CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE

Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA RIBOSOMAL 16S

DIEGO JAVIER JIMÉNEZ AVELLA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C. Colombia

AGOSTO DE 2007.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS COLOMBIANAS DE Azotobacter spp. MEDIANTE EL ANALISIS DE RESTRICCION DEL DNA

RIBOSOMAL 16S


TRABAJO DE GRADO

PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTAR EL TITULO DE

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR:

JOSE SALVADOR MONTAÑA

CO-DIRECTORA:

MARIA MERCEDES MARTINEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D. C. Colombia

AGOSTO DE 2007

NOTA DE ADVERTENCIA Articulo 23 de la resolución No 13 de julio de 1946

“La universidad no se hace responsable por los conceptos omitidos por sus alumnos

en sus trabajos de tesis. Solo se velara porque no se publique nada contrario al

dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales

contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo en buscar la verdad y la

justicia”


RIBOSOMAL 16S


APROBADO

José Salvador Montaña Msc. Director

María del Pilar Márquez Msc. Jurado 1

María Mercedes Martínez Msc. Codirectora

Andrea Juliana Mantilla Microbióloga Industrial

Jurado 2

Bogotá. D. C. Colombia

AGOSTO DE 2007.


RIBOSOMAL 16S


APROBADO

Ángela Umaña MPhil. Decana Académico

David Gómez Msc. Director de Carrera

Bogotá. D. C. Colombia

AGOSTO DE 2007

DEDICATORIA A mis padres por todo su amor, su esfuerzo constante durante mi carrera, su

comprensión, su ayuda y apoyo incondicional y único, y por creer en mí cada

momento en esta gran etapa de mi vida.

AGRADECIMIENTOS A mis directores José Salvador Montaña y María Mercedes Martínez, por su

apoyo incondicional, por compartir sus invaluables enseñanzas y conocimientos

conmigo y por acompañarme en este valioso paso en mi vida.

A todas las personas del Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos de la

Pontificia Universidad Javeriana, por su colaboración y por haber permitido el

desarrollo de esta investigación.

A los investigadores de las Unidades de Saneamiento y Biotecnología Ambiental

(USBA) y Biotecnología Vegetal (UBV) por su colaboración y asesoría.

Al Ingeniero agrónomo Andrés Siabato por su colaboración y asesoría en el

muestreo.

A mis hermanos Julis, Caro y Chepe, por su apoyo y cariño en toda mi carrera.

A mi linis por amarme tanto, por su compañía, por su comprensión y por ser un

apoyo incondicional.

A todas las personas de mi familia que me apoyaron y creyeron en mí día a día.

A mis amigos de la Universidad y de Sogamoso por ser personas importantes y

únicas.

TABLA DE CONTENIDO

1. Introducción...................................................................................................... 1 2. Marco teórico.................................................................................................... 3 2.1. Importancia y problemática del nitrógeno en la agricultura............................. 3

2.2. La rizosfera...................................................................................................... 3

2.3. Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazótrofos)................. 5

2.3.1. Fijación biológica de nitrógeno (FBN).......................................................... 5

2.3.2. Microorganismos diazotróficos simbióticos.................................................. 7

2.3.3. Microorganismos diazotróficos asimbióticos................................................ 9

2.5. Familia Azotobacteraceae............................................................................... 11

2.6. Generalidades del género Azotobacter spp.................................................... 12

2.6.1. Azotobacter chroococcum............................................................................ 16

2.6.2. Azotobacter vinelandii................................................................................. 17

2.7. Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias

diazotrófas.............................................................................................................. 18

2.7.1. Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y

taxonomía............................................................................................................... 19

2.7.2. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado

(ARDRA)................................................................................................................. 21

2.7.3. Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y otras

bacterias diazótrofas mediante el análisis de restricción del RNA ribosomal 16S

(ARDRA)................................................................................................................ 21

3. Formulación del problema y justificación...................................................... 25

4. Objetivos........................................................................................................... 27

4.1. Objetivo general.............................................................................................. 27

4.2. Objetivos específicos....................................................................................... 27

5. Metodología...................................................................................................... 28

5.1. Lugar de muestreo.......................................................................................... 28

5.2. Muestreo del suelo.......................................................................................... 28

5.3. Procesamiento de muestras............................................................................ 29

5.3.1. Medición de pH de las muestras de suelo.................................................... 29

5.3.2. Aislamiento primario..................................................................................... 29

5.4. Aislamiento secundario.................................................................................. 30

5.4.1. Conservación de cepas mediante la técnica de criopreservación en 30

glicerol al 50% (v/v)................................................................................................

