C H A P T E Rkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Genetik ve biyotek/8...Herpes simpleks, tip I Uçuk 1988 İnsan bağııklık yetmezliği virüsü (HIV -1) AIDS 1985 İnsan papilloma virüsü

C H A P T E R

PowerPoint® Lecture by:

Lisa Werner

Pima Community College

Mikrobiyal

Biyoteknoloji

8

Çeviri: Aslı Sade Memişoğlu

© 2013 Pearson Education, Inc.

Konu başlıkları

• Giriş

• 1 Mikropların yapısı

• 2 Araç olarak mikroorganizmalar

• 3 Çeşitli günlük uygulamalarda mikropların

kullanımı

• 4 Aşılar

• 5 Mikrobiyal genom

• 6 Biyoyakıt üretimi için mikropların kullanımı

• 7 Mikrobiyal tanı

• 8 Biyoterörle mücadele


Giriş

• Mikroplar (mikroorganizmalar) çıplak göz ile

görülemeyen, ancak mikroskop altında

görülebilen küçük organizmalardır. – Bakteriler, mantarlar, algler, ve protozoa

• Dünyada oluşan ilk yaşam çeşidi bakterilerdi ve

3.5 milyar yıldır varlar

• Dünyanın yaşayan bölümünün %50’sini

bakterilerin oluşturduğu düşünülmektedir


Giriş

• Etrafımız bakterilerle çevrilidir.

– Ağzımız, deri ve sindirim kanalımızda yaşarlar.

– Vücudumuzda kendi hücre sayımızın 10 katı

civarında bakteri yaşamaktadır!

• Bakteriler gezegendeki an çetin koşullarda

yaşamaya uyum sağlamışlardır:

– Kutup buzulları, çöller, sıcak su kaynakları,

okyanus derinliklerinde yüksek basınçta.


Giriş

• İnsanlar mikropları geleneksel biyoteknolojide uzun

zamandır kullanmaktalar.

• Mikroplar rekombinant DNA teknolojisinin de

temelini oluşturur.

• Mikrobiyal biyoteknolojinin 2 ilginç alanı:

‘biyoyakıtlar’ ve ‘sentetik biyoloji’

• Bakteri türlerinin %1’inden azı tanımlanmış, kültür

ortamında çalışılmıştır.

– Dolayısıyla mikropların biyoteknolojiye gelecekteki

katkısını ancak hayal edebiliyoruz.


1 Mikropların yapısı

• Ökaryot mikroplar: maya, alg, protozoa

• Prokaryotlar: bakteri ve arkea


• Bakterilerin yapısal özellikleri

– Dairesel, tek kromozom küçüktür

• 2–4 milyon baz çifti

– Bazı bakteriler plazmid de içerir

• Plazmidler genelde antibiyotik direnç genleri ve DNA

değişimi için gereken tüp oluşturma genleri içerir

• Plazmidler klonlama için gereklidir

– Bakteriler çok hızlı büyür ve çoğalır– Her 20 dakikada 1 gibi…

– Küçük sıvı kültürlerde milyonlarca hücre büyütülebilir

– Moleküler ve genetik çalışmalarda kullanılmak

üzere mutant tipler oluşturmak çok kolaydır.



• Maya – tek hücreli ökaryot mikroplar;

mantar

– Antibiyotiklerin ve kolesterol düşürücü ilaçların

kaynağı

– Gen ifade mekanizmaları insan hücreleriyle

benzerdir.

– Oksijen varlığında (aerobik) veya yokluğunda

(anaerobik) büyüyebilirler.



2 Araç olarak mikroorganizmalar

1. Mikrobiyal enzimler

– Besin üretiminden, moleküler biyoloji araştırmalarına

farklı uygulamalarda kullanılır.

– Taq DNA polimeraz

• Isıya dayanıklı termofil mikroptan elde edilmiştir – PCR’da

kullanılır.

