Blastocystis spp.

Dientamoeba fragilis

Prof. Dr. Nogay GİRGİNKARDEŞLERCelal Bayar Üniversitesi Tıp Fakültesi

Tıbbi Parazitoloji AD

Sunum Akış Şeması

Morfoloji

Epidemiyoloji

Klinik

Tanı

Tedavi

Morfoloji

Epidemiyoloji

Klinik

Tanı

Tedavi

Blastocystis spp.

Alexeieff, 1911Brumpt, 1912

Kamçılı kisti ??? Bitkinin yaşam formu ???Maya ???Mantar ??? 1967……..

- morfolojik- fizyolojik- moleküler Protozoon

Blastocystis spp.

Kamçılı kisti ??? Bitkinin yaşam formu ???Maya ???Mantar ??? 1967……..

- morfolojik- fizyolojik- moleküler Protozoon

Blastocystis spp.

Tüm canlılarda…- Memelilerde- Kuşlarda- Kemirgenlerde- Primatlarda- Sürüngenlerde

En sık rastlanan bağırsak protozoonu… Uzun yıllar apatojen….sorun yok !!!

insan insan

hayvan insan

insan hayvan

Tüm canlılarda…- Memelilerde- Kuşlarda- Kemirgenlerde- Primatlarda- Sürüngenlerde

En sık rastlanan bağırsak protozoonu… Uzun yıllar apatojen….sorun yok !!!

insan insan

hayvan insan

insan hayvan

Blastocystis spp.

Artan sayıda klinik araştırmalar…

- GİS

- Dermatolojik

- İBS

Apatojen patojen

Moleküler araştırmalar…

Zoonotik potansiyel…

Artan sayıda klinik araştırmalar…

- GİS

- Dermatolojik

- İBS

Apatojen patojen

Moleküler araştırmalar…

Zoonotik potansiyel…

Morfoloji

Dört ana form1. Vakuoler2. Granüler3. Ameboid4. Kist

Avakuoler Multivakuoler

Dört ana form1. Vakuoler2. Granüler3. Ameboid4. Kist

Avakuoler Multivakuoler

Vakuoler Granüler

KistAmeboid

1. Vakuoler form

En sık rastlanan form- Dışkı örnekleri- Kültürde 2 - 200 (4 - 15) μmMerkezi vakuol

hücrenin %90 Lipid ve karbonhidrat;

=> enerji deposuMitokondri benzeri organel

=> hidrogenozom

En sık rastlanan form- Dışkı örnekleri- Kültürde 2 - 200 (4 - 15) μmMerkezi vakuol

hücrenin %90 Lipid ve karbonhidrat;

=> enerji deposuMitokondri benzeri organel

=> hidrogenozom

2. Granüler form

Granüllerin- sitoplazma- merkezi vakuol 6,5 - 8 μm Aksenik olmayan kültürde Granül fonksiyonu ?

- metabolizma ?- çoğalma ?- enerji deposu ?

Granüllerin- sitoplazma- merkezi vakuol 6,5 - 8 μm Aksenik olmayan kültürde Granül fonksiyonu ?

- metabolizma ?- çoğalma ?- enerji deposu ?

3. Ameboid form

Nadir…, 10 - 15 μm Kültür, yarı katı besiyeri Bir iki psödopod Bakteri ve artıklar

=> beslenmede rol ? Patojenite ile ilgisi ?

- Var ; (Tan ve Suresh, 2006)- Yok; (Souppart ve ark., 2009)

Nadir…, 10 - 15 μm Kültür, yarı katı besiyeri Bir iki psödopod Bakteri ve artıklar

=> beslenmede rol ? Patojenite ile ilgisi ?

- Var ; (Tan ve Suresh, 2006)- Yok; (Souppart ve ark., 2009)

4. Kist formu

Son tanımlanan…1991… Nadir…, 2 - 5 μm Bir, dört nükleus, mitokondri Glikojen depoları, vakuoller Normal ısıda 19 gün canlı Dezenfektanlara duyarlı 250C = 1 ay, 40C = 2 ay canlı (Yoshikawa ve ark., 2004) Hayvan modellerinde enfeksiyöz form kanıtlandı

(Moe ve ark., 1996)

Son tanımlanan…1991… Nadir…, 2 - 5 μm Bir, dört nükleus, mitokondri Glikojen depoları, vakuoller Normal ısıda 19 gün canlı Dezenfektanlara duyarlı 250C = 1 ay, 40C = 2 ay canlı (Yoshikawa ve ark., 2004) Hayvan modellerinde enfeksiyöz form kanıtlandı

(Moe ve ark., 1996)

Yaşam döngüsü ve bulaşma

Fekal – oral Kistler..

Vakuoler

İkiye bölünme…

Fekal – oral Kistler..

Vakuoler

İkiye bölünme…

Genetik çeşitlilik SSU-rRNA 13 subtip…(ST)

Genetik çeşitlilik

En sık subtip 3 B. hominis…???...subtip 3 subtip 1 ikinci… İnsanlarda 9 subtip

İki subtip birlikte %1,1 – 14,3 subtip 3 + subtip 1 subtip 1 + subtip 2 subtip 2 + subtip 3 subtip 3 + subtip 5

En sık subtip 3 B. hominis…???...subtip 3 subtip 1 ikinci… İnsanlarda 9 subtip

İki subtip birlikte %1,1 – 14,3 subtip 3 + subtip 1 subtip 1 + subtip 2 subtip 2 + subtip 3 subtip 3 + subtip 5

Genetik çeşitlilik

Subtipler patojenite

Yoshikawa ve ark., 2004 ; ilişki yok… Tan ve ark., 2010; ST 1, 4 ve 7 patojen

ST 2, 3 apotojen

Hussein ve ark., 2009; ST 1 patojenST 3 ve 6 patojen ve apotojen

ST 2 apotojen

Subtipler patojenite

Yoshikawa ve ark., 2004 ; ilişki yok… Tan ve ark., 2010; ST 1, 4 ve 7 patojen

ST 2, 3 apotojen

Hussein ve ark., 2009; ST 1 patojenST 3 ve 6 patojen ve apotojen

ST 2 apotojen

Epidemiyoloji

En sık saptanan bağırsak protozoonu… İnsidans değişken…faktörler… En sık saptanan bağırsak protozoonu… İnsidans değişken…faktörler…

Epidemiyoloji

Japonya %0,5 – 1

Singapur %3,3

Brezilya %40,9

Endonezya %60

Japonya %0,5 – 1

Singapur %3,3

Brezilya %40,9

Endonezya %60

Epidemiyoloji

%1,04 – 32,8

Epidemiyoloji

Klinik

Çelişkili…

Asemptomatik semptomatik

Dirençli bireyler…

Duyarlı bireyler…

- immun sistemi bozulmuş/baskılanmış

- HIV (+) hastalar

- Organ nakli hastaları

Özgül olamayan GİS belirtileri

GİS dışı belirtiler

Çelişkili…

Asemptomatik semptomatik

Dirençli bireyler…

Duyarlı bireyler…

- immun sistemi bozulmuş/baskılanmış

- HIV (+) hastalar

- Organ nakli hastaları

Özgül olamayan GİS belirtileri

GİS dışı belirtiler

Klinik

Özgül olmayan GİS belirtileri- Karın ağrısı- İshal- İshal-kabızlık atakları- Gaz ve şişkinlik- Bulantı ve kusma- İrritabl bağırsak sendromu (İBS) ile ilişkisi ???

Özgül olmayan GİS belirtileri- Karın ağrısı- İshal- İshal-kabızlık atakları- Gaz ve şişkinlik- Bulantı ve kusma- İrritabl bağırsak sendromu (İBS) ile ilişkisi ???