5.4.2. Pigmentación de los aislamientos................................................................ 30

5.4.3. Identificación Bioquímica….......................................................................... 31

5.4.4. Cepa control................................................................................................. 31

5.5. Extracción de DNA.......................................................................................... 32

5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3....................... 33

5.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA)............ 34

5.7.1. Perfil electroforético para el ARDRA............................................................ 34

5.7.2. Análisis filogenético...................................................................................... 35

5.8. Restricción virtual............................................................................................ 35

6. Resultados........................................................................................................ 36

6.1. Medición de pH de los cultivos muestreados.................................................. 36

6.2. Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas.. 36

6.3. Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias

asimbióticas............................................................................................................ 37

6.3.1. Morfología de las colonias............................................................................ 37

6.3.2. Morfología de las células.............................................................................. 37

6.3.3. Pigmentación................................................................................................ 38

6.4. Identificación bioquímica................................................................................. 39

6.5. Extracción de DNA.......................................................................................... 41

6.6. Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3...................... 42

6.7. Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA)............................... 43

6.7.1. Análisis con la enzima AluI........................................................................... 43

6.7.2. Análisis con la enzima HpaII........................................................................ 44

6.7.3. Análisis con la enzima RsaI.......................................................................... 46

6.8. Cladograma generado del análisis con las tres enzimas................................ 48

6.9. Restricción virtual............................................................................................ 48

6.9.1. Análisis virtual con la enzima AluI................................................................ 50

6.9.2. Análisis virtual con la enzima HpaII.............................................................. 52

6.8.3. Análisis virtual con la enzima RsaI............................................................... 53

7. Discusión de resultados.................................................................................. 56

8. Conclusiones.................................................................................................... 67

9. Recomendaciones............................................................................................ 69

10. Referencias..................................................................................................... 70

11. Anexos............................................................................................................. 86

INDICE DE FIGURAS

Figura. 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la

nitrogenasa para la reducción del N2..................................................................... 6

Figura. 2. Quistes de Azotobacter spp.................................................................. 12

Figura. 3. Pigmentación de cepas de Azotobacter................................................ 13

Figura. 4. Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno y

morfología celular de Azotobacter spp.................................................................. 14

Figura. 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis

de las tres nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de

nitrógeno................................................................................................................. 18

Figura. 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá.............................. 28

Figura. 7. Recolección de las muestras de suelo.................................................. 29

Figura 8. Aislamiento primario............................................................................... 30

Figura. 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato.................................... 31

Figura. 10. Baterías bioquímicas de azucares...................................................... 31

Figura. 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias

fijadoras de nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas....................................... 37

Figura. 12. Morfología celular de los aislamientos................................................ 38

Figura. 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato............... 38

Figura. 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos.................................. 41

Figura. 15. Amplificación del DNAr 16S............................................................... 42

Figura. 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima

AluI......................................................................................................................... 43

Figura. 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos.............................. 44


HpaII....................................................................................................................... 45

Figura. 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos............................ 46


RsaI........................................................................................................................ 46

Figura. 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos............................. 47

Figura. 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI,

HpaII y RsaI para los aislamientos.........................................................................

48

Figura. 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en

el análisis de restricción virtual............................................................................... 49

Figura. 24. Restricción virtual con la enzima AluI.................................................. 51

Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para

las secuencias obtenidas del Genbank.................................................................. 51

Figura. 26. Restricción virtual con la enzima HpaII............................................... 52

Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para


Figura. 28. Restricción virtual con la enzima RsaI................................................. 54

Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para


INDICE DE ECUACIONES

Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno......................................... 7

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del

género Azotobacter.............................................................................................. 13

Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas

para la caracterización del género Azotobacter spp............................................ 15

Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados

para la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas.............................. 33

Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA............... 34

Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo................................................ 36

Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de

recuperación por cultivo....................................................................................... 36

Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada

cultivo................................................................................................................... 37

Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas

encontradas en cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá................ 39

Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo

(ATCC 12518) y la cepa CCT.............................................................................. 40

Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos....................................... 41

Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI............................................. 43

Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII........................................... 45

Tabla 13. Morfotipos obtenidos con la enzima RsaI............................................ 47

Tabla 14. Secuencias obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción

virtual.................................................................................................................... 49

Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb

generados con la enzima AluI en las secuencias obtenidas del Genbank.......... 50


generados con la enzima HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank........ 52


generados con la enzima RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank......... 54

RESUMEN

Con el fin de aislar y caracterizar bacterias diazotrófas del genero Azotobacter se

realizó un muestreo de suelo en cultivos de hortalizas ubicados en el

departamento de Boyacá, el aislamiento se realizó en medio Ashby-Sacarosa

libre de nitrógeno. El pH de los suelos se encontró cercano a la neutralidad y el

porcentaje de recuperación obtenido fue alrededor de 40%, los aislamientos

fueron clasificados e identificados fenotípica y bioquímicamente, encontrando

bacterias de las especies A. vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A.

paspali. La caracterización molecular se realizó utilizando un análisis de

restricción del DNAr 16s amplificado (ARDRA), para esto se realizó una

extracción de DNA por medio de la utilización de solventes orgánicos (Fenol), el

gen fue amplificado con iniciadores universales utilizados para bacterias

diazótrofas (Y1-Y3) que amplifican 1487pb del gen. Las enzimas utilizadas en el

ARDRA fueron AluI, HpaII y RsaI las cuales presentaron porcentajes de

polimorfismo alrededor de 16%. Los aislamientos se distribuyeron en tres grupos

que presentaron morfotipos similares para las tres enzimas.

