Biyokimyasal Yöntemler

Dönem Sonu Ödevi

Dersi veren öğretim üyesi : Prof. Dr. Saadet Gümüşlü

Hazırlayan : Arş. Gör. Mustafa Kırça

Cam malzemelerin temizliği ve sterilizasyon

Cam malzemelerin yapısı

Laboratuvarda kullanılan cam malzemelerin çoğu borosilikat veya soda camdan yapılmış malzemelerdir. Biyokimya laboratuvarı gibi laboratuvarlarda borosilikat camlar tercih edilir. Bu cam «Pyrex» veya «Kimaks» olarak da bilinir. Bu isimler ticari isimleridir ve üretici firmalar tarafından tescil ettirilmiştir. Borosilikat camlar % 81 silis, %12 borik asit,

aluminyum ve sodadan oluşur. Alkali oranı düşük, çinko grubu elementler ve ağır metal

içermezler.

Borosilikat camların özellikleri

Kimyasal maddelere, korozyona daha dayanıklıdırlar. Genleşme katsayısı düşük, bu yüzden termal şoka ve bölgesel ısıtmalara karşı dayanıklıdırlar (kısa süreliğine 600 Co ye kadar). Daha kalın, daha sağlam ve kimyasal reaksiyonlara girmeyen bir yapıya sahiptirler. Patlama riskleri azdır. Laboratuvarda bu camlar tercih edilmelidir.

Cam malzeme temizliği

Genel amaçlı malzeme temizliğinde ilk temizlik sıvı deterjan ve uygun bir fırçayla yapılır. Pipetler ve benzer malzemeler içerisine fırça girmeyeceği için kullanıldıktan sonra hemen yıkanmalı veya yıkanana kadar su vey uygun bir çözelti içerisinde bekletilmelidir. Yıkama amaçlı olarak metal iyonu içermeyen deterjanlar tercih edilir. Mevcut değilse normal deterjanla yıkanır ve bol suyla durulanır. Ardından saf sudan geçirilerek suyun akması için ters çevrilerek kurutulur. Ters çevrilmeden kurutulursa kuruyan malzemede su izleri oluşur ve bu istenmeyen bir durumdur. Kullanıldıktan sonra kan, serum ve kimyasal ihtiva eden cam malzemeler ve özellikle pipetler musluk suyuyla dolu bir kaba alınmalıdır. Böylece artık maddeler kurumaz. İçerisinde kalıntı oluşmuş malzemeler % 10’luk KOH içerisinde 12 saat bırakılır. Yağ, protein ve organik madde artığı içeren malzemeler bikromat solüsyonunda 12-24 saat bırakılır. Malzemeler musluk suyuyla durulandıktan sonra bir gece saf suda bekletilir. Na, K, Ca, Pb ve Hg gibi metalik iyonların tayininde iyonize olmayan malzemeler tercih edilmelidir. Cam malzeme yüzeyine adsorbe olan metalleri uzaklaştırmak için malzemeler temizlendikten sonra % 20’lik nitrik asit içerisinde 12-24 saat bırakılır. Sonra durulanıp saf sudan geçirilerek deiyonize hale getirilir. En son basamakta cam malzemeler etüvde kurutulur.

Bikromat temizlik solüsyonu

Isıya dayanıklı bir litrelik balona 500 ml su konur. Balon musluk suyu altında soğutulurken üzerine 250 ml derişik sülfürik asit ilave edilir. Üzerine 100 g potasyum bikromat eklenir, tamamen çözünmesi sağlanır ve son hacim 1 L’ye tamamlanır. Solüsyonun rengi yeşile dönene kadar kullanılabilir.

% 20 lik nitrik asit solüsyonu

Isıya dayanıklı bir balon jojeye 500 ml saf su konur. Musluk suyu altında balon soğutulurken su üzerine yavaş yavaş 200 ml derişik nitrik asit eklenir ve çalkalanır. Son hacim 1L’ ye tamamlanır.

Sterilizasyon

Hücre kültürü laboratuvarı gibi mikroorganizma üreme tehlikesi olan ortamlarda sterilizasyon çok önemlidir. Bu yüzden kullanılan bütün malzemeler steril olmalıdır. Ayrıca çalışma yapan kişiler mutlaka eldiven takmalı ve ellerini % 70 lik etanolle veya dezenfektanlarla sık sık sterilize etmelidir.

Sterilizasyon yöntemleri

Çok farklı sterilizasyon yöntemi vardır: kuru hava, nemli hava, kaynatma, tindalizasyon, otoklav, kimyasal maddeler ve ultraviyole ışın gibi. İhtiyacımıza hangisi cevap veriyorsa ve amaca uygunsa o yöntem tercih edilir. Örneğin, protein çözeltileri için otoklav kullanılamaz fakat tindalizasyon uygulanır. Sterilizasyon için kullanılan kimyasallara örnek olarak % 70 lik etanol veya izopropil alkol, % 37-40 lık formaldehit çözeltisi, klor ve iyot bileşikleri ve peroksitler sayılabilir. Besiyerlerine eklenecek vitamin ve keto grubu içeren karbohidratlarda sterilize edilmelidir. Bunlar için özel, küçük gözenekli filtreler kullanılır. Filtreden geçirilince steril hale gelirler. Ayrıca laboratuvarda kullanılan diğer malzemeler (pipetler, pipet uçları gibi) sterilizasyon ünitelerinde steril hale getirilirler. Bu ünitelerde etilen dioksit gazı kullanılır (patlayıcı olduğu için CO2 ile karıştırılır) ve tek kullanımlık disposable malzemeler etilen dioksitle sterilize edilir. Ayrıca ultraviyole ışın altında tutulurlar ve olası mikroorganizmalar parçalanırlar. Laminer kabinlerde de sterilizasyon uv-ışın ile sağlanır. Bu yöntemde malzeme ile ışın arasında bir engel bulunmamalı, direk teması sağlanmalıdır.

Asit ve baz çözeltilerinin standardizasyonu (ayarlanması)

Asit ve bazlardan istediğimiz konsantrasyonda çözelti hazırladığımızı düşünürüz. Fakat kimyasallardan, cihazlardan, cam malzemelerden ve kişisel hatalardan dolayı ancak istenilen konsantrasyona yakın bir çözelti hazırlayabiliriz. Bundan dolayı hazırlanan çözeltilerin standardizasyonu gereklidir. Örneğin HCl çözeltisi hazırlarken kullandığımız asit % 37 lik olmayabilir çünkü HCl bir gazdır ve asit şişesinin kapağı açılıp kapandıkça % 37 lik derişim azalacaktır. Asit ve bazları ayarlama primer standart maddelerle veya primer standart maddelerle ayarlanmış başka bir çözeltiyle sekonder yoldan yapılabilir. Primer standart madde; yüksek saflıkta, açık havada kolayca nemlenmeyen ve

bozunmayan, yüksek molekül ağırlıklı, tercihen ucuz ve kolay bulunabilen bir maddedir. Bu maddelerle hazırlanan çözeltilerin konsantrasyonları kesin olarak bilinir ve standardizasyona gerek yoktur. Her madde bu özellikleri taşımadığı için primer standart çözeltisi hazırlanamaz, sekonder standart çözeltisi hazırlanır. Primer standartlarla standardize edilir.

Asitler için primer standarların bazıları

Na2CO3

TRİS (tris-(hidroksimetil)aminometan)

Bazlar için primer standarların bazıları

Potasyum hidrojen ftalat (PHP)

Okzalik asit dihidrat

Potasyum hidrojen iyodat

Benzoik asit

0,5 M NaOH’in potasyum hidrojen ftalatla (PHF) standardizasyonu

Deneyden önce primer standart olan PHF etüvde 110 C0’de 2 saat kurutulur ve deneye kadar desikatörde saklanır. Önce 0,5 M NaOH çözeltisi hazırlanır. Bunun için hassas şekilde 10 g tartım alınıp bir miktar saf suda çözülerek son hacim 500 ml’ye tamamlanır. Bu çözeltiden bir bürete doldurulur ve büretin üst çizgisi ayarlanır. Daha sonra yaklaşık 2 gram PHF hassas bir şekilde tartılır ve tartım miktarı not edilir. PHF temiz ve kuru bir erlene alınır. Erlen içerisine 30-40 ml saf su ve 3-4 damla fenolftalein damlatılır. Erlen içeriği büretteki sodyum hidroksitle pembe renk görülene kadar titre edilir ve sarfedilen hacim not edilir. Hesaplama için 2,1340 g PHF tartımı aldığımızı ve 21,2 ml NaOH sarfedildiğini varsayalım. PHF ile NaOH 1:1 reaksiyona girer. O halde

molPHF = molNaOH olur. Önce PHF (204 g/mol) molünü bulalım:

molPHF= g/Ma = 2,1340 g /204 (g/mol) = 0,01046 mol

Bu aynı zamanda sarfedilen NaOH molüdür. NaOH’e ait mol sayısı ve hacim bilindiğine göre artık molaritesi hesaplanabilir.