– Selülaz

• Hayvan yemlerinin daha kolay sindirilebilmesini sağlar

• Taşlanmış kotlar

– Subtilisin

• Çamaşır deterjanları – lekelerdeki proteinleri parçalar


2. Transformasyon – Bakterilerin yabancı

DNA’yı içlerine almaları– Bakteriler büyük miktarlarda protein üretmek için

kullanılır.

3. Raportör olarak mikrobiyal proteinler

– Biyoluminesans – deniz organizmalarının

kullandığı ışık üretme yöntemini kullanmak

• Vibrio fisheri gibi, deniz canlıları üzerinde yaşayan

bakteriler bu ışığı üretir

• lux genleri bu ışığı üretir



– Lux genleri klonlanmış ve gen ifadesi

çalışmalarında kullanılmaya başlanmıştır.

• Klonlanmış lux geni hayvan veya bitki hücrelerine

aktarıldığında bu hücreler o proteini üretir ve gen

ifadesinin göstergesi olarak ışıma yaparlar.



3 Mikropları çeşitli günlük uygulamalarda

kullanmak

1. Gıda ürünleri

– Ekmek, yoğurt, peynir, alkollü içecekler

– FDA (Gıda ve ilaç idaresi) tarafından onaylanan ilk

rekombinant gıda maddesi peynir yapımı için kullanılan

bir enzimdir.

– Geleneksel enzim olan renin, buzağı midesinden

ayrıştırılır.

– Rekombinant renin olan kimosin, klonlanmış ve

bakteride üretilmiştir – daha ucuz ve üretimi daha kolay.


2. Fermentasyon – oksijen yokluğunda şekerlerden

enerji üretmek.

– Laktik asit fermentasyonu: yoğurt, ekşi krema, sirke,

peynir ve ekmek yapımında kullanılır.

– Alkol fermentasyonu: bira, şarap, şampanya yapımı


kullanmak


3. Tedavi proteinleri

– Tıbbi açıdan önemli proteinlerin üretiminde de

bakteriler kullanılır.

– İnsülin


kullanmak


Promotor

İnsülin

A geni

İnsülin

B geni

Promotor

Ampisilin

direnç

geni

Ampisilin

direnç

geni

İnsülin A

zinciri

İnsülin B

zinciri

İnsülin A

zinciri

İnsülin B

zinciri

A

zincirini

saflaştır

B

zincirini

saflaştır

Füzyon proteinin

den ayırmak için

CNBr kullan

Katlanma

Aktif insülin

Disülfit bağları

A protein zinciri

B protein zinciri

İnsana

enjeksiyon için

saflaştır

E. Coli’ye

transformasyon

Bakteriler b-gal ve

insülin füzyon

proteini üretir

Füzyon proteinini

saflaştırmak için b-gal

antikorları ile afinite

kromatografisi


Rekombinant bakterilerde üretilen tıbbi proteinler

Protein İşlev Uygulama

Dnaz DNA parçalayan enzim Kistik fibroz tedavisi

Eritropoietin Alyuvar üretimini tetikler Anemi tedavisi

Faktör VIII Kan pıhtılaştırma faktörü Hemofili tedavisi

Granülosit koloni tetikleyen faktör Akyuvar büyümesini tetikler Kemik iliği nakillerinde

Büyüme hormonu Kemik ve kas büyümesini tetikler Cücelik tedavisi. İneklerde büyüme ve

süt üretimini artırır

İnsülin Hücrelerin glukoz emilimi için gerekli Diyabet tedavisi

hormon

İnterferon ve interlökin Kan hücresi üretimini artıran faktörler Lösemi gibi kanserlerin tedavisinde

Aşılar Bakteri ve virüs enfeksiyonlarını

engellemek için bağışıklık sistemini

uyarır


4. Antibiyotikler

– Mikropların büyümesini engellemek için diğer

mikroplar tarafından üretilir

– 1928 Alexander Fleming - penisilin

– Çoğunluğu bakteriler tarafından üretilir


kullanmak



kullanmakHücre duvarı sentezinin engellenmesi Protein sentezinin engellenmesi

Transkripsiyon Translasyon

Eşlenme

DNA eşlenmesi

ve

transkripsiyonun

engellenmesi

Hücre

metabolizması

için gereken

enzim

aktivitesinin

engellenmesi

Hücre zarına

hasar verme

Antibiyotiklerin etki mekanizmaları


– Antibiyotiklerin yanlış kullanımı dirençli bakterilerin artmasına sebep olmuştur.

