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30/11/2018
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Bromatologia – FCNAUP
josé fernandes
BROMATOLOGIA
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Bromatologia – FCNAUP
josé fernandes
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
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Bromatologia – FCNAUP
josé fernandes
� Os Métodos Espectrofotométricos envolvem a avaliação quantitativa dos fenómenosresultantes da interacção de radiações electromagnéticas (luz visível, raios de UV, raios X,etc) com a matéria (átomos, moléculas, iões)
� Essa interacção pode assumir várias formas, que dependem
� da natureza da radiação
� Fonte� Densidade óptica do meio atravessado� Intensidade
� da natureza da(s) substância(s) com que as radiações entram em contacto
� Estrutura molecular� Opacidade� Sensibilidade fotoquímica
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Princípio Geral
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As REM consistem num fenómeno de natureza vibracional ou ondulatória que se pode definir como:
Propagação de uma perturbação electromagnética no espaço
Natureza ondulatória das REM
Período (T) – intervalo de tempo (s) ao fim do qual um ponto do espaçovolta a possuir um vector campo eléctrico (ou magnético) máximo.
Frequência (ν) – número de períodos por unidade de tempo (Hz ou s-1)E
H
e
λ
Comprimento de onda (λ) – menor distância (m) entre dois pontos doespaço com vector campo eléctrico (ou magnético) máximo.
Número de onda (ν) – número de comprimentos de onda por unidade decomprimento (cm-1)
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Natureza corpuscular das REM
A uma radiação electromagnética de uma determinada frequência está associada uma quantidadediscreta de energia – quantum (plural: quanta) ou fotão.
h = 6,624 x 10-34 J.s (constante de Planck)
A dualidade corpúsculo-onda das REM é fundamental para explicar os fenómenos de absorção e deemissão radiantes pela matéria
É possível calcular a energia de um fotão pela relação de Einstein:
E = hν
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λ, m
10-13
10-11
10-9
10-7
10-5
10-3
10-1
101
ν, Hz
1021
1019
1017
1015
1013
1017
109
107
Rá
dio
in
fra
ve
rme
lho
u
ltra
vio
leta
r
aio
s γ
mic
roo
nd
as
vis
íve
l
ra
ios
X
Região espectralλ
(x 10-9 m)ν
(x 1012 Hz)
Ultravioleta de vácuo
10-18030 000-1 670
Ultravioletapróximo
180-350 1 670-857
Visível 350-780 857-380
Infravermelhopróximo
780-2 500 380-120
Infravermelho médio
- 120-6
Infravermelho longínquo
- 6-0,3
Regiões do Espectro Electromagnético com interesse analítico
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Quando a luz incide numa interface entre dois meios com densidade ópticas diferentes são vários os fenómenos que podem ocorrer
� Refracção� Reflexão � Absorção
Interacção da luz com a matéria
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I0 Ir
n1
n2
θi θr
Reflexão e refracção da luz
Quando uma REM incide numa interface entre dois meios comdensidade ópticas diferentes pode observar-se:
� a reflexão de parte da radiação incidente
� uma variação brusca da direcção de propagação que decorreda diferença da velocidade de propagação nos dois meios(refracção)
A refracção é um fenómeno útil nadecomposição de feixes policromáticos:
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A Absorção dá-se quando a densidade óptica do meio é suficientemente baixa (elevada transparência) e
a intensidade da radiação suficientemente alta para permitir a sua penetração e passagem através da
substância. Nesse caso, parte da energia é absorvida e parte é transmitida
A absorção de energia por parte das moléculas de uma dada substância está relacionada com o tipo de
transições sofridas por estas quando passam do estado fundamental para um estado excitado
Absorção da luz
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� Electrónicas – passagem de electrões para estados excitados
� Raios X (electrões de camadas internas)
� UV e Visível (electrões de camadas externas)
� Vibracionais – deformação nas ligações entre os átomos
� IV
� Rotacionais
� IV longínquo e micro-ondas
� Transição de spin
� Rádio-frequência
Tipos de Transição
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Tipos de Transição
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Tipos de Transição
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josé fernandeshttps://www.youtube.com/watch?v=ZWwLCnuYRys
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Considere-se uma radiação
� Comprimento de onda - λ1
� Intensidade – I0
A atravessar a solução de uma substância S
� Espessura da solução - l
Uma parte da radiação vai ser absorvida, pelo que a intensidade da radiação transmitida vai ser menor
S
l
dx
I0
It
Absorção de REM
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Transparência ou Transmitância (T) = It/I0 varia entre 0 e 1
Percentagem de Transmitância (%T) = 100 x T varia entre 0 e 100
Conceito de Absorvência
A absorvência pode ser convertida em transmitância sabendo que:
%T = 100 x T -log %T = - log 100 – log T A = 2-log%T
Absorvência (A) = log I0/It ou log 1/T
varia entre 0 e + ∞
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Obtenção de espectros de UV-VIS
FEIXE DE RADIAÇÕES MONOCROMÁTICO:
Conjunto de radiações electromagnéticas de um único comprimento de onda(frequência) que percorrem direcções paralelas no espaço.
