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Cap 10 – Análisis de Genes y Genomas. JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al. Objetivos. Al finalizar la presentación el estudiante podrá: Definir biotecnología Conocer los mecanismos de corte y unión del DNA por enzimas - PowerPoint PPT Presentation
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Cap 10 – Análisis de
Genes y Genomas
JA Cardé, PhD
Universidad Adventista
Alberts et al.
Objetivos• Al finalizar la presentación el estudiante
podrá:– Definir biotecnología– Conocer los mecanismos de corte y unión del
DNA por enzimas– Conocer métodos de visualización de las
moléculas orgánicas.– Establecer diferencias, parecidos la
importancia y los diferentes tipos de vectores y bibliotecas
– Conocer distintas aplicaciones de la biotecnología
Biotechnology3 greeks roots
- Bios - life- Teuchos - tools- Logos - study
- Study of tools from living things
Biotechnology
“The application of science and technology to living organisms, as well as parts, products and models thereof, to alter living or non-living materials for the production of knowledge, goods and services.”
Biotechnology
Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use.” - Wikipedia.org
Biotechnology
- Using living organisms, their products or derivatives as tools to solve human issues to improve our life quality.
- Organisms: Model systems
- Products: Proteins, Antibiotics, Genetically Modified Products (GMPs)
- Issues: health, environmental, economical
¿Qué es biotecnología?
• Es el uso de organismos vivos, o sus productos para mejorar nuestra calidad de vida y/o nuestro ambiente.
• Dependiente grandemente de avances en:– Biología molecular– Métodos y/o Tecnología de DNA
recombinante
10_04_Restrict.nuclease.jpgEnzimas de Restricción
Palíndromes
5’ GTAATC 3’
3’ CTAATG 5’
Cohesivos
Romos
Nomenclatura
Aplicaciones
M a n I p u l a c I ó ndelDNA
10_05_gel.electrophor.jpgAnalisis y Visualización de DNA
Azul MetEtBR-UVRadioactividad
Como se verá la gel?
EcoRI 5GA / ATTC5 3CTTA / AG3Alu I 5AG / CT 3
3TC / GA5Not I 5GC / GGCCGC3
3CGCCGG / CG5
LAS 3 A LA VEZ?!!!
5’AAGAATTCGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCGCCGAAGCTTTAAA3’3’ TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGCGGCTTCGAAATTT 5’
10_11_BAC.clones.jpgMapas de Restricción Clonos de BAC
Varias enzimas - individuales y en conjunto
Solapamientos
10_12_de_renaturation.jpgDenaturación y Renaturación
DNA - DS - Complementaridad - GC / AT
3 enlaces vs 2 enlaces; TM
Complejidad del Genoma – Experimentos Cot
Secuencias altamente repetitivas
Moderadamente Repetitivas
Unicas
10_14_1_Southrn.blotting.jpg
Southern/Northern Blotting
10_14_2_Southrn.blotting.jpg
Visualización
10_18_ DNA.in.vitro.jpg
Moléculas QuiméricasLigación = ClonaciónCortesLigación y/oComplementaridad
10_19_DNA.uptake.jpgTraTransformación Bacteriana –
Griffith
Competencia
Transformacion 2
10_20_Bacteria.plasmid.jpgPlasmidos Bacterianos
Vectores
Ori
Antibiótico
MCS/Polylinker
ORF
Ejemplos:pAMPpKANpBLUE
10_21_DNA ligase.jpg
Digestión/Digestión
Cloning
Ligación
Quimera
Transformación
Cultivo/Resistencia
10_22_cloned.DNA.frag.jpgTransformación – Selección - Replicación –
DNA Miniprep
Transformacion 1
10_23_genomic.library.jpg
Bibliotecas: Genómica
-Restricción
-Ligación
-Clonación
-Replicación
-Selección
10_24_hybridization.jpgScreening - Replica plating - Probing radioactivo - Autoradiografía
10_25_cDNA.jpg
Bibliotecas: de cDNA
mRNA Total
Oligo dT
RT
RNAsa H
DDDP - replicación
DS DNA copia mRNA
ClonarSelecciónScreen.
10_26_Genomic_cDNA.jpg
vs
10_27_1_PCR_amplify.jpgReacción de la Polimerasa en Cadena: PCR
-Objetivo
-aplicaciones
10_27_2_PCR_amplify.jpg
PCR 1, PCR 2
10_28_PCR_clones.jpgAplicación-cloning
10_29_PCR_viral.jpgAplicación – detección/diagnóstico
10_30_1_PCR_forensic.jpgAplicación - Forense - VNTR
10_30_2_PCR_forensic.jpg
10_07_1_enzym.dideoxy.jpg
Secuenciacion
Di-deoxi
Aplicación - Secuenciación
10_07_2_enzym.dideoxy.jpg
4 reacciones
ddNTPs
PCR
PAGE
Autoradiografia
10_08_DNA.sequencing .jpgSecuencia Digitalizada/Color Code PCR / Fluorescencia
http:www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html
10_31_SerialDNA.clone.jpgClonación en secuencia
Para unir un grupo de fragmentos derivados de distintos origenes
10_32_expressionvector.jpgVectores de Expresión-Ori, Antibiotico, Polylink
-Promotor eficiente
-Senales de poliA etc
-Transformado en celulas
10_33_gene_protein.jpgDogma Central Repensado - huevo o gallina/gen o
proteína?
10_34_Reporter.genes.jpg
cual será el efecto de seq 1 sobre seq 3)
Genes Reporteros-Determinar el patron de expresion de un gen-Quiero saber cual celua expresa a X, proteina indetectable
10_35_GFP.jpgGFP: Gen Reportero
Promotor de neurona con GFP
Neuronas expresando GFP
Hibridización In situ
- Detección de la presencia de papiloma humano
- Sonda pink complementaria al genoma viral
10_16_In.situ.hybrdztn.jpgIn situ
En cromosomas
Localizar genes
Cromosoma 5
2 pts/por cada gen, WHY?
10_13_hybridization.jpgDiagnósticos
DiagnósticoScreening poblacional para Sckl cell anemia
10_15_DNA.microarrays .jpg
cDDNs de dos celulas para comparar expresion
Marcarlos fluorescente(rojo/verde)
Mezclar e hibridizar con el array
Lavados, Rastreos, Lectura 110 genes
Rojo A > B o Verde B>A o Amarillos
Análisis: spot Rojo, este gen es del pool R, donde se expresa mas que en el otro pool, lo mismo para verde
DNA Microarray- Para monitorear la expresión de miles de genes a la vezER Rx
ER No Rx
10_36_mutagenesis.jpgSite Directed Mutagenesis
10_37_engineered.org.jpgSustituciones: mutantes, KO, doble copia
10_38_ES.cells.jpgTransgénicos
10_39_Transgenic.mice.jpg
10_40_Transgenic.plant.jpg
Transgénicos
¿Preguntas?