– Antibiyotikler sınırlı sayıda yöntemle bir bakteri hücresini durdurur. Bu sebeple, bir çeşit antibiyotiğe direnç kazanılınca genelde diğer pek çoğuna da direnç kazanılmış olur.

– Farklı etki mekanizması olan antibiyotiklerin geliştirilmesi gerekmektedir.

– Mikrobiyologlar farklı çevrelerde araştırmalar yaparak yeni anti mikrobik maddeler keşfetmeye çalışmaktadır.

– Bugünlerde bakteri öldürücü genetiği değiştirilmiş virüs tedavisi geliştirilmesi düşünülmektedir


kullanmak


• Aşılar – Belirli bir patojen tarafından

enfeksiyona karşı bağışıklık sistemini

uyarmak için, patojenin tamamı veya

parçalarının ağız veya enjeksiyon yoluyla

insana verilmesidir.

4 Aşılar


• Aşı yapımı için 3 temel yöntem

– Alt birim aşılar bakteri veya virüsün bazı

bölümlerinin enjeksiyonu

– Değiştirilmiş aşılar yaşlandırma veya

büyüme ortamı değiştirilerek zayıflatılmış

virüs veya bakterilerin enjeksiyonu

– Öldürülmüş aşılar tamamen öldürülmüş

patojenin kulllanılması

4 Aşılar


• Günümüzde alt birim aşılarının çoğunluğu

rekombinant DNA teknolojisi ile mikropların

içerisinde üretilmektedir.

– Hepatit B

• Virüsün dış yüzey proteinlerini kodlayan genler

klonlanmış ve maya hücrelerinde üretilmiştir.

– Gardasil, insan papilloma virüsü aşısı (HPV)

– HIV aşısı

4 Aşılar


• Aşılar için bakteri ve virüs hedefleri

– Biyoteknoloji şirketleri 50’den fazla hedef

üzerinde çalışmakta

• Influenza

• Tuberküloz

• Sıtma

• HIV

4 Aşılar


• Influenza: Grip virüsleri çok hızlı mutasyona

uğradıkları için her yıl yeni aşılar üretilir.

– Influenza A dünya çapında salgınlara sebep

olmaktadır.

• 1918’de 20 milyon kişi öldü

• Kuş gribi (H5N1) 2003’te Asya’da tavuklar arasında salgına

sebep oldu - 200milyon kuş.

– İnsanlar arasında enfeksiyon fazla yayılmadı.

– H5N1’in mutasyona uğrayarak insanlara geçmemesi için aşılar

geliştirildi.

• 2009’da, domuz gribi (H1N1) bir aşı sayesinde kontrol

edilebildi

4 Aşılar


• Tüberküloz (TB)

– Mycobacterium tuberculosis

• Her yıl 2-3 milyon ölüm

• Akciğerlerde lezyonlar

• Çok fazla dirençli bakteri sebebiyle dünya sağlık

örgütü alarm verdi

• Bill ve Melinda Gates Derneği ve diğerleri,

araştırma için $30 milyon verdiler

• Genomu dizilendi, yeni proteinler keşfedildi ve yeni

aşılar klinik deneylerde

4 Aşılar


• Sıtma

– Plasmodium falciparum denilen protozoa

paraziti sebep olur ve böceklerden bulaşır

• Çocuklarda her yıl yarım milyar yeni vaka, her yıl 3

milyon ölüm

• Plasmodiyum tipleri sıtma ilaçlarına karşı direnç

geliştiriyor

• Tüm genom mikro çipleri yeni hedefler belirlemek için

kullanılmaktadır.

