin esquemtica de la tcnica de inmovilizacin por gelacin inica

27

La metodologa de superficie de respuesta fue empleada para analizar la variacin de la

actividad proteoltica durante el proceso de inmovilizacin de mexicana. Se utiliz un

diseo de experimentos central compuesto, teniendo como factores la concentracin

alginato de sodio y la concentracin de cloruro de calcio, como variables respuesta fueron

analizados el tamao de la esfera, la fuerza de compresin, el ndice de inmovilizacin y la

actividad proteoltica. El diseo de experimentos fue construido por medio del programa

Design Expert 7 (Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN).con 13 corridas experimentales

totalmente al azar y 5 repeticiones en el punto central. Las condiciones de

experimentacin se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Diseo central compuesto para la inmovilizacin de mexicana.

Corridas Bloques Concentracin de Alginato de sodio (%)

Concentracin de Cloruro de calcio (%)

1 1 1.00 0.10 2 1 2.00 0.10 3 1 1.00 0.30 4 1 2.00 0.30 5 1 0.79 0.20 6 1 2.21 0.20 7 1 1.50 0.06 8 1 1.50 0.34 9 1 1.50 0.20

10 1 1.50 0.20 11 1 1.50 0.20 12 1 1.50 0.20 13 1 1.50 0.20

28

5.10 Parmetros determinados en la enzima libre y en la enzima inmovilizada

5.10.1 Determinacin de protena

El contenido de protena fue determinado por el mtodo de Bradford (1976). Se tomaron

100 L de muestra y se adicion 1 mL del reactivo de Bradford, se incubo durante 15

minutos a temperatura ambiente y se ley la densidad ptica a 595 nm. Cada

determinacin se realiz por triplicado contra un blanco de reactivos (100 L de agua y 1

mL de reactivo de Bradford). Con dichas lecturas se calcul el contenido de protena

mediante la ecuacin de la curva tipo de Albmina srica bovina y=0.0018x + 0.0287,

donde y es la densidad ptica a 595 nm y x son los g de protena. El coeficiente r2 fue de

0.9926.

5.10.2 Determinacin de la actividad proteoltica

La actividad proteoltica fue determinada por el mtodo de Ortega y del Castillo (1966). Se

tomaron 180 L de muestra y se adicionaron 60 L de cistena 0.8 M en regulador de

fosfatos 0.05 M, pH 7.6 y se dejo en reposo 15 minutos. De esta mezcla se tomaron 25 L,

los cuales fueron adicionados a 475 L de casena al 1% en regulador de fosfatos 0.05 M,

pH 7.6, previamente incubada a 35C. El tiempo de reaccin fue de 10 minutos a 35C 2,

transcurrido este tiempo se adicionaron 750 L de ATC al 5% para detener la reaccin. El

testigo recibi el mismo tratamiento, excepto que los 25 L de la mezcla se agregaron

despus de adicionar el ATC, los tubos se dejaron en reposo durante una hora, se

centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm, posteriormente los productos de la

hidrlisis que se encuentran en el sobrenadante se leyeron en un espectrofotmetro a

280 nm, ajustando contra un blanco de reactivos (500 L de regulador de fosfatos 0.05 M,

pH 7.6 y 750 L de ATC). El ensayo se realiz por triplicado y la actividad proteoltica se

report en UT/mL equivalentes a g de tirosina liberados en una hora, por mL.

29

5.10.3 Efecto del pH y la temperatura en la actividad proteoltica de la mexicana

Para determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad proteoltica se tomaron

180 L de la preparacin enzimtica de mexicana y se adicionaran 60 L de cistena 0.8 M

en regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6; las muestras se incubaron a 35C durante 15

minutos para activar la enzima. Enseguida se colocaron en tubos eppendorf, 475 L de

casena al 1% como sustrato y se agregaron 25 L de la enzima activada. La actividad

proteoltica se realiz por triplicado durante 10 min a diferentes temperaturas (25, 30, 35,

40, 45, 50, 55, 60 y 65C), deteniendo la reaccin con 750 L de ATC al 5%.

