UNI VERSI DAD AUTONOMA METROPOLI TANA UNIDAD IZTAPALAPA ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum brasiliense (CAMBES) PRODUCTORES DE AGENTES ANTI VIH-1 T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTOR EN BIOTECNOLOGA P R E S E N T A ANTONIO BERNAB ANTONIO Director Dr. Francisco Cruz Sosa Co-Director Dr. Ricardo Reyes Chilpa Abril del 2010 ElDoctoradoenBiotecnologadelaUniversidadAutnomaMetropolitanaest incluido en el Programa Nacional de Posgrados de Calidad (PNPC) del CONACyT y ademscuentaconapoyodelmismoConsejoconelConvenio471-01Doctoradoen Biotecnologa Iztapalapa, D.F. a 23 de abril de 2010 El jurado designado por la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud de la Unidad Iztapalapa aprob la tesis ESTABLECIMIENTO IN VITRO DE CULTIVOS DE CALLO DE Calophyllum brasiliense (CAMBES) PRODUCTORES DE AGENTES ANTI VIH-1 que present: ANTONIO BERNAB ANTONIO Comit Tutorial Director: Dr. Francisco Cruz Sosa Co-Director: Dr. Ricardo Reyes Chilpa Asesor: Dr. Vctor Manuel Chvez vila J urado Presidente: Dr. J uan Orozco Villafuerte Secretario: Dra. Leticia Buenda Gonzlez Vocal: Dra. Mara Elena Estrada Ziga Vocal: Dr. Vctor Manuel Chvez vilaAGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIAS AlConsejoNacionaldeCienciayTecnologa(CONACYT)yalaUniversidad AutnomaMetropolitana-Iztapalapa,porelfinanciamientoylaaceptacinrespectiva, que me han permitido seguir desarrollndome. AlDr.FranciscoCruzSosa,porsuasesoraylasfacilidadesotorgadasduranteel desarrollo de esta investigacin. AlDr.VctorManuelChvezvilayalDr.RicardoReyesChilpa,porsusvaliosos comentarios y sugerencias. A la Dra. Leticia Buenda Gonzlez, Dra. Mara Elena Estrada Ziga y al Dr. Juan Orozco Villafuerte, por sus valiosos comentarios y el apoyo incondicional brindado, que permitieron culminar satisfactoriamente esta investigacin. Al Dr. Jaime Eduardo Vernon Carter, que por su gran ayuda en la revisin del Artculo derivado de este trabajo. Amishermanos,enespecialaVictoriaquehasidocomounaMadre.Amissobrinos, Toa,Gaby,Lalo,NeryyPablo,queconunasonrisafuemsquesuficientepara impulsarme y seguir adelante. Amiscompaerosyamigos:Lety,MaleyJuanporsuvaliosaamistadyporlos momentos de alegra que hemos pasamos en esta Universidad. Amisamigos:LorenzoMartnyLeonardolvarez,quesiempremehanbrindadosu amistad y me han apoyado en los momentos ms difciles. A todas aquellas personas que de alguna u otra forma me ayudaron a culminar este trabajo. Gracias! i TABLA DE CONTENIDO INDICE DE TABLAS..iv INDICE DE FIGURAS..v 1. ABREVIATURAS ............................................................................................................ 12. RESUMEN ........................................................................................................................ 23. ABSTRACT ...................................................................................................................... 34. INTRODUCCIN ............................................................................................................. 44.1. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ............................................................... 44.1.1. El virus de inmunodeficiencia en el mundo ........................................................ 44.1.2. El virus de inmunodeficiencia humana en Mxico ............................................. 64.2. Biotecnologa vegetal ................................................................................................. 94.3. Cultivo de tejidos vegetales ...................................................................................... 114.4. Factores que afectan el cultivo de tejidos vegetales ................................................. 144.4.1. Material vegetal ................................................................................................. 144.4.2. Medio de cultivo ................................................................................................ 154.4.2.1. Sales inorgnicas ........................................................................................ 154.4.2.2. Compuestos orgnicos ................................................................................ 174.4.2.2.1. Reguladores de crecimiento vegetal .................................................... 174.4.2.2.2. Vitaminas ............................................................................................. 194.4.2.2.3. Fuente de carbono ................................................................................ 194.4.2.3. Material de soporte y pH ............................................................................ 204.4.3. Temperatura, luz y humedad ............................................................................. 204.5. Metabolitos secundarios ........................................................................................... 214.5.1. Terpenos ............................................................................................................ 23ii 4.5.2. Fenoles ............................................................................................................... 244.5.3. Alcaloides .......................................................................................................... 254.6. Produccin de metabolitos secundarios en cultivos in vitro..................................... 265. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 295.1. Distribucin .............................................................................................................. 295.1.1. Gnero Calophyllum .......................................................................................... 295.1.2. Calophyllum brasiliense .................................................................................... 305.2. Usos tradicionales de Calophyllum brasiliense ........................................................ 325.3. Metabolitos secundarios del gnero Calophyllum y su actividad biolgica ............. 345.4. Cultivo in vitro del gnero Calophyllum .................................................................. 406. JUSTIFICACIN ............................................................................................................ 417. OBJETIVOS .................................................................................................................... 427.1. Objetivo general ....................................................................................................... 427.2. Objetivos particulares ............................................................................................... 428. HIPTESIS ..................................................................................................................... 439. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................................ 439.1. Material vegetal ........................................................................................................ 439.2. Establecimiento de plntulas .................................................................................... 439.3. Evaluacin de medios de cultivo, antioxidantes ....................................................... 449.4. Condiciones aspticas ............................................................................................... 459.5. Medio de cultivo y condiciones de incubacin ........................................................ 469.6. Induccin de callo ..................................................................................................... 469.7. Preparacin de extractos y muestras para el anlisis por HPLC .............................. 479.8. Anlisis por HPLC ................................................................................................... 489.9. Anlisis estadstico ................................................................................................... 49iii 10. RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................................... 4910.1. Establecimiento de plntulas .................................................................................. 4910.2. Evaluacin de compuestos antioxidantes y medios de cultivo ............................... 5010.3. Induccin de cultivos callo ..................................................................................... 5210.4. Produccin de calanlidos y cido apetlico .......................................................... 6011. CONCLUSIONES ......................................................................................................... 6612. PERSPECTIVAS .......................................................................................................... 6713. REFERENCIAS ............................................................................................................ 68 iv NDICE DE TABLAS Tabla 1. Composicin de algunos medios de cultivos......................................................... 16Tabla 2. Rendimiento de compuestos de cultivos de clulas vegetales en comparacin con las plantas madre. ................................................................................................................ 27Tabla 3. Actividad biolgica y principales clases de compuestos del gnero Calophyllum 35Tabla4.PorcentajedeinduccindecalloenexplantesdehojasinmadurasdeC. brasilienseCambescondiferentesconcentracionesycombinacionesdeKINy2,4-D KIN y ANA despus de seis semanas de cultivo. ............................................................... 55Tabla 5. Porcentaje de induccin de callo en explantes de hoja inmadura y semilla madura de C. brasiliense, bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + IBA despus de 6 semanas de cultivo. ...................................................................................................... 58Tabla 6. Porcentaje de induccin de callo en explantes de hoja inmadura y semilla madura de C. brasiliense bajo diferentes concentraciones y combinaciones de BAP + PIC y BAP + ANA despus de 6 semanas de cultivo. ............................................................................... 59Tabla7.Anlisiscuantitativodecalanlidosycidoapetlicoenextractoshexnicosde cultivos de callo y muestras de hoja de C. brasiliense. ....................................................... 62 v NDICE DE FIGURAS Figura1.NmeroestimadodepersonasquevivenconVIH(millonesdepersonas)enel mundo, 1990-2008. ................................................................................................................ 5Figura 2. Nmero de casos acumulados (miles de personas) de SIDA en Mxico, por ao de diagnstico y notificacin, 1990-2009. ............................................................................ 7Figura 3. Esquema general del cultivo de tejidos vegetales ................................................ 14Figura 4. Distribucin geogrfica del gnero Calophyllum............................................... 29Figura 5. Distribucin geogrfica de Calophyllum brasiliense ........................................... 30Figura 6. Ejemplar de C. brasiliense en los Tuxtlas, Veracruz, Mxico ............................. 