Klinik

Kaşıntı Ürtiker Anjiyoödem Palmoplanter prurit

Dışkıda lökosit (+) Eozinofili

Kaşıntı Ürtiker Anjiyoödem Palmoplanter prurit

Dışkıda lökosit (+) Eozinofili

Blastocystis İBS

Blastocystis İBS

Tanı

Laboratuvarlar için sorunlu…

- Patojenite klinisyen ihmal…

- Polimorfik yapısı deneyim…

- Ayırıcı tanısı…

Mikroskobi

Kültür yöntemleri

Moleküler yöntemler

Laboratuvarlar için sorunlu…

- Patojenite klinisyen ihmal…

- Polimorfik yapısı deneyim…

- Ayırıcı tanısı…

Mikroskobi

Kültür yöntemleri

Moleküler yöntemler

Mikroskobi

En az 3 dışkı örneği… Taze dışkı, zaman faktörü Doğrudan (direkt) bakı Formol etil asetat yoğunlaştırma (FEAY) yöntemi Kalıcı boyalı preparatlar

- Trikrom- Demir hematoksilen- Giemsa- Field

En az 3 dışkı örneği… Taze dışkı, zaman faktörü Doğrudan (direkt) bakı Formol etil asetat yoğunlaştırma (FEAY) yöntemi Kalıcı boyalı preparatlar

- Trikrom- Demir hematoksilen- Giemsa- Field

Mikroskobi

Demir hematoksilenx400

Trikrom x400 Trikrom x400

Mikroskobi

Yoğunluğu bildirilen tek GİS paraziti…

x400 (yüksek büyütme) alanında

- 1 parazit / 10 alan nadir

- 1 – 5 parazit / 1 alan az – orta

- ≥ 5 / 1 alan bol

Parazit yoğunluğu semptomlar

- Ok ve ark., 1999, var…

- Leder ve ark., 2005, yok…

Yoğunluğu bildirilen tek GİS paraziti…

x400 (yüksek büyütme) alanında

- 1 parazit / 10 alan nadir

- 1 – 5 parazit / 1 alan az – orta

- ≥ 5 / 1 alan bol

Parazit yoğunluğu semptomlar

- Ok ve ark., 1999, var…

- Leder ve ark., 2005, yok…

Kültür Yöntemleri

Ksenik ve aksenik besiyerleri Duyarlı yöntem Kısa süreli (24-72 saat) yeterli Jones… Robinson Dobell Boeck-Drbohlav TYSGM-9 besiyeri Yarı katı besiyerinden Blastocystis kolonileri…

Ksenik ve aksenik besiyerleri Duyarlı yöntem Kısa süreli (24-72 saat) yeterli Jones… Robinson Dobell Boeck-Drbohlav TYSGM-9 besiyeri Yarı katı besiyerinden Blastocystis kolonileri…

Moleküler Yöntemler

Taze dışkı veya kültürden

Konvansiyonel PZR

GZ-PZR

PZR-RFLP

PZR-dideoksi sekanslama

SSU-rRNA PZR-RFLP

STS primerleri PZR

Taze dışkı veya kültürden

Konvansiyonel PZR

GZ-PZR

PZR-RFLP

PZR-dideoksi sekanslama

SSU-rRNA PZR-RFLP

STS primerleri PZR

Tanıda hangi yöntemi seçelim?

Stensvold CR., ve ark. 2007.Detecting Blastocystis using parasitologic and DNA-based methods: a comparative study. Diagn MicrobiolInfect Dis.

107 dışkı örneği;- Trikrom- FEAY- Ksenik besiyeri- PZR

PZR; duyarlılık / özgüllük %- Trikrom 82 / 100- FEAY 50 / 100- Besiyeri 89 / 100

Taze dışkı ve kısa süreli kültürden izolasyonla PZR farkı yok

Tanıda hangi yöntemi seçelim?

Roberts T., ve ark. 2011.Comparison of microscopy, culture and conventionalPCR for detection of Blastocystis sp. İn clşnical stoolsamples. AmJ Trop Med Hyg.