Para determinar el efecto del pH sobre la actividad proteoltica se tomaran 180 L de la

preparacin enzimtica de mexicana y se adicionaran 60 L de cistena 0.8 M en

regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6; las muestras se incubaron a 35C durante 15

minutos para activar la enzima. Se colocaron en tubos eppendorf, 475 L de casena como

sustrato preparada al 1% en diferentes reguladores preparados de la siguiente manera:

pH 5.0 y 5.5 (acetatos 0.05M), pH 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0 (fosfatos 0.05M), pH 8.5, 9.0, 9.5

10.0 (boratos 0.05M) y se agregaran 25 L de la enzima activada. La actividad proteoltica

realiz por triplicado durante 10 min a temperatura de 35C, deteniendo la reaccin con

750 L de ATC al 5%.

El testigo recibi el mismo tratamiento para ambos casos, excepto que los 25 L de la

mezcla se agregaron despus de adicionar el ATC, los tubos se dejaron en reposo durante

una hora, se centrifugaron durante 10 minutos a 13000 rpm, posteriormente los

productos de la hidrlisis que se encuentran en el sobrenadante se leyeron en un

espectrofotmetro a 280 nm, ajustando contra un blanco de reactivos (500 L de

regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7.6 y 750 L de ATC). El ensayo se realizara por triplicado

y la actividad proteoltica se reportara en UT/mL equivalentes a g de tirosina liberados en

una hora, por mL usando la ecuacin de una Curva Tipo de Tirosina.

30

5.10.4 Determinacin de las constantes cinticas

Con la finalidad de conocer y comparar las propiedades cinticas de la mexicana libre e

inmovilizada se determin la actividad proteoltica utilizando el sustrato sinttico N-

BenzoilDL-Arginina p-nitroanilida (BAPNA Sigma Aldrich) a diferentes concentraciones. El

anlisis cintico incluy el ensayo de las siguientes concentraciones de sustrato: 0.05,

0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.45, 0.50, 0.75, y 0.90 mL. El BAPNA fue disuelto en dimetil

sulfxido, se complet con las siguientes cantidades de regulador de fosfatos pH 7, 0.1 M

respectivamente: 0.85, 0.80, 0.75, 0.65, 0.55, 0.45, 0.40, 0.15 y 0.0 mL con cistena 25 Mm

y EDTA 25 mM. Posteriormente para iniciar la reaccin se adicionaron a los tubos con el

sustrato 0.1 mL de mexicana y al testigo se le adicion 0.1 mL del mismo regulador. Se

dejo transcurrir la reaccin por 10 minutos a una temperatura de 40 C. La reaccin se

detuvo adicionando 0.25 mL de acido actico y se midi el incremento de absorbancia a

410 nm contra un blanco de reactivos.

5.11 ndice de inmovilizacin

Para determinar el ndice de inmovilizacin se prepar un volumen total de 50 mL de una

mezcla de alginato de sodio enzima de la siguiente manera: 0,5 g de alginato se

dispersaron en 25 mL de agua destilada y 0,05 g de enzima mexicana se disolvieron en 25

mL de regulador de fosfatos 0.05 M, pH 7,6, posteriormente esta dispersin se goteo en

una solucin de cloruro de calcio 0,1 M para la obtencin de las esferas. Se tom una

muestra al inicio de la preparacin enzimtica, as como solucin endurecedora (CaCl2)

despus de 6 h de maduracin para determinar el porcentaje de enzima inmovilizada se

emple la Ecuacin 3 (Sankalia y col., 2005):

% = Ecuacin 3

31

5.12 Rendimiento de produccin

El rendimiento fue determinado preparando 1.5 g de alginato dispersado en 100 mL de

agua destilada. Posteriormente se comenz a gotear sobre una solucin de cloruro de

calcio 0.1 M para la obtencin de las esferas. Posteriormente se secaron en un horno a

una temperatura de 40 C hasta obtener peso constante. El porcentaje de esferas

obtenidas se determin por medio de la Ecuacin 4 (Calero y col., 2008):

% = Ecuacin 4

32

6 RESULTADOS Y DISCUSIONES

6.1 Caracterizacin del soporte de inmovilizacin

Las dispersiones de alginato de sodio (sin enzima) se caracterizaron fsica y

reolgicamente. En el Cuadro 3 se muestran los resultados de dichas pruebas. En trminos

de viscosidad, las soluciones presentaron valores en un intervalo de 387.6 a 3240 cp, para

concentraciones de alginato de sodio de 1% a 2% respectivamente, este resultado mostr

que la viscosidad en las dispersiones de alginato incrementa de forma exponencial a los

incrementos de concentracin.

