-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
1/16
by ALPERENTOO
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
2/16
Saflatrmailemi 4 basamaktan oluur;
1-) Hcrelerin ayrlmas2-) Lizis; Hcrelerin paralanmas3-) Protein
ve dier kontaminantlardan uzaklatrlmas4-) RNA saflatrlmas
RNA Saflatrlmas
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
3/16
Nkleik asitlerin daha sonra kullanlacaprosedrn tipine baldr.
Saflk dzeyine baldr.
Nkleik asitlerin molekler arlna
Zaman ve ekonomik durumlara bal
olarak deiebilir.
Saflatrma tekniklerinintercihi
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
4/16
Nkleik asitlerin saflatrlmas iin ok eitli yntemlervardr, en
uygun tekniin seimi aadaki kriterlere baldr.
1-) Hedef nkleik asit
2-) Kaynak organizma
3-) Balang materyali ( doku, yaprak, tohum vb.)4-) stenen
sonular ( verim, saflk, prifikasyon iin gerekli
sre)
5-) Bir sonraki uygulama ( PCR, klonlama, iaretleme,
RT-PCRvs.)
RNA Saflatrlmas
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
5/16
Hcre ekstraktlarndan nkleik asitlerin saflatrlmasyntemleri
aadaki tekniklerden iki veya daha fazlasnn
birlikte kullanmn gerektirir. Bunlar; Ekstraksiyon
Kromotografi
Santrifgasyon
Afinite kolon ayrm
Saflatrma Yntemleri
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
6/16
Optimum miktar ve saflkta RNA elde etmek iin balangmateryali
miktarnn iyi belirlenmesi gerekmektedir.
Genellikle maksimum 100 mg hcre kullanlabilmektedir.
Birok bitki materyali iin Rneasy spin kolonlarn kapasitesi
veBuffer RLT nin lizis kapasitesi bu miktarlar geememektedir.
Balang Materyal MiktarnnBelirlenmesi
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
7/16
Balang Materyal MiktarnnBelirlenmesi
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
8/16
Kullanmdan nce Buffer RLT veya Buffer RCLye-Mercaptoethanol
(-ME) katlmaldr.
1 ml Buffer RLT veya Buffer RLC iin 10 l -ME ilave edilir.
-ME ieren Buffer RLT veya Buffer RLC 1 ay oda
scaklndasaklanabilmektedir.
Kullanmdan nce Buffer RPE ye ienin zerinde gsterildiikadar 4
hacim etanol (%96-100) ilave edilmelidir.
Balamadan nce YaplmasGerekenler
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
9/16
1)Bitki materyalinin miktar belirlenir. 100 mgdan daha
fazlamateryal kullanlmamaldr.
2)Tartlm dokular hemen sv azota alnr ve havanda toz
halinegetirilir. Toz halindeki doku ve sv azot, Rnaz iermeyen sv
azotile soutulmu 2 mllik ependorf tplere aktarlr. Dokunun
erimesine izin verilmeden sv azot uurulur ve hemen 3.basamaa
geilir.
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
10/16
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
11/16
3) Maksimum 60 mg toz rnek iin 600 l Buffer RLT veya BufferRLC
ilave edilip hzl ekilde vortekslenir.
4) Lizatlar(600 l) 2mllik toplama tplerine
yerletirilmiQIAshredder spin kolonlara transfer edilir ve maksimum
hzda 2dakika santirfj edilir. Toplama tpnde oluan pelete zarar
vermeden biriken spernatant dikkatlice yeni bir ependorf
tpeaktarlr ve bu spernatant sadece bir sonraki basamak
iinkullanlr.
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
12/16
5) Lizatlarykamak iin 0.5 hacim etanol ( 450 l spernatant +225 l
EtOH) eklenir ve pipetleme yaparak kartrlr ve
beklemeden bir sonraki basamaa geilir.
6) rnekler, 2mllik toplama tplerine yerletirilmi RNeasy
spinkolonlara transfer edilir. Kapaklar kapatlr ve 15 sn 8000
xg
( 10.000 rpm) hzda santrifj edilir. Toplama tpnde birikenksm
atlr.
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
13/16
7) RNeasy spin kolonlara 700 l Buffer RW1 eklenir. Kapak kapatlr
ve spinkolon membranlarnnykanmas iin 15 sn 8000 xg ( 10.000 rpm )
hzdasantrifj edilir. Toplama tpnde biriken ksm atlr.
8) RNeasy spin kolona 500 Buffer RPE eklenir. Kapak nazike
kapatlr vespin kolon membranlarnn ykanmas iin 15 sn 8000 xg (
10.000 rpm )hzda santrifj edilir. Toplama tpnde biriken ksm
atlr.
9) RNeasy spin kolona 500 l Buffer RPE eklenir. Kapak kapatlr ve
spin kolonmembranlarnnykanmas iin 2 dakika 8000 xg ( 10.000rpm )
hzdasantrifj edilir.
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
14/16
10) Rneasy spin kolonlar yeni 1.5 mllik tplere yerletirilir.
30lRnaz iermeyen su direkt olarak spin kolon membrana eklenir.
Kapak nazike kapatlr ve RNA elsyonu iin 1 dk. 8000 xg ( 10.000
rpm) hzda santrifj edilir.
11) Eer istenilen RNA miktar 30 gdan fazla ise 30-50 l Rnaz
iermeyen su kullanlarak 11. basamak tekrar edilir.
PROTOKOL
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
15/16
-
7/30/2019 Bitki Hcre ve Dokularndan Total RNA Saflatrlmas
16/16