M = n = 0,01046 mol = 0,493 M

V 21,2x10-3 L

0,5 M olarak hazırladığımızı sandığımız NaOH çözeltisi aslında 0,493 molardır.

0,1 N HCl çözeltisinin ayarlanması

Primer standart madde olarak sodyum karbonat (Na2CO3 ) kullanılır. Deneyden önce sodyum karbonat etüvde 110 Co’de iki saat kurutulur ve deneye kadar desikatörde

muhafaza edilir. Konsantrasyonu 0,1 N olan HCl çözeltisi hazırlanır. Sonra 0,1-0,2 gram sodyum karbonat hassas bir şekilde tartılır ve tartım miktarı not edilir. Hazırlanan HCl çözeltisi bir bürete doldurulur ve büretin üst çizgisi ayarlanır. Tartılan Na2CO3 bir erlene alınır ve üzerine 30-40 ml saf su ve 3-4 damla metil oranj damlatılır. Sonra titrasyon yapılır ve dönüm noktasındaki sarfiyat kaydedilir. Hesaplamalar için 0,1223 g Na2CO3 tartımı aldığımızı ve 21,4 ml NaOH sarfiyatı yaptığımızı varsayalım. Kullanacağımız eşitlik şu şekilde ifade edilir:

Nasit x Vasit (ml) = gram Na2CO3

miliekivalent gram Na2CO3

Bu eşitlikte eşitliğin sol tarafı normalitesi belirlenecek aside veya baza ait iken sağ taraf ise primer standart maddeye aittir. Değerleri eşitlikte yerine koyduğumuzda;

NHCl x 21,4 = 0,1223 g = 2,308

(106/2000)

NHCl = 0,1078 N

0,1 N hazırladığımızı düşündüğümüz asit çözeltisinin gerçek konsantrasyonu 0,1078 N olarak bulduk. Bu bize asitler ve bazların çözeltileriyle çalışırken standardizasyonun önemini göstermiştir.

ÇÖZELTİLER ve KONSANTRASYON BİRİMLERİ

İki veya daha fazla kimyasalın homojen bir karışımıdır. Miktarı az olana çözünen, Miktarı çok olana ise çözücü adı verilir.

Çözelti hazırlarken temiz laboratuvar araç ve gereçleri, saf bir çözücü (distile su), yeterli saflıkta kimyasallar, 0,1 mg hassasiyete sahip kalibre edilmiş bir analitik teraziye ihtiyacımız vardır. Ayrıca uygun laboratuvar koşulları gereklidir.

Temiz laboratuvar araçları için deterjanla yıkanmış, organik kirlilikten arındırılmış (kromik asit) ve metal iyonlarından kurtarılmış (distile su) malzemeler kullanılmalıdır. Distile su ve deiyonize suyun farkı nedir? Distile su damıtılmış sudur, ilk elde edildiğinde sterildir. Fakat destilasyon cihazından gelebilen metal iyonları bulunabilir. Element ölçümlerinde bidistile veya tridistile su kullanmak daha uygundur. Deiyonize su ise metallerden arınmıştır fakat steril değildir. Suyun iyon tutucu reçinelerden geçirilmesiyle elde edilir. Organik kirlilik içerebilir.

Saf bir kimyasal nedir? % 100 saf kimyasal yoktur fakat bizim için % 99’dan saf kimyasallar çoğu zaman yeterlidir. Saf kimyasal madde ölçüm sonuçlarını etkilemeyecek kadar az miktarda safsızlık, yabancı madde içeren kimyasaldır. Saflık derecesi arttıkça

kimyasalların fiyatları da artar. Temelde üç gruba ayrılır fakat bazı gruplamalara göre 7 sınıfa kadar ayrılmıştır. Saflık derecesine göre kimyasallar üçe ayrılır: teknik, analitik ve spektroskopik saflıktaki kimyasallar. Teknik kimyasallar: yeterince saf değildir, endüstriyel amaçlıdır ve laboratuvar kullanımına uygun değildir. Analitik saflıktaki kimyasallar birçok laboratuvar çalışması için uygundur. Spektroskopik saflıkta kimyasallar yüksek saflıktadır ve spektroskopik çalışmalarda bile ölçümü etkilemez.

Çözelti hazırlandıktan sonra etiketleme yapılmalıdır. Bu etikette çözeltinin konsantrasyonu, ne çözeltisi olduğu, hazırlandığı tarih ve saat ayrıca hazırlayanın adı ve soyadı bulunmalıdır.

Çözeltilerde konsantrasyon birimleri

Yüzde konsantrasyonlar Molarite (M) Normalite (N) Formalite (F) Molalite (m)

Yüzde çözeltiler

100 ml veya 100 g çözeltide çözünmüş madde miktarını ifade eder. Birim belirtilmemiş ise katılar için gram, sıvılar için ml esas alınır.

Katı maddelerden çözelti hazırlanırken yüzde miktarı kadar gram madde tartılarak bir miktar suda çözülür ve son hacim 100 ml’ye tamamlanır.

Sıvılardan hazırlanacak çözeltide ise

A) hacim/hacim olarak: yüzde miktarı kadar hacim, sıvıdan alınarak ve son hacim suyla 100 ml ye tamamlanarak veya

B) ağırlık/ağırlık olarak: yüzde miktarı kadar gram, sıvıdan darası alınmış bir kapta tartılarak alınır ve son olarak ağırlık 100 grama tamamlanır. (pek kullanılmaz)

Bu yüzden sıvılardan çözelti hazırlanırken birimi belirtilmelidir (v/v veya w/w) Genel olarak çözünen katı ise gram madde, çözünen sıvı ise ml madde alınıp çözelti hazırlanır.

Örneğin, % 10 luk NaCl çözeltisi denilince 10 g NaCl tartılır, bir miktar suda çözülür ve son hacim 100 ml ye tamamlanır. % 70 lik etanol çözeltisi içinse 70 ml etanol alınarak son hacim suyla 100

ml ye tamamlanır. Sıvılardan çözelti hazırlanırken sıvının konsantrasyonu % 100 lük kabul edilir.

Örneğin % 20 lik HCl çözeltisi hazırlanırken % 37 lik derişik hidroklorik asitten 20 ml alınır, bir miktar suyun üzerine aktarılır ve son hacim 100 ml ye tamamlanır. Asit üzerine su asla dökülmez, su üzerine asit dökülmelidir. Ayrıca balon joje musluk suyu altında soğutularak eklenmelidir. Böylece sıçramalar ve kazalar önlenir. Çünkü asit ve suyun karışması ekzotermik bir olaydır.

% 10 g HCl çözeltisi hazırlamak istiyorsak asidi bu defa % 100 lük kabul edemeyiz. 1 ml derişik asitte kaç gram HCl bulunduğunu bilmemiz gerekir. Bunun için (d x %) ifadesi kullanılır.

Derişik HCl için d=1,19 ve % 37 ise 1 ml HCl içerisinde

1,19x0,37= 0,4403 gram HCl bulunur.

Bu yüzden 10 g HCl için 10/0.4403 = 22.7 ml derişik. asit alınıp 100 ml çözeltisi hazırlanır.

Molarite

Bir litre çözeltide çözünen maddenin mol sayısını gösterir. M harfi ile gösterilir. M = n / V ile ifade edilir. Hazırlanan çözeltilere molar çözeltiler denir. Katı ve sıvılardan molar çözelti hazırlanmasında hesaplamalar farklıdır.

Katı bir maddeden molar çözelti hazırlama örneği

500 ml 0,1 M NaOH çözeltisi için; (NaOH için molekül ağırlığı= 40 g/mol)

M = n/V ise

0,1 = n / 0,5 ise n = 0,05 mol

g NaOH = 0,05 mol X 40 g/mol

g NaOH = 2 g

2 g NaOH alınır ve bir miktar suda çözülerek son hacim 500 ml ye bir balon jojede tamamlanır.