La densidad muestra un comportamiento similar al de la viscosidad con valores de 0.997

g/cm3 para una concentracin de 1% de alginato de sodio, mientras que empleando 1.5%

de alginato la densidad fue de 1.009 g/cm3 y para una concentracin ms alta de polmero

el valor fue de 1.100 g/cm3.La comparacin entre las concentraciones ensayadas muestra

que existe una diferencia estadsticamente significativa entre las medias de las variables

con un nivel del 95 % de confianza. Los resultados de densidad obtenidos para las

dispersiones son semejantes a lo reportado por Cancela y col., (2003) para dispersiones de

alginato de sodio (Prolabo) para intervalos de concentraciones entre 0.5 y 1.5% de

alginato. El pH no se ve afectado por la concentracin de alginato, manteniendo un valor

constante para las tres concentraciones empleadas.

Cuadro 3. Caracterizacin fsica y reolgica de las soluciones de alginato de sodio.

Alginato de sodio (%) Viscosidad (Cp) Densidad (g/cm3) pH

1.0 387.6 5.06 0.997 0.07 7.24 0.02

1.5 1346 5.29 1.009 0.01 7.35 0.02

2.0 3240 10.11 1.100 0.00 7.39 0.03

33

6.2 Produccin de esferas de alginato

Basndonos en el trabajo de Rodrguez y col. (2003) la solucin de alginato de sodio fue

preparada a partir de acido algnico calentando a 60 C para obtener una

despolimerizacin parcial, de esta manera fue posible trabajar con distintas

concentraciones del polmero. Se prepararon lotes de esferas de alginato con diferentes

condiciones experimentales (concentraciones de alginato y solucin de cloruro de calcio).

Despus de la elaboracin de las esferas, fue evaluado el tamao, obteniendo lotes con

diferentes distribuciones de tamao de partcula. En el Cuadro 4 se muestra los tamaos

obtenidos, los cuales fueron obtenidos en un intervalo de 1.86 a 2.04 mm.

Cuadro 4. Efecto de la concentracin de alginato de sodio y cloruro de calcio sobre el

dimetro de la esfera.

CaCl2 (M) Alginato de sodio (%)

1.0% 1.5% 2.0%

0.1 1.97 0.07 2.00 0.07 2.03 0.05

0.2 1.86 0.07 1.97 0.06 2.04 0.05

0.3 1.86 0.10 1.91 0.08 2.03 0.05

El tamao de las esferas es un parmetro importante ya que puede influir en el perfil de

liberacin y en otros parmetros, tales como la eficiencia de encapsulacin (Saez y col.,

2007). Alonso y col. (1994) mencionan varias condiciones experimentales que afectan el

tamao de las esferas elaboradas entre las cuales podemos mencionar el tipo de polmero

y su masa molecular, la proporcin entre el polmero y la sustancia a encapsular

(Haznedar y Dortunc, 2004) y la velocidad de agitacin en el momento de formar las

partculas (Lee y col., 1999; Mateovic y col., 2002) son los factores que ms inciden en este

parmetro.

34

Calero y col. (2008) mencionan que la gelificacin inica permite obtener tamaos de

esferas que van desde 1 a 5 mm, los valores obtenidos de las esferas de alginato de sodio

elaboradas en el presente trabajo se encuentran dentro de este intervalo.

6.2.1 Caracterizacin fsica de las esferas producidas

Se determin el efecto de la concentracin de alginato de calcio sobre el contenido de

humedad, el Cuadro 5 muestra que los valores de humedad oscilaron entre 97.5 a 93.6 %

para las concentraciones de alginato de 1 a 2%. Estos resultados son similares a lo

reportado por Torres y col. (1998) para concentraciones de alginato de sodio de 1% el

contenido de humedad fue de 96%, mientras que a una concentracin de alginato de 2%

el porcentaje de humedad fue de 95%.

Cuadro 5. Efecto de la concentracin de alginato de sodio sobre la humedad, el volumen

medio unitario y la porosidad del lecho en esferas de alginato de calcio.