Se realizó una comparación de los morfotipos generados en los aislamientos

frente a los generados en una restricción virtual con las mismas enzimas,

utilizando secuencias parciales del gen DNAr 16s de bacterias diazótrofas

obtenidas del Genbank. Los aislamientos presentaron cierta homología con

bandas generadas con la restricción virtual, sin embargo, algunas

identificaciones no fueron precisas ya que el patrón de bandas coincidía con

otras especies de Azotobacter o con otros géneros como en el caso de los

aislamientos C1BR y C5BR. Por otro lado, el aislamiento C5T presentó el mismo

morfotipo con A. chroococcum para las tres enzimas, indicando que su similitud

genética es evidente con esta especie, además corroborando su identificación

preliminar y su pigmentación en medio benzoato. Demostrando que las técnicas

moleculares junto con las convencionales y la bioinformática son herramientas

fundamentales para la caracterización de bacterias diazótrofas importantes en la

agricultura, además de su importancia en estudios de biodiversidad,

bioprospección y biotecnología.

ABSTRACT

With the aim to isolate and characterized nitrogen fixing bacteria from

Azotobacter genera, a soil sample was made in vegetable cultures located at the

department of Boyacá, the isolation was made in the Ashby-Sucrose medium

free of nitrogen. The PH of soils was found near neutrality, and the porcentage of

recovery obtained was around the 40%, the isolations were classified and

identified phenotypical and biochemiclally, finding bacterias of the species A.

vinelandii, A. chroococcum, A. negricans y A. paspali. The molecular

characterization was made using an amplified ribosomal DNA restriction analysis

(ARDRA), for this an extraction of the DNA was made by using organic solvents

(phenol), the gen was amplified with universal primers used for nitrogen fixing

bacterias (Y1-Y3) that amplifies 1487pb of the gen. The enzymes used in the

ARDRA were AluI, HpaII y RsaI which presented polymorphism percentages

around 16%. The isolations were distributed in three groups that presented

similar morphotypes for the three enzymes.

A comparison betweeen the morphotypes generated by isolations and the ones

generated in a virtual restriction with the same enzymes, using partial secuencies

of the gen DNAr 16s from nitrogen fixing bacterias obtained from the Genbank.

The isolations presented certain similarities with bands generated wtih the virtual

restriction; nevertheless some identifications were not precised due that the

pattern of bands matched with other species of Azotobacter or with other genders

kile in the case of isolation C1BR y C5BR. In the other hand, the isolation C5T

presented the same morphotype with A. chroococcum for the three enzymes

indicating that the genetic similarity is evident with this specie, besides

corroborating its preliminar identification and pigmentation on a bezoatum

medium. Showing that the molecular techniques with the conventional ones and

the bioinformatic are fundamental tools for the nitrogen fixing bacterias

characterization important in the agriculture, besides its importance in

biodiversity, bioprospection and biotechnology studies.

1. INTRODUCCIÓN. Actualmente la gran mayoría de cultivos agrícolas Colombianos dependen de

los fertilizantes químicos sintetizados, los cuales proporcionan nutrientes

asimilables por las plantas, buscando optimizar los procesos de producción. El

uso indiscriminado de fertilizantes químicos, ocasiona contaminación de cuerpos

de agua y suelos, sumado al incremento de los costos de producción y el

impacto negativo en la salud animal y humana. Por esto, el uso de agricultura

orgánica, tecnologías limpias y seguras, han hecho que los biofertilizantes se

conviertan en una gran alternativa para disminuir estos inconvenientes. Los

biofertilizantes son preparaciones de células vivas o latentes que cumplen

funciones específicas en los cultivos, como, la fijación biológica de nitrógeno, la

solubilización del fósforo, la producción de hormonas promotoras de crecimiento,

la producción de antibióticos y la generación de agentes quelantes de hierro.

Las bacterias fijadoras de nitrógeno (diazótrofas) fueron las primeras en

producirse comercialmente con fines de biofertilización pero posteriormente las

bacterias diazótrofas asimbióticas cobraron importancia en la agricultura. De este

grupo, las más utilizadas como biofertilizantes corresponden al género

Azotobacter, compuesto por 7 especies (Azotobacter chroococcum, A. vinelandii,

A. beijerinckii, A. paspali, A. armeniacus, A. nigricans y A. salinestris), siendo A.

chroococcum y A. vinelandii las que se encuentran en gran proporción en la

rizosfera de suelos tropicales que se caracterizan por poseer altos contenidos de

materia orgánica, fosfatos y valores de pH cercanos a la neutralidad. Las

bacterias del género Azotobacter son fijadores de nitrógeno de vida libre,

solubilizadores de fósforo, productores de sustancias promotoras del

crecimiento vegetal (PGPR) y degradadoras de plaguicidas. Por estas razones

se consideran indicadores de salud en cultivos agrícolas.

Los métodos de cultivo más utilizados para aislar bacterias del género

Azotobacter incluyen aislamiento en medio libre de nitrógeno; enriquecimiento en

solución de Winogradsky y posterior siembra en medio libre de nitrógeno; y

siembra de gránulos individuales de suelo en medio libre de nitrógeno. Para su

identificación se emplean pruebas como fermentación de ramnosa, manitol,

inositol, malonato, benzoato y sucrosa; además de test de oxidasa y catalasa,

producción de pigmentos, crecimiento en diferentes valores de pH, crecimiento

en diferentes concentraciones de NaCl y de oxigeno. La identificación también

se realiza mediante observación de la morfología celular, de colonias y la

formación de estructuras de resistencia. Sin embargo, estos métodos generan

ambiguedad en el momento de diferenciar especies dentro del género

Azotobacter u otros géneros diazótrofos como Beijerinckia y Derxia. Por esta

razón su utilización es insuficiente para la identificación y caracterización de

bacterias diazotrófas, además de ser útiles solo para bacterias cultivables.