31Figura 7. Productosartesanalesabase demadera, y ltexcomo usomedicinal del gnero Calophyllum ........................................................................................................................ 33Figura 8. Distribucin geogrfica en Mxico de los quimiotipos 1, 2 y 3 de C. brasiliense ............................................................................................................................................. 37Figura 9. Compuestos qumicos aislados de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 1) ....... 38Figura 10. Compuestos qumicos aislados de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 2) ..... 39Figura11.PlantajovendeC.brasiliensequemuestrahojasinmadurasusadasparael cultivo in vitro. .................................................................................................................... 44Figura12.ExplantesdeC.brasilienseinmersosensolucinantioxidanteprevioala siembra ................................................................................................................................ 46Figura 13. Establecimiento de plntulas de C. brasiliense en invernadero. ........................ 50Figura14.PorcentajedesobrevivenciadeexplantesdehojadeC.brasiliensecon diferentes compuestos antioxidantes y condiciones de incubacin.. ................................... 52Figura 15. Respuestas inducidas de callo y raz en explantes de hoja de C. brasiliense, bajo tratamientos de RCV. .......................................................................................................... 53vi Figura16.RespuestasinducidasdecalloenexplantesdesemilladeC.brasiliense,con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M. .......................................................................................... 57Figura 17. Cromatograma por HPLC del calanlido B. ...................................................... 61Figura 18. Cromatograma por HPLC del calanlido C. ...................................................... 61Figura 19. Cromatograma por HPLC del cido apetlico. .................................................. 61Figura 20. Cromatograma por HPLC de extractos de callo de semilla (CS). ..................... 63Figura 21.Cromatograma por HPLC de extracto de callo de hoja (CH). .......................... 63Figura 22. Cromatograma por HPLC de extracto de hojas de plantas de invernadero. ...... 64 1 1. ABREVIATURAS AIA cido 3-indolactico AIBcido 3-indolbutrico ANAcido naftalenactico BAP6-bencilaminopurina CENSIDACentro Nacional para la Prevencin y Control del VIH/SIDA CHCallos provenientes de explantes de hojas CSCallos provenientes de explantes de semillas CTVCultivo de tejidos vegetales DGEDireccin General de Epidemiologa DWADDetector de absorcin de doble longitud de onda DWDry weight FAOOrganizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin HPLCHigh performance liquid chromatography IMSSInstituto Mexicano del Seguro Social KINCinetina (6-furfuril aminopurina) MCPAcido 2-metil-4-cloro fenoxiactico OMSOrganizacin Mundial de la Salud p/vPeso/volumen (concentracin) PFPeso frescoPSPeso secoPICPicloram (cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolinico) PVPPolivinilpirrolidona RCVReguladores de crecimiento vegetal SIDASndrome de inmunodeficiencia adquirida SSSecretara de Salud TDZTidiazuron [1-fenil-3-(1,2,3-tidiazol-5-il) urea] TRTranscriptasa reversa TrTiempo de retencin UNAIDSPrograma Conjunto de las Naciones Unidas sobre el VIH/SIDA) v/vVolumen/volumen (concentracin) WPMMedio de cultivo para plantas leosas (Woody Plan Medium) Zeatina6-hidroximetil buterilamino purina VIH-1Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1 2iP6-dimetilamino purina 2,4,5-Tcido 2, 4, 5- triclorofenoxiactico 2,4-Dcido 2,4-diclorofenoxiactico 2 2. RESUMEN Laincidenciadelvirusdeinmunodeficienciahumanatipo1(VIH-1)haaumentado drsticamente en las ltimas dcadas, lo que ha motivado la bsqueda de nuevos frmacos ymtodosdeproduccin.Calophyllumbrasiliense(Cambes)esunrboltropicalque producecalanlidos,metabolitossecundariosquesonactivoscontralatranscriptasa reversa (TR) del VIH-1. En este trabajo, se demuestra que el cultivo de tejidos vegetales es una tcnica til para la produccin de estos metabolitos. Para ello, se evaluaron diferentes concentraciones y combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal (KIN, BAP, TDZ, ANA, 2,4-D,AIB yPIC) enexplantes de hojasy semillas deC. brasilienseencultivo in vitro, para establecer cultivos de callo capaces de producir calanlidos. Se utiliz el medio de cultivo para plantas leosas WPM y todos los cultivos se incubaron en condiciones de oscuridad.Losresultadosmostraronque,lamayorinduccindecalloenexplantesde semillas(100%)ocurriconBAP8.88M+PIC24.84M,mientrasquelamayor induccindecallosparalosexplantesdehoja(80.67%)seobtuvoconKIN0.46M+ ANA 5.37 M. Los anlisis cuantitativos realizados a los extractos hexnicos de callo por medio del HPLC, revel que hubo mayor produccin de calanlido B y calanlido C en los callosprovenientesdelosexplantesdesemillasqueenaquellosdesarrolladosapartirde losexplantesdehojas,encantidadesde309.25vs8.70mgkg-1PSparaelcalanlidoB; 117.70vs0.0mgkg-1PSparacalanlidoC,respectivamente.Estetrabajoesunpaso inicialparalainvestigacindelaproduccinporcultivodetejidos,deestoscompuestos para contrarrestar el VIH-1. 3 3. ABSTRACT Theincidenceofhumanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1)-infectedpeoplehas drastically increased over the last few decades, and has motivated the search for new drugs anddrugproductionmethods.Calophyllumbrasiliense(Cambes)isarainforesttreethat producescalanolides,secondarymetabolitesthatareactiveagainsthuman immunodeficiencyvirustype1reversetranscriptase(HIV-1RT).Inthisthesis,we demonstrate that plant tissue culture is a useful technique for producing these metabolites. Differentconcentrationsandcombinationsofplantgrowthregulators(KIN,BAP,TDZ, NAA,2,4-D,IBAandPIC)weretestedinleafandseedexplantstoestablishcallus culturescapableofproducingcalanolides.WoodyPlantMediumwasusedassubstrate, andallcultureswereincubatedindarkconditions.Thehighestcallusinductioninseed explants (100%) occurred with BAP 8.88 M + PIC 24.84 M, whereas the highest callus inducementfortheleafexplants(80.67%)occurredwithKIN0.46M+-naphthaleneaceticacid(NAA)5.37M.HPLCquantitativeanalysisrevealedhigher calanolideBandcalanolideCproductionincallusesfromseedexplantsthanthose developedfromleaves,inamountsof309.25vs.8.70mgkg-1DWforcalanolideB; 117.70 vs. 0.0 mg kg-1 DW for calanolide C, respectively. This study is therefore an initial steptoinvestigatingtheproductionofthesecompoundsintissueculturewithactivity against HIV-1 RT. 4 4. INTRODUCCIN4.1. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) 4.1.1. El virus de inmunodeficiencia en el mundo Elsndromedeinmunodeficienciaadquirida(SIDA),causadoporelvirusdela inmunodeficienciahumana(VIH),esunaenfermedadinmunosupresoraqueresultaen infecciones oportunistas y neoplasias malignas (Singh et al. 2005). Hasta el momento dos tipos principales de VIH se han identificado, el VIH-1 y VIH-2. El VIH-1 es la causa de la epidemia en todo el mundo y es el ms conocido, es un virus muy variable y que muta con facilidad, permitiendo as escapar de la inmunidad del husped y crear variantes resistentes alosmedicamentosypresenteelmayordesafoparaeldesarrollodeunavacunaeficaz contra este virus (Papathanasopoulos et al. 2003). El VIH-2 es mucho menos patgeno se produceraravez,yaqueseencuentraprincipalmenteenfricaoccidental.(Singhetal. 2005; De Clercq 1995). Pese a los avances constantes en la terapia antirretroviral, el SIDA causado por el VIH-1 se haconvertidoenlaprincipalcausademuerteenfricayencuartoanivelmundial,el nmerodepersonasconelVIHestaumentandoaunritmoalarmanteenlaIndiayel sudeste asitico (OMS 2009). De acuerdo a cifras del Programa Conjunto de las Naciones UnidassobreelVIH/SIDA(UNAIDS),hastael2009,elporcentajemundialdepersonas quevivenconelVIHsehaestabilizadodesdeelao2000.Sinembargo,elnmerode personasquevivenconVIHenelmundocontinucreciendoenel2008,estimando33.4 millones (Figura 1), siendo 20% mayor que en el ao 2000 (UNAIDS 2009). 5 Figura1.NmeroestimadodepersonasquevivenconVIH(millonesdepersonas)enel mundo, 1990-2008 (UNAIDS 2009). La UNAIDS (2009) menciona tambin que, cada da 7,400 personas se infectan por el VIH en todo el mundo, esto es, 2.7 millones de personas contrajeron la infeccin en el 2009, y hubo 2 millones de defunciones relacionadas con el SIDA en este mismo ao. De los 33.4 millonesdepersonasquevivenconelVIH,31.3millonescorrespondenaadultos,15.7 millones a mujeres, y 2.1 millones a menores de 15 aos. Afortunadamente, la tasa nueva de infecciones por el VIH ha disminuido en varios pases pero, a nivel mundial, el aumento denuevasinfeccionesenotrospasescontrarresta,almenosenparte,estastendencias favorables.Amedidaquehaaumentadoelaccesoatratamientosantirretroviralesenlos ltimosdiezaos,disminuyelnmeroanualdefallecimientosporSIDA(UNAIDS 2009). 6 4.1.2. El virus de inmunodeficiencia humana en Mxico En Mxico, el SIDA ocup el lugar 17 como causa de muerte en el 2007, pero al igual que enelrestodelospasesdelmundo,seha convertidoenunproblemaprioritariodesalud pblicamuycomplejo,conmltiplesrepercusionespsicolgicas,sociales,ticas, econmicas y polticas que rebasan el mbito de la salud, que constituye una amenaza para laseguridadnacionalyparaeldesarrolloeconmicoysocialdelasnaciones.Del continenteamericano,MxicoocupaeltercerlugardespusdeEstadosUnidosyBrasil (UNAIDS2009).DeacuerdoaestimacionesrealizadasporelCentroNacionalparala Prevencin y Control del VIH/SIDA (CENSIDA), de manera conjunta con el UNAIDS, en Mxico existan 220,000 personas adultas infectadas por el VIH en el 2009. Por otra parte, CENSIDA (2009) indic que desde el inicio de la epidemia en nuestro pas en 1981, hasta el17denoviembredel2009,enelRegistroNacionaldeCasosdeSIDAsehan contabilizado 135,003 casos acumulados de SIDA. Adems, Magis et al. (2008) con apoyo de los datos de CENSIDA menciona que la mayora de los casos registrados correspondan a personas que ya haban fallecido y el resto (39%) a quienes padecan la enfermedad y se encuentraban recibiendo tratamiento antirretroviral. De estos casos, el 80% corresponda a hombres y 20% a mujeres, lo que indic que por cada cinco hombres se ha infectado una mujer.El intervalo de edades que comprende 15 a 44 aos acumula el 77.5%de los casos, seguidoporun20.1%enpersonasmayoresde45aosyelresto(2.4%)correspondea personasde0a14aos.Enelaode1999seelevlanotificacinoportunadelos diagnsticosdebidoalaofertadetratamientosantirretroviralesacargodelIMSSyla Secretaria de Salud (SS) (Figura 2). 