Concentracin

de alginato

(%)

Humedad

(%)

Volumen medio

unitario (cm3)

Porosidad del

lecho ()

1.0 97.5 0.2909 0.0110 0.0012 0.391 0.0596

1.5 96.0 0.9286 0.0120 0.0007 0.336 0.0295

2.0 93.6 0.5023 0.0137 0.0007 0.240 0.0425

Segn Weert y col. (2000) la presencia de agua en las esferas puede provocar fenmenos

indeseables, tales como cambios en la matriz polimrica por la hidrlisis de los enlaces

ster del polmero, o cambios en la protena favorecidos por el medio hmedo. Por esta

razn, resulta importante determinar la humedad en las esferas.

35

En cuanto al volumen medio unitario se efecto la determinacin para 10 lotes de 100

unidades cada uno de acuerdo a lo expuesto en la Seccin 5.6, obtenindose esferas con

volumen medio unitario de 0.011 a 0.013cm3. Los resultados mostrados en el Cuadro 5

presentaron diferencias significativas respecto a las medias del volumen unitario, con un

nivel de confianza del 95% al hacer el anlisis de varianza.

Posteriormente se determin el volumen vacio o porosidad () a 10 lotes de esferas

sustituyendo los datos en la ecuacin de la Seccin 5.7 de materiales y mtodos con el fin

de determinar el espacio hueco o libre que existe entre las esferas de alginato de calcio a

travs del cual circula el sustrato al ser empacadas contiguamente en una columna de

vidrio, obteniendo valores entre 0.24 y 0.39 como se muestra en el Cuadro 5. Al hacer el

anlisis de varianza se encontr que la concentracin de alginato tuvo un efecto

significativo respecto a la porosidad media de las muestras con un nivel de confianza del

95%. Podemos atribuir que la cantidad de espacio libre para cada concentracin de

alginato pudo verse afectada por la porosidad de la capa, el dimetro de las partculas, la

esfericidad o forma de las partculas, la orientacin del empaquetado y la rugosidad de las

partculas, entre otros factores.

36

6.2.2 Anlisis de imgenes de las esferas

6.2.2.1 Microscopa ptica

El anlisis en el microscopio ptico con un aumento de 40X mostr que en el interior de la

esfera se observa una estructura reticular (Figura 8).

Figura 8. Micrografa de microscopa ptica para esferas de alginato de calcio al 1%.

6.2.2.2 Microscopa estereoscpica

Las esferas obtenidas fueron observadas al microscopio estereoscpico, determinndose

la formacin de matrices de atrapamiento con una estructura esfrica bien definida y con

un interior hueco, obtenidas por medio de la tcnica de gelificacin inica (Figura 9).

Figura 9. Micrografa de microscopa estereoscpica (32X) para esferas de alginato de

calcio al 1%

37

6.2.2.3 Microscopa confocal

La microscopia confocal se realiz con el objetivo de estudiar la distribucin de la enzima

en la esfera, en la Figura 10 se observar un corte transversal realizado con un microtomo

de 40 m de espesor, en el cual podemos ver a la enzima embebida en la pared de la

esfera emitiendo una mayor fluorescencia con respecto al centro de la misma, al emplear

una longitud de excitacin de 480 nm. Estas imgenes se correlacionan con las estructuras

morfolgicas observadas usando un microscopio ptico (Seccin 6.2.2.1).

Figura 10. Micrografa de microscopa confocal. Corte transversal de la esfera de alginato

de calcio al 1%.

38

Figura 11. Micrografas de microscopa confocal. A) Testigo. B) Esfera de alginato al 1%

con mexicana. C) Esfera de alginato al 1% con mexicana y marcada con FITC.

A

B

C

39

En la Figura 11 (A) se observ una imagen superficial de una esfera de alginato de calcio

sin la adicin de enzima, la cual se consider como testigo; cabe hacer notar que no hubo

fluorescencia empleando una longitud deexitacin de 480 nm. En la Figura 11 (B) se

muestra la flourescencia emitida nicamente por la enzima en ausencia del flourocromo

(FITC), mientras que en la Figura 11 (C) la emisin se potencializo al adicionar el

flourocromo empleando una potencia del lser de 5%. Bajo estas condiciones se observ

una mejor distribucin de la enzima en la superficie de la esfera, lo que confirma la

presencia de la mexicana en la pared de la estructura capsular.

6.2.2.4 Microscopia electrnica de barrido

Las muestras obtenidas del proceso de inmovilizacin empleando el mtodo de gelacin

inica fueron analizadas por MEB, con ampliaciones de X43, X50 y X100. Los resultados

indican que el tamao se encuentra en intervalos que van de 1.37 mm hasta 2.54 mm de

dimetro (Figura 12), obtenindose ste ltimo para una concentracin de alginato de

2.0%.

