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Boas práticas de laboratório e
biossegurança na manipulação
de vírus
Prof. Dr. José Luiz Proença Módena
13/10/2016
Universidade de Campinas
Instituto de Biologia
Departamento de Genética, Evolução e
Bioagentes
Definindo um vDefinindo um víírusrus
Replique-me
Vírus são extremamente pequenos
O Virion e o vírus
Os vírus são organismos com duas fases
Estrutura viral
Vírus nús
Vírus Envelopados
Lipid
Glycoprotein
Matrix
Critérios Avaliação de risco para vírus
• Virulência
• Modo de transmissão• Estabilidade• Estrutura da partícula viral
• Concentração e volume
• Origem do vírus
• Disponibilidade de medidas profiláticas
• Dose infectante
• Tipo de ensaio
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Manual de Biossegurança Anvisa, 2010
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe I
•Cepa virais atenuadas•Vírus naturalmente não patogênicos
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe II
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe III
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe III
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe IV
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe IV
Classe de risco dos vírus
Classificação de riscos dos agentes biológicos, Ministério da Saúde, 2006.
Classe IV
Classe de riscos dos agentes impacta diretamente nas
recomendações de biossegurança
• Pelo que foi falado até aqui, éapenas o nível de risco biológico que determina as recomendações de biossegurança para um determinado procedimento?
Trabalhando com vírus em laboratório NB2
Equipamentos de proteção individual (EPI)•Avental•Luvas•Mascaras•Óculos de proteção•Sapatos fechados (propé)
Equipamentos de proteção Coletiva (EPC)•Cabine de segurança biológica Classe II A•Lava olhos•Autoclave
Trabalhando com vírus em laboratório NB2
Boas práticas em laboratórios clínicos (BPLCs)•Proibido comer•Prender cabelo•Uso IPIs•Limpar superfícies antes e após o uso•Nunca pipetar com a boca•Nunca reencapar agulhas•Descartar resíduos adequadamente, autoclavar material antes do descarte•Lavar as mãos sempre que deixe o laboratório
Trabalhando com vírus em laboratório NB2
Trabalhando na cabine Classe II
• Limpar a superfície da cabine com álcool 70%• Ligar Luz ultra violeta por 15 minutos• Restringir fluxo de pessoas durante uso da cabine• Limpar os objetos antes de introduzi-los na Cabine (álcool 70%)• Colocar o material na área de trabalho, de modo a formar
diferentes ambientes (limpos e sujos) dentro da cabine• Nunca usar bicos de Bunsen dentro da cabine• Sempre tenha um descarte com hipoclorito 1% dentro da cabine• No término, limpar os objetos com álcool 70% antes de retirá-los
da cabine• Limpar a superfície com hipoclorito 1% e depois álcool 70%.• Ligar a luz UV por 15 minutos
Trabalhando com vírus em laboratório NB2
Trabalhando com vírus em laboratório NB3
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
•Vírus de DNA;
• Fita Simples;
• Não Segmentado;
• Capsídeo icosahédrico com 18 a 26nm;
• Não envelopado;
Brieu et al, 2007Gurda et al, 2010
Bocavírus Humano
Hantavirus Araraquara
Família Bunyaviridae•Vírus de RNA de polaridade negativa tri-segmentado•Transmitido pela excretas de roedores (via inalatória)•Síndrome pulmonar por hantavírus (alta letalidade, próxima dos 30% em humanos)
Washington University in Saint Louis (EUA)
VVíírus Oropoucherus Oropouche
ribonucleocapsid
Lipid envelope
Gn and Gc
RNA polymerase
� Arbovírus circulante na América Central e caribe
� Pertence a família Bunyaviridae, genus Orthobunyavirus
� Genoma segmentado de RNA de polaridade negativa
� S: N and NSs
� M: Gc, Gn and NSm
� L: RNA polimerase
Oropouche : ciclos de transmissãoOropouche : ciclos de transmissãoCiclo na mata
Hospedeiros vertebrados: preguiças, macacos,
passáros.
Vetores: Aedes serratus and Coquillettidia
venezuelensis.
Ciclo Urbano
Hospedeiros vertebrados: homem, animais
domesticos?
Vectors: Culicoidis paraensis or Culex
quinquefasciatus.