Sıvılardan molar çözelti hazırlama:

Öncelikle sıvıların birim hacmindeki ağırlığı hesaplamak gerekir. Yani örnek olarak hidroklorik asidi alırsak 1 L % 37 lik HCl (d=1,19 g/ml) içerisinde kaç gram HCl bulunduğunu bulmamız gerekir. Buradan da 1L HCl içerisindeki mol sayısını hesaplayarak asidin molaritesini elde ederiz. Daha sonra istediğimiz çözeltiyi elde etmek için gerekli dilüsyonları yaparız.

Bir örnekle açıklarsak :

Öncelikle derişik hidroklorik asidin molaritesini hesaplayalım:

M = % x d (g/ml) x V (ml)

mol ağırlığı (g)

M = 0,37 x 1,19 x 1000 = 12,06 M

( 35,5 + 1) g

Şimdi seyrelterek istediğimiz çözeltiyi hazırlayabiliriz.

Seyreltme için C1 x V1 = C2 x V2 formülünü kullanırız.

C1 ve V1 derişik çözeltiye ait birimlerken C2 ve V2 hazırlamak istenilen çözeltiye aittir.

3 M, 250 ml çözelti hazırlamak için derişik HCl’den kaç ml alınmalıdır?

C1= 12,06 M; V1 = bilinmiyor; C2= 3M; V2 = 250 ml

12,06 M x V1 = 3 M x 250 ml ise

V1 = 62,2 ml

62,2 ml derişik asit alınır, bir miktar saf su üzerine dökülür ve son hacim 250 ml’ye tamamlanır.

Normal çözeltiler

Litresinde bir eşdeğer gram sayısı kadar madde içeren çözeltidir. Kolaylık açısından eşdeğer gram sayısı mol sayısı gibi düşünülebilir. Tek farkı maddenin gram cinsinden ağırlığının mol kütlesinden ayrı olarak tesir değerliğine de bölünmesidir.

Eşdeğer gram sayısı, çözünen maddenin gram cinsinden ağırlığının o maddenin (tesir değerliği x mol kütlesi) ne bölünmesiyle bulunur. Ekivalan gram sayısı olarakta bilinir. «Eq» olarak gösterilir. 1000’e bölünürse miliekivalan gram sayısı bulunur. Bu durumda çözelti hacminin ml olarak alınması kolaylık sağlar.

O halde tesir değerliği nedir? Tesir değerliği asitlerde ortama verilen H+ sayısı,bazlarda OH- sayısı tuzların ise aldığı veya verdiği elektron sayısıdır. Oksido-redüktif maddelerde redoks reaksiyonlarda aldığı veya verdiği elektron sayısıdır. Moleküler çözünen türler için (glikoz, üre vb.) tesir değerliği 1 dir.

Tesir değerliği HCl için 1, H2SO4 için 2,H3PO4 için 3 tür. NaOH için 1, Ca(OH2) için 2 dir. Na2SO4 tuz için 2, Ca3(PO4)2 içinse 6 dır.

KMnO4 içinse 5 tir.

2 KMnO4 K2O + 2 MnO + 5/2 O2

Normalite matematiksel olarak

gram

N = (mol ağırlığı x tesir değerliği)

V(L)

Veya N x ml çözelti = gram / molekül ağırlığı (hacimi ml olarak aldığımız için 1000’e böleriz)

T.d x 1000

Katı maddelerden normal çözelti hazırlama

Bir katı maddeden 1 ekivalan gram sayısı kadar ağırlık tartılıp suda çözülerek litreye tamamlanırsa 1 N çözelti elde edilir.

(+7) (+2)

Örneğin, 1 N 1L NaOH çözeltisi için (NaOH için tesir değerliği 1 ve 40 g/mol)

N = ekivalan gram sayısı = gram NaOH / (mol kütlesi x tesir değerliği)

V (L) V (L)

1 = gram NaOH / (40 g/mol x 1) ise 1 = gram NaOH

1 L 40

gram NaOH = 40

Gerekli olan 40 g NaOH tartılır ve bir miktar saf suda çözülerek son hacmi 1 L’ye tamamlanır.

Sıvı maddelerden normal çözelti hazırlama

Sıvı maddelerin yine birim hacmindeki ekivalan gram sayısını hesap etmek gerekir. Bunun için önce litredeki veya belirli hacimdeki ağırlık bulunur sonra bu hacimdeki ekivalan ağırlık hesaplanır ve normal çözelti hazırlanır.

% 98 lik der. sülfürik asidin (d=1,85 g/ml ve Ma= 98,08 mol/L) normalitesini hesaplayalım. Bunun için önce litresinde kaç gram sülfürik asit olduğunu sonra litresindeki ekivalan gram sayısını bularak normalitesi hesaplarız.

Litredeki gramı için m = % x d x V den

m= 0,98.1.85.1000 = 1813 g

Bu sayıyı mol ağırlığına bölersek der. sülfürik asitin molaritesini; (mol ağırlığı / T.D.)ne bölersek normalitesini buluruz. Çünkü molarite ile normalite arasındaki tek fark tesir değerliğine bölmektir. Bu yüzden der. sülfürik asit

1813g/98,09(g/mol) = 18,5 M

Ve 1813 g/(98,08 / 2) = 37 N dir.

Molarite ile normalite arasındaki bu ilişki

(Molarite x Tesir değerliği) = Normalite olarak ifade edilir.

Formal çözeltiler

Bir maddenin bir litrelik çözeltisinde bulunan formül gram sayısıdır. Molarite ile formalite sayısal değer olarak aynı sonucu verirler. Yani ikisi arasındaki fark sayısal değil kavramsaldır. Formalite

« F» ile gösterilir.

Bir F ve 1 M NaCl çözeltileri litrede 58,5 gram sodyum klorür içerir fakat burada formal terimini kullanmak daha doğrudur. Çünkü NaCl moleküler çözünmez, iyonlarına ayrışır.

Günümüzde pek kullanılmayan bir birimdir.

1 F 1L KOH çözeltisi için KOH’in formül gramı = 39,1+16+1,08 = 56,18 gramdır.

56,18 gram madde tartılıp bir miktar distile suda çözülerek son hacim 1L ye tamamlanırsa 1 F çözelti elde edilmiş olur.

Molal çözeltiler

Molalite, 1000 g çözücüde çözünen maddenin mol sayısıdır ve «m» harfiyle gösterilir. Özellikle farklı sıcaklıklarda yapılacak çalışmalarda kullanışlıdır.

Molarite ve normalitede esas olan çözelti hacmidir ve sıcaklık değiştikçe sıvıların hacmi değişir.

Molalite de ise esas olan çözücünün ve çözünenin ağırlığı olduğundan sıcaklık değişse bile çözeltinin molalitesi değişmez.

1 m 1L glukoz (Ma=180 g/mol) çözeltisi için

1000 g su alınır ve 180 g glukoz suda çözündürülür.

Bu birimde günümüzde fazla kullanılmayan birimlerden bir tanesidir.

Ppt, ppm ve ppb çözeltiler

Ppt, parts per thousand = binde bir

Ppm, parts per million = milyonda bir

Ppb, parts per billion = milyarda bir demektir.

Ppt bazen parts per trillion (trilyonda bir) olarak da kullanılabilir. Bu nedenle hangi amaçla ppt yazıldığına dikkat edilmelidir.

Bu ifadeler eser miktarda madde içeren çözeltiler için kullanılır.

Ppt = gram çözünen x 103 veya gram çözünen

gram çözelti kg çözelti

Ppm = gram çözünen x 106 veya mg çözünen

gram çözelti kg çözücü

Ppb = gram çözünen x 109 veya µg çözünen

gram çözelti kg çözelti şeklinde ifade edilirler.

Yukarıdaki formüllerde kg çözelti yerine litre çözelti yazılabilir. Fakat bunun tek şartı çözücünün su olmasıdır. Çünkü bilindiği gibi 1 g su = 1 ml sudur. Bu konsantrasyon birimi sıklıkla su analizlerinde tercih edilir.

Ppm çözelti hazırlama

500 ml 50 ppm BaCl2 çözeltisi için;

Ppm = (g çözünen / g çözelti ) x 106

5o = ( g çözünen / 500 g ) x 106

g çözünen = 0,025 g = 25 mg

25 mg BaCl2 tartımı alınarak 500 ml suda çözülür.

Pearson karesi (çapraz kuralı)

Ağırlıkça yüzde olarak verilen konsantrasyonları farklı iki çözeltiden üçüncü bir çözelti elde edilmek istenirse çapraz kuralı uygulanır.

% 95 lik ve % 20 lik etanol çözeltisi kullanarak % 50 lik etanol çözeltisi hazırlayalım:

A: birinci çözelti (%95lik)

B: ikinci çözelti (%20lik)

C:hazırlanmak istenen çözelti

(C-B) : A çözeltisinden alınacak miktar

(A-C) : B çözeltisinden alınacak miktar

A C-B

C

B A-C

95 50-20 = 30 ml

50

20 95-50 = 45 ml

% 95 lik etanolden 30 ml ve % 20 likten 45 ml alınarak % 50 lik çözelti hazırlanabilir.

Osmolar çözeltiler

Litresinde bir osmol gram çözünen madde içeren çözeltilerdir. Bir osmol ise osmotik bakımdan aktif olan molekül, iyon veya radikaldir.

Osmolgram = mol ağırlığı / partikül sayısı

NaCl için osmolgram = 58,5/2 = 29,25 g

BaCl2 için (137+2x35,5)/2 = 104 g

1 osmol gram madde bir miktar suda çözülerek hacim 1L ye tamamlanır.

İzotonik çözeltiler

Birbiri ile aynı sayıda osmotik olarak aktif partikül ihtiva eden çözeltilere izotonik çözeltiler denir. Tıbbi laboratuvarda kanın osmotik basıncı ile aynı olan çözeltiler kastedilir.

Kanın osmotik basıncı 0,3 osmolardır. 1 osmolar NaCl litresinde 29,25 g madde ihtiva eder. O halde izotonik NaCl için 0,3x29,25 = 8,775 g madde suda çözülür ve hacmi litreye tamamlanırsa izotonik NaCl (serum fizyolojik) elde edilir.

Örnek çözelti hazırlama soruları

Katı maddelerden çözelti hazırlama

1. CuSO4.5H2O (249,5 g/mol) kullanarak 0,25 M 1L çözelti hazırlanması

M = n/V

0,25 = n/ 1 ise n = 0,25 mol

n = m/Ma

0,25 = m/(249,5)

m = 0,25 x 249,5 = 62,375 g

62,375 g tartım alınarak bir miktar suda çözülür ve son hacim litreye tamamlanır.

2. 250 ml 0,1 M KCl (74,5 g/mol) çözeltisi hazırlama

M = n/V

0,1 = n/0,25 L

n = 0,1 x 0,25 = 0,025 mol

m = n x Ma

m = 0,025 x 74,5 = 1,8625 g

1,8625 g madde tartılır ve bir miktar suda çözülerek hacim 250 ml’ye tamamlanır.

3. 0,400 N Na2SO4 ın (142 g/mol) 400 ml çözeltisinin hazırlanması

N x ml = gram / miliekivalent gram

miliekivalent gram = Ma/(t.d. x 1000) eşitlikleri kullanılır.

miliekivalent gram (meq) = 142/(2 x 1000) = 0,071

İlk formülün değerlerini yerine yazarsak;

0,400 x 400 = g/0,071

160 = g/0,071

g = 11,36

11,36 g madde tartılır ve bir miktar suda çözülerek hacim 400 ml’ye tamamlanır.

4. 0,200 N tiyoürenin (76 g/mol) 700 ml çözeltisinin hazırlanması

N x ml = gram / miliekivalent gram

miliekivalent gram (meq) = 76/(1 x 1000) = 0,076

0,200 x 700 = g/0,076

140 = g/0,076

g = 10,64

10,64 g madde tartılır ve bir miktar suda çözülerek hacim 700 ml’ye tamamlanır.

5. CaCl2.4H2O (175 g/mol) kullanarak 0,25 m 500 ml çözelti hazırlanması

m (molalite) = n çözünen / kg çözücü

0,25 = n /0,5

n = 0,25 x 0,5 = 0,125

m (gram) = n x Ma = 0,125 x 175 = 21,875 g

21,875 g madde tartılır ve 500 ml suda çözülür.

Sıvı maddelerden çözelti hazırlama

1. Derişik hidroklorik asitten (% 37’lik, d=1,19 g/ml) 100 ml 0,25 M çözelti hazırlanması

M = n/ V

0,25 = n/0,1

n = 0,025 gereklidir.

m = n x Ma

m = 0,025 x 36,5

= 0,9125 g

0,9125 g HCl için kaç ml derişik asit almamız gerektiğini bulmalıyız

m = % x d x V

0,9125 = 0,37 x 1,19 x V

V = 2,07 ml

2,07 ml der. HCl asit bir miktar su üzerine dökülür ve çözelti acmi 100 ml’ye tamamlanır.

2. Derişik HCl’den % 15’lik (v/v) 500 ml çözelti hazırlanması

% 15’lik 100 ml çözelti içerisinde 15 ml asit ve 85 ml su vardır. 500 ml içinse bu değerlerin 5 katı hacimler alınmalıdır.

Gerekli der. asit: 15 x 5 = 75 ml

Veya toplam çözelti hacmi x (% derişim) = 0,15 x 500 = 75 ml

Gerekli olan su miktarı = 500-75 = 425 ml

veya toplam çözelti hacmi x (% su derişimi) = 500 x 0,85 = 425 ml

75 ml der. asit alınır ve balon jojedeki bir miktar su üzerine dökülür ve son hacim 500 ml’ye tamamlanır.

3. d = 1,84 g/ml % 98’lik H2SO4’den 250 ml 0,12 N çözelti hazırlanması

N x ml = g /meq

meq = Ma/(t.d. x 1000)

meq = 98/(2 x 1000) = 0,049

İlk eşitlikten 0,12 x 250 = g/0,049

g = 1,47

Son olarak 1,47 g H2SO4 için gereken asit hacmini hesaplarız

m= % x d x V

1,47 = 0,98 x 1,84 x V

V = 0,82 ml = 820 µL alınarak çözeltisi hazırlanır.

4. d= 0,925 g/ml % 25’lik derişik amonyak çözeltisinin molalitesinin hesaplanması

m = mol çözünen/kg çözücü

mol çözünen = g/Ma

g = % x d x V = 0,25 x 0,925 x 1000 = 231,25 gramdır. Bunun kaç mol olduğunu bulmalıyız:

n = 231,25 / 17 = 13,6 mol

Çözeltideki amonyak yüzdesi % 25 ise geri kalan % 75 lik kısım sudur. 1 L çözeltide 750 ml =750 g su vardır.

m = n/kg çözücü

m = 13,6/0,75 = 18,1

5. Derişik amonyaktan 0,200 N 1L çözelti hazırlanması

N x ml = g/meq

meq = Ma/(t.d. x 1000) = 17/(1x1000) = 0,017

İlk formülden 0,200 x 1000 = g/0,017

g = 200 x 0,017 = 3,4 gram amonyak gereklidir. Bu kadar gram için gereken hacim hesaplanır.

m = % x d x V

3,4 = 0,25 x 0,925 x V

V = 3,4/(0,25x0,925) = 14,7 ml derişik amonyak alınarak suyla son hacmi 1L’ye tamamlanır.

6. % 15’lik Na2CO3 çözeltisinden 150 ml % 5’lik çözelti hazırlanması

% 15’lik çözeltiden % 5’lik çözelti hazırlamak istiyorsak 15/5 = 3 kat dilüsyon yapmamız gerekir.

% 15’lik çözeltiden almamız gereken hacim: toplam istenen hacim/dilüsyon katsayısı

= 150/3 = 50 ml alırız ve 100 ml su ekleyerek 150 ml çözelti elde etmiş oluruz. Toplam hacim 150 ml ve % 15’lik çözeltiden aldığımız hacim 50 ml olduğuna göre 150/50 = 3 kat dilüsyon yaptğımızı görürüz ve hesaplamamızı doğrulayabiliriz.

pH Kavramı, Tampon Çözeltiler ve Biyolojik Sıvılardaki Önemi

pH kavramı

“Power of hydrogen” yada “potential of hydrogen” anlamına gelen kısaltmadır. İlk olarak 1909’da Sorensen tarafından ortaya konulmuştur. Terim olarak bir çözeltideki hidrojen iyonu konsantrasyonun (-) logaritmasıdır. Bir çözeltinin asitliği ve dolayısıyla bazlığı hakkında bilgi verir.

Peki niçin hidrojen iyonu konsantrasyonu yerine eksi logaritmasını kullanırız? Bazen direk hidrojen iyonu konsantrasyonu kullanılır fakat çoğu zaman bu konsantrasyon özellikle biyolojik

sıvılarda 0,0003 veya 1.10-6 gibi çok küçük değerdedir. İfade kolaylığı açısından yukarıdaki ifadeler yerine pH 3,5 veya pH 6 deriz.

pH’nın matematiksel tanımı

pH = - log [H+] olarak tanımlanır.

Su azda olsa kendi kendine iyonize olabilir.

H2O + H2O H3O+ + OH-

İfade kolaylığı için çoğu zaman H+ diye ifade etsekte gerçekte bu H3O+ , H5O2+ , H7O3

+ gibi hidrate bir formdur. Reaksiyon kolaylık açısından daha basit şekilde ifade edilebilir:

H2O H+ + OH-

Suyun disosiasyon sabitini bu reaksiyondan yararlanarak bulabiliriz. Bu hesaba ihtiyaç duymamızın sebebi suyun zayıf bir asit gibi iyonlaşmasıdır. Eğer kuvvetli bir asit gibi iyonlaşsaydı gerek kalmazdı. Çünkü kuvvetli asitler suda % 100 iyonlaşırlar ve asidin konsantrasyonu hidrojen konsantrasyonuna eşit olurdu.

Fakat burada suyun hangi oranda disosiye olduğu bulunmalıdır. Bu değer diğer zayıf asit/bazlar içinde hesaplanabilir. Bu değerler standart şartlarda (1 atm ve 25 oC) hep aynıdır, bir defa hesaplanınca aynı şartları sağlamak koşuluyla aynı değer kullanılabilir.

Suyun disosiasyonu şu şekilde ifade edilir :

K = [ H+] [OH-]

[H2O]

25 oC de saf suyun pH’sı 7 olduğu için [ H+] = [OH-] = 10-7 dir.

Suyun molaritesi ise 1 L de (1000 g / 18g) dan 55,56 molardır.

O halde K = (10-7)x(10-7)

55,56

K = 1,8 x 10-16 mol/L

Suyun yüksek molaritesi bu derece az olan bir disosiasyondan etkilenmez. Eşitliği yeniden düzenlersek suyun iyonlaşma sabitesi olan Ksu elde edilir

Ksu = K [H2O] = [ H+] [OH-]

= (1,8 x 10-16) x (55,56)

Ksu = 1,00 x 10-14 [ H+] = [OH-] = 10-7 olarak belirlenir.

pH neden önemlidir ?

Vücutta gerçekleşen biyokimyasal reaksiyonların çoğu pH’nın dar bir aralıkta tutulduğu ortamda gerçekleşir. Sağlıklı bir kimsenin normal fizyolojik işlevlerini yerine getirmesi için vücut sıvılarındaki pH belli bir aralıkta tutulmalıdır. Bunu sağlayan ise tampon sistemleridir.

Tampon çözelti

Tampon çözelti, az miktarda kuvvetli asit veya kuvvetli baz ilavesine veya dilusyona karşı hidrojen iyonu konsantrasyonu değişmeyen veya çok az değişen çözeltilerdir. Yani tampon çözeltiler pH değişimine direnç gösteren çözeltilerdir.

Tampon sistemleri Le Chatelier prensibine göre çalışırlar. Bu prensibe göre denge halindeki bir sistemde koşullar değiştirildiğinde, sistem değişikliğin etkisini en aza indirecek yönde hareket eder. Örneğin, asetik asit-asetat tamponuna asit ilave edildiğinde artan hidronyum konsantrasyonuna karşılık asetik asit konsantrasyonu artacak ve asetat konsantrasyonu azalacaktır. Böylece asetik asit/asetat oranı değişmeyecek veya çok az değişecektir. Dolayısıyla pH sabit kalacaktır.

Bir tampon asit varlığında baz, baz varlığında ise asit gibi davranır. Böylece pH dar bir aralıkta tutularak organizma korunmuş olur. Çoğu tamponlar zayıf bir asit ve onun konjuge bazını ya da zayıf bir baz ve onun konjuge asidini içerirler. Ancak bir tampon zayıf bir asidin kuvvetli bir bazla ya da zayıf bir bazın kuvvetli bir asitle de kısmen nötralizasyonuyla da oluşturulabilir.

Henderson-Hasselbach denkleminin türetilmesi

Bu denklem, çözeltinin pH sı ve zayıf asidin pKa değeri ile zayıf asit ve onun konjuge bazının kons. oranı arasındaki ilişkiyi tanımlar.

HA şeklinde ifade edilen bir zayıf asit:

HA H+ + A- şeklinde iyonlaşır.

Disosiasyon sabiti ise

Ka = [H+] [A-]

[HA] şeklindedir.

Bu eşitlikten [H+] nu çekersek:

[H+] = Ka. [HA]

[A-] ve iki tarafın logaritmasını alırsak:

log [H+] = log Ka + log [HA]

[A-]

İki tarafı (-1) ile çarpalım:

- log [H+] = - log K - log [HA]

[A-]

-log [H+] ile –log K yerlerine pH ve pK terimlerini koyalım :

pH = pK - log [HA]

[A-]

(-) işaretini kaldırmak için son terimi ters çevirelim:

pH = pK + log [HA]

[A-]

Bu denklem tampon sistemlerin incelenmesinde oldukça yararlıdır. Eşitlikte yer alan pKa değeri sabit olduğuna göre tampon çözelti pH’sı, zayıf asit ve onun konjuge bazının konsantrasyonu ile doğrudan ilişkilidir.

[A-] = [HA] olduğu durumda

1 olur.

pH = pK + log [A-]

[HA]

log 1 = 0 olduğu için

pH = pKa olur.

Bu nokta asidin tam olarak yarısının nötralize edildiği noktadır. Burdan pKa için bir zayıf asidin konsantrasyonun konjuge bazına eşit olduğu pH değeridir diyebiliriz.

Tampon kapasitesi

Bu terim bize bir tamponun hangi pH aralığında maksimum tamponlama yapacağı bilgisini verir. Bir litrelik tampon çözeltisinde, bir ünitelik pH değişikliği için gerekli olan kuvvetli bir asit veya kuvvetli bir bazın mol sayısıdır veya tampon çözeltisinin pH’sı bir ünite değişikliğe uğratılırken bir litrelik tamponun nötralleştirebildiği kuvvetli asit veya bazın mol sayısıdır.

Tampon kapasitesi, sistemdeki bileşenlerin total konsantrasyonlarına ve her bir bileşenin kendi konsantrasyonuna bağlıdır. Örneğin, belli bir konsantrasyonda kuvvetli asit/baz ilavesi pH’da 0,01-0,02 birim değişikliğe sebep olurken tampon 5 kat dilüe edildiğinde pH değişimi 0,05-0,1 gibi daha büyük değerlere ulaşır. Tampon çözeltiler bir noktadan sonra pH yı sabit tutmada yetersiz kalırlar ve tampon kapasitesini aşarlar.

Zayıf asitlerin konjuge bazlarıyla veya zayıf bazların konjuge asitleriyle hazırlanan çözeltilerin en etkin tamponlama yaptığı pH aralığı pK 1 arasındadır. pH’sı 5 olan bir çözeltinin tamponlanması isteniyorsa kullanılacak zayıf asidin pK’sı 4-6 arasında olmalıdır.

Tampon çözelti hazırlanması

Asit ve baz şekli bulunan maddelerden tampon hazırlanırken Handerson-Hasselbach eşitliğinden asidin ve tuzun gerekli olan mol miktarları hesaplanır. Daha sonra katı maddeler için kaç gram gerektiği, sıvı maddeler için kaç mililitre gerektiği hesaplanır. Daha sonra bir miktar çözücüde çözüldükten sonra son hacime tamamlanmadan önce pH-metreyle pH ayarı yapılır. pH ayarı yapıldıktan sonra çözelti son hacmine tamamlanır. Tris gibi tek şekli olan maddelerden ise istenen konsantrasyon ve hacimde bir çözelti hazırlanır. Daha sonra pH’sı pH-metre yardımıyla 1N NaOH veya 1 N HCl kullanılarak ayarlanır. Daha sonra çözelti son hacime tamamlanır.