Las micrografas de las Figura 12 (A, B, C) muestran formas variadas e irregulares, sin

embargo se mantiene la constante de una formacin reticular en la superficie de las

esferas. Una aspecto importante a destacar es que a medida que la concentracin de

alginato se incrementa se observa una superficie con menos pliegues. Sankalia y col.

(2005) reportan que al aumentar la concentracin del alginato de sodio existe un

incremento en la viscosidad y un retraso en la penetracin del calcio al interior de la

esfera ocasionando un descenso en el entrecruzamiento, as como una reduccin en la

porosidad y rugosidad en la superficie de la esfera. Resultados semejantes fueron

obtenidos en este trabajo, como se muestra tambin en la Figura 13 (B, D, F).

40

Figura 12. Microscopa electrnica de barrido de las esferas obtenidas a diferentes

concentraciones de alginato de sodio (A) 1.0%, (B) 1.5% y (C) 2.0%.

A

B

C

41

Figura 13. Micrografas obtenidas por MEB. Efecto de la concentracin de alginato de

sodio en la morfologa de la superficie: (A-B) 1.0%, (C-D) 1,5%, (E-F) 2,0%. Concentracin

de cloruro de calcio 0.10 M.

A B

C D

E F

42

6.3 Parmetros determinados en la enzima libre y en la enzima inmovilizada

6.3.1 Efecto del pH en la actividad proteoltica de la mexicana

La Figura 14 presenta el efecto del pH en la actividad de mexicana libre e inmovilizada

sobre casena. Como se observa, la actividad proteoltica para la enzima libre aumenta

gradualmente hasta alcanzar un mximo (20,363.46 UT/mL) en pH 7.5 y posteriormente

se observa un descenso, a pH 10 la mexicana libre conserva un 59.5% y a pH 5 se

conserva un 14.14% de la actividad proteoltica con respecto al pH ptimo. Para la enzima

inmovilizada el comportamiento es distinto, se observa que el intervalo del pH ptimo es

mayor, con valores entre 8.5-9.5, mostrando una actividad proteoltica de 22,433 UT/mL y

22,408 UT/mL respectivamente.

Figura 14. Efecto del pH en la actividad de la mexicana sobre casena al 1% en regulador

de fosfatos 0.05 M, a 35C.

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0

Act

ivid

ad p

rote

olt

ica

(UT/

mL)

pH

Enzima libre Enzima inmovilizada

43

La diferencia en el comportamiento se debe posiblemente a que la esfera le proporciona

mayor estabilidad a la enzima. Los valores de pH ptimo para la enzima libre se

encuentran dentro del intervalo de valores de pH ptimo (pH 7-8) de las proteasas

cistenicas, como la papana y sernicas como la tripsina (Whitaker, 1994).

Lei y col (2004) realizaron estudios sobre papana libre e inmovilizada en microesferas

magnticas reportando valores de actividad proteoltica sobre casena en un intervalo de

pH entre 5.0 a 10.0 a una temperatura de 40C, sealando tambin que el pH ptimo para

la enzima soluble fue de 6.5 mientras que para la enzima inmovilizada fue de 8.0, los

resultados mencionados anteriormente son similares a los obtenidos en este trabajo, esto

indica que tanto la papana inmovilizada como la mexicana exhiben una buena

adaptabilidad al medios alcalinos, este comportamiento se puede atribuir a la similitud

que existe entre ellas por ser consideradas como proteasas cistenicas provenientes de la

familia de las caricceas.

6.3.2 Efecto de la temperatura en la actividad proteoltica de la mexicana

Se determin la temperatura ptima de actividad de la mexicana libre e inmovilizada

sobre un sustrato natural, la casena. En la Figura 15 se observ que el intervalo de la

temperatura ptima para la mexicana libre se encuentra entre 35 40C, la mexicana

libre conserva un 30% de la actividad proteoltica a 25C, mientras que a una temperatura

de 65C mantiene nicamente el 21%. Para la enzima inmovilizada a 65C no se observa

un descenso en la actividad proteoltica, por el contrario, esta aumenta conforme

incrementa la temperatura, esto se puede atribuir a la capacidad de la esfera para proveer

a la enzima de cierta proteccin contra las condiciones del medio de de reaccin.