FEIXE DE RADIAÇÕES POLICROMÁTICO:
Conjunto de radiações electromagnéticas de diferentes comprimentos de onda(frequências) que percorrem direcções paralelas no espaço.
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Obtenção de espectros de UV-VIS
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Componentes básicos de um equipamentoconvencional
• fonte de radiação policromática
• sistema de monocromação
• compartimento de amostragem
• dispositivo de detecção
• dispositivo de leitura
Absorção molecular selectiva de REM no UV/VIS, resultante de transições electrónicas, vibracionais
e rotacionais de modo quantificado e proporcional à concentração.
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Espectros de UV-VIS
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Espectros de UV-VIS
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Os equipamentos utilizados na espectrofotometria de UV/VIS podem ter diferentes designaçõesde acordo com a região espectral onde actuam e o modo de selecção de comprimentos de onda:
Colorímetros no VIS, independentemente do tipo de selecção de λ
Fotómetros selecção descontínua (apenas alguns λ)
Espectrofotómetros selecção contínua de λ
Analisadores multicanal usam policromador
Equipamento
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É igualmente possível efectuar medidas de absorvência utilizando a visão como elemento de detecção:
Comparadores visuais
avalia-se a cor complementar reflectida
Colorímetros
avalia-se a intensidade da cor
complementar transmitida
Equipamento
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Nas lâmpadas de deutério, a descarga eléctrica ocasiona a dissociação molecularcom libertação de fotões de comprimento de onda entre 160 e 375 nm
As lâmpadas de tungsténio/ halogéneo emitem REM entre os 350 e os 2500 nm.O halogeneto de tungsténio formado após sublimação decompõe-se no filamentoincandescente aumentando o tempo de vida útil da lâmpada
Fontes de Radiação
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Nos monocromadores a selecção dos comprimentos de onda é contínua: depende da inclinação doelemento dispersante relativamente a radiação incidente.
Os monocromadores apresentam transparência próxima de 100% e largura de banda fixa ou ajustável entre 0,2 e 20 nm.
fenda de entrada
fenda de saída
rede de difracção
espelhos colimadores
λ1 λ2
fenda de entrada fenda de
saída
lente colimadora lente de
focagem
prisma
200 400 600 800 nm
350 400 500 800 nm
200 250 300 400 800 nm
rede
prisma de vidro
prisma de quartzo
Monocromadores
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O compartimento de células é o elemento constituinte do equipamento com o qual o operadormais interactua devendo ser estanque à luz exterior e pintado internamente de negro por forma aabsorver REM estranha à medida.
As células devem ser colocadas namesma posição ou com a mesma facepara a REM incidente.
Células de leitura
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Quando se opera na zona do visível podem-se utilizar células de vidro ou plástico (estas descartáveis). Nazona do ultra-violeta as células devem ser de quartzo ou sílica fundida.
Não existem duas células iguais, pelo que quando seexecutam uma série de medidas sobre soluções comabsorvência reduzida, deve usar-se a mesma célula.
Existem diferentes tipos de células com diferentes percursosópticos, capacidade, agitação magnética, de fluxo,termostatáveis.
Células de leitura
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Nos espectrofotómetros de feixe duplo a REM proveniente da fonte ésubdivida ou direccionada de modo alternado entre uma célula contendoo branco ou uma célula contendo a amostra.
Espectrofotómetros de feixe duplo
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Embora mais dispendiosos os espectrofotómetros de feixe duplo apresentam duas vantagensimportantes:
1 - o sinal do branco e da amostra são comparados em simultâneo, não sendonecessária a estabilização térmicas do equipamento.
2 - possibilitam o traçado dos espectros de modo automático:
as duas células são preenchidas com o “branco”, e traça-se o espectro. O equipamento corrige todos os
valores de absorvência para 0.
substitui-se a solução do branco pela amostra e procede-se ao traçado do espectro
Espectrofotómetros de feixe duplo
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Lei de Lambert-Beer - Premissas de validade
1 . A radiação incidente é monocromática
2. A composição da solução é homogénea
3. A temperatura é constante
4. As partículas absorventes têm carácter independente
5. O índice de refracção não varia com a concentração
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
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k – constante de proporcionalidadel – comprimento da zona atravessada pela radiaçãoc – concentração
A = k x c x l
Lei de Lambert-Beer
k é a constante de proporcionalidade na lei de Beer. Na prática corresponde ao valor de absorvênciaquando l é unitário e c é unitário para um dado comprimento de onda e um dado sistemasoluto/solvente.
