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Question 1 Dans le cadre d'une sance de travaux pratiques danalyse microbiologique dun chantillon d'eau, l'enseignant confie ladjoint technique principal de laboratoire la prparation suivante : prparation dun milieu de culture glos Slanetz et Bartley, prparation et montage en salle de travaux pratiques d'appareils de filtration de l'eau. La fiche technique du fournisseur de la glose Slanetz et Bartley indique : "Prparation : Dissoudre 41,5 g.L-1, striliser sous vapeur fluente (marmite vapeur). Ne pas autoclaver. Mlanger soigneusement au milieu encore liquide, vers 50C, 10 mL d'une solution 1% de TTC. Couler ensuite en botes de Ptri. pH 7,2+/- 0,1" 1. Milieu de culture : composition, prparation, strilisation a. Indiquer dans le tableau ci-dessous le rle des diffrents constituants de ce milieu de culture :

b. Prciser les caractristiques nutritives et biochimiques de ce milieu.

Milieu ordinaire solide, enrichi en facteurs de croissance, slectif des coques G+. Culture des Streptocoques et des Entrocoques. Lecture des colonies rouges (TTC+) ou blanches (TTC-)

Constituants (en g.L-1) Rle des constituants

Peptone de casine 15,0 source de C, N, nergie

Peptone de farine de soja 5,0 source de C, N, nergie

Extrait de levure 5,0 source de C, N, nergie et facteurs de croissance

D(+) glucose 2,0 substrat, source C et nergie

Azide de sodium 0,4 Inhibiteur, agent slectif coques Gram +

Phosphate dipotassique 4,0 tampon pH

Agar-agar 10,0 solidification milieu

Triphnyl 2,3,5, ttrazolium chlorure (TTC) 0,1 indicateur redox (bactries rductrices du TTC), orientation

Eau qsp* 1L milieu de vie des cellules, hydratation *qsp : quantit suffisante pour

c. Indiquer les conditions d'hygine et de scurit requises pour peser la poudre du milieu de culture et indiquer le(s) constituant(s) justifiant ces conditions.

Rcipient et matriel de prlvement propres, mais pas ncessairement striles, sous Sorbonne en fonctionnement dans laboratoire de prparation

d. Justifier le mode de strilisation de cette glose.

Prsence de substances thermolabiles, donc pas dautoclavage (azide). TTC strilis par filtration car ne supporte pas une forte temprature.

e. Indiquer les conditions techniques requises pour repartir la glose en botes de Ptri.

On coule environ 20 mL par bote de Ptri dans des botes striles, de faon aseptique avec le milieu en surfusion 55C (sinon condensation). On laisse prendre en masse en laissant les botes fermes.

2. Filtration : montage strilisation, utilisation Les appareils de filtration de l'eau sont en plastique rigide thermorsistant. Les membranes filtrantes striles usage unique sont en actate de cellulose et de porosit de 0,45 m. Aprs filtration, les membranes sont dposes la surface des botes de Ptri prcdemment prpares, puis incubes. a. Indiquer les conditions de prparation avant strilisation de ces appareils. Justifier le mode de strilisation choisi.

Appareils propres et emballs hermtiquement (dans sac autoclave ou papier aluminium) Strilisation des appareils lautoclave (car le plastique ne supporte pas la chaleur sche). b. Donner la signification du terme "porosit". Justifier lintrt de la membrane utilise pour la filtration de l'eau.

Porosit = prsence de pores laissant filtrer les lments dont diamtre est infrieur au diamtre des pores. Ici, pores de 0,45 m : le filtre retient les bactries dont le diamtre est suprieur. Les impurets et autres substances de leau ainsi que l'eau sont filtres#

c. Etablir la liste du matriel au poste de travail ncessaire pour la ralisation de la filtration d'un chantillon d'eau de 100 mL.

Par lve : un appareil filtration strile, filtres, bec Bunsen pour striliser flacon eau, flacon deau distille strile pour rincer avant et aprs filtration, pince, trompe vide, glose Slanetz en bote de Ptri.

3. Culture et identification Les lves exploitent leurs botes de Ptri de la manire suivante :

contrle microscopique des colonies : la coloration de Gram prsente des coques Gram positif ; dnombrement des colonies d'entrocoques rduisant le TTC en formazan qui les colorent en

rouge. a. Dcrire les tapes techniques de la ralisation et de l'observation microscopique d'une coloration de Gram. Justifier son intrt dans l'orientation du diagnostic.