7 Figura 2. Nmero de casos acumulados (miles de personas) de SIDA en Mxico, por ao de diagnstico y notificacin, 1990-2009 (CENSIDA 2009). A diferencia del ao 2004 cuando solamente se haba registrado puntualmente el 18.6% de los casos ingresados al Registro Nacional de Casos de SIDA, entre los aos 2005 y 2007 se consigiregistrareficazmenteentreel50%yel65%,loqueindiclapresenciadeuna mejora progresiva en el registro adecuado de los nuevos casos diagnosticados en cada ao (Magis et al. 2008). Las cifras ms elevadas en los aos 2002, 2004 y 2008 fueron debidos aprocesosactivosdelaDireccinGeneraldeEpidemiologa(DGE)paradisminuirel subregistro de casos. EnloqueserefierealadistribucindelVIH,hastamarzodel2009seregistrqueel 54.5%deloscasosseconcentrensloseisentidadesfederativas:DistritoFederal (16.9%),EstadodeMxico(11.0%),Veracruz(9.1%),Jalisco(8.0%),Puebla(4.8%)y Baja California (4.7%) (CENSIDA 2009). Conocer las cifras de mortalidad por VIH/SIDA yrealizareladecuadoseguimientoyanlisisdelasmismasposeeunvalorestratgico 051015202519901991199219931994199519961997199819992000200120022003200420052006200720082009Diagnstico NotificacinProcesoactivodelaDGEpara disminuir el subregistro. Incrementoporofertadeantirretrovirales por SS.8 enorme a la hora de evaluar logros y fracasos en la lucha contra la infeccin en Mxico. En otras palabras, la mortalidad disminuira siempre y cuando descienda el nivel de contagio, sedetecteelVIH/SIDAensusetapasmstempranasyseapliquentratamientos especficos mas sencillos, econmicos y eficaces (Magis et al. 2008). Enrelacinaesto,hanhechoesfuerzosconelobjetivodebuscarmedicamentosms efectivosydebajocosto,sinembargohastaelmomento,nosetienealgunadrogaque puedaeliminarelVIH.Labioactividadguiadaporelfraccionamientodelosextractos crudos ha proporcionado molculas dirigidas al descubrimiento de drogas candidatas anti-VIH.Esas,quedurantelaltimadcada,sehanrealizadoimportantesprogresosenla investigacin sobre productos naturales que poseen actividad anti-VIH (Singh et al. 2005). Algunos ejemplos, son los extractos del gneroIpomoea carnea, varias especies de Vitex sp.,Cannaindica,Justiciagendarussa,extractosdeRhuschinensis,einclusoalgunas cianobacteriasverde-azulesdeaguadulcesehanmostradotenerdemoderadaabuena actividadcontraelVIH(JassimyNaji2003;Wangetal.2006;Woradulayapinijetal. 2005).Alafechasehalogradoidentificarpocomsde120compuestosnaturales, principalmentedeplantas,quepuedencontrarrestarinvitrolosefectoscitopticosde clulasinfectadasconestetipodeviruseimpedirsureplicacin.Estoscompuestos presentan una gran diversidad estructural encontrndose, entre otros, alcaloides, cumarinas, flavonoides,lignanos,fenoles,quinonas,saponinas,diterpenos,triterpenos,xantonasy polisacridos sulfatados (Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes 2009). 9 4.2. Biotecnologa vegetalOriginalmenteelconceptodebiotecnologasecircunscribaalcampodelaingeniera bioqumica,demanerafundamentalenelreadelamicrobiologaindustrialyla tecnologa enzimtica (Garibay et al. 1993). Sin embargo ha adquirido un significado ms amplio.Labiotecnologaesungradientedetecnologasquevandesdelastcnicasdela biotecnologatradicionalcomolafermentacin dealimentosyelcontrolbiolgico,hasta labiotecnologamoderna,basadaenlautilizacindelasnuevastcnicasdelaingeniera gentica (Altman 1999). La Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin(FAO2000),mencionaquedeacuerdoalconveniosobreladiversidad biolgica,sedefinealabiotecnologacomo:"todaaplicacintecnolgicaqueutilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus derivados para la creacin o modificacin de productosoprocesosparausosespecficos".Enelsentidoampliodeladefinicinde biotecnologa,labiotecnologavegetalconstituyeelempleodelasplantasparala produccindebienesyservicios,incluyendotodaslastcnicasagronmicasyhortcolas tradicionales, pues sin stas, no podra alcanzarse el objetivo de la biotecnologa que es la produccindecultivosdemayorcalidadymasaltorendimiento(Robertetal.1993).En lastresltimasdcadas,labiotecnologamodernahaemergidocomounreapromisoria queofrecediversasoportunidadesparalamanipulacindelossistemasbiolgicosysu explotacin comercial (Daz 2005). En la actualidad, diversos problemas relacionados con laelaboracindeproductosseresuelvenmediantelaaplicacindebiotecnologas novedosas.Lasaplicacionesmaspotencialesdelabiotecnologavegetalsobrela produccindealimentossonenormesyprcticamentetodosloscultivosalimentarios puedenbeneficiarseenunaformauotradelasnuevastcnicascomoenmayores rendimientos, incrementar la superficie cultivable y mayor calidad de productos (Robert et 10 al.1993).Enesteaspecto,labiotecnologavegetalcontribuyeencuatroenfoques principales: a) la multiplicacin masivade cultivares sanos y de alta calidad a travs de las tcnicasdepropagacininvitroconocidascomomicropropagacin,b)lageneracinde germoplasma libre de enfermedades, c) la generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas, y d) la conservacin de germoplasma por medio de cultivos in vitro contribuir tambinaunqueindirectamente,almejoramientogenticodeloscultivos(Robertetal. 1993; Altman 1999; George et al. 2008).Porotraparte,labiodiversidaddeMxicoofrecevariasopciones,quesloconlas herramientas de la biotecnologa vegetal es factible aprovechar; por ejemplo, el desarrollo del campo de la etnobotnica para la identificacin de especies con principios activos para la produccin de nuevos frmacos, aditivos y enzimas para la industria puede constituirse en una nueva actividad sumamente redituable para las comunidades vinculadas a las zonas dereservaecolgica,propiciandoconello,suaprovechamientoracionalysuproteccin (Bosh2003).Aproximadamenteel25%detodoslosfrmacosprescritosenlospases industrializados contienen compuestos que son directa o indirectamente, a travs de semi-sntesis,derivadosdelasplantas,ymuchasveceselsustitutossintticosnoposeenla misma eficacia y especificidad farmacolgica (Neumann et al. 2009). De acuerdo a Rates (2001),el11%delos252medicamentosquesonconsideradosporlaOrganizacin MundialdelaSalud(OMS)comobsicosyesenciales,derivanexclusivamentedelas plantas con flores.En las ltimas dos dcadas la biotecnologa vegetal se ha desarrollado como un rea nueva yprometedoraenelcampodelabiotecnologa,centrndoseenlaproduccinde metabolitossecundariosvegetales.Paraalgunoscompuestosdeinters,comola escopolamina la morfina, la quinina, vinblastina, atropina, y la digoxina, hasta el momento 11 no se han podido llegar a un proceso comercialmente viable, lo que ha limitado la cantidad de investigacin en el desarrollo de alternativas biotecnolgicas para la produccin de cada unodelosproductosmencionados(Verpoorteetal.1994).Aunqueenlabiotecnologa vegetallosesfuerzosdeinvestigacindelasplantassehandiluido,paraalgunos compuestossehapodidoincrementarconsiderablementelosnivelesdeproduccin,por ejemplo,shikonina(Tabata1988)yberberina(FuyitayTabata1987).Actualmentela investigacinsecentraespecialmenteenlasposibilidadesdeaplicarlaingeniera metablicaparamejorarelrendimientoanivelescomercialmenteinteresantes.Sibienes ciertoquelabiotecnologamodernaabarcaunagranvariedaddeinstrumentosde investigacin,muchosdelosproductosexitosamentecomercializadosenlaactualidad provienendedosgrandesreas,laingenieragenticayelcultivoinvitrodetejidos vegetales (Diaz 2005). 4.3. Cultivo de tejidos vegetalesElcultivodetejidosvegetales(CTV)ocultivoinvitrovegetalesunapoderosa herramienta de la biotecnologa moderna, y a grandes rasgos, esta tecnologa consiste en el usodepartesaisladasdelasplantas,llamadosexplantes,ymantenidosenunmedio nutritivoartificialaspticobajocondicionesambientalescontroladas(Barbaetal.2001). Estemedionutritivofuncionacomoreemplazodelasclulas,tejidosoelementos conductores originalmente vecinos del explante (Neumann et al. 2009). 12 Pierik (1990), menciona seis tipos de cultivos in vitro o cultivo de tejidos vegetales: 1.Cultivodeplantasintactas:sesiembrelasemillainvitro,delacualseobtieneuna plntula y finalmente una planta. 2.Cultivodeembriones:secultivaelembrinaisladodespusderetirarelrestodelos tejidos de la semilla. 3.Secultivainvitrounrganoaislado(unaporcindetejidoounrgano).Sepueden distinguirdistintostipos,porejemplo,cultivosdemeristemos,cultivosdepicesdel vstago, cultivo de races, cultivo de anteras, etc. 4.Cultivo de callo: Es un tejido obtenido por medio del aislamiento de rganos o tejidos diferenciadosloscualesposteriormentesonllevadosaunadesdiferenciacincelular presentado una proliferacin continua, acelerada y de apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. 5.Cultivodeclulasaisladas.Eselcrecimientodeclulasindividualesobtenidasdeun tejido, callo o cultivo en suspensin. 6.Cultivodeprotoplastos:Seobtieneapartirdeclulas,pordigestinenzimticadela pared celular. Se debe enfatizar en que el CTV es una serie de tcnicas que se utilizan en investigacin y enlaproduccincomercialdeproductosvegetalesyplantas.Enelprimercaso,seha empleadoenestudiosdefisiologa,bioqumica,morfognesis,anatoma,embriologa, fitomejoramiento y preservacin de germoplasma; mientras que el segundo caso se utiliza en la biosntesis de productos naturales (saborizantes, colorantes, aromatizantes, frmacos) 13 y en lamicropropagacin de plantas ornamentales, forestales, frutales y hortcolas (Barba et al. 2001).Elcultivodetejidosvegetalesexploratambincondicionesquepromuevenladivisin celular y la reprogramacin gentica en condiciones in vitro. Adems, se ha convertido en unprocedimientoestndarparalabiotecnologavegetalyhoyendasepuedereconocer cinco grandes reas donde el cultivo in vitro de clulas es generalmente aplicado (Loyola-VargasyVzquez-Flota2006):a)propagacinagranescaladematerialelite,b) generacindeindividuosfrtilesgenticamentemodificados;c)comounmodelopara estudios de fisiologa celular vegetal; d) preservacin de especies en peligro de extincin y recursosfitogenticos;ye)paralaproduccindeproductosnaturalesometabolitos secundarios. Dentrodeestasaplicaciones,lapropagacininvitroomicropropagacinesunadelas tcnicas ms estudiadas, con mayores avances y la que ms se aplica comercialmente a un mayornmerodeespecies,incluyendoamuchasplantasmedicinales(Barbaetal.2001; Routetal.2000).Esteultimoautormencionatambinquelapropagacindeplantas,a travsdelcultivodetejidossepuededividirentresgrandescategoras:elenfoquems comnconsisteenaislarlosmeristemosorganizadoscomopicesoyemasaxilarese inducirlosparaconvertirseenplantascompletas,estesistemadepropagacines comnmenteconocidacomolamicropropagacin;enelsegundoenfoque,losbrotes adventiciosseinicianenlashojas,razydeltallooensegmentosdecallosderivadosde dichos rganos; el tercer sistema de propagacin consiste en la induccin de embriognesis somtica en clulas y en cultivos de callos (Figura 3). Otra de las grandes aplicaciones en queactualmenteseestpotencializandoenlatcnicadelCTV,eslaproduccinde 14 compuestosdegranvalorparalaindustria,lacualesunreadeintensainvestigacin dentro de la biotecnologa. Figura 3. Esquema general del cultivo de tejidos vegetales (Lindsey y Jones 1989). 4.4. Factores que afectan el cultivo de tejidos vegetales Engranparte,elxitodelcultivodetejidosvegetalesseencuentraens,enelpropio material vegetal, la composicin del medio de crecimiento (sales inorgnicas), hormonas, y condicionesdelcultivotalescomolatemperatura,pH,luz,yhumedad(Pierik1990; Cardoza 2008). 4.4.1. Material vegetal Elmaterial vegetal por smismo, as como elmedio de cultivo y los factores fisiolgicos decrecimiento,puedeninfluirenelcrecimientoydesarrolloinvitro.Lacapacidadde regeneracin de las plantas es muy variada, siendo las dicotiledneas las que generalmente 15 se regeneranmejor que lasmonocotiledneas. Adems, conforme una planta envejece, su capacidad regenerativa suele disminuir, por lo cual, se tienen que utilizar plantas juveniles. Los tejidos jvenes, no lignificados, generalmente son los ms apropiados para el cultivo, aunqueestopuedevariar.Porotraparte,esimportantequeelmaterialvegetalestesano, puesto que esto repercute en el porcentaje de infeccin. Tambin se ha observado que los explantesobtenidosdeplantasdecamposonmsdifcilesderegenerarqueaquellas provenientes de invernadero. Es conocido que es mucho ms difcil inducir el crecimiento enestructurasmuypequeascomoclulas,agregadosdeclulas,ymeristemos,queen estructuras ms grandes, como explantes de hojas, tallo o tubrculos (Pierik 1990). 