l costuma medir-se em cm.
se c= 1 mol/L, k representa-se por є (absortividade molar)
se c= 1 g/L, k representa-se por a (absortividade específica)
se c = 1 g/dL, k representa-se por A1%1 cm (coef. absorção específica)
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A absorvência (A) depende
� Estrutura molecular da substância
� grupos cromóforos
� grupos auxócromos
� Comprimento de onda da radiação
� Natureza do solvente
Coeficientes de Absorção
Atendendo aos valores normais de A1%1cm (raramente são superiores a 1000), as soluções têm de
ser analisadas em concentrações da ordem dos 10-2 – 10-6 gramas/L
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
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Um grupo cromóforo corresponde à parte de uma molécula responsável pela sua cor. A cor surge quando a
molécula absorve radiações de determinado comprimento de onda e transmite ou reflecte em outro
comprimento de onda. O grupo cromóforo corresponde à região da molécula onde a diferença de energia
entre duas orbitais moleculares é igual à energia da radiação incidente. Nesse caso a radiação pode ser
absorvida pela excitação de um electrão do seu estado fundamental para o estado excitado
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Grupos Cromóforos e Auxócromos
Um grupo auxócromo corresponde a um grupo funcional ligado ao grupo cromóforo capaz de modificar a
capacidade deste de absorver luz, alterando o comprimento de onda ou a intensidade da absorção
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Grupos Cromóforos e Auxócromos
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Compostos corados
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Um elevado número de espécies de natureza orgânica e inorgânica podem ser quantificadospor espectrofotometria de UV/VIS.
� Método da Curva de Calibração
� Método das adições (de padrão)
� Outros métodos
MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Análise Quantitativa
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Análise Quantitativa
conc.
A
MÉTODO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO:
Fundamenta-se no traçado de uma curvade calibração de A em função da concen-tração da espécie que se pretende quantificar.Pode ser obtida por ensaio de soluções decalibração com concentração crescente naespécie a medir ou por calibração “in situ”.
É o método analítico mais utilizado em espectrofotometria de UV/VIS
É utilizado quando a matriz da amostra é simples e fácil de simular
É utilizado quando o número de amostras a analisar é elevado
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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS
Análise Quantitativa
Geralmente admite-se uma variação proporcional de A em função da concentração, sendo a rectacalculada por regressão de A em c pelo método dos mínimos quadrados.
A escolha das soluções de calibração é bastante importante pois condiciona a exactidão dosresultados.
Pode-se optar por:
Soluções puras da espécie a medir
Padrões de matriz sintética – simula-se a composição da amostra quanto aos constituintesmaioritários
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conc.
A
Precisão
Valor médio
A precisão das medidas (diminuição do
impacto dos erros fortuitos) aumenta
com:
1º número de soluções de calibração utilizadas
2º declive da recta de calibração
3º número de medidas sobre cada amostra
4º proximidade entre o valor de absorvência
medido e o valor médio das absorvências
obtidas para as soluções de calibração
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Análise Quantitativa
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Procedimentos abreviados (menos precisos quando não automatizados):
� uma única solução de calibração – pressupõe que a lei de Beer é válida até à concentração dopadrão quando se acerta o 0 de absorvência com o solvente
� duas soluções de calibração – pressupõe a existência de um erro sistemático à lei de Beer devendoa concentração da amostra situar-se entre as das soluções de calibração. O 0 de absorvência éacertado com o reagente ou com a matriz da amostra (branco).
A validação da exactidão dos resultados pode ser efectuada por:
1º ensaio de amostras certificadas (padrões NBS, BCR e IAEA)2º correlação de resultados com outra técnica analítica3º ensaios de recuperação (pouco fiável para amostras complexas)
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Análise Quantitativa
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MÉTODO DAS ADIÇÕES DE PADRÃO:
Fundamenta-se no traçado de uma curva deregressão de A em função da concentração,volume ou massa de padrão adicionado aalíquotas da amostra contendo a espécie que sepretende quantificar.
Deve existir proporcionalidade entre absorvên-cia e concentração
É utilizado quando a matriz da amostra condiciona a magnitude daabsorção.É utilizado quando a matriz da amostra é complexa e difícil de simularÉ utilizado quando o número de amostras a analisar é reduzido
conc.massa ouvolume
A
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Análise Quantitativa
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Análise Quantitativa
Quantidades crescentes de uma solução padrãosão adicionadas a volumes constantes deamostra, sendo o volume final de todas assoluções submetidas a ensaio similar.
O resultado é calculado com base no valor daabcissa correspondente à interpolação do dobroda ordenada na origem ou pelo móduloda abcissa obtido após extrapolação da recta deregressão.
A
m