Debido a esto, se han desarrollado técnicas de huella genética como DGGE,

RFLP, RAPD, ARDRA y secuenciación que permiten una identificación y

caracterización mas precisa.

El DNA ribosomal 16S es utilizado en estudios de filogenia y taxonomía ya que

su estructura y función han permanecido constantes a través del tiempo de modo

que las alteraciones en la secuencia reflejan cambios aleatorios, su transmisión

es principalmente vertical ya que no está sujeto a transferencia génica horizontal

entre microorganismos. La técnica molecular de amplificación del DNA ribosomal

16S es utilizada constantemente en microbiología, ya que por sus características

precisas permite identificar y caracterizar bacterias no cultivables, bacterias

cuyas características bioquímicas no se adaptan a las de ningún género o

especie reconocido; bacterias con elevados requerimientos nutricionales; cuya

caracterización fenotípica no es suficiente o aquellas con crecimiento muy lento.

En este estudio se pretende obtener un acercamiento a la identificación,

caracterización molecular y filogenia de cepas nativas Colombianas del género

Azotobacter mediante el análisis de restricción del DNA ribosomal 16S

amplificado (ARDRA), y con esto lograr una aproximación al conocimiento de la

diversidad genética de bacterias diazotrófas asimbióticas aerobias en cultivos

agrícolas colombianos, a través de la estandarización de un protocolo para la

extracción del DNA total, amplificación y restricción del DNA ribosomal 16S y el

análisis conjunto con la información de secuencias de bacterias diazótrofas

obtenidas del Genebank. En un corto plazo se busca realizar la validación de

esta técnica e incluirla en el portafolio de servicios del laboratorio de

Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana para el

control de calidad de bioinsumos agrícolas.

2. MARCO TEORICO 2.1 Importancia y problemática del nitrógeno en la Agricultura Debido a que el nitrógeno es el elemento más limitante para el crecimiento de

las plantas en suelos tropicales (Franco & Dobereiner, 1994), se ha

incrementado el uso de productos de síntesis, con el ánimo de aumentar la

producción agrícola. Existen reportes de 77 x 106 toneladas de nitrógeno

aplicados mundialmente como fertilizante en diversos cultivos de gran

importancia agronómica, como hortalizas, caña, sorgo, maíz, arroz, flores y

ornamentales entre otros. Lo anterior ha provocado efectos negativos en los

recursos naturales, tales como acumulación de nitratos en las aguas freáticas,

toxicidad en las plantas por la presencia de altos niveles de NO2 en los suelos,

contribuyendo con la muerte de la biota del suelo, ocasionando desequilibrios en

los procesos naturales biogeoquímicos que se traducen en un alto costo

económico, social y ecológico. (Marín et al., 2003).

2.2 La rizósfera El termino rizósfera se refiere a la zona del suelo influenciada por el desarrollo

de raíces, en donde se activa la proliferación de microorganismos (Hiltner, 1904);

este efecto rizosférico se debe al suministro de exudados radicales que

contienen azúcares, aminoácidos, vitaminas y enzimas, además de señales que

modulan la interacción microbio-planta (Kennedy & Smith, 1995; Bowen &

Rovira, 1999). Las propiedades físicas, químicas y biológicas de la rizósfera son

muy diferentes a las del suelo no rizosférico particularmente, la población

microbiana desciende entre 10 a 100 veces al alejarse pocos milímetros de la

superficie radical (Collados, 2006).

Las poblaciones rizosféricas están compuestas por bacterias, hongos, algas,

nemátodos, protozoos y virus pero la mayor parte de las investigaciones se

centran en hongos y bacterias (Bowen & Rovira, 1999; Gryndler, 2000). Se

estima que existen unas 30.000 especies de bacterias y 1.500.000 especies de

hongos de los cuales solo un 1% y 8% respectivamente han sido identificadas

(Kennedy & Smith, 1995; Barea, 2000). En este contexto hay que referir que la

utilización de técnicas basadas en el análisis de moléculas de DNA ha puesto de

manifiesto que entre el 90% y 99% de los microorganismos del suelo son viables

pero no cultivables (Barea et al., 2005), por lo que dichas técnicas permiten

caracterizar los microorganismos y establecer sus relaciones filogenéticas.

Análisis pioneros de la complejidad microbiana en suelos, realizados por Torsvik

et al., (1990), utilizando técnicas de reasociación de DNA, pusieron en evidencia

la gran diversidad genética bacteriana presente. Así el número de genomas

bacterianos diferentes estimados en una muestra de suelo forestal fue de unos

4.000, en claro contraste con la diversidad genética de las bacterias aisladas en

cultivo a partir de la misma muestra (200 veces menor). En otras muestras de

suelo de la amazonia brasilera la diversidad genómica fue incluso superior

(8.000-10.000 genomas diferentes) (Torsvik et al., 1998).

Los microorganismos en la rizosfera desempeñan funciones de gran importancia

en relación con procesos de edafogénesis; ciclos biogeoquímicos de elementos

como el carbono, el nitrógeno, oxígeno, el azufre, el fósforo, el hierro y otros

metales; fertilidad de las plantas y protección frente a patógenos; degradación de

compuestos xenobióticos y producción de fitohormonas (Nogales, 2005).

Dentro de la microflora de la rizosfera se encuentran especies pertenecientes a

los géneros Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Enterobacter, Erwinia,

Flavobacteria, Hafnia, Klebsiela, Serratia Xanthomonas, Azotobacter,

Azospirillum, Clostridium, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia y Bacillus

(Kloepper et al., 1989; Bashan & Levanony, 1990; Tang, 1994; Barea et al.,

2004). Otras bacterias importantes en la microflora del suelo y en la agricultura

son las fosfato solubizadoras, como las aisladas por Useche et al., (2004), en un

estudio de la diversidad en diferentes suelos de la Amazonía, Pseudomonas

spp., P. cepacia, P. gladioli, Xanthomonas spp., X. maltophilia, Enterobacter

agglomerans, Chromobacterium sp., X. maltophilia, y Chromobacterium sp.;

constituyeron nuevos reportes de bacterias solubilizadoras de fósforo en

Colombia.

Observaciones de secciones ultrafinas de suelo mediante microscopía

electrónica, tomografía, análisis geoestadístico y la elaboración de modelos,

especialmente basados en fractales, han demostrado que la distribución de las

bacterias edáficas está altamente estructurada, y que esta estructuración es

importante para la funcionalidad y estructura del suelo. Las bacterias se

organizan en microcolonias compuestas de pocas células que pueden

pertenecer a diferentes morfotipos (Nunan et al., 2003). 2.3 Microorganismos fijadores de nitrógeno atmosférico (diazotrófos) La fijación biológica de nitrógeno molecular la llevan a cabo diversos géneros de

bacterias de vida libre, algunas de estas se encuentran en la rizósfera en vida

libre, y otros géneros bacterianos forman asociaciones mutualistas con plantas

(Saribay, 2003). Las bacterias fijadoras de nitrógeno presentan una amplia

diversidad taxonómica, con diferentes estilos de vida y de asociación con los

vegetales. Sin embargo, sólo una pequeña proporción de especies es capaz de

hacerlo; 87 especies en dos géneros de arqueobacterias, 38 de bacterias, y 20

géneros de cianobacterias se han identificado como diazótrofas (Hussein, 1999).

En la rizósfera la fijación del nitrógeno se realiza aparentemente sólo por ciertos

tipos de bacterias y por algunos miembros del taxón Archea; estos diazotrófos

incluyen algunas especies de Bacillus spp., Clostridium spp. y Klebsiella spp.,

miembros de la familia Azotobacteraceae (A. vinelandii y A. chroococcum),

Rhizobiaceae y del orden Rhodospirillales (Singleton, 2004). Además de estos,

se han descrito géneros en diferentes hábitats con la capacidad de fijar nitrógeno

atmosférico, entre estos están: Beijerinckia, Chromatium, Rhodopseudomonas,

Rhodospirillum, Rhodomicrobium, Chlorobium, Azospirillum, Desulfovibrio,

Desulfotomaculum y Pseudomonas (Atlas & Bartha 2002).

2.3.1 Fijación biológica de nitrógeno (FBN) La fijación biológica de nitrógeno esta catalizada por el complejo enzimático

nitrogenasa. El complejo de la enzima tiene dos coproteínas, la proteína I

contiene hierro y molibdeno y la proteína II contiene solamente hierro, aunque se

han encontrado una enzima alterna de Azotobacter vinelandii que contiene

vanadio (Drummond et al., 1995; Eady et al., 1988). La proteína I es un

tetrámero de alrededor de 220.000 Da, formado por dos tipos de subunidades α2

β2, de masa molecular semejante, y producto de los genes nifDK (Telisa et al.,

1999). La proteína II es un dímero de alrededor de 68.000 Da, el gen

responsable de la síntesis de esta proteína es nifH, esta proteína tiene la función

de transportar los electrones del donador fisiológico de electrones (ferrodoxina o

flavodoxina), hacia la proteína I para llevar a cabo la reducción de la molécula de

N2, (Figura 1) (Baca et al., 2000). Se han descrito alrededor de 20 genes

involucrados en la fijación biológica de nitrógeno, cuya secuencia y funciones

han sido ya determinadas. Igualmente se conoce que los genes estructurales de

la nitrogenasa están sumamente conservados, así como un cierto número de

otros genes cuyos productos juegan un papel en la maduración de la enzima, la

síntesis del cofactor, el transporte de molibdeno y la regulación (Elmerich, 1993;

Lee et al., 2000; Desnoues et al., 2003). Las proteínas NifL y NifA son las

encargadas de la regulación y el control de la expresión de los genes nif en la

fijación biológica del nitrógeno, en Azotobacter vinelandii estas dos proteínas

están codificadas por el operon nifLA (Martínez et al., 2005).

Figura 1. Genes implicados en el flujo de electrones hacia el sitio activo de la nitrogenasa para la reducción del N2. Fuente: Baca et al., (2000). La reducción de nitrógeno requiere mucha energía, alrededor de 12 a 16

moléculas de ATP por cada molécula de nitrógeno fijada (Ecuación 1)

(Betancurt, 2002; Singleton, 2004; Baca et al., 2000). Para la fijación bacteriana

de nitrógeno molecular se necesita un aporte importante de energía (150

kcal/mol) en forma de ATP y coenzimas reducidas; la energía puede obtenerse a

través de la conversión de la energía lumínica que realizan los organismos

fotoautótrofos, como las cianobacterias, o a través de la respiración de los

heterótrofos como Azotobacter (Atlas & Bartha, 2002). Ya que la fijación de

nitrógeno en bacterias aeróbicas como Azotobacter es un proceso que demanda

gran cantidad de energía, requiere una eficiente fosforilación oxidativa. La

enzima nitrogenasa es altamente sensible al oxígeno y muchos diazotrófos fijan

nitrógeno anaeróbicamente o microaeróbicamente y en algunas cianobacterias

el proceso se realiza en estructuras de resistencia como los heterocistes.

(Singleton, 2004).

Ecuación 1. Reacción en la fijación de nitrógeno. Fuente: Baca et al., (2000)

N2 + 8H+ + 8e- + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP +16Pi

La nitrogenasa purificada es inactivada rápida e irreversiblemente por el O2, la

proteína (Fe) es mucho más sensible que la proteína (Mo-Fe) con una vida

media en presencia de aire de 45 segundos y 10 minutos respectivamente

(Robson & Postgate, 1980). El efecto de O2 sobre la nitrogenasa restringe la

fijación de N2 en la mayoría de las especies de eubacterias a condiciones

anaeróbicas o de microaerobiosis. Azotobacter y Beijerinckia pueden fijar

nitrógeno a la presión normal de oxígeno, ya que protegen su nitrogenasa de la

inactivación oxidativa por una combinación de compartimentación y de complejos

mecanismos bioquímicos entre los que se encuentran, la protección

conformacional o switching off (Moshiri et al., 1994); la expresión de la citocromo

oxidasa cytbd; la autoprotección, la cual consiste en reducir por medio de la

nitrogenasa reductasa el oxigeno a peróxido de hidrogeno y posiblemente a

agua y por lo tanto, reduciría el oxigeno en la vecindad de la nitrogenasa

(Thorneley & Ashby, 1989). Además de esto, el uso de nitrogenasas alternativas

y la producción de polímeros como alginato y los PHBs (Polihidroxibutiratos) son

alternativas eficientes para proteger el complejo (Atlas & Bartha, 2002; Espin,

2002 <on line>).

2.3.2 Microorganismos diazotróficos simbióticos. Las bacterias diazotróficas simbióticas son aquellas que son capaces de fijar

nitrógeno atmosférico en simbiosis con las raíces de plantas leguminosas

(guisantes, judías, tréboles, alfalfa, entre otras). Estas raíces poseen pequeños

engrosamientos llamados nódulos que contienen bacteroides o rizobios, en esta

alianza, la planta suministra nutrientes y protección, mientras que el rizobio

proporciona a la planta nitrógeno fijado de la atmósfera (Espín, 2002 <online>).

Se han descrito 40 especies en 9 géneros de bacterias que forman nódulos en

leguminosas, sin embargo, existen bacterias simbióticas que pueden colonizar

otras plantas, Por ejemplo, Rhizobium leguminosarum y cepas fotosintéticas de

Bradyrhizobium se han encontrado en raíces de arroz (Yanni et al., 2001) ;

Rhizobium ettli en raíces de maíz (Gutierrez & Martinez, 2001) y Azorhizobium

caulinodans en las raíces de la oleaginosas (Brassica napus); los nódulos de las

raíces de aliso (Alnus) contienen bacterias del género Frankia, mientras que el

pequeño helecho flotante Azolla contiene Anabaena azollae dentro de cavidades

especializadas. Así mismo, se han detectado cepas pertenecientes a la

cianobacteria Nostoc en las raíces de corraloides de cícadas (Cycas,

Encephalatos, Zamia) de un jardín botánico mediante métodos basados en PCR.

Pisa, (2002), realizó una análisis filogenético amplificando el DNAr 16S con

primers especificos para diazótrofas de cepas simbióticas capaces de nodular

cultivos de frijol (Phaseolus vulgaris) en Brasil, encontrando un 42% de bacterias

del genero Rhizobium, 17% de Ralstonia y 6% de Burkholderia.

Una de las simbiosis más efectivas es la que se establece entre Bradyrhizobium

japonicum-Soya, donde un 70% de la fijación de nitrógeno por la bacteria es

asimilada por la planta. En Brasil se ha empleado con éxito la fertilización

biológica de soya con B. japonicum y 0% de aporte de nitrógeno como fertilizante

químico, ello ha conducido a que este país sea el segundo productor de soya a

nivel mundial (Baldani et al., 1997). En Colombia se han evaluado biofertilizantes

a base de Rhizobium en cultivos de maní, frijol y soya con resultados positivos

en la producción y en la disminución de costos (Torres, 2000 <on line>).