4 Aşılar


5 Mikrobiyal genomlar

• 1994 Mikrobiyal Genom Programı (MGP)

– Çevre biyolojisi, araştırma, endüstri ve sağlık

alanlarında uygulama potansiyeli olan

mikroorganizmalar ve protozoa patojenlerinin

genomlarının tamamını dizilemek


• Neden dizilemek isteyelim?

– Streptococcus pneumoniae, kulak ve akciğer

enfeksiyonuna ve her yıl 3 milyon çocuğun

ölümüne sebep olur.

• Aşıların çoğu çocuklarda etkisizdir

• 2001’de genomu dizilendi ve bakteri yüzeyinde

pek çok yeni protein keşfedildi

• Yeni tedavilerin yolunu açabilir



• Neden dizilemek isteyelim?

– Bakteri hücre metabolizması, bölünmesinde

yer alan veya insan/hayvan hastalıklarına

sebep olan genlerin keşfedilmesi

– Yeni türlerin bulunması

• Biyoremediasyon veya başka işler için

• Hastalık yapan tiplerin keşfi



• Metagenomik çalışmaları mikrop

komünitelerinin genomlarını diziler

– J. Craig Venter enstitüsü (JCVI) yatla tüm

dünyayı dolaşarak mikroorganizma örnekleri

topluyor.

• Büyücü II Keşif gezisi



• Bir pilot projede yüzlerce fotoreseptör geni

tanımladılar

– Yakıt olarak hidrojen üretimi için fotosentezin

gerçekleştirilmesini sağlayabilir

– Fotoreseptörler aynı zamanda görme için gereklidir

• Toplamda 400 mikrop türünden 6 milyar baz DNA

dizilediler.



• 2008’de ABD ulusal sağlık enstitüsü (NIH)

İnsan mikrobiyom projesini duyurdu

– İnsanlar üzerinde veya içinde yaşayan 600 adet

mikrop türünün genomlarının dizilenmesi.



• Projenin hedefleri:

– Bireyler ortak bir mikrobiyom paylaşıyor mu?

– Mikrop komünitelerini nasıl aldığımız ve devam

ettirdiğimizi belirlemek

– Mikrobiyomu etkileyen koşullar ve sağlıkla ilişkisi

– Analiz için yeni yöntemler geliştirmek



• Viral genomik


Dizilenen tıbbi açıdan önemli virüs genomları

Virüs İnsan hastalığı Dizilendiği yıl

Ebola virüsü Kanamalı ebola ateşi 1993Hepatit A virüsü Hepatit A 1987Hepatit B virüsü Hepatit B 1984Hepatit C virüsü Hepatit C 1990Herpes simpleks, tip I Uçuk 1988İnsan bağışıklık yetmezliği virüsü (HIV-1) AIDS 1985İnsan papilloma virüsü Rahim ağzı kanseri 1985İnsan polio virüsü Çocuk felci 1981İnsan rinovirüsü Grip 1984İnfluenza A virüsü

H5N1 (kuş gribi) Ciddi grip 2007H1N1 (Domuz gribi) Ciddi grip 2009

SARS-ciddi akut solunum koronavirüsü Ciddi akut solunum sendromu 2003Variola virüsü Çiçek 1992


• Sentetik genomlar

oluşturmak: Bir bakteri

Türünün işlevsel sentetik

genom üretildi

5 Mikrobiyal genomlarM. Mycoides genomu

tasarla

1.8 Mb genomu içeren 10000

bazlık kaset DNA’ları kimyasal

olarak sentezle

E.Coli bakterisinde

klonlama

S.Cerevisiae içinde tüm

genomun birleştirilmesi

M.Capricolum içine transfer


• Sentetik genomlar:

– M. mycoides JCVI-syn 1.0 genomu sentetik

olarak üretildi.