Örnek:

pH sı 4,9 olan 0,1 M asetat tamponundan 250 ml hazırlayalım (pKa=4,76 ve antilog 0,14 = 1,38)

pH = pK + log [A-]

[HA]

4,9 = 4,76 + log [A-]

[HA]

log [A-] = 0,14

[HA]

MAKSİMUM TAMPONLAMA BÖLGESİ

Antilog 0,14 = 1,38 = [A-]

[HA]

[A-] + [HA] = 0,1 [A-] = 0,1 - [HA]

olduğuna göre eşitliği yeniden düzenleyelim

0,1 - [HA] = 1,38

[HA]

[HA] = 0,042 mol

Ve [A-] = 0,1 – 0,042 = 0,058 mol

Hazırlayacağımız tampon 1 litresinde 0,042 mol asetik asit ve 0,058 mol asetat tuzu (sodyum asetat) içerecektir. 250 ml’de ise 0,0105 mol asetik asit ve 0,0145 mol sodyum asetat içerecektir.

Daha sonra kaç ml asetik asit ve kaç gram sodyum asetat alınacağı hesaplanır.

0,0105 mol asetik asit = 0,0105 x 60 = 0,63 gram

m = % x d x V ise 0,63 = 1 x 1,05 x V

V = 0,6 ml glasiyel asetik asit alınmalıdır.

0,0145 mol sodyum asetat için ;

0,0145 x 82 = 1,19 g alınmalıdır.

Balon jojeye asit ve asetat alındıktan sonra saf suyla çözülürler.

Son hacim 250 ml ye tamamlanmadan önce pH metre ile pH tam olarak 4,9 a ayarlanır. Daha sonra hacim 250 ml’ye tamamlanır.

Örnek tampon hazırlama soruları

1. pH 5,4 olan 500 ml 0,1 M asetat tamponu hazırlama (asetik asit için pKa=4,7 ve d= 1,05 g/ml)

pH = pKa + log [Tuz]

[Asit]

pH = pKa + log [Asetat]

[Asetik asit]

5,4 = 4,7 + log [Asetat]

[Asetik asit]

log [Asetat] = 5,4 – 4,7 = 0,7

[Asetik asit]

[Asetat] = antilog 0,7

[Asetik asit]

[Asetat] = 0,2

[Asetik asit]

Toplam mol n = M x total hacim

0,1 x 500 ml = 50 mmol

Asetatın molüne X dersek asetik asit molüne 50-X deriz. O halde yukarıdaki eşitlik şu hali alır:

[Asetat] = 0,2 = X

[Asetik asit] 50-X

Bu eşitlikten X = 10-0,2X

X = 8,3 mmol (asetat) ise 50-X = 41,7 mmol (asetik asit)

Asetatın sodyum tuzunu kullanırsak eğer (NaAc = 82 g/mol) gereken sodyum asetat miligramı:

8,3 x 82 = 680 mg

Gereken asetik asit hacmi için önce gereken gramı sonra hacmi hesaplarız.

Gereken gram: 41,7 x 60 x 10-3 = 2,502 g

M = % x d x V

2,502 = 1 x 1,05 x V

V = 2,38 ml

Sodyum asetat bir behere alınır üzerine asetik asit eklenir ve hacim yaklaşık 450 ml olacak şekilde su eklenir. Sonra pH, pH-metreyle 5,4 olacak şekilde ayarlanır. Sonra hacim bir balon jojede 500 ml’ye tamamlanır.

2. pH’sı 6,2 olan 1L 0,2 M sitrat tamponu hazırlanması (sitrik asit için pKa=6,4 )

pH = pKa + log [Tuz]

[Asit]

6,2 = 6,4 + log [sitrat]

[sitrik asit]

Antilog (- 0,2) = [sitrat]

[sitrik asit]

[sitrat] = 0,63

[sitrik asit]

Toplam mol = 1L x 0,2M = 0,2 mol Sitrata X dersek sitrik asit 0,2-X olur:

X = 0,63 bu eşitlikten X = 0,077 mol (sitrat) ve (0,2-X) = 0,123 mol sitrik asit

(0,2 –X)

Sodyum sitrat kullanırsak (214.11 g mol−1) gereken gram : 214,11 x 0,077 = 16,48 g

Gereken sitrik asit gramı : 0,123 mol x 192,124 gmol-1 = 23,63 g (sitrik ait oda sıcaklığında katıdır)

Bu maddelerin tartımı alınır ve bir miktar suda çözülürler, sonra pH-metreyle pH ayarı yapılır ve son hacim ayarlanır.

3. pH 7,4 olan 600 ml 0,1 M fosfat tamponu (fosforik asit için pKa = 7,2)

7,4 = 7,2 + log [monohidrojen fosfat] = 0,63

[dihidrojen fosfat]

Antilog 0,2 = [monohidrojen fosfat] = 1,58

[dihidrojen fosfat]

Toplam mol = 600 ml x 0,1 M = 60 mmol

Monohidrojen fosfata X dersek dihidrojen fosfat 60-X olur. O halde

X = 1,58 bu eşitlikten X = 36,7 mmol (HPO4-2) ve 60-X = 23,3 mmol (H2PO4

-)

60-X

Monohidrojen fosfatın sodyum tuzunu(141,96 g/mol)ve dihidrojen fosfatın sodyum tuzunu (112 g/mol) kullanalım.

Gereken disodyum monohidrojen fosfat gramı : 36,7 x 10-3 x 141,96 = 5,2 g

Gereken sodyum dihidrojen fosfat gramı :23,3 x 10-3 x 112 = 2,61 g

Gereken tartımlar yapılır ve bir miktar saf suyla çözülerek hacim yaklaşık 500-550 ml’ye getirilir. pH-metreyle pH 7,4’e ayarlanır ve son hacim 600 ml olacak şekilde saf su ilave edilir.

4. pH’sı 10 olan 1L 0,5 M NH4+ tamponu (amonyak için pKa = 9,2; d= 0,73 g/ml ; %31’

lik çözeltisi halinde)

10 = 9,2 + log [NH3]

[NH4+]

0,8 = log [NH3]

[NH4+]

Antilog 0,8 = [NH3] = 0,16

[NH4+]

Toplam mol = 1L x 0,5 M = o,5 mol

Amonyak molü X olursa amonyum molü 0,5-X olur. O halde eşitlik şu hali alır:

X = 0,16 ve bu eşitlikten X = 0,0276 mol (NH3) ve 0,5-X = 0,4724 mol (NH4+)

0,5-X

Amonyum için klorür tuzu olan amonyum klorür (53,49 g/mol) kullanırsak gereken gram:

53,49 x 0,4724 = 25,27 g

Geeken amonyak kütlesiise : 0,0276 x 17 = 0,4692 g

M = % x d x V formülünden

0,4692 = 0,31 x 0,73 x V ise V = 2,1 ml amonyak alınır.

Uygun bir kaba amonyum tuzu ve üzerine amonyak alınarak çözünmeleri suyla sağlanır. Daha sonra su eklenir, ph-metreyle ph ayarlanır ve son hacme seyreltilir.

5. pH’sı 3,6 olan 200 ml 0,2 M glisin-HCl tamponu (glisin için pKa = 9,78)

Glisin ve benzer maddeler hem asit hem baz grubu taşıyan maddeleridir ve bunların tampon çözeltisi hazırlanırken direk olarak verilen konsantrasyonda bir çözelti hazırlanır ve daha sonra pH-metre yardımıyla istenilen pH asit veya baz çözeltisiyle ayarlanır.

200 ml 0,2 M glisin çözeltisi için gereken mol sayısı : 200 x 10-3 x 0,2 = 0,04 mol

Glisinin molekül ağırlığı 121,1 gramdır. Gereken gram =121,1 x 0,04 = 4,844 g

4,844 gram glisin tartılır ve 100-150 ml suda çözülür ve 1 N HCl yardımıyla ph-metre kullanılarak pH ayarı yapılır ve hacim 200 ml’ye tamamlanır.