4.4.2. Medio de cultivo 4.4.2.1. Sales inorgnicas El medio de crecimiento es una composicin de minerales esenciales y vitaminas que son necesariasparaelcrecimientoydesarrollodelaplanta,esdecir,sinaguaynutrientes minerales,lasplantasolosexplantesnopuedenvivirinvitro,yaquenoson completamenteauttrofoscuandosedesarrollanenestascondiciones.Losminerales constandemacronutrientescomoelnitrgeno(N),potasio(K),fsforo(P),calcio(Ca), magnesio(Mg),yazufre(S),quesonrequeridosporlasplantasengrandescantidades (g/l);mientrasaaquellosqueserequierenencantidadesmnimas(mg/l)sedenominan micronutrientes como el fierro (Fe), zinc (Zn), cloro (Cl), boro (B), cobre (Cu), nquel (Ni), molibdeno (Mo), manganeso (Mn) (Pierik 1990; Cardoza 2008). Estos elementos junto con elcarbono(C),oxgeno(O)yelhidrgeno(H),conformanlos17elementosesenciales. Algunosotros,comoelcobalto(Co),aluminio(Al),sodio(Na)yeliodo(I)hansido esenciales o benficos para algunas especies (George et al. 2008).16 Porlogeneral,losmediosdecultivo(Tabla1),estnbasadosenformulacionesya establecidas (Pierik 1990; Gamborg y Phillips 1995).Tabla 1. Composicin de algunos medios de cultivos. Componentes Gamborg et al (1976) Murashige y Skoog (1962) Lloyd y McCown (1981) mg l-1 Macronutrientes KNO325001900 Ca(NO3)2.4H2O556.00 NH4NO31650400.00 (NH4)2.SO4134.00 NaH2PO4.H2O150.00 KH2PO4170.00170.00 K2SO4990.00 CaCl2.2H2O150.00440.0096.00 MgSO4.7H2O250.00370.00370.00 Micronutrientes FeSO4.7H2O27.8027.8027.80 MnSO4.4H2O13.2022.3022.30 ZnSO4.7H2O2.008.608.60 H3BO33.006.206.20 KI0.750.83 CuSO4.5H2O0.0250.0250.25 Na2MoO4.2H2O0.250.250.25 CoCl2.6H2O0.0250.025 Na2EDTA37.3037.3037.30 Compuestos orgnicos Mioinositol100.0100.0100.0 Glicina2.0 cido nicotnico1.00.50.5 Piridoxina1.00.50.5 Tiamina10.00.11.0 Sacarosa (g/l)20.030.020.0 Fuente: Pierik (1990) y Gamborg y Phillips (1995). 17 UnodelosmediosnutritivosmsusadosenelCTVeseldeMurashige ySkoog(1962), quefuedesarrolladoparaelcrecimientoptimodecultivosdecallosdetabaco,yel desarrolloresulttilparaungrannmerodeespecies.Estemedio,consisteenpreparar porseparadosolucionesbase(stock)demacroelementos,microelementos,etc., almacenarlasenfroymezclarlosenlaproporcinadecuadaenelmomentodesu utilizacin(Pina2008),aunqueactualmenteseencuentranformulacionespreparadasa nivel comercial. A pesar de que este medio de cultivo es ms utilizado para la mayora de las plantas, no siempre es el ms adecuado para ciertas especies, debido a su alto contenido desales.PorejemploalgunasespeciesrespondenmejoralmediorealizadoporLloydy McCown(1981).EstemediodecultivodenominadoWoodyPlantMedium(WPM)es usadoampliamenteparaelcultivodetejidosdeplantasleosasosensiblesalasalinidad (Cardoza 2008, Pierik 1990). 4.4.2.2. Compuestos orgnicos 4.4.2.2.1. Reguladores de crecimiento vegetal LosRCVmsusadasenelcultivodetejidossonlasauxinas,talescomo,elcido3-indolactico(AIA),cido3-indolbutrico(AIB),cidonaftalenactico(ANA),cido2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D), cido 2, 4, 5- triclorofenoxiactico (2,4,5-T), cido 2-metil-4-clorofenoxiactico(MCPA).LasauxinascomoelAIA(auxinanatural)seutilizanen concentraciones de 0.01 a 10 mg l-1, y las auxinas sintticas como AIB, ANA y 2,4-D, se usan desde concentraciones menores que van desde 0.001-10 mg l-1, por ser relativamente ms activas. Las auxinas estimulan principalmente la elongacin celular y expansin de los tejidos, divisin celular (formacin de callo) y formacin de races adventicias, inhibicin 18 deformacindevstagosaxilaresyadventicios,yfrecuentementeembriognesisenlos cultivosdeclulasensuspensin.Esdecir,conunaconcentracinbajadeauxinas predominalaformacinderacesadventicias,mientrasqueconaltasconcentracionesda lugar a la formacin de callo (Pierik 1990). Se menciona tambin que, el 2,4-D y 2,4,5-T son muy efectivas para el crecimiento de callos (Bhojwani y Razdan 1983). Por otra parte, elcido4-amino-3,5,6-tricloropicolinicopicloram(PIC),esunherbicidadetipo sistmicoqueaconcentracionesbajastieneefectossimilaresalasauxinas(Collinsetal. 1978).Aunquenoescomnmenteusado,sehanobtenidoresultadosfavorablesparala induccindecallo,brotesyembriognesissomtica(ValverdeyArias1989;Beyly Sharma 1983). Lascitocininasporsuparte,seusanparaestimularelcrecimientoyeldesarrollo,siendo lasmscomunes,el6-furfurilaminopurinacinetina(KIN),6-bencilaminopurina(BAP), 6-dimetilaminopurina(2iP),y6-hidroximetilbuterilaminopurina(zeatina).Estos reguladores,ademsdepromoverladivisincelular,inducenlaformacindevstagos axilaresporladisminucindeladominanciaapicalyretardaelenvejecimientoyseusa generalmente altas concentraciones de 1-10 mg l-1 (Cardoza 2008; Pina 2008; Pierik 1990). Adems deestos reguladores tambin se ha llegado a utilizar el N-fenil-N-1,2,3-tidiazol-5-il urea tidiazuron (TDZ), el cual induce una gran diversidad de respuestas en el cultivo. El TDZ presenta la propiedad nica de imitar los efectos de las auxinas y a las citocininas enel crecimiento y la diferenciacin delosexplantescultivados(Murthy etal.1998). En concentracionesmenoresde0.22mgl-1puedeinducirmayorproliferacinaxilarque muchasotrascitocininas,sinembargo,alincorporarcantidadesmayoresa0.22mgl-1,el TDZpuedeestimularlaformacindecallos,brotesadventiciosembrionessomticos (Huettema y Preece 1993).19 4.4.2.2.2. Vitaminas Lasvitaminasmsutilizadasenelcultivodetejidosvegetalessonlatiamina(B1), piridoxina (B6) y el acido nicotnico (PP niacina). La nica vitamina que ha demostrado tenerimportanciaenelcultivodeclulasyrganoseslatiamina,yseusan concentracionesde0.1-5mgl-1aligualqueelcidonicotnico(PPniacina),mientras quelapiridoxinaesde0.1-1mgl-1.Estasdosltimasseutilizandebidoaquepueden estimularprocesosdecrecimientoespecficos(HurtadoyMerino1987).Elmio-inositol tieneunefectoestimulantemuysignificativoyseutilizanconcentracionesgeneralmente de100-200mgl-1.Elcidoctricojuntoconelcidoascrbico(vitaminaC),avecesse utilizanenconcentracionesmuyelevadas(1-100mgl-1),principalmenteparaevitarla oxidacin de ciertos inculos (Pierik 1990). 4.4.2.2.3. Fuente de carbono Enadicin,lasplantasrequierendeunefuentedecarbonoexterna(azcares),yaquelos cultivos in vitro no fotosintetizan lo suficiente para soportar las necesidades de carbono del tejido,ademsdequeelcrecimientodeciertoscultivostienelugarencondicionesde oscuridad(Cardoza2008).Lafuentedecarbonomsusadaeslasacarosayseemplean concentracionesde2a3%,pudiendovariardeacuerdoalaespecieentre5a12%. Generalmente el crecimiento y desarrollo aumentan con la concentracin de azcar, hasta que alcanza un ptimo, mientras que disminuye a elevadas concentraciones (Pierik 1990). 20 4.4.2.3. Material de soporte y pH Comomaterialdesoporte,elagar(8gl-1)eselmsusadoenelcultivodetejidos,pues provee al medio un excelente gel hmedo que sirve como soporte al inoculo. Sin embargo, fisiolgicamentenoesinerte,puestoqueesunafuentedecantidadesvariablesde sustanciasinhibidorasoestimulantesdelcrecimiento,porloque,sepuedensustituirpor GelriteoPhytagel(2gl-1),loscualessonmspurosydeaparienciaclaraqueelagar (Cardoza 2008; Hurtado y Merino 1987). ElpHenelmedioesdegranimportanciayaqueinfluyeenlaabsorcindevarios componentes del medio, la mayora de stos se ajustan a un pH de 5.2-5.8 (Cardoza 2008). Pierik (1990) menciona que el pH en el rango de 5-6.5 es apto para el crecimiento, con un mximo de 6.0, mientras que un pH bajo (menor de 4.5) o alto mayor de 7), generalmente frena el crecimiento y desarrollo in vitro. Si el pH es demasiado bajo, puede ocasionar que laauxinaAIAyelcidogiberlicoseanmenosestables,elagarpierdesurigidez,y algunas sales como el fierro y fosfato pueden precipitar. 4.4.3. Temperatura, luz y humedad Otrostiposdefactoresqueinfluyenenelcultivosonlaluz,temperaturaylahumedad relativa.Apesardequeloscultivosdetejidosnosonfotosintticamenteeficientes,la iluminacininfluyeenlosprocesosmorfogenticosyengeneralenelmetabolismo.El fotoperiodogeneralmenteutilizadoesde16 horas luz y 8de oscuridad,intensidad de luz de 25-50 molm-2 s-1. Algunos cultivos son tambin incubados en la oscuridad, debido a que la luz incrementa la produccin de compuestos fenlicos, los cuales interfieren con el crecimientodelcultivodecallos(Pina2008;Cardoza2008;GeorgeyDavis2008).A 21 veces,dependiendodelaespecieexperimental,seeligeunatemperaturamsbaja(18 para especies bulbosas), o una temperatura ms alta (28-29 para especies tropicales), pero debetomarseencuentaquelatemperaturainteriordelosrecipientesquecontienenlos cultivosinvitroes3-4gradosmsaltaqueenlacmaradecrecimiento.Porotraparte, debetenersetambinencuentaquelahumedadenlosrecipientesdelcultivoes relativamentealta,porloquelahumedaddelacmaradecrecimientodebeser30-50%. Sinembargo,silahumedadeselevadaenlacmara,darcomoresultadounamayor cantidad de infecciones al igual que una elevada temperatura (Pierik 1990).

4.5. Metabolitos secundarios Todaslasclulasvegetalesrealizanprocesosmetablicoscomunesqueconducenala formacindecompuestoscomolosazcaressimples,aminocidos,nucletidos,cidos grasos y polmeros derivados de ellos (polisacridos, protenas, cidos nucleicos y lpidos, entreotros),esencialesparalavidacelulary,engeneral,delaplanta(Pioletal.2000). Estosprocesosconstituyen,ensuconjunto,elmetabolismoprimario,yaloscompuestos indicados se denominan metabolitos primarios, los cuales estn involucrados directamente enelcrecimientoyenelmetabolismo(Ramawat2007).Ademsdeestosprocesos metablicos, en las plantas se pueden desarrollar otras rutasque conducen a laformacin decompuestosusualmentepeculiaresdeciertosgrupostaxonmicosvegetales(gnero, especieofamilia)(Ramawat2007).Estasrutasconstituyenelmetabolismosecundarioy sus productos secundarios se denominan metabolitos secundarios, productos secundarios o productosnaturales(Pioletal.2000).Estoscompuestosestnconsideradoscomoproductosfinalesdelmetabolismoprimarioyporlogeneralnoestninvolucradosen 22 procesosdefotosntesis,respiracin,transportedesolutos,translocacin,sntesisde protenas, asimilacin de nutrientes, diferenciacin, formacin de carbohidratos, protenas y lpidos (Taiz y Zeiger 2006). La distribucin de los metabolitos secundarios en las plantas es mucho ms restringida que el de losmetabolitos primarios;uncompuestoamenudo slo seencuentraen unas pocas especies,oinclusodentrodeunaspocasvariedadesdeunaespecie(Smetanska2008). Adems,labiosntesisdeestosmetabolitosserestringetambinafasesespecficasdel desarrollo,tantodelorganismocomodelasclulasespecializadas,yaperodosdeestrs causados, por ejemplo, por la deficiencia de nutrientes, factores ambientales, o el ataque de microorganismos(Pioletal.2001).Tambin,desempeanunpapelimportanteenla adaptacin de las plantas con su entorno, y en su mayora tienen un papel ecolgico puesto que protegen a las plantas de ser comidas por herbvoros y en contra de ser infectados por patgenos; sirven como atrayentes (olor, color y sabor) de polinizadores, y al ser ingeridas poranimalesayudanaladispersindelassemillas;funcionantambincomoagentesde competenciaentrelasplantasyalasimbiosisdemicroorganismoplanta(Bourgaudetal. 2001;TaizyZeiger2006).Porejemplo,sehaprobadoquelasplantasproducen fitoalexinascomorespuestaalataquedebacteriasyhongos(Gurib-Fakim2006).La produccin de metabolitos secundarios suele ser bajo (menos del 1% PS), dependiendo en granmedidadeestostiposdefactores(Neumannetal.2009).Porotraparte,muchas plantashansidoutilizadasdesdecientosdeaosparaeltratamientoycuradelas enfermedadesinfecciosasynoinfecciosas,loquepropiciunadelasbasesms importantes para el nacimiento de la medicina (Samuelsson 2004 y Floriani et al. 2006). En laactualidad,lainvestigacinydesarrollosecentranenlasplantasqueproducen metabolitossecundariosdeintersfarmacutico,talescomo,sustanciascon 23 inmunomoduladores,antibiticos,antiparasitarios,antitumoral,antiinflamatorio, hipoglucemia y antivirales (Yamada 1991). DeacuerdoaCroteauetal.(2000),losmetabolitossecundariosvegetalesseclasifican generalmente en tres grandes familias (terpenos, compuestos fenlicos y alcaloides). 4.5.1. Terpenos Los terpenos o terpenoides constituyen la clase ms grande de los productos secundarios, y elnombrederivadelhechoquefueelprimermiembrodelaclasequefueaisladodela trementina(terpentin)(Croteauetal.2000).Lasdiversassustanciasdeestaclaseson generalmenteinsolublesenagua.Todoslosterpenossederivandeunidadesdecinco tomosdecarbono(TaizyZeiger2006).Enelmetabolismoprimariolosterpenos funcionancomoconstituyentesdemembranas,pigmentosfotosintticos,sustanciasde crecimientoyhormonasvegetales.Lamayoradelosterpenosseencuentranenresinas, ltex,cerasyaceites,yleconfierentoxicidadoindigestascomounamedidadedefensacontraherbvoros(Staba1982).Porejemplo,lospiretroidesqueocurrenenlashojasy flores de especies de Chrysanthemumfuncionan como insecticida; los cardenlidos de la plantaDigitalispurpureatienenunsaboramargoysonextremadamentetxicospara animales superiores incluyendo a humanos; los aceites esenciales de la menta, el limn, la albahacaylasalvia,contienenmonoterpenosvoltilesquedanunolorcaractersticoal follaje;lashormonasvegetalescomolasgiberelinasylosbrasinoesteroideslascuales regulanelcrecimiento;losesterolesqueformanpartedelamembranacelular;ylos carotenoidesrojos,naranjayamarillosfuncionancomoaccesoriosenlafotosntesisy protegenalostejidosfotosintticosdelaoxidacin(TaizyZeiger2006).Algunas 24 familias de plantas en las que los terpenos se encuentran en abundancia son la Asteraceae, Chenopodiaceae, Taxaceae y Euphorbiaceae (Habermehl y Fliegner 1998). 4.5.2. Fenoles Los fenoles son otras de las caractersticas comunes de las plantas, las cuales contienen una granvariedadcomoflavonoides,estilbenos,taninos,cumarinas,lignanosyligninas,y variosfuncionancomoantibiticosypesticidasnaturales.Otrosactancomoseales qumicasenlafloracinylapolinizacindelasplantas,yenlosprocesosdesimbiosis vegetalcomoenlafijacindelnitrgenoydeparasitismovegetal(HeldtyHeldt2005). Lospolifenolessondecaractersticasaromticasydefciloxidacinenlasplantas, tiendenasersolublesenaguayusualmenteselocalizanenlavacuola.Econmicamente son importantes porque contribuyen al sabor, aroma y color de los alimentos y bebidas, por ejemplo, el aroma y el sabor del t estn relacionados con el contenido de polifenoles de la hoja,asmismo,elsaboramargodelacervezasedebeasucontenidodehumulona, mientrasqueelcolorrojodelvinoesdebidoalapresenciadeantocianinas(Pioletal. 2000).Lascumarinaspuedenencontrarseencubiertasdesemillas,frutos,flores,races, hojasytallos,aunqueengenerallasmayoresconcentracionesseencuentranenfrutosy flores,yaquejueganunpapelimportanteendefensaantimicrobial,antialimentaria,filtro deUV,ytienepropiedadesinhibidorasdelagerminacin(Croteauetal.2000).Estos compuestosseproducenenvariasplantasdelasfamiliasporejemplo,Rutaceae, Umbellifereae, Solanaceae y Clusiaceae (Ramawat 2007). 25 4.5.3. Alcaloides Losalcaloidespertenecenaungrupodemetabolitossecundariosquesesintetizande aminocidosycontienen1omstomosdenitrgenocomoconstituyentesde heterociclos. Son de naturalezaalcalina (bsica) y generalmentesolubles en agua (Held y Held 2005;).Porotraparte,losalcaloides,adiferenciadelamayoradelosotrosproductosnaturales constituyenelgrupodesustanciasvegetalessecundariasmsrepresentativo,numerosoy diverso(TazyZeiger2006).Estoscompuestoshansidoutilizadosdesdehacemucho tiempoporloshumanosenformadeextractosdeplantascomoveneno,estimulantes,y narcticos.Laimportanciadelosalcaloidesparalaplantaquelosproduceradicaenque constituyen reservorio de nitrgeno para s misma, a la vez, pueden actuar como sustancias alelopticaso disuasorios alimentarios, contribuyendo as a la defensa vegetal o el ataque de determinados patgenos o depredadores (Piol, et al. 2000). Por ejemplo, la nicotina del tabaco se us como uno de los primeros insecticidas por el humano, y sigue siendo uno de los ms efectivos; la cafena es una toxina efectiva para insectos, se encuentran en hojas y semillasdelcacao,caf,hierbademate,yt(Croteauetal.2000).Casitodoslos alcaloidessontxicosparaloshumanoscuandoseusanencantidadessuficientes,sin embargo, a concentraciones bajas son tiles farmacolgicamente tales como la morfina, la codena y la escopolamina, y otros, como la cocana, la nicotina y la cafena se usan como estimulantes o sedantes (Taiz y Zeiger 2006). 26 4.6. Produccin de metabolitos secundarios en cultivos in vitro Las plantas medicinales se han utilizado como una fuente importante de frmacos durante milesdeaos,yansonbasedelasprcticassistemticasdelamedicinatradicionalen muchos pases de todo el mundo (Pan et al. 2009). Adems, el descubrimiento de frmacos deplantasmedicinalessigueproporcionandonuevaseimportantepistascontravarios objetivos farmacolgicos incluyendo el cncer, el Alzheimer, la malaria, y el dolor, como sealanBalunasyKinghorn(2005).Dichosautorestambinmencionanque,apesarde queeldescubrimientodeprincipiosactivosdeplantasmedicinalessigueproporcionando una importante fuente de nuevos frmacos, hay numerosos desafos como la adquisicin de materiales vegetales. Por otra parte, la produccin de metabolitos secundarios de plantas se halogradopormuchotiempoatravsdelcultivosolodealgunasplantasmedicinalesen campo.Sinembargo,lasplantasprocedentesdebiotoposespecficospuedenserdifciles de cultivar fuera de sus ecosistemas. Tambin ocurre quelas plantascomunes no resisten losgrandescultivosdecampo, debido a la sensibilidaddepatgenos, lo que ha llevadoa loscientficos ybiotecnlogos aconsiderar el cultivo de tejidosy clulas vegetales como una forma alternativa de producir los metabolitos secundarios correspondientes (Bourgaud et al. 2001).Elprimergranavancedelatcnicadelcultivodetejidosocurriconelestablecimiento exitosodelneascelularescapacesdeproduciraltosrendimientosdemetabolitos secundariosencultivosdeclulasensuspensin(Zenk1978).Losproductosdemsalto interssongeneralmenteglucsidosyalcaloides.Juntoaestos,esteroides,enzimas, pigmentos,loscualestambin,sondeconsiderableinters.Talessonloscasosdela produccindevinblastinaylavincristinaenlneascelularesdeCatharanthusroseus, quinolinaenCinchonaledgerianaydiosgeninaencultivosdecallosdeDioscorea 27 deltoidea,entreotros(Constableetal.1981;Scraggetal.1990;RavishankaryGrewal 1991).Anivelcomercialsehanlogradoencultivosinvitrolaproduccinindustrialde algunoscompuestoscomolashiconina,ginsensidosyberberina,enbiorreactorescon escalas de 4000 a 75000 litros (Merillon 2007).Ambos productos se usan comnmente en laindustriadealimentos,elprimerocomocoloranteyelsegundocomosaborizante (Calva-Calvaetal.2000).Existenenlaliteratura,reportesdeunaseriedecultivosde clulas vegetales que producen una mayor cantidad de metabolitos secundarios que en las plantas madre (Tabla 2) (Smetanska 2008). Tabla 2. Rendimiento de compuestos de cultivos de clulas vegetales en comparacin con las plantas madre.CompuestoEspecie Rendimiento (% PS) Cultivo/plantaCultivo in vitroPlanta madre Ajmalicina Catharanthus roseus10.33.3 AntraquinonasMorinda citrifolia182.28 BerberinaCoptis japonica1323.3 GinsensidosPanax ginseng274.56 NicotinaNicotiana tabacum3.421.7 Acido rosmarnico Coleus blumei2739 Shiconina Lithospermum erythrorhizon201.513.5 Ubiquinona-10Nicotiana tabacum0.0360.00312 Fuente: Smetanska (2008). 28 Porotraparte,tambinsehaincrementadoelintersenlasmedicinasnaturalesquese obtienendelasplantasoextractosdeellas.Lossistemastradicionalesdeutilizar medicamentos a base de plantas medicinales estn en aumento, lo que ha dado lugar a una enorme presin sobre la biodiversidad y la destruccin de los biotopos de valor particular en los pases en desarrollo (Neumann et al. 2009).Lasplantassonlafuentetradicionaldemuchosproductosqumicosyfarmacuticos.La mayoradelosproductosnaturalesvaliosossonresultadodelmetabolismosecundariode lasplantas,yposeengrancomplejidadestructuraldeformaquelasntesisartificiales difcilycostosa,porlocual,elcultivodeclulasvegetalesesunatcnicaprometedora paralaproduccininvitrodemetabolitossecundarioscomplejos(BarzyEllis1981; Ravishankar y Venkataraman 1988). Algunos ejemplos de medicamentos derivados directa oindirectamentedelosvegetalessonelpaclitaxol(Taxol),lapodofilotoxinayla camptotecina,paratratarelcncer.Lamorfina,esutilizadacomoanalgsico,yotrosproductossemi-sinteticos(hormonasesteroidales)sonderivadosdeladiosgenina (Neumannet al. 2009). 29 5. ANTECEDENTES 5.1. Distribucin5.1.1. Gnero CalophyllumLa familia Clusiaceae o Guttiferae consta de aproximadamente 50 gneros y 1200 especies distribuidasentodoelmundo(Cronquist1981).DeacuerdoaStevens(1980),elgnero Calophyllum est constituido por 187 especies, todas ellas rboles tropicales, de las cuales 179especiesseencuentranenlaZonaIndo-Malasiaysolo8especiesenelcontinente Americano,distribuyndoseprincipalmenteenMxico,CentroamricaySudamrica (Figura4).EntrelasespeciesdelgneroCalophyllummsconocidasporsuimportancia qumica y medicinal se encuentran: C. brasiliense, C. fragrans,C. inophyllum, C. dispar, C.thwaitesii,C.moonii,C.cordato-oblongum,C.panciflorum,C.caledonicum,C. mucigerum,C.teysmannii,C.venulosum,C.polyanthum,C.blancoiyC.enervosum.C. brasiliense es lamsinvestigada en ste gnero por sus actividades biolgicas (Cechinel-Filho et al. 2009). Figura 4. Distribucin geogrfica del gnero Calophyllum (http://www.discoverlife.org). 