– Cansız bir nesneden yeni bir yaşam formu

oluşturmadı fakat yine de sentetik genomların

yaşamı sürdürebildiği kanıtlandı.

– Yeni bakteri veya hücre türleri tasarlanıp,

istenilen görevi yapmak üzere

programlanabilir!!!

– Etik sorunlar!



6 Biyoyakıt üretimi

• Sadece ABD yılda 140 milyar galon yakıta ihtiyaç

duymaktadır

• Tahıldan, yılda 5 milyar galon etanol üretmekteyiz.

– Çok karlı veya verimli değil

• Biyorafineriler, bitki sapları veya diğer ürünlerdeki selülozu

şekere dönüştürebilir ve bu da sürdürülebilir etanol üretimi

için kullanılabilir.

• Günümüzde mikroplar selülozu şekere veya şekeri alkole

daha verimli dönüştürmeleri için genetik olarak

değiştirilmektedir.

• Doğada da biyoyakıt üretimi için kullanışlı enzimler üreten

yeni mikroplar halen araştırılmaktadır.


7 Mikrobiyal tanı

• Mikrobiyal tanı – mikropları tanımlamak ve

izlemek için kullanılan yöntemler

• Bakteri tespit stratejileri

– Restriksiyon analizi, PCR ve DNA dizileme

– Klinik örneklerin karşılaştırılabilmesi için veri

tabanları bulunmaktadır.

– Gıdalardaki bakterileri tespit etmek için

kullanılmakta.


Örnek (kan,

tükürük)

Bakteri hücreleri

Restriksiyon analizi PCR analizi DNA dizileme

Restriksiyon enzim

kesiminden sonra

DNA parçaları Hedef DNA

PCR cihazında

çoğaltma

Agaroz

elektroforezi

ÖrnekBakteri DNA’sının

çoğaltılması

DNA

dizileme

Dizi analizi

Bilinen dizilerle veri

tabanında karşılaştır

Bakterinin tanımlanması


7 Mikrobiyal tanı

• Bulaşıcı hastalıkların tespiti için mikroçipler

– Affymetrics şirketi SARS çipi geliştirdi

• Üzerinde ~30,000 prob (DNA parçası) var – bunlar tüm virüs

genomunu temsil ediyor

– Mikroçipler ayrıca belirli bir patojendeki ani değişimleri

(mutasyonları) de tespit edilmesi için kullanılıyor.


7 Microbial Diagnostics

Farklı patojenlere konakçının cevapları tanımlanır


8 Biyoterör

• Biyoterör – İnsanlara veya gıda için bağımlı

oldukları hayvan/bitkilere zarar vermek

amacıyla biyolojik materyal kullanımı.

• Sadece 12 civarında organizma verimli

şekilde kültürde büyütülebilir, elde edilebilir

ve biyoterörde kullanılabilir

• Hava yoluyla, tarım uçakları veya su yoluyla

uygulanır.


POTANSİYEL BİYOLOJİK SİLAHLAR

Patojen Hastalık tehdidi ve genel semptomlar

Brucella (bakteri) Çiftlik hayvanlarını enfekte eder. İnsan ve hayvanlarda brusellosise

yol açar. Uzun süreli ateş ve halsizlik. Hafif veya ölümcül olabilir

Bacillus anthracis (bakteri) Şarbon. Deri tipi, deride tedavi edilebilir lezyonlar oluşturur.

Solunursa grip benzeri semptomlarla başlayıp zaatürreye çevirir –

genelde ölümcüldür.

Clostridium botulinum (bakteri) Botulizm. Bakterinin kendisi veya toksini içeren yiyeceklerle bulaşır.

Kaslarda farklı derecelerde felç. Solunum veya kalpte felç ölümle

sonuçlanır.