6. pH’sı 4,2 olan 100 ml 0,2 M sodyum formiyat tamponu hazırlama (formik asit için pKa: 3,75 ve d= 1,22 g/ml)

pH = pKa + log [HCOO-]

[HCOOH]

4,2 = 3,75 + log [HCOO-]

[HCOOH]

0,45 = log [HCOO-] => antilog 0,45 = [HCOO-] / [HCOOH]

[HCOOH]

[HCOO-] / [HCOOH] = 0,35

Toplam mol sayısı : 100 ml x 0,2 M = 20 mmol

HCOO- molüne X dersek HCOOH molüne 20-X deriz. O halde eşitlik

X = 0,35 halini alır.

20-X

X = 7 – 0,35 x X ise X = 5,18 mmol (HCOO-) ve 20-X = 14,82 mmol (HCOOH)

HCOO- için NaHCOO (68 g/mol) kullanırsak gerekli olan gram ağırlık :

5,18 x 10-3 x 68 = 0,3522 g

Gereken formik asit (46,03 g/mol) gramı : 14,82 x 10-3 x 46,03 = 0,6822 g

0,6822 g için gereken formik asit hacmi için m = % x d x V formülünden

0,6822 = 1 x 1,22 x V den V = 0,56 ml = 560 µL

0,3522 g sodyum formiyat tartımı uygun bir kaba alınır, üzerine formik asit eklenir ve hacim 70-80 ml’ye distile suyla tamamlanır. pH-metreyle pH 4,2’ye ayarlanır ve son hacim balon jojede 100 ml’ye tamamlanır.

7. pH’sı 3,5 olan formik asit tampon çözeltisi hazırlanmak isteniyor. Bunun için 400 ml 1,00 M formik asit içerisine ilave edilmesi gereken sodyum formiyat gramı nedir? (formik asit için Ka = 1,8 x 10-4)

pH = pKa + log [HCOO-]

[HCOOH]

3,5 = - log (1,8 x 10-4) + log [HCOO-]

[HCOOH]

3,5 = 3,74 + log [HCOO-]

[HCOOH]

log [HCOO-] = -0,245 ise

[HCOOH]

[HCOO-] = antilog (-0,245) = 0,569

[HCOOH]

400 ml 1,00 M formik asit çözeltisinde 0,4 L x 1,00 M = 0,4 mol asit vardır.

Mol HCOO- = 0,569 x 0,4 = 0,228 mol sodyum formiyat gereklidir.

Gereken sodyum formiyat (67,997 g/mol) gramı : 0,228 x 67,997 g/mol = 15,5 g

8. pH’sı 3,37 olan bir tampon çözelti hazırlanması isteniyor. Bunun için 250 ml 0,300 M sodyum mandelata (C6H5CH(OH)CO2Na) ilave edilmesi gereken 0,200 M HCl hacmi nedir? (Mandelik asit için pKa = 3,4)

pH = pKa + log [Mandelat]

[Mandelik asit]

3,37 = 3,4 + log [Mandelat]

[Mandelik asit]

log [Mandelat] = -0,03 ise [Mandelat] = 0,933

[Mandelik asit] [Mandelik asit]

Çözelti içerisindeki mandelatın molü : 0,3 M x 0,25 L = 0,075 mol

Mandelik asitin molü ise eklenen HCl molüne eşit olacaktır. Ayrıca mandelat molüde eklenen asit molü kadar azalacaktır ve böylece mandelat ve H+ birleşerek mandelik asit oluşacaktır.

Eklenecek HCl molüne X dersek mandelat / mandelik asit eşitliği şu hali alacaktır:

0,075 – X = 0,933

X

X = 0,0388 mol HCl gereklidir. Gereken hacim M = n/V den

0,200 = 0,0388/V ise V = 0,194 L = 194 ml

9. pH’sı 1,50 olan 0,1 M 200 ml HCl- KCl tamponunun hazırlanması isteniyor. Gerekli olan derişik HCl hacmini (% 37’lik,d = 1,18 g/ml ve pKa = -6,2) ve KCl (74,55 g/mol) kütlesini bulunuz.

pH = pKa + log [KCl]

[HCl]

1,50 = (-6,2) + log [KCl]

[HCl]

7,7 = log [KCl] ise antilog 7,7 = log [KCl]/ [HCl]

[HCl]

[KCl]/ [HCl] = 2

toplam mol = 0,2 L x 0,1 M = 0,02 mol

KCl molüne X dersek, HCl molü 0,02-X olur. Eşitlik yeniden düzenlenirse:

X / (0,02-X) = 2

X = 0,04 – 2X

X = 0,0133 (KCl molü)

0,02 – X = 0,0067 (HCl molü)

Gerekli KCl kütlesi = 0,0133 x 74,55 g/mol = 0,99 ≈ 1 gram

Gerekli HCl kütlesi = 0,0067 x 36,46 g/mol = 0,2443 g

Gerekli HCl hacmi için m = % x d x V formülünden;

0,2443 = 0,37 x 1,18 x V

V = 0,56 mL = 560 µL

Bir behere 1 g KCl alınır ve üzerine 560 µL HCl eklenir. Distile suyla çözülür ve hacim 150-160 mL’ye tamamlanır. pH-metreyle pH ayarlandıktan sonra son hacim bir mezürde 200 mL’ye tamamlanır.

10. pH’sı 10,0 olan 400 mL 0,20 M Na2CO3-NaHCO3 tamponu hazırlanacaktır. Gerekli olan Na2CO3 kütlesini (106 g/mol) ve NaHCO3 kütlesini (84 g/mol ve pKa = 10,3) hesaplayınız.

pH = pKa + log [Na2CO3]

[NaHCO3]

10 = 10,3 + log [Na2CO3]

[NaHCO3]

-0,3 = log [Na2CO3]

[NaHCO3]

0,5 = [Na2CO3]

[NaHCO3]

Toplam mol = 0,2 M x 0,4 L = 0,08 mol

NaHCO3 molüne X dersek Na2CO3 molüne (0,08-X) deriz. Eşitliği yeniden düzenlersek:

X/0,08-X = 0,5 olur.

Buradan X = 0,0267 (NaHCO3 molü) ve (0,08-X) = 0,0533 (Na2CO3 molü) bulunur.

Gerekli NaHCO3 kütlesi : 0,0267 x 84 g/mol = 2,24 gram

Gerekli Na2CO3 kütlesi : 0,0533 x 106 g/mol = 5,65 gram

Tartımlar bir behere alınır ve bir miktar suda çözülür, hacim 300-350 mL’ye tamamlanır ve pH-metreyle pH ayarı yapılır. Daha sonra son hacim bir mezürde 400 mL’ye tamamlanır.

Good’s tamponları

Good tamponları Norman Good ve meslektaşları tarafından belirlenmiş ve tanımlanmış 12 tampon sistemidir. Good bu tamponları seçerken biyokimya ve biyoloji araştırmalarında kullanılabilmeleri için bazı kriterler belirlemiştir. Pek çoğu ortamda değişime uğramaz, kararlıdır.

Good’un belirlediği kriterler :

1. pKa : Birçok biyolojik reaksiyon nötral pH’ya yakın aralıkta gerçekleştiği için, ideal tamponlar için pKa değerleri bu bölgede maksimum tamponlama kapasitesine sahip olacak şekilde seçilmelidir.

2. Çözünürlük : biyolojik sistemler sulu ortamda oldukları için suda iyi çözünme gereklidir. Nonpolar solventlerde (lipid ve organik çözücüler) düşük çözünürlük ayrıca yararlıdır. Bu özellik tamponların hücre membranı ve diğer hücre kompartmanlarında birikmesine engel oluşturur.

3. Membran impermeabilitesi : ideal olarak bir tampon, kolayca hücre membranlarını geçememelidir, bu da tamponun hücre içinde akümülasyonunu önler.

4. Minimal tuz etkisi : yüksek iyonik tamponlar, bazı biyolojik sistemlerde komplikasyon ve problemlere yol açar.

5. İyi huylu katyon etkileşimleri : eğer tamponlar katyonik ligandlarla kompleks oluşturuyorsa oluşan kompleks çözünür olmalıdır. İdeal olarak en azından tampon bileşenlerinden bazıları kompleks oluşturmamalıdır.

6. Stabilite : tamponlar kimyasal olarak kararlı olmalıdır, enzimatik ve non-enzimatik parçalanmaya direnç göstermelidir.