30 5.1.2. Calophyllum brasiliense Calophyllum brasiliense Cambes es un rbol tropical que pertenece a la familia Clusiaceae. Comnmente se conoce como Oc, bar, sakbalamt, barillo, cedro cimarrn y guaya, entre otros, dependiendo de la regin donde se encuentre. C. brasiliense es la especie con mayor distribucinenAmrica,ydesugnero,eseldemayorimportanciamedicinal.Se encuentraenlasselvastropicaleshmedasdesdeBrasilhastaMxico(Figura5).Esta especie,eslanicadesutipoenMxico,yselocalizadesdeelsurdeVeracruzhasta Quintana Roo y de Nayarit hasta Chiapas, a una altitud de 0 a 650 msnm (Niembro 1986). Figura5.DistribucingeogrficadeCalophyllumbrasiliense (http://www.discoverlife.org). DeacuerdoaPenningtonySarukhn(1968)yNiembro(1990),estaespeciesedescribe como un rbol caducifolio de 20 a 45 m de altura y un dimetro de 40 a 60 cm (Figura 6). Lacortezaexternaesfisuradadecolorpardomorena,internadecolorcremarosado, laminada,fibrosa,amargayconexudadoamarillo.Lashojassondecusadas,simples; lminas de 6 x 2.5 a 14 x 5.5 cm, elpticas u oblongas, verde oscuras y brillantes en el haz, 31 verdeplidasenelenvs;glabras;nervaduracentralprominenteenelenvs;nervios secundarios perpendiculares al central, numerosos y cerca uno del otro; de textura coricea. Algunosrbolestiranlashojasenabrilomayoenlaszonasmssecas.Lasfloresson dioicas, en panculas axilares de 2 a 5 cm de largo, glabras; flores masculinas y bisexuales perfumadas,spalosverdosos,glabros,ptalosdecolorcremaamarillentos,estambres numerososyfloresfemeninasconelperiantosemejantesalasmasculinas,ovariospero hinchado, estilo corto, estigma grande y obtuso, florece de julio a diciembre. Figura 6. Ejemplar de C. brasiliense en los Tuxtlas, Veracruz, Mxico. a) planta adulta, b) troncofisurado,c)inflorescenciaenformadepancula,d)frutosinmadurosye)semillas maduras. ab cde32 Los frutos son drupas de 2.5 a 3 cm de largo, ovoides o esfricas, verde amarillentas en la madurez,deolorfragante,conendocarpioduroyunasemillagrandeporfruto.El mesocarpiocontienefibrasquesecontraenyarrugancuandosesecan.Lassemillasson esfricas de 1.5 x 1.3 cm, blanco amarillentas, sin endospermo. Maduran generalmente de octubre a diciembre. De acuerdo a Cronquist (1981), la clasificacin taxonmica es la siguiente: Reino: Plantae Subreino: Tracheobionta Divisin: Magnoliophyta Clase: MagnoliopsidaSubclase: DilleniidaeOrden: Theales Familia: Clusiaceae Gnero: Calophyllum Especie: brasiliense 5.2. Usos tradicionales de Calophyllum brasiliense ElgneroCalophyllumcomprendeplantasalascualseleshaatribuidograncantidadde usos en los trpicos (Figura 7).DentrodelosusostradicionalesmscomunesdelgneroC.brasiliensedestacanlos siguientes:Maderable:Seelaboranartculostorneadosyartesanas.Sehausadoparasustituiral cedro y la caoba. Su principal producto es la madera de excelente calidad que se usa para hacerquillas,mstiles,costillasyarmadurasdeembarcacionesascomoparamuebles finos,triplay,parquet,puentes,carroceras,armazones,tejamanil,chapas,ebanistera, 33 durmientes,decoracindeinteriores,partesdemolinos,puertasyventanas,telares, pasamanos,huellasydescansos,mangosparacubiertos.Lamaderaesespecialmentetil paralosplatosdecomidaycalabazas,yaquenoimpartealgnsaboralosalimentos (Stevens 1980; Dweck y Meadowsy 2002). Figura 7. Productosartesanalesabase demadera, y ltexcomo usomedicinal del gnero Calophyllum (Friday y Okano 2006). Aromatizante: La corteza contiene un aceite esencial semejante al del sndalo. Combustible: El aceite que contienen las semillas se utiliza con fines de iluminacin. Forrajero:Enalgunospasesseusacomoalimentoparaganado,ademssonfuentede alimento para una gran cantidad de animales del bosque. Colorante: La corteza, hervida por 25 minutos produce un tinte de color pardo, excelente en la tincin de fibras naturales. Medicinal:EnalgunascomunidadesruralesenMxicosehaextradoelaceitedelas semillas, y se ha usado para curar enfermedades cutneas. La resina que mana del tronco se 34 conocecomoblsamo de Mara y se leatribuyen propiedadesmedicinales para disminuir lacomeznenlapiel,cicatrizarulceras,diurticas,inflamacindeojoseinsolacin (Niembro1986;DweckyMeadowsy2002).Enparticular,lashojasycortezadeC. brasiliensefrecuentementeseusanenlamedicinatradicionalparatratardiferentes enfermedades como dolor, infecciones, infusiones para el asma, y como laxantes (Oliveira 1994).Tambinsehanusadoparatratarlabronquitis,disturbiosgstricosyhepticos (Sartorietal.1999),diabetesehipertensin(DukeyMartnez1994),diarreayherpes (Rutter1990),ascomo,reumatismo,varices,hemorroidesylcerascrnicas(Correa 1978). 5.3. Metabolitos secundarios del gnero Calophyllum y su actividad biolgica ElgneroCalophyllumesconsideradoconunricopotencialparaobtenernuevos compuestos especialmente con actividades qumicas y biolgicas y que puede contribuir al desarrollodelafitoterapia.LasplantasdelgneroCalophyllumcontienenprincipalmente cumarinas, xantonas, flavonoides, esteroides, y triterpenos, algunos de ellos con actividad biolgica relevante (Tabla 3) (Cechinel-Filhoet al. 2009). VarioscompuestosdelgneroCalophyllumhansidoestudiadosdesdeelpuntodevista farmacolgico, para contrarrestar algunas enfermedades como el cncer, el cual es una de laspatologascomunesentodoelmundo.Alrespecto,sehademostradoqueestegnero contienecompuestoscomoelcalofilolidoymammeaB/BB,potentescontralneas celularesdeleucemiahumana(HL-60)(Itoetal.2006)yclulascancergenaKBdela nasofaringe (Guilet et al. 2001). Por otra parte, la cumarina GUT-70 inhibi el crecimientode otras clulas de leucemia (BV173) (Kimura et al. 2005). Las mammeas A/BA y A/BB, 35 cumarinas tipo mammea han destacado por tener propiedades altamente citotxicas contra lneas tumorales PC3 (prstata), K562 (linfoma) y U251 (sistema nervioso central) (Reyes-Chilpa et al. 2004). Tabla 3. Actividad biolgica y principales clases de compuestos del gnero Calophyllum EspecieActividad biolgicaTipo de compuesto C. brasilienseAnalgsico, antiviral Terpenos,coumarinas, xantonas Antiulceregnico, anticancergenoCromanonas, flavonoides Antibacterial, molusquicidaTriterpenos C. fragransDesconocidaXantonas C. inophyllumAntitumoral, antiviralCoumarinas, Xantonas Citotxica, antibacterialtriterpenos C. disparDesconocidaCoumarinas C. thwaitesiiDesconocidaXantonas, terpenos C. mooniiDesconocida Xantonas,biflavonoides triterpenos, esteroides C. cordato-oblongumDesconocidaXantonas, biflavonoides C. panciflorumDesconocidaXantonas, biflavonoides C. caledonicumAntifngico, antimalariaXantonas C. mucigerumAntileucmico, insecticidaXantonas, coumarinas C. teysmanniiDesconocidaXantonas C. venulosumDesconocidaBiflavonoides C. polyanthumDesconocidaCoumarinas, cido benzoico C. blancoiDesconocidaCromanonas, xantonas C. enervosumAntibacterialXantonas, cetonas Fuente: Cechinel-Filhoet al. 2009. Varias familias de plantas producen diversos metabolitos secundarios que poseen actividad para detener la infeccin por el VIH (Harnett et al. 2005; Mi-Jeong et al. 2002; Ovenden et al. 2004). En particular, la familia Clusiaceae, de la cual destaca el gnero Calophyllum, es una de las fuentes actuales para este tipo de investigacin, ya que produce cumarinas cuyos 36 metabolitostienenactividadsignificativacontraelVIH-1(Dharmaratneetal.2002; McKee et al. 1996, Reyes-Chilpa y Huerta-Reyes 2009). EnunacolectadehojasdeC.lanigerumvar.AustrocoriaceumrealizadaenMalasiaen 1987,seaislporprimeravezlascumarinascalanlidoAycalanlidoB,enelcualse demostrqueamboscompuestosfueronaltamenteactivosparainhibirlaTRdelVIH-1 (Kashmanetal.1992).Posteriormente,enunesfuerzoporidentificarunafuentenatural suficiente y sostenible del calanlido A, se llevaron a cabo estudios qumicos y biolgicos delexudadodeltexdeestamismaespecie,enelcualnoseencontrelcalanlidoA. MientrasqueenlosextractosdeltexdeC.teysmanniivar.inophylloide,seobservde formaabundanteelcalanlidoB(costatlido)yqueactualmenteestsiendoevaluado comounaalternativaposiblealcalanlidoAparaeldesarrollodefrmacosanti-VIH (Fuller et al. 1994; Buckheit et al. 1999). Patil et al. (1993) menciona que otras cumarinas como el inofilum B y el inofilum P, aisladas de C. inophyllum Linn, fueron activos contra laTRdelVIH-1encultivosdeclulasinfectadas,aunqueotroscompuestosrelacionados comoelinfilumA,C,D,yE,incluyendoelcidocaloflicofueronmenosactivoso totalmente inactivos. ParaelcasoparticulardeMxico,sloexistelaespecie,C.brasilienseCambes.En estudiosrealizadosenelInstitutodeQumicadelaUNAM,seevaluaronextractosde diferentescolectasdehojasdeC.brasiliense,loscualesrevelaronlaexistenciadedos quimiotipos, es decir, tienen dos diferentes composiciones qumicas en sus hojas(Huerta-Reyes et al. 2004 y Reyes et al. 2004). stos se distribuyen en las zonas hmedas del pas (Figura 8) (Fonseca 2007). 37 Figura 8. Distribucin geogrfica en Mxico de los quimiotipos 1, 2 y 3 de C. brasiliense (Fonseca 2007). El primer quimiotipo (quimiotipo 1) produce cumarinas tipo mammeas (Figura 9) y tienen alta actividad citotxica en clulas tumorales humanas in vitro (Reyes-Chilpa et al. 2004). Elsegundoquimiotipo(quimiotipo2)contienecompuestosminoritariosdipirano cumarinas tetraccilicas (Figura 10), como el (+)-calanlido A, el (-)-calanlido B y el (+)-calanlidoC,loscompuestosmayoritariossoncromanonas,principalmenteelcido apetlico de los cuales, los dos primeros son inhibidores potentes in vitro de TR del VIH-1 (Huerta-Reyes et al. 2004). Sin embargo, el contenido de calanlidos es bajo, mientras que loscompuestosmsabundantessoncromanonas,delascualeselcidoapetlicoesel compuestomayoritarioytienetambinactividadcontrahongosfitopatgenosy antibacterial(Aguilar-Bauelos2005;Cottigliaetal.2004).Otroestudiorealizadopor Fonseca(2007)revellapresenciadeuntercerquimiotipo(Figura8)conunperfil cromatogrfico diferente a los quimiotipos 1 y 2, y que actualmente estn en estudio.38 Mammea A/BA, R1 Mammea A/BB, R2 Mammea B/BA, R1 ciclo F Mammea B/BB, R2 ciclo F Mammea C/OA, R1 Mammea C/OB, R2 Mammea B/BA, R1 Mammea B/BB, R2 Figura 9. Compuestos qumicos aislados de hojas de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 1). (Reyes-Chilpa et al. 2004). 39 (+)- Calanlido A (-)- Calanlido B (-)- Calanlido C cido apetalico Figura 10. Compuestos qumicos aislados de hojas de Calophyllum brasiliense (quimiotipo 2) (Huerta-Reyes et al. 2004). Las xantonas de la madera de C. brasiliense inhiben en un rango de 21-83% el crecimiento del micelio de Postia placenta, un hongo xilfago comn (Reyes et al. 1997). Adems, el cidoapetalico,uncompuestoaisladodelashojas,presentactividadcontrahongos fitopatgenosCurvularialunatayRhizoctoniarepensAguilar-Bauelos(2005).Enotro estudio,sedemostrquecompuestosaisladosdeextractosmetanlicosderaces,tallos, hojas,floresyfrutos,ensumayoratuvieronefectospositivosencontradebacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Pretto et al. 2004). Los extractos orgnicos de diversas especiesmexicanasfueronevaluadasparadeterminarsuactividadantimicrobiana, especficamentecontraEscherichiacoliyStaphylococcusaureus,seencontrquelas 40 mejores son cinco plantas, dentro de las que destaca C. brasiliense (Yasunaka et al. 2005). Por otra parte, en una evaluacin in vitro de Leishmania amazonensis, un protozoario que causaleishmaniosis,seencontrqueelcompuestoaisladomammeaA/BB,unacumarina deC.brasiliensetuvoactividadencontradeesteorganismoen50-90%(Brenzanetal. 2008,2007).Porlotanto,estosestudiosdemuestranelporqudelusotradicionalde extractosdelaplantaencontradeafeccionesantimicrobianas.Otroestudioreciente, relacionado a problemas gstricos, se demostr que los extractos de esta especie, evaluados en ratas de manera in vitro e in vivo, presentaron actividad contra la bacteria Helicobacter pylori, validando as el uso popular de esta planta para tratamientos antiulcerosos (Souza et al. 2009). 5.4. Cultivo in vitro del gnero Calophyllum Aunque el gnero Calophyllum pareceser una fuenteprometedora de frmacosanti-VIH, pocos trabajos se han realizado sobre estas especies en lo que a cultivos in vitro se refiere, e inicialmente fueron enfocado a estudios de micropropagacin debido a que la especie se encuentraenzonasrestringidas,aunadoaesto,laexplotacindebosques(NairySeni 2003), por lo que sus poblaciones y sus hbitat estn desapareciendo. En un estudio sobre micropropagacin estos mismos autores reportaron alta eficiencia y multiplicacin in vitro deC.apetalumquienesobtuvieronun85%supervivenciaexsitudelasplantas micropropagadas.EnotrotrabajorelacionadoenC.inophyllumtambinsehanobtenido resultadosfavorablesdemicropropagacin,delcualsehanobtenidoporcentajesde supervivenciahastadel72%encondicionesdecampo(Thenganeetal.2006).Porotra parte,debidoalaimportanciadestaplantaporsuspropiedadesmedicinalescontrael 41 VIH,sehanrealizadotrabajosrecientementesobrelaproduccindemetabolitos secundariosencultivoinvitrodelgneroCalophyllum.LosestudiosrealizadosenC. inophyllumfueronenfocadosalaproduccindedipiranocumarinasanti-VIHencultivos decalloycultivosdeclulassuspensinylosresultadosfueronprometedoresalobtener altascantidadesdeinofilumB,inofilumD,calofillido,inofilumA,inofilumP,yel inofilumC,con40.5,44.7,45.2,73.7,141.3y142.1mg/100gdepesofrescodecallo, respectivamente(Pawaretal.2007;PawaryThengane2009).Sinembargo,hastael momento no se han realizado trabajos sobre cultivos in vitro de la especie C. brasiliense. 6. JUSTIFICACIN Tanto en Mxico como el mundo, el VIH sigue aumentando ao tras ao, y la produccin de los frmacos para combatir el SIDA son cada vez ms costosos, lo que ha motivado a la exploracin de nuevos frmacos y mtodos para su produccin. Algunos estudios actuales seestnenfocandoalainvestigacindeproductosnaturalesdealgunasplantasque producen diversos compuestos para detener la infeccin por el VIH. La familia Clusiaceae, enespecialelgneroCalophyllumhatenidomayorrelevanciaporcontenercompuestos con buena actividad anti VIH-1 como son los calanlidos. Sin embargo, estudios realizados han demostrado que este tipo compuestos se encuentran en concentraciones muy bajas, por locual,serequierengrandescantidadesdemateriasecaparaobtenermnimascantidades (menosdel1%).Porotraparte,staespecieposeeamenazapotencialporladisminucin delapoblacindebidoadiferentesfactoresbiticosyfactoresabiticos.Lossistemas tradicionalesdeutilizarmedicamentosabasedeplantasmedicinas,estnaumentandoen todoelmundo.Estohadadolugaraunaenormepresinsobrelabiodiversidad,yla 42 destruccin de los biotopos de valor particular en los pases en desarrollo que participan en el cumplimiento de las exigencias de los mercados mundiales. La tecnologa del Cultivo de TejidoVegetalespodraserunaherramientatilparasuperarestaslimitacionesy proporcionar nuevos medios para la produccin de metabolitos secundarios. Recientemente se ha realizado un estudio sobre la produccin in vitro de distintos tipos de inofilum en C. inophyllum contra el VIH; sin embargo no existen estudios relacionados para la produccin de calanlidos, utilizando cultivo de tejidos de C. brasiliense. 7. OBJETIVOS 7.1. Objetivo general EstablecerlascondicionesparaelestablecimientodecultivosdecallodeC.brasiliense Cambes capaces de producir compuestos inhibidores del HIV-1. 7.2. Objetivos particulares Evaluardiferentestiposdeexplantes(hojasjuvenilesysemillasmaduras)parala induccin de callo. Evaluardistintosreguladoresdecrecimientovegetal(auxinas:ANA,AIB,2,4-Dy picloram;ycitocininas:KIN,BAPyTDZ)enlainduccindecalloencultivosdeC. brasiliense. Seleccionar lneas celulares de callos de C. brasiliense a partir de cultivos de ambos tipos de explantes.Identificar y cuantificar los metabolitos secundarios (calanlidos) inhibidores del VIH-1. 43 8. HIPTESIS C.brasilienseesunaplantaquedeformanaturalproducecalanlidos,metabolitos secundarios que poseen una fuerte actividad contra la reversa transcriptasa del VIH-1, por lo que se espera que los cultivos in vitro de callo de sta especie retengan la capacidad de sintetizar dichos metabolitos. 9. MATERIALES Y MTODOS 9.1. Material vegetal SecolectaronfrutosysemillasdeC.brasilienseCambes,enelmesdenoviembredel 2005,2006y2007enlaregindeLosTuxtlas,enlacomunidaddeLaLagunadel municipio de Catemaco, Estado de Veracruz, Mxico. Un muestra de la planta previamente identificada y registrada con el nmero 14425 se deposit en el herbario del IMSS (Huerta-Reyes et al. 2004). 9.2. Establecimiento de plntulas Lassemillassinendocarpioysintegumentofuerondesinfectadasconunasolucin fungicidadeBravo720(tetracloroisoftalonitrilo)al27%(v/v)duranteunahorayfueron germinadasbajocondicionesdesombraencontenedoresdeplsticoconagrolitaypeat mosscomosustratoaunarelacin1:1,respectivamente.Cuandolasplntulasalcanzaron entre10y15cmdealtura(aproximadamente3mesesdespus),setransfirieronabolsas negras de polietileno de 20 x 30 cm conteniendo una mezcla de agrolita, peat moss y tierra 44 negra (1:1:1). Las plantas se condicionaron y crecieron en el invernadero localizado en la Universidad Autnoma Metropolitana Campus Iztapalapa (UAM-I). Unavezquelasplantasseclimatizaronyempezaronacrecernuevosbrotes,lashojas inmaduras de aproximadamente 5 cmdelongitud se cortaron de la planta para ser usadas como recurso de explantes para el cultivo in vitro (Figura 11). Figura11.PlantajovendeC.brasiliensequemuestrahojasinmadurasusadasparael cultivo in vitro. 9.3. Evaluacin de medios de cultivo, antioxidantesSeevaluarondiferentesmediosdecultivocomoelMS(MurashigeySkoog1962),B5 (Gamborg et al. 1976), y WPM de Lloyd y McCown (1981), sin RCV (Tabla 1). Adems, seevaluarondiferentestiposdecompuestosconsideradoscomoantioxidantes:a)cido ctrico 100 mg l-1 + cido ascrbico 50 150 mg l-1, b) carbn activado 250 500 mg l-1, y c)polivinilpirrolidona(PVP)250500mgl-1.Loscultivosseincubaronencondiciones 45 de oscuridad total con luz (luz fluorescente blanca a 50 mol m-2 s-1) con un fotoperodo de 16 horas. Todos los tratamientos se hicieron con 4 repeticiones cada uno. 9.4. Condiciones aspticas Lashojasinmadurasysemillasmadurassedesinfectarondemanerasuperficialconuna solucinjabonosapor5min,seguidaporunainmersinenetanolal70%(v/v)por30s. Posteriormente,abajayconagitacinconstante,lashojasfueronsumergidasenuna solucin de hipoclorito de sodio al 0.6% (v/v) por 15 min, agregando tres gotas de Tween-20porcada100mldesolucinpreparada.Paralassemillasusadascomoexplantes,el tratamientodedesinfeccinfueuntantodiferente,stassesumergieronpor1henuna solucinfngicadeBravo720(tetracloroisoftalonitrilo)al27%(v/v),seguidoporuna inmersin de hipoclorito de sodio al 4.2% (v/v) durante 1 h.Posteriormente,enelinteriordeunacampanadeflujolaminar(Figura12),previamente desinfectada,ambostiposdeexplantesfueronlavadostresvecesconaguadestilada esterilizada.Unavezdesinfectados,losexplantessecortarondentrodecajaspetri conteniendo solucin antioxidante compuesta por cido ctrico y cido ascrbico (100 mg l-1 + 150 mg l-1, respectivamente). Las hojas se cortaron en segmentos de 5 x 5 mm, y las semillas se cortaron en cuatro secciones iguales. Despus, los segmentos se sumergieron en solucionesnuevasdeantioxidanteenvasosdeprecipitado,realizando3cambios peridicosdedichasolucindurante3o4minparaeliminarlamayorpartedelltex exudadoduranteloscortes.Finalmente,34explantessedepositaronenfrascostipo Gerber contenido 25 ml de medio de cultivo, previamente esterilizado. 46 Figura12.ExplantesdeC.brasilienseinmersosensolucinantioxidanteprevioala siembra: a) hojas, b) semillas. 9.5. Medio de cultivo y condiciones de incubacin ElmediodecultivoutilizadofueelWoodyPlantMdium(WPM)deLloydyMcCown (1981), el cual fue suplementado con 2 % de sacarosa (p/v), 10 mg l-1 de cido ctrico, 150 mg l-1 de acido ascrbico, 250 mg l-1 de PVP, y 0.18% de phytagel (p/v), (Sigma, St. Louis, MO, USA). Todos los cultivos se incubaron a 25 2C en oscuridad total. 9.6. Induccin de callo Parainducirlarespuestadecalloenlosexplantes,diferentesconcentracionesy combinaciones de RCV (citocinina y auxinas) se incorporaron al medio del cultivo: a) KIN (0.00, 0.46, 2.32, 4.65, 6.97, 9.30 y 11.63 M) + 2,4-D (0.00, 0.45, 2.26, 4.53, 6.8, 9.06 y 11.32 M) + ANA(0.00, 0.53, 2.68, 5.37,8.05, 11.74y 13.42 M);b) BAP (0.0,4.44 and8.88M)+AIB(9.80,19.60y29.40M);c)BAP(8.88M)+PIC(8.28,16.56y 24.84 M) + ANA (10.74, 21.48 y 32.22 M); y d) TDZ (0.04, 0.45, 4.54, 13.62 y 27.24 M). Finalmente, el valor del pH se ajust a 5.8, y el medio de cultivo se esteriliz a una b a 47 temperaturade121Cdurante18min.Losexplantesdehojasysemillasseevaluaron usando los tratamientos descritos arriba, con excepcin del inciso (a), que no fue evaluado enlosexplantesdesemilla.Paracadatratamientoseusarontresfrascos.Larespuestade induccindecallosoracesdesarrolladosdelosexplantes,seexpresaroncomoun porcentaje del total de los explantes evaluados despus de 6 o 9 semanas. Los tratamientos queindujeronlosmejoresporcentajesdecallosdeexplantesdesemillafueron seleccionadoscomolneascelulares,loscualessesiguieronsubcultivandoensus respectivosmediosdeinduccinyRCV.Lastransferenciasamediodecultivofueron realizadasenperiodosde15dasparalosprimeroscuatrociclosdesubcultivos, posteriormentelastransferenciassehicieroncadamesdurante10ciclos.Despusdelos ciclosdesubcultivo,serealizelanlisisporHPLCparacuantificarlaproduccinde metabolitos de los callos. 9.7. Preparacin de extractos y muestras para el anlisis por HPLC Las muestras frescas de hojas y callos se secaron a 60C en una estufa y posteriormente se pulverizaron.Lasmuestrassecas(500mg)seextrajeronusandocincociclosdehexano por 24 h a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras se filtraron, se mezclaron y seconcentraronbajopresinreducidaenunRotavapor(BuchiRE-111;Buchi Laboratoriums-TecnickAG,Flawil,Switzerland).Lasmuestrasconcentradassesecaron porevaporacindeldisolventerestanteatemperaturaambiente.Loscompuestosde referenciacalanlidoB,calanlidoCycidoapetlicofueronproporcionadosporelDr. RicardoReyesChilpadelInstitutodeQumicadelaUNAM.Antesdeiniciarelanlisis por HPLC, se prepararon soluciones de 0.75 mg ml-1 de los compuestos de referencia con 48 acetonitrilo (3 mg/4 ml). Adems, con el fin de obtener la curva de calibracin, se hicieron dilucionesdecadaunodeloscompuestosdereferenciapreparados(10,25,50y100mg ml-1). Cada muestra de biomasa extrada de callos provino de un frasco. Mientras que para lasmuestrasdelashojasdelasplantasdeinvernaderosetomaron3hojasdiferentespor cada repeticin. Ambos tipos de muestras con un total de 3 repeticiones. 9.8. Anlisis por HPLC ElcontenidodecalanlidoB,calanlidoCycidoapetlicosedeterminenunequipo WatersHPLCequipadoconunabombabinaria1525(WatersCo.,MA,EE.UU),una columna C18 kromasil (250 x 3 mm, tamao de partcula 5 m) y un detector de absorcin dedoblelongituddeonda(2487DWAD)(WatersCo.,MA,USA).Lafasemvil consistideunamezcladeacetonitrilo(60%)yagua(40%),lacualsebombeo isocrticamentedurante45minaunflujode1mlpormin.Ladeteccinserealiz utilizandounalongituddeondade284nmconDWAD.Elvolumendeinyeccinfuede 20 l. Las muestras y los compuestos de referencia se analizaron de la misma forma. Cada solucin preparada se pasaron por un filtro de nylon de 0.45 m (Acrodisc, 25 mm Syringe Filter),antesdeserinyectada.Paraprocesarlosdatoscromatogrficosseuselsoftware Waters Breeze 3.3. Para identificar y cuantificar los calanlidos y el cido apetlico de las muestras, se utilizaron los datos de los respectivos tiempos de retencin y las reas de los picos de las curvas de calibracin. Cada muestra se inyect tres veces. 49 9.9. Anlisis estadstico Para el anlisis estadstico se us el software SAS 9.0 (SAS Institute Inc, 2002). Los datos obtenidosdelosporcentajesdeinduccincallosylacuantificacindecalanlidosyel cido apetlico se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA), seguido por una prueba decomparacindemediasmltipleTukey-Kramer.LosvaloresdePmenoresde0.05se consideraroncomosignificativos.Cadatratamientoserealizconalmenostres repeticiones. 