513 dışkı örneği;- Demir hematoksilen- 2 Besiyeri

- Boeck Drbohlav- TYSGM-9

- 2 konv. PZR

513 dışkı örneği;- Demir hematoksilen- 2 Besiyeri

- Boeck Drbohlav- TYSGM-9

- 2 konv. PZR

- PZR en duyarlı- Mikroskobi en az duyarlı

- PZR epidemiyolojik çalışmalarda- PZR yoksa; mikroskobi + kültür

Tedavi

Tartışmalar… Sonuçlar olumlu… Parazitolojik ve klinik iyileşmeMetronidazol Nitazoksanid Trimetoprim-sülfametaksazol (TMP-SMX) ParomomisinMetronidazol + paromomisin

Tartışmalar… Sonuçlar olumlu… Parazitolojik ve klinik iyileşmeMetronidazol Nitazoksanid Trimetoprim-sülfametaksazol (TMP-SMX) ParomomisinMetronidazol + paromomisin

Tedavi

Nigro ve ark., 2003, metronidazol- 40 hasta metronidazol, %88 klinik, %80 paraz.- 36 hasta plasebo, %14 klinik, %3 paraz.- p<0,001

Ok ve ark., 1999, TMP-SMX, 50 hasta- %94,3 parazitolojik iyileşme- %78 klinik iyileşme- %20 belirtilerin azaldığı- %2 değişiklik yok

Nigro ve ark., 2003, metronidazol- 40 hasta metronidazol, %88 klinik, %80 paraz.- 36 hasta plasebo, %14 klinik, %3 paraz.- p<0,001

Ok ve ark., 1999, TMP-SMX, 50 hasta- %94,3 parazitolojik iyileşme- %78 klinik iyileşme- %20 belirtilerin azaldığı- %2 değişiklik yok

Tedavi

Dientamoeba fragilis

Wenyon 1907

Jepps ve Dobell 1918

Camp 1974 Honigberg 1974

Silberman ve ark. 1996 16S-benzeri rRNA “Kamçısız kamçılı”

5-12 μm İki çekirdekli %60-80 Tek çekirdekli %20-40

D. fragilis’in sıfatları…

“Sıra dışı bir bağırsak patojeni”Butler WP, Dig Dci Sci, 1996

“Önem kazanan bir protozoon enfeksiyonu”Van Gool T ve Dankert J, Ned Tijdschr Geneeskd, 1996

“Klinik parazitolojinin sırrında saklanan gizem”Windsor JJ ve Johnson EH, Br J Biomed Sci, 1999

“İhmal edilen bir diyare etkeni”Girginkardeşler N ve ark. Clin Microbiol Infect, 2003

“Sıra dışı bir bağırsak patojeni”Butler WP, Dig Dci Sci, 1996

“Önem kazanan bir protozoon enfeksiyonu”Van Gool T ve Dankert J, Ned Tijdschr Geneeskd, 1996

“Klinik parazitolojinin sırrında saklanan gizem”Windsor JJ ve Johnson EH, Br J Biomed Sci, 1999

“İhmal edilen bir diyare etkeni”Girginkardeşler N ve ark. Clin Microbiol Infect, 2003

Geçiş yolu ???

Epidemiyoloji

%1 - 52 %1 – 5 (ortalama)

Epidemiyoloji

%0,3 - 2

Epidemiyoloji

Epidemiyoloji

CBÜ’de D. fragilis insidansı

D. fragilis insidansı

3,1

2,3

1,2

1,81,6

0,000,501,001,502,002,503,003,504,00

2000 2001 2002 2003 2004

Yıllar

İnsi

dans

(%)

D. fragilis insidansı

3,1

2,3

1,2

1,81,6

0,000,501,001,502,002,503,003,504,00

2000 2001 2002 2003 2004

Yıllar

İnsi

dans

(%)

Klinik

GİS yakınmaları- Karın ağrısı- İshal- İshal-kabızlık atakları- Gaz ve şişkinlik- Bulantı ve kusma- İrritabl bağırsak sendromu (İBS)- Kolit, alerjik kolit

GİS yakınmaları- Karın ağrısı- İshal- İshal-kabızlık atakları- Gaz ve şişkinlik- Bulantı ve kusma- İrritabl bağırsak sendromu (İBS)- Kolit, alerjik kolit

Klinik

Kaşıntı Ürtiker Zayıflama Halsizlik Ateş Eozinofili

Kaşıntı Ürtiker Zayıflama Halsizlik Ateş Eozinofili

İBS ile ilişkisi?