OROV causou mais de 30 epidemias na região amazônica, com mais de 500.000 casos reportados
Oropouche: doenOropouche: doençça em humanosa em humanos
� Febre do Oropouche
◦ Sintomas: febre (39oC), mialgia, dor de cabeça, artralgia, fotofobia e mal estar. Alguns pacientes tem sinais hemorrágicos, como exantema, petequias e sangramento de gengivas.
� OROV é associados com sinais de acometimento neurológico, encafalite e meningite
� Pode estar associado com abortos
Sala de Paramentação Sala de Apoio
Na sala da esquerda (WNV, CHIKV)
Trabalhávamos com:
• jaleco descartável de plástico (não era de corpo inteiro)•Propé de plástico•Máscaras N95•Óculos de proteção•Luva pele até o cotovelo•Segunda luva•Touca descartável
Na sala da direita (OROV, VEEV)
•Trabalhávamos com:•Macacão impermeável de corpo inteiro•Propé de plástico•Respirador PFF2•Luva pele até o cotovelo
Trabalhando com vírus em laboratório NB3:
Procedimentos de Segurança
Entrando e trabalhando no NB3
•Vestir todo o aparato de segurança
•Checar a pressão da sala antes de entrar
•Sempre trabalhar em dupla
•Nunca permanecer no local por mais de 6 horas
•Procedimentos que envolvam chance de aerossol (vortex, centrifugação, Magnalyser) devem ser conduzidos dentro da cabine de segurança)
•Cabines de segurança II-B
•Usar sempre dois pares de luvas e descartar o primeiro par antes de remover a mão da cabine (deixar um saquinho autoclavável para isso na cabine)
Trabalhando com vírus em laboratório NB3:
Procedimentos de Segurança
Acidentes:
• Em caso de derramamento de liquido, parar o que estiver fazendo, cobrir com um papel toalha embebido em hipoclorito e sair do ambiente. Deixar agindo por pelo menos 30 minutos
• Em caso de acidentes com agulha ou mordida de animais: ser encaminhado para quarentena em ambiente isolado
• Os freezers devem ser monitorados por uma central que avisa o pesquisador responsável assim que tiver alterações significantes de temperatura
Trabalhando com vírus em laboratório NB3:
Procedimentos de Segurança
Saindo do NB3:
•Ir até a área limpa próxima a porta de saída e remover o propé para pisar na área demarcada
•Borrifar Lisol no corpo, braços e mascárá
•Repetir o processo com Hipoclorito, depois álcool 70% e por fim água
•Sair da sala de experimentação até a ente sala
•Remover o capacete, o macacão e a luva pele, evitando encostar a parte externa da roupa na pele
•Descartar em lixo que deve ser autoclavável
•Usar testes de esterilidade de autoclave em todas as corridas (o lixo deve ser incinerado após autoclavação)
•Lavar bem as mãos
Trabalhando com vírus em laboratório NB3:
Procedimentos de Segurança
Manipulando animais:
• Sempre abrir as gaiolas em cabines de segurança, mesmo que seja para limpar a gaiola
• Sempre que trabalhar com animais anestesiados (quetamina e xelazina)
• Nunca trabalhar com grupos muito grande de animais num mesmo dia
• Evitar trabalhar de noite, pois os camundongos são mais ativos nesse período
Linhas de pesquisaLinhas de pesquisa� Caracterizar o papel de outros PPR no controle de OROV e outros
arbovírus?
� Como IRF-5 controla a neuroinvasão pelos bunyavírus e flavivírus (Zika)?◦ Infecção em animais KO para Rag e uMT, replicação em células endoteliais, Mecanismos
de cavalo de Troia, transporte retrógrado.,
� Quais componentes virais são importantes no antagonismo de IFN-I?
Em colaboração:
� Caracterizar epítipos lineares de Zika� Caracterizar as citocinas no soro dos pacientes com Zika� Desenvolver novos métodos de diagnóstico� Caracterizar o papel de imunomoduladores para aumentar a eficiência
vacinal para Zika� Desenvolver vacinas alternativas contra Zika e OROV� Caracterizar possíveis antivirais contra Zika
� Polimorfismo gênico/microbioma e doença grave por Zika
ObrigadoObrigado
Diamond Lab
Collona Lab•Renata Sesti Costa
Eurico Arruda (FMRP-USP-Brazil)
Andrew Pekosz (Johns Hopkins University – USA)
Michael Gale, Jr (University of Washington – USA)
Funding: SBV: