Appl. Sci. 2020, 10, 1710; doi:10.3390/app10051710  www.mdpi.com/journal/applsci 

Article 

Cancer  Stem  Cell  Target  Labeling  and  Efficient Growth Inhibition of CD133 and PD‐L1 Monoclonal Antibodies  Double  Conjugated  with  Luminescent Rare‐Earth Tb3+ Nanorods 

Thi Thao Do 1,2,3,*, Nhat Minh Le 4, Trong Nhan Vo 4, Thi Nga Nguyen 4, Thu Huong Tran 3,5   

and Thi Kim Hue Phung 2,4 

1  Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet Road,   

Hanoi 10000, Vietnam 2  Institute of Health Research and Educational Development in Central Highlands, Gia Lai 61000, Vietnam; 

whitelily109@gmail.com 3  Graduate University of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang 

Quoc Viet Road, Hanoi 10000, Vietnam; tthuongims@gmail.com 4  Hung  Vuong  Gifted  High  School,  Gia  Lai  61000,  Vietnam;  luciuslee68@gmail.com  (N.M.L.); 

nhanvo283@gmail.com (T.N.V.); nguyenngaibt@gmail.com (T.N.N.) 5  Institute of Materials Science, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet Road, 

Hanoi 10000, Vietnam 

*  Correspondence: thaodo74@yahoo.com; Tel.: +84‐24‐38361774 

Received: 22 January 2020; Accepted: 26 February 2020; Published: 2 March 2020 

Abstract: Rare‐earth nanomaterials are being widely applied in medicine as cytotoxicity agents, in 

radiation  and  photodynamic  therapy,  as  drug  carriers,  and  in  biosensing  and  bioimaging 

technology. Terbium (Tb), a rare‐earth element belonging to the lanthanides, has a long luminescent 

lifetime, large stock displacement, narrow spectral width, and biofriendly probes. In cancer therapy, 

cancer  stem  cell  (CSC)‐targeted  treatment  is  receiving  considerable  attention due  to  these  cells’ 

harmful characteristics. However, CSCs remain barely understood. Therefore, to effectively  label 

and inhibit the growth of CSCs, we produced a nanocomplex in which TbPO4∙H2O nanorods were 

double conjugated with CD133 and PD‐L1 monoclonal antibodies. The Tb3+ nanomaterials were 

created  in the presence of a soft  template  (polyethylene glycol 2000). The obtained nanomaterial 

TbPO4∙H2O was hexagonal crystal and nanorod in shape, 40–80 nm in diameter, and 300–800 nm in 

length.  The  nanorods  were  further  surfaced  through  tetraethyl  orthosilicate  hydrolysis  and 

functionalized  with  amino  silane.  Finally,  the  glutaraldehyde‐activated  Tb3+  nanorods  were 

conjugated with CD133 monoclonal antibody and PD‐L1 monoclonal antibody on  the surface  to 

obtain  the  nanocomplex  TbPO4∙H2O@silica‐NH2+mAb^CD133+mAb^PD‐L1  (TMC).  The  formed 

nanocomplex was able to efficiently and specifically label NTERA‐2 cells, a highly expressed CD133 

and  PD‐L1  CSC  cell  line.  The  conjugate  also  demonstrated  promising  anti‐CSC  activity  by 

significant inhibition (58.50%) of the growth of 3D tumor spheres of NTERA‐2 cells (p < 0.05). 

Keywords: cancer stem cells; CD133 mAb; ion Tb3+; nanorod; NTERA‐2; PD‐L1; TMC 

 

1. Introduction 

In recent years, cancer studies have involved the consideration of cancer stem cell (CSC) theory. 

CSCs  are  a  subpopulation  of  cells  in  tumors  that  have  self‐renewal,  differentiation,  and 

tumorigenicity  abilities  [1].  These  cells  are  related  to  therapy  drug  resistance,  metastasis,  and 

recurrent cancer [2]. The identification of CSCs is based on typical cellular surface markers, such as 

Cluster  of Differentiation  133  (CD133), CD44, CD24,  and Aldehyde dehydrogenases  (ALDH),  of 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  2  of  11 

which CD133 appears in various types of cancer cells in solid tumors. This glycoprotein is among the 

most  popular markers  for  isolation  of  CSCs  [3].  CD133,  also  known  as  prominin‐1,  is  a  cross‐

membrane  glycoprotein.  Evidence  has  shown  that  CD133  might  be  related  to  metastasis, 

tumorigenesis, and drug resistance. Therefore, CD133 is used not only as a specific surface antigen 

to detect and isolate CSCs, but also in therapeutic strategies [4]. 

Another typical feature of CSCs is immunosurveillance resistance [5]. Programmed death‐ligand 

1 (PD‐L1) is also reported as a CSC surface marker which blocks PD‐1 on the surface of T cells. Thus, 

PD‐L1 limits the response of T cells, helping CSCs to escape the immune system for their growth and 

metastasis [6]. Since 2014, PD‐L1 monoclonal antibody has been clinically approved for anticancer 

immunotherapy worldwide. 

CD133  and  PD‐L1  antibodies  are  reported  to  have  the  ability  to  detect  and  treat  cancers, 

especially when combined with nanomaterials. Nanomaterials have improved the therapeutic index 

of  clinical  drugs  by  enhancing  circulation  time  and  increasing  permeability  and  retention  [7]. 

Nanomaterials help with probing, tracking, homing, and studying CSCs’ behavior. In this area, rare‐

earth nanomaterials such as Terbium (Tb), a lanthanide, have attracted considerable attention. The 

advantages of lanthanide compounds include long luminescence lifetime, large stock displacement, 

and narrow spectral width, which are useful for fluorescent marking, probes, and sensors for use in 

tests and human body imaging [8]. Nanoscale lanthanides are highly stable, and it is easy to fabricate 

and functionalize their surfaces using biological substances such as antigens, monoclonal antibodies, 

enzymes, and aptamers. These molecules can be used to improve therapeutic efficacy or for locating 

nanoparticles  in vivo. Therefore,  in  this study, Tb3+ was used to produce nanomaterials  to double 

conjugate with the monoclonal antibodies against CD133 and PD‐L1 for the purpose of biolabeling 

and growth  inhibition of  cancer  stem  cells, which were NTERA‐2 pluripotent human  embryonic 

carcinoma cells. 

2. Materials and Methods 

2.1. Materials 

Cultured Dulbecco’s Modified  Eagle Medium  (DMEM),  fetal  bovine  serum  (FBS),  Trypsin‐

EDTA, and antibiotics (antibiotics/antimycotics) were received from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). 

Human CD133 monoclonal antibody, PD‐L1 monoclonal antibody, and CD133 antibody conjugated 

with FITC (CD133‐FITC) were sourced from Thermo Fisher (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA). Other 

chemicals were provided by Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). 

2.2. Preparation of TbPO4.H2O@silica‐NH2 Nanomaterials   

Terbium orthophosphate monohydrate (TbPO4∙H2O): Tb(NO3)3∙5H2O (Sigma, 99.9 %) was added 

to NH4H2PO4 solution (Merck) in the presence of polyethylene glycol 2000 (PEG‐2000) and stirred for 

3–12 h. The pH of the obtained solution was adjusted  in the range of 4–12 by adding 10% NaOH 

solution before incubating at 200 °C for 24 h. The product (TbPO4∙H2O) was centrifuged at 5900 rpm 

and washed with ddH2O before drying at 60 °C for 5–10 h. The nanomaterial was then coated with 

silica through a hydrolysis reaction with tetra ethyl orthosilicate (TEOS) (Aldrich, 99.99%). Briefly, 

TbPO4∙H2O was added to a mixture solution containing TEOS, ethanol, acetic acid, and water and 

stirred for 15 min (TbPO4/TEOS molar ratio of 1:0.2). The solution was then centrifuged and washed 

three times with 33% ethanol solution. Glycerol solution (0.5 mL) was added to a hydrous mixture of 

ethanol  containing  TbPO4∙H2O  coated  silica  (TbPO4∙H2O@silica)  and  stirred  for  30  min.  3‐

aminopropyl  trimethoxy  silane  (APTMS)  was  dispersed  in  ethanol  before  being  mixed  with 

TbPO4∙H2O@silica solution (TbPO4∙H2O@silica/APTMS molar ratio of 1:0.2) and stirred for 15 min to 

functionalize the surface with  ‐NH2. The TbPO4∙H2O@silica‐NH2 (TM) materials were washed  two 

times with ethanol, two times with ddH2O, and finally dispersed in phosphate buffer saline (PBS) 

(1X, pH 7). 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  3  of  11 

2.3. Conjugation of TbPO4∙H2O@silica‐NH2 Nanomaterials with CD133 Monoclonal Antibody and PD‐L1 

Monoclonal Antibody (mAb)   

The TbPO4∙H2O@silica‐NH2 nanomaterial  in  sodium phosphate  solution was gently vortexed 

before  adding  0.5%  glutaraldehyde  solution  in  a  ratio  of  1:0.5  (v/v)  and mixed  for  1  h  at  room 

temperature (RT) to disperse completely. The mixture was centrifuged and washed three times with 

PBS solution to remove glutaraldehyde. Then, 40 μg of CD133 antibodies (Thermo Fisher, Invitrogen, 

Carlsbad, CA, USA) was added into the 400 μL glutaraldehyde pre‐activated TbPO4∙H2O@silica‐NH2 

and incubated at 37 °C for 30 min. After incubation, the suspension was centrifuged at 6000 rpm for 

5 min at 4 °C; the supernatant was retained to determine the amount of unconjugated antibodies in 

the combined efficiency study. The TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133 residue after rinsing with 

PBS three times was continuously conjugated with mAb^PD‐L1 by adding 40 μg of this PD‐L1 mAb 

at 37 °C for a further 30 min. After a centrifuge step at 6000 rpm for 5 min at 4 °C, the supernatant 

solution  was  retained  to  determine  the  conjugation  efficiency.  The  PBS  washing  residue  of 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133‐mAb^PD‐L1  (TMC)  nanocomplex was  reconstituted  in  PBS 

and stored at 4 °C before being used for further experiments. 

Conjugation efficiency was measured through the indirect detemination of unbound IgG in the 

supernatant after combining mAb with nanomaterials using a NANOPHOTOMETER P300 system 

(IMPLEN.INC., USA). The conjugated efficiency was calculated using the following fomula: 

CE% = 100% − 

× 100.  (1) 

2.4. Characterization of the Obtained Nanocomplex 

The morphology of nanomaterials was observed by field emission scanning electron microscopy 

(FESEM, Hitachi). The structure of the material was determined using an X‐ray diffraction measuring 

system (Siemens D5000 with  = 1.5406 Å, diffraction angle in the range of 15° ≤ 2 ≤ 75°). Infrared spectra  of  the  samples  were  measured  on  a  NICOLET  impact  410  Fourier  transform  infrared 

spectrometer (FTIR). The fluorescence spectrum of the product was measured at a wavelength of 355 

nm by using the Horiba Jobin Yvon IHR 320 (USA) system at Hanoi Polytechnic University, and some 

samples were measured on the Horiba Jobin Yvon IHR 550 system (USA) at the Institute of Materials 

Science, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST). 

2.5. Cell Culture 

In this study, the NTERA‐2 cell line, which is a pluripotent human embryonic carcinoma cell 

line, served as CSCs and CCD‐18Co cells (the human colon normal) were used as healthy cells. These 

cell lines were kindly provided by Dr. P. Wongtrakoongate, Mahidol University, Thailand and Prof. 

Chi‐Ying Huang, National Yang‐Ming University, Taiwan. Cells were maintained in DMEM medium 

supplement with  10%  fetal  bovine  serum  and  1%  antibiotics  (antibiotics/antimycotics  solution, 

Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in incubator at 37 °C, 5% CO2, and 100% humidity. 

2.6. Observing and Imaging TMC‐Nanocomplex‐Labeled Cells 

Cells at log phase were seeded into 96‐well plates with a concentration of 10,000 cells/well and 

incubated at 37 °C, 5% CO2 for 24 h. The culture medium was removed, then cells were fixed with 

10% formaldehyde for 10 min at RT. TMC nanocomplex (10 μL) was dilluted in 190 μL of PBS before 

it was added into each well and incubated at 4 °C for 1 h. The unbound TMC were removed and 

washed with PBS three times. At the end of the process, PBS was added to the wells before the cells 

were observed under an Olympus Scan ^R fluorescence microscope (Olympus Europa SE & Co.KG, 

Hamburg, DE). 

 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  4  of  11 

2.7. Detecting the TMC‐Nanocomplex‐Labeled Cells by Flow Cytometry 

NTERA‐2  cells  and  CCD‐18Co  cells  at  log  phase  were  harvested  with  trypsin‐EDTA  and 

collected into a Falcon tube. Cells were re‐suspended with DMEM medium containing 2% FBS and 

separated into several tubes, then TMC nanocomplex was added to the cells and incubated at 4 °C 

for at  least 15 min and protected  from  light. After that, cells were washed  three time with PBS to 

remove the unbound TMC. The cells incubated with CD133 mAb conjugated FITC (Thermo Fisher, 

Invitrogen;  Carlsbad,  CA,  USA)  served  as  a  reference  control.  The  numbers  of  labeled  and 

luminescent cells in 10.000–12.000 counting cells were measured and analyzed using the Novocyte 

flow cytometry system and NovoExpress software (ACEA Bioscience Inc.). 

2.8. TMC Cytotoxicity Determination 

MTT  ((3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazolium  bromide  )  assay  was  used  for 

measurement  of  the  cytotoxic  activity  of  the  TMC  nanocomplex.  This method  is  based  on  the 

formation of formazan by MTT relating to the effectiveness of enzymatic activities in viable cells [9]. 

Briefly,  cells were  seeded  in  96‐well  plates  (10,000  cells/well)  and  treated with TMC  at  various 

concentrations of corresponding 0.08, 0.4, 2, or 10 μg/mL of PD‐L1 mAb amounts, for 72 h at 37 °C, 

5% CO2. The experiments were performed in triplicate to ensure accuracy. Then, 10 μL fresh MTT (5 

mg/mL) was added to the each well of the experimental plate and incubated at 37 °C. After 4 h, all 

medium was discarded and the formazan crystal formations were dissolved by adding 50 μL/well 

DMSO 100%. The OD values were measured at 540 nm using a spectrophotometer (BioTek, ELx800). 

The number of surviving cells was calculated by the formula: 

% survival = 

100.  (2) 

2.9. Effective of TMC on the Growth of Tumor Spheroids Co‐Cultured with Macrophages 

Macrophages were isolated from the peritoneum of healthy BALB/c mice using a Macrophage 

mouse  Isolation Kit  (Peritoneum)  (Miltenyi Biotech., Bergisch Gladbach, Germany). The  isolation 

cells were cultured in DMEM containing 10% FBS, 1% antibiotics and incubated at 37 °C and 5% CO2. 

In order to form 3D tumor spheroids, the hanging drop method was used. NTERA‐2 cells (1500 

cells) in 20 μL medium were dropped onto the underside of the lid of a 60 mm tissue culture dish. 

The lids were then inverted onto 5 mL medium‐filled bottom dishes and incubated at 37 °C, 5% CO2, 

95% humidity. After 3 days of incubation, cell aggregates were formed. 

The obtained spheroids were then co‐cultured with macrophages in 96‐well plates. Wells were 

covered by 1% agarose before spheroids were transferred to the wells. The macrophage cells were 

then co‐cultured with the spheroids in the wells. The TMC treatment was executed by directly adding 

TMC  into  the  co‐culture wells  and  further  incubating  for  3 days. The  growth  of  spheroids was 

observed under microscopy. The  images were  analyzed using  ImageJ  software  to determine  the 

growth area of the spheroids and to compare with the negative control. 

2.10. Statistical Analysis 

The data are reported as mean ± standard deviation (SD), which were analyzed using GraphPad 

Prism 7 software and unpaired t‐tests. p < 0.05 was considered to indicate statistical significance. 

3. Results 

3.1. Characteristics of the Synthesiszed Nanomaterials   

The morphologies of nano TbPO4∙H2O and TMC are presented  in Figure 1. From  the FESEM 

images, TbPO4∙H2O formed nanorods with diameter 30–40 nm and length 300–800 nm. After coating 

with silica, surfacing with –NH2, and conjugating with mAb, the diameter of the complex slightly 

increased to 40–80 nm, but the length remained at 300–800 nm. 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  5  of  11 

 

(a) 

 

(b) 

 

(c) 

Figure  1.  FESEM  images  of  the  produced  nanomaterials:  (a)  TbPO4∙H2O  nanorods,  (b) 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2; (c) TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133‐mAb^PD‐L1 nanocomplex (TMC). 

The designed TbPO4∙H2O nanorods were also typical hexagonal crystals, as proven by the X‐ray 

diagram (Figure 2). 

10 20 30 40 50 60

PDF 20 - 1244

Inte

nsit

y (a

.u.)

2- Theta (degree)

PDF 20 - 1244

TbPO4.H

2O

 

Figure  2. The X‐ray diagram of Terbium phosphate monohydrate hexagonal  crystals determined 

using an X‐ray diffraction measuring system (Siemens D5000 with  = 1.5406 Å, diffraction angle in the range of 15° ≤ 2 ≤ 75°). 

To be suitable for biological labeling, created nanomaterials must be strongly luminescent after 

design. Therefore, the fluorescence of the obtained nano TbPO4∙H2O and TMC was measured. The 

results in Figure 3 show that strong fluorescence levels of TbPO4∙H2O and TMC were excited at 355 

nm and emitted at 545 nm. They also exhibit that the main emission peaks of the TbPO4∙H2O product 

were at 488, 545, 586, and 620 nm, which correspond to the 5D4−7Fj (J = 6, 5, 4, 3) transitions of Tb3+ 

ions. These results are consistent with the data reported by Lien et al. [10]. 

 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  6  of  11 

450 500 550 600 650

(2)

5D4-

7F3

5D4-

7F4

5D4-

7F5

5D4-

7F6

Inte

nsity (a

.u.)

Wavelength (nm)

(1) TbPO4.H

2O

(2) TbPO4.H

2O@silica-NH

2

(1)

 

Figure 3. Fluorescence spectra of excitation at 355 nm of TbPO4∙H2O incubated at 200 °C for 24 h (1) 

and TbPO4∙H2O@silica‐NH2 coated with a silica layer attached to NH2 groups (2). 

The  FTIR  spectra  of  TbPO4∙H2O,  TbPO4∙H2O@silica‐NH2,  TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb  are 

shown in Figure 4. Curve (a) is the FTIR spectrum of TbPO4∙H2O. Curves (b) and (c) (corresponding 

to  the  products  TbPO4∙H2O@silica‐NH2  and  TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb,  respectively)  have  the 

same profile as curve (a), which indicates strong absorption in the region 770–600 cm−1. The two peaks 

at 660 and 600 cm−1 are typically attributed to the Tb‐O and PO43‐ vibrations, respectively. In Fig. 4, 

curve (a), we can also observe oscillations of the O‐H bond at around 1600 cm−1 and near 3600 cm−1. 

In curves (b) and (c), the unique absorption peaks from internal vibration of the amino bands (1642 

cm−1) and the strong absorption band (3443 cm−1) from symmetric and asymmetric N–H stretching 

vibration can be observed, which demonstrate the appearance of APTMS and mAb on the obtained 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2 and TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb. The strong absorption band in the region 

1000–950 cm−1 (two peaks at 1008 and 950 cm−1) arises from Si‐O‐Si asymmetric vibration. Thus, it can 

be suggested that conjugation (linkage) between luminescent nanorods and mAb was formed in the 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb nanocomplex. 

3000 2000 100040

60

80

100

Tra

nsm

itta

nce

(%

)

Wavenumber (cm-1)

TbPO4.H2O

 (a) 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  7  of  11 

3000 2000 100040

60

80

100TbPO4.H2O@silica-NH2

Tra

nsm

itta

nce

(%

)

Wavenumber (cm-1) 

(b) 

3000 2000 100040

60

80

100TbPO4.H2O@silica - NH2 - mAb

Tra

nsm

itta

nce

(%)

Wavenumber (cm-1)

(c) 

Figure 4. The FTIR spectra of TbPO4∙H2O (a), TbPO4∙H2O@silica‐NH2 (b), and TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐

mAb (c) obtained using a NICOLET impact 410 Fourier transform infrared spectrometer. 

3.2. Probing NTERA‐2 and CCD‐18Co Cells with TMC Nanocomplex 

 As  presented  in  Table  1,  the  CE  index,  which  reports  the  conjugation  efficiency  of 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2 nanorods with mAb against CD133 and PD‐L1, was high, ranging from 60% 

to 100%. 

Table 1. The conjugated efficiency of TbPO4∙H2O@silica‐NH2 nanorods with mAb against CD133 

and PD‐L1. 

No.  Samples Input 

mAb   

Free mAb in 

Supernatant CE 

1  TbPO4∙H2O@silica‐NH2 ‐CD133 mAb  40 μg  0  100% 

2  TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133‐mAb^PD‐L1  40 μg  8–16 μg  60%–80% 

To  evaluate  the  binding  ability  of  TMC  to  cells,  cells were  observed  under  a  fluorescence 

microscope. According to Feng et al., NTERA‐2 highly express CD133, so this cell line was chosen for 

this experiment [11]. As shown in Figure 5, NTERA‐2 cells labeled with luminescent nanocomplex 

TMC expressed strong  luminescence under  fluorescence microscopy compared with  the negative 

control (Figure 5). Although TbPO4∙H2O@silica‐NH2 could bond with the cells, the bonds were weak; 

therefore, the fluorescence image was not bright. 

 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  8  of  11 

 (a) 

 (b) 

 (c) 

 (d) 

Figure  5.  NTERA‐2  cells  after  1  h  of  incubation  with  (a)  TbPO4∙H2O@silica‐NH2;  (b)  TMC 

(TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133‐mAb^PD‐L1);  (c)  CD133‐FITC;  and  (d)  negative  control; 

observed using an Olympus Scan^R 100X fluorescent microscope system. 

The  flow  cytometry  results  also  provided  the  percentage  of  probed  cells  using  the  TMC 

nanocomplex. CD133‐FITC (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA) served as a reference control. As shown 

in Figure 6, CD133 expression was found in about 95.83% ± 7.31% of NTERA‐2 cells when stained 

with CD133‐FITC. A similar result (97.77% ± 5.69%) was found in NTERA‐2 cells that were incubated 

with TMC (p > 0.05). The percentage of CD133‐positive cells was only 1.11% ± 0.06% for NTERA‐2 

cells incubated with unconjugated TbPO4∙H2O nanorods. 

       

(a)  (b)  (c)  (d) 

Figure 6. Flow cytometry analysis of  labeled NTERA‐2 cells  incubated with (a) TbPO4∙H2O@silica‐

NH2; (b) TMC, (c) CD133‐FITC; and (d) negative control using a Novocyte flow cytometry system 

and NovoExpress software (ACEA Bioscience Inc.). 

CCD‐18Co cells were also incubated with the nanorods conjugated with mAb under the same 

conditions. However, luminescent expression of CCD‐18Co cells bound with nanomaterials was not 

noticed under the fluorescent microscopic observation. The results from flow cytometry analysis also 

showed a very  low percentage of CD133‐positive cells  in  the CCD‐18Co cell population  (0.85% ± 

0.07%) which had been incubated with TMC (Figure 7). Lodi reported that the expression of CD133 

in CCD‐18Co cells  is hardly noticeable  [12]. Thus,  this cell  line served as  the negative control  for 

CD133 markers. These results prove that the TMC nanocomplex could specifically bind to CSCs. 

       (a)  (b)  (c)  (d) 

Figure 7. Flow cytometry analysis of CCD‐18Co cells incubated with (a) TbPO4∙H2O@silica‐NH2; (b) 

TMC,  (c)  CD133‐FITC;  and  (d)  negative  control  using  a Novocyte  flow  cytometry  system  and 

NovoExpress software (ACEA Bioscience Inc.). 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  9  of  11 

3.3. Effect of TMC on the Proliferation of NTERA‐2 and CCD‐18Co Cells 

The proliferation of NTERA‐2 and CCD‐18Co cells treated with TMC was assessed using the 

MTT assay. TMC showed the ability to inhibit the growth of NTERA‐2 cells by up to 14.12% at the 

highest concentration of 10 μg/mL (Table 2). The antiproliferative activity of TMC on CCD‐18Co cells 

was slightly lower than that on NTERA‐2 cells (P > 0.05). TbPO4∙H2O@silica‐NH2 did not show any 

cytotoxicity on either NTERA‐2 or CCD‐18Co cells. 

Table 2. The effects of TMC on the proliferation of NTERA‐2 and CCD‐18Co cells 

Samples % Proliferation 

NTERA‐2  CCD‐18Co 

TM (TbPO4∙H2O @silica‐NH2)  92.23 ± 3.68  93.41 ± 2.19 

TMC (TbPO4∙H2O @silica ‐NH2 ‐mAb^CD133‐mAb^PD‐L1)  85.88 ± 5.76  89.67 ± 4.36 

CD133‐FITC (ThermoFisher)  87.63 ± 7.08  90.33 ± 2.41 

Negative control  100  100 

3.4. Effect of TMC on NTERA‐2 Spheroids 

One  of  the  key  features  of  CSCs  in  tumors  is  adaptive  immune  resistance.  This  unique 

characteristic helps CSCs escape destruction by  immune cells such as  lympho T and NK cells or 

macrophages,  resulting  in  tumor progression  and metastasis. This phenomenon  is  thought  to be 

related  to programmed  cell death  ligand  1  (PD‐L1). PD‐L1  is  expressed on  tumors  and binds  to 

programmed  cell  death  1  (PD1)  on  immune  cells,  leading  to  the  inhibition  of  tumor‐infiltrating 

lymphocytes (TILs) [13]. Therefore, PD‐L1 blocking decreases the growth of tumors. In this study, we 

measured tumor growth inhibition due to the activity of TMC using the research model, which was 

3D NTERA‐2 spheroids co‐cultured with macrophages. TMC showed the ability to inhibit the growth 

of 3D tumor spheroids (Figure 8). As a result of TMC application, the areas of the 3D spheroids were 

reduced by 58.50% ± 1.60%, which is a significant reduction in comparison with the negative control 

after three days of treatment (p < 0.05). 

     (a)  (b)  (c) 

Figure 8. 3D tumor spheroid images at Day 3 under treatments of TbPO4∙H2O@silica‐NH2 (a), TMC 

(b),  and  negative  control  (c) using  an Olympus  Scan^R  100X  fluorescence microscope  system  for 

observation. 

4. Discussion 

Lanthanides have now been widely applied in medicine. Their applications include therapy and 

imaging. Unlike  other metals,  lanthanides  are  luminescent,  stable,  and  biosafe  [14]. Among  the 

lanthanides,  Tb  is  a  typical  lanthanide  with  strong  green  fluorescence  and  has  potential  for 

biomedical labeling or imaging. This material has also been studied for use as a carrier for drugs such 

as a measles virus antibody [15] or cobra venom antigens [10]. Due to the advantages of Tb, we chose 

this material to produce a nanocomplex, TMC, which is Tb3+ nanorods double conjugated with CD133 

and  PD‐L1 mAb  for  the  purpose  of CSC  labeling  and  therapeutic  solution.  TbPO4∙H2O  formed 

nanorods  30–50  nm  in  diameter  and  300–800  nm  in  length. After  surface  functionalization,  the 

nanorods were  successfully double conjugated with CD133 and PD‐L1 mAb with high efficiency 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  10  of  11 

(60%–100%). The labeling ability of TMC to detect CSCs is equivalent to that of the reference CD133‐

FITC. However, CD133 is also expressed in stemlike cells throughout the body. Thus, mAb against 

other CSC‐specific markers such as EpCAM, CD44, CD24, etc., will be double conjugated with our 

TbPO4∙H2O@silica‐NH2‐mAb^CD133  (instead  of  PD‐L1  mAb)  in  order  to  improve  the  specific 

targeting  activity  of  the  nanocomplex  for  fundamental  CSC  research  or  for  future  clinical 

applications. 

Together with CSC probing, TMC with PD‐L1 mAb was produced in a structure selected for the 

purpose of cancer treatment. PD‐L1 is a ligand of PD‐1, and the interaction of PD‐L1 and PD‐1  in 

immune cells may cause  inactivation of  these cells  [16]. However, PD‐L1 acts as an antiapoptotic 

receptor  in  response  to  Fas  ligation.  Therefore,  PD‐L1  is  closely  related  to  cancer  stem  cell 

proliferation  [17]. PD‐L1 antibodies are  commercially available  to  clinically  treat  several  types of 

cancer [18]. Herein, although TMC only slightly inhibited the growth of NTERA‐2 cells in vitro, the 

nanocomplex strongly inhibited the growth of these 3D NTERA‐2 spheroids when co‐cultured with 

macrophages.  According  to  Genevieve,  PD‐L1  monoclonal  antibodies  enhance  the  ability  of 

macrophages  to proliferate and activate,  leading  to  increased numbers of TAM  (tumor‐associated 

macrophages) and thereby inhibiting the growth of tumor tissues [17]. 

5. Conclusions 

Tb3+ nanomaterials were produced using polyethylene glycol 2000 (PEG‐2000) as a soft template. 

The obtained TbPO4∙H2O nanomaterial was a hexagonal crystal and nanorod in shape, 40–80 nm in 

diameter, and 300–800 nm in length. These Tb3+ nanorods were further silica surfaced using tetraethyl 

orthosilicate (TEOS) hydrolysis and  functionalized with amino silane to obtain TbPO4∙H2O@silica‐

NH2 (TM) materials. The glutaraldehyde‐activated TM was double conjugated with CD133 and PL‐

D1  monoclonal  antibodies  to  produce  the  nanocomplex  TbPO4∙H2O@silica‐

NH2+mAb^CD133+mAb^PD‐L1  (TMC). The  formed nanocomplex presented highly  efficient  and 

specific  labeling  of NTERA‐2  cells,  a  CSC  cell  line  strongly  expressing  CD133  and  PD‐L1.  The 

nanoconjugate  also  exhibited  promising  anti‐CSC  properties,  including  58.50%  inhibition  of  the 

growth of 3D tumor spheres of NTERA‐2 cells, and its anti‐tumor properties should be further tested 

in in vivo experiments. 

Author  Contributions:  Conceptualization:  N.M.L.,  T.N.V.,  T.T.D.  Methodology:  T.T.D.,  T.K.H.P.,  T.H.T. 

Software, validation,  formal analysis,  investigation,  resources, data curation: T.N.N., T.H.T., N.M.L., T.N.V., 

Writing—original draft preparation: T.N.N. Writing—review and  editing: T.T.D. All authors have  read and 

agreed to the published version of the manuscript. 

Acknowledgments:  The  authors  thank  The  Institute  of Natural  Product  Chemistry,  Vietnam Academy  of 

Science and Technology (VAST) for the Olympus Scan^R fluorescent microscope (Olympus Europa SE & Co.KG, 

Hamburg, DE) and the Vietnam Ministry of Education and Training for their partly support under grant number 

B2019‐MDA‐04. 

Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.   

References 

1. Yu, Z.; Pestell, T.G.; Lisanti, M.P.; Pestell, R.G. Cancer stem cells. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2012, 44, 2144–

2151. 