Ralisation dun frottis sur une lame partir dune colonie, dans une goutte deau ; fixation par flambage Coloration : cristal violet, lugol, alcool-actone (dcoloration), fuschine ou safranine Schage Observation objectif 100 limmersion (huile) Intrt : voir si la bactrie tudie est un coque ou bacille, Gram + ou -.

b. Citer le ractif prparer pour raliser le test catalase. Donner le rsultat attendu dans le cas d'un entrocoque.

Pour le ractif catalase, il faut prparer de leau oxygne 10 volumes. Les Entrocoques sont catalase ngatif, donc absence de bulles ou de dgagement de dioxygne (rsultat ngatif)

c. Citer la famille laquelle appartiennent les entrocoques. Indiquer la signification de leur prsence dans l'eau.

Les Entrocoques appartiennent aux Streptococcaceae. Leur prsence dans leau rvle une contamination dorigine fcale ; ce sont des indicateurs (prsents dans lintestin hommes et animaux).

Question 2 : Fractionnement et dosage des protines sriques par lectrophorse sur actate de cellulose

1. Prciser la nature chimique des protines et de la cellulose.

Respectivement molcule organique protidique et glucidique

2. Donner le principe de llectrophorse.

Mthode de fractionnement et danalyse base sur la migration diffrentielle dions, de molcules ou de particules charges dans un champ lectrique (au sein dun tampon imprgnant un support poreux inerte).

3. Chaque compartiment de la cuve lectrophorse est rempli par une quantit gale de tampon

vronal ajust pH 8,6. Prciser le matriel, les ractifs et le mode opratoire pour ajuster le pH de la solution tampon 8,6.

pHmtre, lectrodes, solution(s) tampon(s) talon(s), solutions dacide et de base, pipette (ou compte goutte ou burette), solution tampon ajusterEtalonnage du pHmtre avec une ou deux solutions tampons (suivant lappareil) temprature de travail (du laboratoire). Par ajouts dacide (ou de base) progressifs on amne le pH de la solution tampon (pralablement mise a temprature du laboratoire) la valeur de 8,6.

4. Indiquer les prcautions observer pour dposer le srum.

Mise en place de la bande dlectrophorse : avec une pince, essorer trs lgrement une bande dactate de cellulose immerge 15 min dans le tampon. Positionner la bande dactate de cellulose (face mate) sur son chevalet support en vitant la formation de bulles dair entre la face brillante (support semi-rigide) et ce dernier. Placer le support et la bande dans la cuve remplie de tampon. Dpt : se laver les mains. Prendre des gants latex (type gants de chirurgien) et raliser le dpt cot cathode perpendiculairement laxe de la plaque avec un applicateur charg (2 4 L) en srum ; attendre 5 10 s pour labsorption du srum dans lactate de cellulose. Enlever les gants les jeter en tant que dchets dactivit de soins risque infectieux. Se laver les mains.

5. Calculer la masse peser pour prparer 200 cm3 dacide trichloroactique 25 g.dm-3.

m = C. V = 25 x 0.2 = 5 g 6. Prciser le matriel, les quipements individuels de protection et le mode opratoire pour prparer

500 cm3 dacide thanoque 5 % partir dune solution commerciale pure (ou acide actique glacial).

Sorbonne, lunettes de scurit, gants pais synthtiques, prouvette 50 cm3 (ou pipette jauge en verre de 25 cm3 + poire daspiration, fiole de 500 cm3 Dans la fiole de 500 cm3 contenant environ 200 cm3 deau dsionise, prlever sous Sorbonne et ajouter 25 cm3 dacide thanoque ; ajuster au trait de jauge avec de leau dsionise.

7. Cocher le(s) pictogramme(s) pouvant complter ltiquette du flacon de mthanol utilis pour la

dshydratation. 8.

F

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T

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9. Calculer les volumes en cm3 de mthanol pur, dacide thanoque et de glycrol ncessaires pour

prparer 500 cm3 de ractif transparisant.

425 cm3 de mthanol pur, 70 cm3 dacide thanoque et 5 cm3 de glycrol.

10. Donner laspect de llectrophorgramme obtenu aprs coloration et transparisation.

11. Schmatiser llectrodensitogramme classiquement obtenu (srum non pathologique).