10. RESULTADOS Y DISCUSIN10.1. Establecimiento de plntulas Se estima que los frutos colectados tenan aproximadamente un mes de maduracin, puesto que tenan una coloracin amarillenta (caracterstica demadurez). Adems,otra cantidad desemillas(sinmesocarpio)fueronrecolectadasdirectamentedelsuelo.Estas caractersticaspudieronhaberinfluidoenelbajoporcentajedegerminacinobtenido (36%). Por otra parte, se menciona que las temperaturas en donde se desarrolla sta especie oscilanentre25y28C(Flores2002).Adems,paraobtenerunamejorgerminaciny establecimientodeplntulasdeC.brasilienselatemperaturaoptimadebeserde30C (Neryetal.2007).Estemismoautormencionaquelascubiertasseminalescomoel endocarpo y/o el tegumento no influyen estadsticamente en la germinacin, pero hay una tendencia a reducirla si la semilla es sembrada con alguno de estas cubiertas. En relacin a esto, las semillas en el presente trabajo fueron sembradas sin cubiertas seminales, pero no hubo un control sobre las temperaturas en el invernadero, lo que cual pudo tambin haber influido en el porcentaje de germinacin. 50 Laemergenciaradicularocurriaproximadamentealos20dasyelepicotiloaparecia los 44 das despus de la siembra como se muestra en la Figura 13. Figura13.EstablecimientodeplntulasdeC.brasilienseeninvernadero.a)semillasin cubierta, b) emergencia radicular a los 20 das, c) emergencia epicotiledonar a los 44 das, d) plntulas de 3 meses de edad, y e) plntulas de un 1 ao de edad. 10.2. Evaluacin de compuestos antioxidantes y medios de cultivo Duranteelestablecimientodecultivosaspticos(sinreguladoresdecrecimiento),se observ una apariencia de color marrn oscuro en todos los explantes despus de 1 semana del cultivo. A las dos semanas, todos los explantes murieron. Para tratar de disminuir este problema,serealizaronsubcultivosfrecuentes.Sinembargo,estatcnicanoevit completamente el problema de oxidacin de los explantes, tal como lo encontrado por Fett-Neto et al. (1992). El cido ctrico y cido ascrbico, se usan como antioxidantes, en tanto ab cde51 que el carbn activado, posee una red muy fina de poros, con una gran superficie interna, en la cual puede absorber todo tipo de sustancias como son: pigmentos txicos, marrones, y negros (compuestos de tipo polifenol oxidados y taninos), pero tambin puede absorber a los RCV, vitaminas, y algunos minerales como Zn, Fe, etc. Las concentraciones de uso del carbnactivadovande0.2-3%p/v(Pierik1990).ElPVPesunpolmero,quealser adicionadoalmedioenconcentracionesde250-1000mgl-1absorbesustanciasdetipo fenlico (Johansson 1983; Tomas 2008). Se observ una clara diferencia de los tratamientos, siendo la condicin de oscuridad en la quesepresentlamayorsupervivenciadelosexplantes,principalmentecuandose adicionaron 250 mg l-1 de PVP al medio de cultivo, obteniendo un 87.5% de supervivencia (Figura14).Esprobablequelosmetabolitossecundarios,comolascumarinas,uotros compuestos producidos por C. brasiliense, hayan sido liberados de la vacuola debido a las heridasdelahoja(Buchananetal.2000,loquepudosertoxicoalosexplantes;Wink 1997). Se sabe tambin que, las condiciones de crecimiento ptimo de los cultivos in vitro dependen de las condiciones nutricionales, y que pueden variar entre especies (Bhojwani y Razdan 1983). En cuanto a los medios de cultivo utilizados, se observ que el WPM fue el que tuvo el mejor efecto sobre el crecimiento de los explantes. Estos explantesmostraron unaspectoliso,suave,conalargamientoymantuvieronsucoloracinverdosa.Porel contrario, en los explantes cultivados en los otros medios de cultivo (B5 y MS), se observ unaspectoduro,quebradizoysincrecimientooalargamiento.Porlotanto,elWPMse seleccion como el medio de cultivo ms apropiado para C. brasilienseen la induccin de callo con RCV. Estos resultados son similares a los publicados por Pawar et al. (2007) en C.inophyllumquienencontrqueconelWPMencontrunamejorrespuestaenla induccin de callos. 52 31.3 bc31.3 bc 31.3 bc25.0 c50.0 a37.5 b25.0 c62.5 b50.0 c37.5 d37.5 d62.5 b87.5 a50.0 c0.010.020.030.040.050.060.070.080.090.0100.0Testigo A. citrico + A. ascorbico (100+50)A. citrico + A. ascorbico (100+150)Carbn activado (250)Carbn activado (500)PVP (250) PVP (500)Sobrevivencia de explantes (%)Compuestos antioxidantes (mg l-1)Luz Oscuridad Figura14.PorcentajedesobrevivenciadeexplantesdehojadeC.brasiliensecon diferentescompuestosantioxidantesycondicionesdeincubacin.Media+DSconla misma letra en barras del mismo color no son estadsticamente diferentes al nivel de 5% de probabilidad. 10.3. Induccin de cultivos callo CuandoseanalizelefectodeRCV,seobservqueeltratamientodelcontrol(sin reguladores de crecimiento), no tuvo induccin de callo o alguna respuesta en los explantes dehojaodesemilla,loscualesseobservarondeaspectoquebradizoysincrecimiento (Figura15a,16a),entantoqueotrostratamientosconRCVindujeronrespuestaacalloy en algunos indujeron rizognesis directa. En los explantes de hoja, los tratamientos donde se combin KIN + (2,4-D ANA) favorecieron la induccin de callo a partir de los 40 das de cultivo. El tratamiento con KIN + 2,4-D indujo un callo verde friable, que se observ en toda la superficie de los explantes de hoja (Figura 15b). Despus de 2 semanas, las callos 53 se tornaron de un aspecto amarillento (Figura 15c). El tratamiento con KIN + ANA indujo uncallodeaspectocompactoyblanco(Figura15d)oraz(Figura15e)enlosbordesde corte del explante. En tanto que la races inducidas de los explantes de hoja dieron origen a callo semifriable de color caf, (Figura 15f) despus de 3 semanas (61 das de cultivo). Figura 15. Respuestas inducidas de callo y raz en explantes de hoja de C. brasiliense, bajo tratamientosdeRCV:a)Explantessinreguladores(control);b)calloverdosofriable inducido deexplantes de hoja con KIN 4.65M+ 2,4-D 4.53 M despus de 40 dasde cultivo;c)callodesarrolladoapartirde(a),dossemanasdespus;d)callocompacto;e) rizognesis directa en explantes de hoja con KIN 0.46 M + ANA 5.37 M, despus de 40 das de cultivo; f) callo semifriable desarrollado a partir de (e), tres semanas despus. Entrminosgenerales,lasauxinas2,4-DoANAtuvieronunmayorefectoquelas citoquininas sobre la induccin de callo en los explantes de hoja (Tabla 4). Por otra parte, cuando se compar el efecto de la induccin de callo entre las auxinas 2,4-D y ANA, no se encontraron diferencias estadsticas entre stas. En las tres concentraciones bajas de 2,4-D o ANA (0.45, 2.26 y 4.53 M o 0.53, 2.68 y 5.37 M, respectivamente), evaluadas como la cde fb a 54 nicafuentedeRCV,losexplantesdehojamostraronunainduccindecallode50-67% (Tabla4).CuandoseevaluaronlastresconcentracionesmsbajasdeKIN(0.46,2.32y 4.65M)sinauxina,huboporcentajesdeinduccindecallode29-35.25%enlos explantesdehoja(Tabla4).Estosresultadospuedendebersealhechodequelasauxinas estn implicadas en muchos aspectos del proceso de crecimiento y desarrollo de las plantas (Benjamins y Scheres 2008; Vanneste y Friml 2009). El tratamiento con 4.65 M de KIN tuvounainfluenciasignificativaenlaformacindecallo,unarespuestaqueocurrien cadaconcentracinevaluadadelaauxina2,4-D(Tabla4).Sinembargo,lainduccinde callo ms alta (80.67%) se obtuvo cuando la KIN se combin con ANA en concentraciones de0.46My5.37M,respectivamente(Tabla4).Adems,estoscallosmostraronun mejordesarrolloquealosobtenidosconlostratamientosdeKIN+2,4-D(Tabla4).Los tratamientos con KIN + (2,4-D ANA) que indujeron los mayores porcentajes de callo en explantesdehojafueronevaluadosparalosexplantesdesemilla,sinembargo,nose observningunarespuesta.Seesperabaquelosexplantesdesemillaprodujeran significantes porcentajes de induccin de callocomo se observ en los explantes dehoja, ya que las clulas pertenecientes a las semillas estn menos diferenciadas que las de hojas. Debidoa lainsatisfactoria respuestade induccin obtenidasen losexplantes de semilla y debidoalescasomaterialvegetal,nosehicieronmsintentosconelrestodelos tratamientos de KIN, 2,4-D y ANA (inciso a). 55 Tabla4.PorcentajedeinduccindecalloenexplantesdehojasinmadurasdeC. brasilienseCambescondiferentesconcentracionesycombinacionesdeKINy2,4-D KIN y ANA despus de seis semanas de cultivo. RCV (M) Induccin de callo (%) RCV (M) Induccin de callo (%) KIN2,4-DANA 00 0.00 0.00k00.00 0.00k00.4552.84 4.01fg0.53 54.25R 6.01fg 02.2667.00 0.00bcd2.6862.50 5.89de 04.5350.00 0.00fg5.37 50.00 0.00fg 0.46029.00 5.66ij029.00 5.66ij 0.460.4571.00 5.66bc0.53 50.00 0.00fg 0.462.2652.84 4.01fg2.68 64.00 3.77cd 0.464.5347.17 4.01g5.37 80.67R 3.77a 2.32035.25 3.18hi035.25 3.18hi 2.320.4566.85 0.24bcd5.37 37.34 6.13h2.322.2662.67 6.13de8.0550.00 0.00fg2.329.060.00 0.00k11.74 25.00 0.00j 2.3211.320.00 0.00k13.4257.00 1.88ef 4.65033.00 0.00hi0 33.00 0.00hi4.650.4552.67 3.77fg0.530.00 0.00k 4.652.2664.75 3.18cd2.680.00 0.00k 4.654.5372.34 2.12b5.370.00 0.00k 4.656.8050.00 0.00fg8.0557.00 1.88ef 4.659.0629.00 5.66ij11.74 0.00 0.00k 4.6511.3237.34 6.13h13.4250.00 0.00fg 6.974.5337.34 6.13h0.53 25.00 0.00j 6.976.8025.00 0.00j2.6864.75 3.18cd6.979.0625.00 0.00j5.3764.75R 3.18cd 6.9711.3225.00 0.00j11.7450.00 0.00fg 9.300.45 66.84 0.24bcd2.68 0.00 0.00k 9.302.26 66.84 0.24bcd5.370.00 0.00k 9.304.5357.00 1.88ef8.050.00 0.00k 9.306.8037.34 6.13h11.7425.00 0.00j 11.624.5337.34 6.13h0.5337.50 5.89h 11.626.8025.00 0.00j2.68 67.00 0.00bcd 11.629.0625.00 0.00j5.3764.75R 3.18cd Solo se presentan los tratamientos que fueron capaces de inducir la formacin de callo. Las combinaciones usadas de KIN y 2,4-D ANA fueron establecidas usando un diseo factorial (7x7x2). Media+DSconlamismaletraenlascolumnasnosonestadsticamentediferentesalnivelde5%de probabilidad; media seguida por el superndice "R"indica que el callo inducido se desarrollo de raz. 56 Debido a que ninguna investigacin sobre cultivos de tejidos vegetales para la produccin demetabolitossecundarioshasidoreportadaenCalophyllumbrasiliense,lacitocinina KIN,ylasauxinas2,4-DyANAfueroninicialmenteseleccionadasparalainvestigacin decallo,debidoaquesonlosmsactivosycomnmentesonempleadosparaestablecer cultivosdetejidos(Staba1982).Sinembargo,stosprimerosresultados,nofuerontan satisfactorios como se esperaba. Estos callos, desarrollados a partir de los tratamientos que generaronelmayorporcentajedeinduccin(KIN0.46M+ANA5.37M),mostraron uncrecimientolentocuandosesubcultivaron.Porlotanto,sedecidiestablecer tratamientos con otros RCV utilizando tambin combinaciones de citocininas y auxinas [b) BAP + AIB, c) BAP + PIC o ANA, y d) TDZ] para evaluar explantes de semilla y hoja. De acuerdo a los nuevos tratamientos (b c) utilizados para la induccin, el callo apareci en toda lasuperficie delos explantes de hoja ysemilla. Deigualforma, la respuestaocurri despus de los 40 das de cultivo en los explantes de hoja, y se desarroll un callo blanco y compactosimilaraloobservadoenlostratamientosconKIN+ANA(Figura15d), mientras que en los explantes de semilla inicialmente se form un callo blanco y friable a los10das(Figura16b),ydossemanasdespus(aproximadamente20dasdeiniciodel cultivo)sevolvideuncolormsamarillento(Figura16c)ydespusde30das,stese torno a un color caf claro y de aspecto semifriable (Figura 16d). 57 Figura16.RespuestasinducidasdecalloenexplantesdesemilladeC.brasiliense,con BAP 8.88 M + PIC 24.84 M.a) Explante sin reguladores (control); b) a los 10 das; c) a los 20 das; y d) despus 30 das de cultivo, respectivamente. Los tratamientos con BAP + AIB (tratamientos b) mostraron una induccin de callo pobre, ysepresentsloendost