Ebola virüsü veya Marburg virüsü Her ikisi de kanamalı ateşe yol açar. Ciddi ateş, kas/eklem ağrısı,

kanama

Francisella tularensis (bakteri) Tularemi. Solunum çökmesi, şok ve ölümle sonuçlanabiken

solunum inflamasyonu

İnfluaenza virüsleri (büyük ve bulaşıcı bir grup) Nezle. Ciddiyeti ve sonuçları virüs tipine göre değişir.

Rickettsia (birkaç bakteri tipi) Tifüs ve kayalık dağlar lekeli humması gibi farklı hastalıklar

Variola virüsü Çiçek. Titreme, yüksek ateş, sırt ağrısı, başağrısı, cilt lezyonları

Yersinia pestis (bakteri) Hıyarcıklı veba. Yüksek ateş, baş ağrısı, lenf düğümlerinin şişmesi,

şok, dolaşımın çökmesi, organ yetmezliği, çoğunlukla birkaç gün

içinde ölüm


GIDA KAYNAKLARINA YÖNELECEK BİYOSİLAHLAR İÇİN POTANSİYEL PATOJENLER

Hastalık Hedef/taşıyıcı Patojen

Hayvan Hastalıkları

Ayak ve ağız hastalığı çiftlik hayvanları Ayak ve ağız virüsü

Afrika domuz gribi Domuzlar Afrika domuz gribi virüsü

Bitki hastalıkları

Tahıllarda Kök pası (mantar) arpa, yulaf, buğday Puccinia spp.

Güney mısır yaprağı küfü (mantar) mısır Bipolaris maydis

Pirinç yanığı (mantar) pirinç Pyricularia grisea

Patates küfü (mantar) patates Phytophthora infestans

Turunç pamukçuğu (bakteri) turunç Xanthomonas axonopodis

Zoonoz (hayvandan insana geçen hastalıklar)

Brucellosis (bakteri) çiftlik hayvanları Brucella melitensis

Japon beyin iltihabı (virüs) sivrisinek

ŞArbon (bakteri) çiftlik hayvanları Bacillus anthracis


8 Biyoterör

• Biyosilahlara karşı biyoteknoloji

– ABD’de 2001’deki şarbon saldırıları buna

hazırlıklı olunmadığını gösterdi

– 2004’te, ABD hükümeti Biyokalkan prolesine,10

yıl için 6 milyar dolar ayırdı

– Hedef biyosilahlardan korunmak ve tedavi etmek

için aşı ve ilaç depolamak


8 Biyoterör


– Bir saldırının tespit edilebilmesi için hava ve

su kaynaklı patojenlerin sahada test edilmesi

gerekir.

– Pentagon’da şarbon sırasında, Körfez savaşı,

Afganistan ve Irak savaşlarında kullanılan

tespit yöntemleri başarılı olmadı.

– Daha hassas ve kesin biyosensörlere

gereksinim var.

• PCR temelli

• Protein mikroçipler


Kandaki

proteinler

Bir şarbon proteinine

karşı antikor

Bir çiçek proteinine

karşı antikor

Bir grip proteinine

karşı antikor

Antikor çipi

Floresan

boyalı 2.

antikor

Boyalı

antikor

Kandaki proteinler

Şarbon antikoru

Bağlanmamış

antikorlar

Kanda şarbon

proteinleri

olduğunu

gösteren

floresan nokta

Okuma


8 Biyoterör


– Bir saldırı olduğunda antibiyotik gibi tedavi

ilaçlarına ihtiyaç olacak

– Ülkeler stok yapmalı

– Aşılar biyosilahlara maruz kalmadan kullanılmalı

– Eğer bilinmeyen veya genetiği değiştirilmiş

organizmalar kullanılırsa bu ilaçlar bile etkili

olmayacaktır

Documents

C H A P T E Rkisi.deu.edu.tr/asli.memisoglu/Genetik ve biyotek/8...Herpes simpleks, tip I Uçuk 1988 İnsan bağııklık yetmezliği virüsü (HIV -1) AIDS 1985 İnsan papilloma virüsü