Asi mismo, la utilización de plantas fijadoras de nitrógeno como el trébol y la

alfalfa, pueden incluirse dentro de los esquemas de rotación de las cosechas;

plantas como la Azolla se utiliza como abono orgánico, una práctica común en el

sudeste de Asia, mientras que en los arrozales la fertilidad puede incrementarse

potenciando el crecimiento de cianobacterias autónomas fijadoras de nitrógeno

(Singleton, 2004). Por otro lado, Santillana et al., (2005), comprobaron la

capacidad de Rhizobium para promover el crecimiento de plantas de tomate

(Lycopersicon esculentum Miller), evidenciando la producción de sustancias

promotoras de crecimiento de tipo citoquininas, ácido indol acético y ácido

giberélico.

La simbiosis Rhizobium-Leguminosas es el resultado de una interacción muy

específica entre la bacteria y la planta (Singleton, 2004). La formación del nódulo

es un proceso inducido por un intercambio de señales entre los dos participantes

de la interacción; sustancias con efecto mitógeno (factores de nodulación) son

sintetizadas por los genes de nodulación del microsimbionte (genes nod), en

respuesta a la excreción por la planta de sustancias de tipo flavonoide (Baca et

al., 2000). Se han reportado que existen alrededor de 26 genes nod expresados

en el proceso de nodulación y 26 genes nif expresados en la fijación de

nitrógeno, los cuales codifican para 416 proteínas involucradas en estos dos

sistemas (Freiberg et al., 1997). Sin embargo, Kaneko et al., (2000), identificaron

39 genes cromosomales involucrados en el proceso de nodulación y 46 en la

fijación de nitrógeno.

2.3.3 Microorganismos diazótrofos asimbióticos. Las bacterias diazótrofas asimbióticas son aquellas que pueden fijar nitrógeno

atmosférico sin la necesidad de formar una simbiosis con plantas, ya que estas

poseen diferentes estrategias para proteger el complejo nitrogenesa. Estas

bacterias se encuentran prácticamente en todos los hábitats: suelo, mar, fuentes

de agua dulce y sedimentos. Entre los principales géneros bacterianos que se

hallan en vida libre o endófitos asociados a la rizosfera se encuentran:

Azotobacter spp., Azotococcus spp., Azospirillum spp., Beijerinckia spp.,

Azotomonas spp., Bacillus spp., Citrobacter spp., Clostridium spp., Chromatium

spp., Chlorobium spp., Desulfovibrio spp., Desulfomonas spp.,

Gluconacetobacter spp., Herbaspirillum spp., Klebsiella spp. (Rodríguez et al.,

2003).

Magalãhes et al., (2001), aislaron y caracterizaron molecularmente 38 cepas

fijadoras de nitrógeno de la rizosfera, hojas y tallos de cultivos de piña y banano

en Rio de Janeiro (Brasil); caracterizaron cepas de Herbaspirillum seropedicae,

Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y Burkholderia

tropicalis, mostrando la gran diversidad de bacterias fijadoras de nitrógeno

asimbioticas en suelos tropicales. Torres et al., (2000), aislaron 18 cepas del

género Azotobacter de 20 cultivos de arroz en el Tolima (Colombia), las cuales

producían importantes concentraciones de de acido indol acético (AIA),

incluyendo A. vinelandi con 32.22 ppm y A. chroococcum con 30.07 ppm de AIA.

Por otro lado, Aquilanti et al., (a) (2004), aislaron bacterias diazotróficas

asimbióticas de la rizósfera de cultivos de maíz, trigo y hortalizas en Italia, los

géneros encontrados fueron de la familia Azotobactereaceae, al igual que

miembros del géneros Beijerinckia, Azomonas y Agrobacterium. Tejera et al.,

(2005), aislaron cepas de A. chroococcum y Azospirillum spp. de la rizósfera de

cultivos de caña de azúcar en Granada España, utilizando medio libre de

nitrógeno (Burk`s) (Martínez et al., 1985) para su aislamiento, las cepas fueron

identificadas y caracterizadas por medio de métodos convencionales (motilidad,

producción de pigmentos, fermentación de azúcares, producción de PHBs y

morfología de la colonia y celular) y moleculares (Rep- PCR y ARDRA).

Entre las bacterias diazótrofas asimbióticas utilizadas como biofertilizantes una

de las más importantes es Azotobacter spp, la importancia agronómica de esta

radica especialmente en la capacidad de producir antibióticos, sustancias

estimulantes del crecimiento vegetal (SPCV) del tipo auxinas, giberelinas y

citoquininas (Pandey & Kumar, 1990); además de la fijación de nitrógeno,

producción de vitaminas, pigmentos, (Pandey et al., 1998) aminoácidos y otras

moléculas con actividad biológica de interés industrial y comercial como

polisacáridos (Sabra et al., 2001; Cuesta et al., 2006.). CORPOICA produce

biofertilizantes a base de A. chroococcum (Monibac), su forma de presentación

es líquida, su concentración es de 107 UFC/g y ha sido utilizado en cultivos de

algodón, tomate y ají (CORPOICA, 2007 <online>). Bacterias del género

Azotobacter han sido utilizadas como bioinoculantes en cultivos agrícolas

colombianos. El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) mediante la resolución

00375 define bioinoculante como aquel producto elaborado con base en una o

más cepas de microorganismos benéficos que, al aplicarse al suelo o a las

semillas, promueven el crecimiento vegetal o favorece el aprovechamiento de

los nutrientes en asociación con la planta o su rizósfera (ICA, 2004), su uso

favorece a procesos limpios y rápidos de origen microbiano, están elaborados de

diferentes grupos de microorganismos: bacterias, hongos y algas (Garzón et al.,

2001).