2. Clevers, H. The cancer stem cell: Premises, promises and challenges. Nat. Med. 2011, 17, 313–319. 

3. Glumac, P.M.; LeBeau, A.M. The role of CD133 in cancer: A concise review. Clin. Transl. Med. 2018, 7, 18. 

4. Barzegar Behrooz, A.; Syahir, A.; Ahmad, S. CD133: Beyond a cancer stem cell biomarker. J. Drug Target. 

2019, 27, 257–269. 

5. Bruttel, V.S.; Wischhusen, J. Cancer stem cell immunology: Key to understanding tumorigenesis and tumor 

immune escape? Front. Immunol. 2014, 5, 360. 

6. Wu, Y.; Chen, W.; Xu, Z.P.; Gu, W.  PD‐L1 Distribution  and  Perspective  for Cancer  Immunotherapy‐

Blockade, Knockdown, or Inhibition. Front. Immunol. 2019, 10, 2022–2022. 

Appl. Sci. 2020, 10, 1710  11  of  11 

7. Bae, K.H.; Chung, H.J.; Park, T.G. Nanomaterials for cancer therapy and imaging. Mol. Cells 2011, 31, 295–

302. 

8. Bünzli, J.‐C.G.; Piguet, C. Taking advantage of luminescent lanthanide ions. Chem. Soc. Rev. 2005, 34, 1048–

1077. 

9. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and 

cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 1983, 65, 55–63. 

10. Lien, P.T.; Huong, N.T.; Huong, T.T.; Khuyen, H.T.; Anh, N.T.N.; Van, N.D.; Tuan, N.N.; Nghia, V.X.; Minh, 

L.Q. Optimization of Tb3+. J. Nanomater. 2019, 2019, 3858439. 

11. Feng, H.‐L.; Liu, Y.‐Q.; Yang, L.‐J.; Bian, X.‐C.; Yang, Z.‐L.; Gu, B.; Zhang, H.; Wang, C.‐J.; Su, X.‐L.; Zhao, 

X.‐M. Expression of CD133 correlates with differentiation of human colon cancer cells. Cancer Biol. Ther. 

2010, 9, 216–223. 

12. Lodi, D.; Ligabue, G.; Cavazzini, F.; Lupo, V.; Cappelli, G.; Magistroni, R. CD133 and CD24 expression in 

renal tissue of patients affected by autosomal dominant polcystic kidney disease. Stem Cell Discov. 2013, 3, 

211–217. 

13. Srinivasan, P.; Wu, X.; Basu, M.; Rossi, C.; Sandler, A.D. PD‐L1 checkpoint  inhibition and anti‐CTLA‐4 

whole  tumor cell vaccination counter adaptive  immune resistance: A mouse neuroblastoma model  that 

mimics human disease. PLoS Med. 2018, 15, e1002497. 

14. Teo,  R.D.;  Termini,  J.;  Gray,  H.B.  Lanthanides:  Applications  in  Cancer  Diagnosis  and  Therapy: 

Miniperspective. J. Med. Chem. 2016, 59, 6012–6024. 

15. Le, Q.M.; Tran, T.H.; Nguyen, T.H.; Hoang, T.K.; Nguyen, T.B.; Do, K.T.; Tran, K.A.; Nguyen, D.H.; Le, 

T.L.; Nguyen, T.Q. Development of a fluorescent label tool based on lanthanide nanophosphors for viral 

biomedical application. Adv. Nat. Sci. Nanosci. Nanotechnol. 2012, 3, 035003. 

16. Blank, C.; Gajewski, T.F.; Mackensen, A. Interaction of PD‐L1 on tumor cells with PD‐1 on tumor‐specific 

T  cells  as  a mechanism  of  immune  evasion:  Implications  for  tumor  immunotherapy. Cancer  Immunol. 

Immunother. 2005, 54, 307–314. 

17. Hartley, G.P.; Chow, L.; Ammons, D.T.; Wheat, W.H.; Dow, S.W. Programmed cell death ligand 1 (PD‐L1) 

signaling regulates macrophage proliferation and activation. Cancer Immunol. Res. 2018, doi:10.1158/2326‐

6066.CIR‐17‐0537. 

18. Liu, K.; Tan, S.; Chai, Y.; Chen, D.; Song, H.; Zhang, C.W.‐H.; Shi, Y.; Liu, J.; Tan, W.; Lyu, J. Structural basis 

of anti‐PD‐L1 monoclonal antibody avelumab for tumor therapy. Cell Res. 2017, 27, 151–153. 

 

© 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access 

article  distributed  under  the  terms  and  conditions  of  the  Creative  Commons 

Attribution (CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).