44

Varios reportes indican un incremento en la estabilidad de la enzima con un incremento

en la temperatura, particularmente en enzimas proteolticas las cuales en estado libre

sufren una autodegradacin y al ser inmovilizadas se reduce en buena medida este

fenmeno (Wang y col., 1979).

Oliver (1999) menciona que la temperatura ptima de una enzima es un parmetro

operacional ms que una caracterstica verdadera. A temperaturas bajas la velocidad de

formacin de los productos es constante, pero a temperaturas altas, hay una disminucin

de la cantidad total de la enzima presente, debido a que se desnaturaliza en funcin del

tiempo y la temperatura.

Figura 15. Efecto de la temperatura en la actividad de la mexicana sobre casena al 1% en

regulador de fosfatos 0.05 M, a 35C.

0

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

35,000

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Act

ivid

ad p

rote

olt

ica

(UT/

mL)

Temperatura (C)

Enzima libre Enzima inmovil

45

Estudios similares del efecto de la temperatura sobre la actividad proteoltica de papana

libre e inmovilizada en microesferas magnticas reportadas por Lei y col (2004) muestran

valores de temperaturas optimas de 65C y 80C respectivamente, demostrando as que

las enzimas inmovilizadas presentan una mejor resistencia a temperaturas altas en

comparacin con las enzimas en solucin libre.

6.3.3 Determinacin de las constantes cinticas

Se llev a cabo la determinacin de Km y Vmx con BAPNA usando diferentes

concentraciones de sustrato (0.5 a 9 mM). Ambos valores se obtuvieron por anlisis de las

velocidades iniciales en una serie de concentraciones de sustrato y una concentracin

nica de enzima (Oliver y col. 1977, Whitaker, 1994).

El mtodo de Lineweaver-Burk, descrito en 1934, es el mtodo ms utilizado para calcular

Km y Vmx a partir de los datos obtenidos experimentalmente al medir la velocidad inicial

a varias concentraciones de sustrato con una concentracin dada de enzima. Este mtodo

se basa en la linearizacin de la Ecuacin 5:

1 = [ ] + 1 Ecuacin 5

La cual corresponde a la ecuacin de una lnea recta (Y = m x + b) donde:

= = [ ] = =

46

Km / Vmax representa la pendiente de las rectas obtenidas con un trazo de Lineweaver-

Burk, tiene la ventaja que involucra en el numerador a las constantes de disociacin del

complejo enzima-sustrato (k1 y k2) y en el denominador al producto de la constante de

velocidad de formacin del complejo (k1), la constante cataltica (k2) y la concentracin

inicial de enzima (Eo) (Oliver, 1999). Los valores para estas constantes se presentan en el

Cuadro 6.

Cuadro 6. Constantes cinticas de la mexicana sobre BAPNA

Sistema Kcat (s-1) Km (mM) Kcat/Km (M s-1) 1Enzima libre 0.96 10.56 90.90

1Enzima inmovilizada 0.38 1.48 263.15 1 Mtodo de Lineweaver-Burk

Los valores de Km de la mexicana libre reflejan que tiene afinidad por el BAPNA, no

obstante, Ortega y del Castillo (1966), reportan que la mexicana acta sobre diversos

tipos de sustratos proteicos como la casena y la hemoglobina, por lo tanto, la proteasa

puede ejercer su accin sobre diferentes sustratos y no sobre un sustrato en especifico,

dado lo cual concluimos que no es una enzima especifica en sentido estricto. Oliver (1997)

reporta valores de 1.44, 10.5 y 136.2 para Kcat, Km y Kcat/Km, respectivamente,

empleando mexicana a las mismas condiciones (pH 7.0 y 40 C). Los valores de Kcat, Km y

Kcat/Km para la enzima inmovilizada fueron de 0.38 s-1, 1.48 mM y 263.15 M s-1

respectivamente. Los datos demuestran que la concentracin de sustrato necesaria para

la mexicana inmovilizada son menores que los requeridos para la enzima libre, bajo las

mismas condiciones de experimentacin. Los resultados con relacin a la interaccin entre

la mexicana inmovilizada sobre el sustrato BAPNA muestran que existe una mayor

afinidad con respecto a la enzima libre. Un efecto similar en cuanto a la afinidad del

sustrato sobre la enzima inmovilizada fue reportado por Lei y col. (2004) con papana

inmovilizada en microesferas magnticas.