Tanı

Mikroskobi En az 3 dışkı örneği Taze dışkı, zaman faktörü SAF, PVA, Schaudinn Kalıcı boyalı preparatlar

- Trikrom- Demir hematoksilen Kültür yöntemleriMoleküler yöntemler

Mikroskobi En az 3 dışkı örneği Taze dışkı, zaman faktörü SAF, PVA, Schaudinn Kalıcı boyalı preparatlar

- Trikrom- Demir hematoksilen Kültür yöntemleriMoleküler yöntemler

D. fragilis, %0,9 NaClx1000 D. fragilis, %0,9 Lugol x1000

D. fragilis, Trikrom x1000

D. fragilis, Trikrom x1000 D. fragilis, SAF, Trikrom x1000

Ayırıcı Tanı

Lökosit, %0,9 NaCl x400

D. fragilisB. hominis

Ayırıcı Tanı

D. fragilis, Trikrom

x1000

I. bütschlii, Trikrom

x1000

E. nana, Trikrom

x1000

Kültür Yöntemleri

Ksenik besiyerleri- Pirinç unu- Antibiyotik Robinson Talis Boeck-Drbohlav TYSGM-9

Ksenik besiyerleri- Pirinç unu- Antibiyotik Robinson Talis Boeck-Drbohlav TYSGM-9

Kültür Yöntemleri

6-40 μm Pirinç unu taneleri

Aksenik kültürü yok

Kültürde Ayırıcı Tanı

D. fragilis

B. hominis

Dientamoeba fragilisEntamoeba histolytica Blastocystis hominis

B. hominis

Yöntemlern= 650

n + Duyarlılık ÖzgüllükYöntemlern= 650Mikroskobi 12 34,3 99

MBD 14 40 100

TYGM-9 10 28,6 100

PZR 15 42,9 100

GZ-PZR 35 100 100

Moleküler Tanı

Kültürdeki trofozoitler

Taze dışkıdan izolasyon

PZR

GZ-PZR

MT-PZR

Kültürdeki trofozoitler

Taze dışkıdan izolasyon

PZR

GZ-PZR

MT-PZR

Moleküler Tanı

SSU-rRNA Johnson JA, Clark CG, 2000

- Genotip 1 (n=11)

- Genotip 2 (n=1)

Peek ve ark. 2004Windsor ve ark. 2004 Genotip 2 yok !

Stark ve ark. 2005 Zayıf genetik marker => yeni bölgeler ?

SSU-rRNA Johnson JA, Clark CG, 2000

- Genotip 1 (n=11)

- Genotip 2 (n=1)

Peek ve ark. 2004Windsor ve ark. 2004 Genotip 2 yok !

Stark ve ark. 2005 Zayıf genetik marker => yeni bölgeler ?

Moleküler Tanı - ITS

Internal transcribed spacer (ITS)- Genetik çeşitliliğin en sık araştırıldığı bölge- Yüksek oranda çeşitlilik- Kolayca çoğalabilir- Yakın akraba türler arasında dahi yüksek çeşitlilik

Bart A ve ark. 2008 ITS-1 baz dizisinde C (sitozin) yerleşim

farklılıklarına göre tiplendirme başarılı(C-profiling)

ITS 1 uygun epidemiyolojik marker

Internal transcribed spacer (ITS)- Genetik çeşitliliğin en sık araştırıldığı bölge- Yüksek oranda çeşitlilik- Kolayca çoğalabilir- Yakın akraba türler arasında dahi yüksek çeşitlilik

Bart A ve ark. 2008 ITS-1 baz dizisinde C (sitozin) yerleşim

farklılıklarına göre tiplendirme başarılı(C-profiling)

ITS 1 uygun epidemiyolojik marker

Moleküler Tanı - HRM

High-resolution melting curve (HRM) analizi

Hussein ve ark. 2009

PZR sonrası HRM analizi

30 dışkı örneği (IBS)

- 4 farklı profil (subtip)

- Profil klinik

HRM analizi uygun epidemiyolojik marker

High-resolution melting curve (HRM) analizi

Hussein ve ark. 2009

PZR sonrası HRM analizi

30 dışkı örneği (IBS)