7. Optikal absorbans : tamponlar yaygın şekilde kullanılan spektrofotometrik çalışmalarda interferans oluşturmamaları için, 230 nm’den daha uzun dalga boyundaki görünür bölge ve uv ışınlarını absorbe etmemelidir.

8. Hazırlanmasının kolay oluşu : tamponlar kolayca hazırlanabilmeli ve ucuz olmalıdırlar.

TAMPON pKa(20 Co) ΔpKa/°CMES 6.15 -0.011

ADA 6.6 -0.011

PIPES 6.8 -0.0085

ACES 6.9 -0.020

Kolamin klorit 7.1 -0.027

BES 7.15 -0.016

TES 7.5 -0.020

HEPES 7.55 -0.014

Asetamidoglisin 7.7 -

Trisin 8.15 -0.021

Glisinamit 8.2 -0.029

Bisin 8.35 -0.018

Tamponların biyolojik sıvılardaki önemi

İnsan metabolizmasındaki reaksiyonlar belli bir pH aralığında gerçekleşirler. Tampon sistemler olmasaydı bu reaksiyonlar olmayacak dolayısıyla hayat duracaktı. Kanın pH değeri 7,35-7,45 gibi çok dar bir aralıktadır. Fizyolojik olarak metabolizmanın sağlıklı bir şekilde işlemesi için tampon sistemler kaçınılmazdır.

Ortalama metabolik hız günde 22. 000 meq asit üretir. Bunun yalnızca 100 meq kadarı idrarla atılır. Eğer bu asidin tamamı bir anda vücut sıvılarında çözünmüş olsaydı, vücut sıvılarının pH’sı 1den küçük olurdu. Karaciğer ve kalbin fonksiyonlarını yerine getirebileceği ve nöral impulsların iletilebileceği en geniş pH aralığı 6,8-7,8 dir. (bazı kaynaklarda 8,0)

Vücutta temel olarak 4 tane tampon sistemi bulunur:

1. Bikarbonat-karbonik asit tampon sistemi

2. Hemoglobin tampon sistemi

3. Fosfat tampon sistemi

4. Protein tampon sistemi

Temel olarak bikarbonat tampon sistemi ekstraselüler pH’yı, hemoglobin tampon sistemi eritrosit içi pH’yı ; fosfat tampon sistemi bütün hücrelerde intraselüler pH’yı ;protein tampon sistemi ise hücre ve plazmanın pH’sını korurlar.

Bikarbonat tampon sistemi

Bu tampon vücuttaki en önemli tampondur. Bu tampon kanın toplam tampon gücünün % 55’ini oluşturur. Normal metabolik şartlarda vücudumuz bir günde 13 molden fazla CO2 üretir (0,5-1

kg). Karbonik asidin pK değeri 6,1 iken ekstraselüler pH 7,4’tür. Bu yüzden bu tamponun işlev

göremeyeceği düşünülebilir. Ancak kandaki CO2 miktarı karbonik aside göre 500 kat daha fazladır ve HCO3

- ve CO2 düzeylerinin akciğerler ve böbrekler tarafından düzenlenmesiyle ekstraselüler sıvılardaki en güçlü tampon olmayı başarır.

Kanda bikarbonat/karbonik asit oranı 20:1 dir. Handerson-Hasselbalch eşitliği bu sistem için;

pH = pKa + log [HCO3-]

[H2CO3 ]

pH = 6,1 + log 20 = 6,1+ log 2 + log 10

1

pH = 7,4

Kandaki bikarbonat konsantrasyonu metabolik olaylarla ilgiliyken, karbonik asit konsantrasyonu solunumsal olaylarla ilgilidir.

Karbonik anhidraz

Karbonik anhidraz

Kana kuvvetli bir asit yada baz karıştığında bikarbonat tampon sistemi nasıl işlev görür?

HCl + NaHCO3 H2CO3 + NaCl

H2CO3 H2O + CO2

NaOH + H2CO3 NaHCO3 +H2O

Asidoz- Alkoloz ve nedenleri

Kan pH’sının < 7,35 olması durumuna asidoz; kan pH’sının > 7,45 olması durumuna alkoloz denir.

Homeostaz için kan pH değeri bu ikisi arasında olmalıdır. Mutemel sebepleri arasında başlıca

Metabolik bozukluklar CO2’in akciğerlerden atılamaması Aşırı asit üretimi ve böbreklerden bikarbonatın uzaklaştırılamaması vardır.

Asidoz

Asidoz durumunda sinir sisteminin baskılanması ve daha ileri durumlarda koma görülmektedir. Solunum güçlüğüne astım ve amfizem eşlik etmekte, açlığa bağlı metabolik bozukluklar ortaya çıkmaktadır. Kan pH’ının düşmesi kanda CO2 kons. artırır ve açlık kandaki asidik maddeleri artırarak pH’yı düşürür. Bunlara yanıt olarak CO2 atılımı için ventilasyon artar, böbreklerden H+ atılımı artar ve vücut sıvılarına HCO3 dönüşü sağlanır.

Alkoloz

Sinir sisteminin uyarılması ve konvülsiyona (bilinç kaybı ve kaslarda şiddetli kasılma) neden olur. Kandan önemli miktarda CO2 uzaklaştığı hiperventilasyon veya HCO3 kons. artışına bağlı olarak alkoloz gelişir. Vücut solunumu yavaşlatarak veya HCO3 artışını sağlayarak alkolozu düzeltmeye çalışır.

Fosfat tampon sistemi

Fosforik asidin ikinci hidrojenine ait pK değeri 6,8 dir. Bu yüzden fizyolojik pH’ da etkin bir tampondur. Fakat bikarbonat ile karşılaştırılırsa hücre dışındaki tamponlama kapasitesi çok düşüktür. Çünkü ekstraselülerde konsantrasyonu bikarbonatın 1/12 si kadardır. Bununla birlikte fosfat tamponu böbrek tübüler sıvısında ve intraselüler sıvıda konsantrasyonunun fazla oluşu ve böbrek tübüler sıvısının ve intraselüler sıvının pH değerinin tampon pK’ sına yakın olması nedeniyle çok önemlidir.

Fosfat tampon sisteminin ana elemanları H2PO4- ve HPO4

-2 tır. İdrarla atılan ve H+, Na+ gibi pozitif yüklü iyonları nötralize ederek asit-baz dengesinin düzenlenmesinde vazgeçilmez bir rolü vardır. Bisfosfogliserat gibi organik fosfatlar eritrositlerin tamponlama gücünün % 15’ ini oluşturur.

Protein tampon sistemleri

Protein yapısındaki amino asitlerin proton alıp-vermesine dayanan bir tampondur. Ayrıca proteinlerin hücre içi kons. yüksektir. Plazma ve dokularda tampon görevi yapan proteinlerin tampon kapasitesi histidinin imidazol grubuna bağlıdır. Plazma proteinlerinin tampon kapasitesinin % 95 kadarını yapısında 16 histidin bulunduran albumin sağlar. Globulinlerin tampon kapasitesi daha

düşüktür. Fizyolojik pH’ta tampon gücü olan tek amino asit histidindir. Bunu pK değeri 6.0 olan yan grubuna borçludur.

Hemoglobin tampon sistemi

Hemoglobin tampon sistemi eritrosit içindeki en önemli tampon sistemidir. Hemoglobinin tampon gücüde histidinden kaynaklanır. Metabolik olaylarda açığa çıkan ve hücreye difüze olan CO2 hemoglobin yapısındaki histidinin imidazol ve amino grupları ile karbamino bileşikleri oluşturur. Hb her bir zincirinde 9 adet histidin içerir ve bunlar tampon görevi yapar.

Oksijen salındığında hemoglobine CO2 bağlanırken oluşan H+ deoksihemoglobin ile tamponlanır. Deoksihemoglobin, oksihemoglobine göre daha zayıf asit olduğu için pH değerinin artması için hidrojen iyonlarının nötralizasyonunu gerçekleştirmektedir. Oksijen Hb’e bağlandığında salıverilen H+ iyonları bikarbonat ile birleşerek karbonik asit oluşturur ve bu asit daha sonra CO2’e yıkılarak pCO2

artışına neden olur. Hidrojen iyonlarının hareketini eritrosit membranı engellemediği için Hb, hücre dışı tampon olarak da görev yapmaktadır.