- 4 farklı profil (subtip)

- Profil klinik

HRM analizi uygun epidemiyolojik marker

Moleküler Tanı

Tedavi

Tartışmalar…

Sonuçlar olumlu…

Parazitolojik iyileşme

Klinik iyileşme

Aksenik kültürün yokluğu…

Olumlu sonuçlar => patojeniteyi destekler…

Tartışmalar…

Sonuçlar olumlu…

Parazitolojik iyileşme

Klinik iyileşme

Aksenik kültürün yokluğu…

Olumlu sonuçlar => patojeniteyi destekler…

Tedavi

Difetarson (Keystone JS, ve ark., 1983) Karbason (Dardick K., 1983) Tetrasiklin (Dardick K., 1983) İyodokinol (Spencer MJ ve ark., 1982) Eritromisin (Preiss U ve ark., 1991) Paromomisin (Vandenberg ve ark., 2007) Metronidazol (Spenser MJ ve ark., 1979; Cuffari

ve ark., 1998) Seknidazol (Girginkardeşler N, ve ark., 2003) Ornidazol (Kurt Ö, ve ark., , 2008)

Difetarson (Keystone JS, ve ark., 1983) Karbason (Dardick K., 1983) Tetrasiklin (Dardick K., 1983) İyodokinol (Spencer MJ ve ark., 1982) Eritromisin (Preiss U ve ark., 1991) Paromomisin (Vandenberg ve ark., 2007) Metronidazol (Spenser MJ ve ark., 1979; Cuffari

ve ark., 1998) Seknidazol (Girginkardeşler N, ve ark., 2003) Ornidazol (Kurt Ö, ve ark., , 2008)

Tedavi

Metronidazol (30 mg/kg/gün 5 gün)

Seknidazol (2 gr, 30 mg/kg tek doz)

Ornidazol (2 gr, 30 mg/kgtek doz)

Paromomisin (25-35 mg/kg/gün 7 gün)

İyodokinol (40 mg/kg/gün 20 gün)

Tetrasiklin (4x500 mg/gün 10 gün)

Metronidazol (30 mg/kg/gün 5 gün)

Seknidazol (2 gr, 30 mg/kg tek doz)

Ornidazol (2 gr, 30 mg/kgtek doz)

Paromomisin (25-35 mg/kg/gün 7 gün)

İyodokinol (40 mg/kg/gün 20 gün)

Tetrasiklin (4x500 mg/gün 10 gün)

Tedavi

Sonuç olarak…

Mikrobiyoloji ve Parazitoloji laboratuvarı çalışanlarıBlastocystis ve D. fragilis’i dikkate almalı…

Klinisyenler her iki parazitin GİS, İBS ve dermotolojikyakınmalara neden olabileceğini göz önüne almalı…

Etkili tedavi ile klinik ve parazitolojik iyileşme…

Semptomatik olgular uygun tedavi almalı…

Mikrobiyoloji ve Parazitoloji laboratuvarı çalışanlarıBlastocystis ve D. fragilis’i dikkate almalı…

Klinisyenler her iki parazitin GİS, İBS ve dermotolojikyakınmalara neden olabileceğini göz önüne almalı…

Etkili tedavi ile klinik ve parazitolojik iyileşme…

Semptomatik olgular uygun tedavi almalı…

Yapacaklarımız ve yapabileceklerimiz…

Genotiplendirme çalışmaları…

İn vitro ilaç ve bitki ekstresi çalışmaları…

İBS ve GİS maligniteleri ile ilişkisi…

Katkılar…

Genotiplendirme çalışmaları…

İn vitro ilaç ve bitki ekstresi çalışmaları…

İBS ve GİS maligniteleri ile ilişkisi…

Katkılar…

Ben manevi miras olarak hiçbir ayet, hiçbir dogma, hiçbirdonmuş ve kalıplaşmış kural bırakmıyorum. Benim manevimirasım ilim ve akıldır…

Mustafa Kemal Atatürk

çok teşekkür ederim…Ayvalık