El control de calidad y la vigilancia de estos productos en Colombia esta a

cargo del ICA, en general un bioinoculante debe cumplir con adecuada

concentración bacteriana, especificidad para la estimulación del crecimiento

vegetal y para su formulación comercial deben presentar lote y fecha de

vencimiento además de cumplir con las condiciones de almacenamiento

adecuadas (Bashan, 1998). Para bioinoculantes a base de Azotobacter el

inóculo debe presentar una concentración de 1x105 UFC/ml, sin embargo, estas

concentraciones varían de acuerdo al cultivo a manejar. En Colombia existen

diversas empresas encargadas en la producción e importación de estos

bioinoculantes, entre las empresas registradas por el ICA se encuentra

Agrotecnia LTDA, Biocultivos S.A, Eco Organics LTDA, Microagro LTDA, Safer

Agrobiologicos, Fingifert Oriente Colombiano LTDA entre otras (ICA, 2007

<online>)

Neeru et al., (1991), utilizaron A. chroococcum como bioinoculante en la India

para una variedad de cereales, oleaginosas y vegetales obteniendo resultados

favorables en el peso seco de la planta y la producción de grano. Igualmente

Galindo et al., (2006), inocularon bacterias diazotrófas (A. vinelandii) y

solubilizadores de fosfato en plántulas de mangle y plantas de Citrullus vulgaris

en la isla de San Andrés (Colombia) incrementando la altura de las plantas, el

número de hojas y de nodos. Los bioinoculantes en Colombia también se han

utilizado en cultivos de crisantemo (Santana et al., 2002), pompón y clavel

(FUNDASES, 2007 <online>).

García et al., (2005), mediante la inoculación de Azotobacter beijerinckii y

Azospirillum spp. lograron aumentar la absorción de urea y la trasformación de

los exudados radicales en SPCV, incrementando el peso fresco y seco del trigo

inoculado. Estudios realizados en la India indican que los beneficios obtenidos

en la inoculación de semillas con Azotobacter son marginales en suelos con

pobre contenido de materia orgánica, pero muy favorables en suelos con mucha

carga orgánica (Stevenson et al., 2000). Está documentado que bacterias del

género Azotobacter y Azospirillum han utilizadas en sistemas de acuacultura y

en producción de vermicompost para aumentar el contenido de nitrógeno y

fósforo del producto (Garg et al., 2001; Kumar & Singh, 2001).

2.5 Familia Azotobacteraceae.

La familia Azotobacteraceae pertenece a la subclase gamma de las

proteobacterias (Tchan, 1984), esta compuesta por bacterias fijadoras de

nitrógeno de vida libre que comúnmente habitan en suelo, agua y sedimentos.

Estudios de DNA ribosomal 16s (DNAr 16S) han identificado dos géneros en

esta familia, Azotobacter y Azomonas El género Azotobacter se diferencia de

Azomonas por la presencia de quistes pero no se puede diferenciar

morfológicamente de muchas otros géneros de bacterias diazotrófas como

Azospirillum y Beijerinckia; comprende siete especies: A. chroococcum, A.

vinelandii, A. beijerinckii, A. paspali (Doberienener & Day, 1975), A.

armeniacus, A. nigricans (Tchan & New, 1984(a)) y A. salinestris (Page &

Shivprasad, 1991). El género Azomonas comprende tres especies: A.

macrocytogenes, A. agilis, y A. insignis (Tchan & New, 1984(b)).

Los miembros de esta familia Azotobacteraceae tienen la capacidad de sintetizar

antibióticos y generar sustancias promotoras del crecimiento vegetal, (Pandey &

Kumar, 1990) además de fijar nitrógeno no simbióticamente, especies como A.

chroococcum y A. vinelandii son utilizadas como bioinoculantes en suelos

tropicales y alcalinos. Igualmente muchos miembros de la familia

Azotobacteraceae son utilizados para producción de compuestos de interés

comercial como polisacáridos, (Sabra et al., 2001) vitaminas y pigmentos

(Pandey et al., 1998). 2.6 Generalidades del género Azotobacter spp. Los microorganismos de este género comprenden bacterias con forma bacilar,

reaccionan a la tinción de Gram como Gram negativos y en cultivos viejos como

Gram variables, las células son ovoides y miden aproximadamente de 2µm a

4µm de diámetro, siendo las de mayor tamaño las de A. chroococcum que llegan

a medir hasta 6µm, puede llegar a formar cadenas de tamaños variables, la

forma de resistencia es el quiste (Figura 2), son aerobios pero algunos pueden

vivir en tensiones bajas de oxígeno y su movilidad se debe a flagelos perítricos

(Tabla 2), además, producen pigmentos solubles en agua en medios específicos

(Tabla 1) (Figura 3) (Saribay, 2003).

Figura 2. Quistes de Azotobacter spp. Fuente: Autor.

En medio libre de nitrógeno con glucosa como única fuente de carbono, las

células jóvenes de diferentes especies presentan una forma bacilar con

extremos redondeados (Figura 4B). Las células de cultivos viejos tienden a ser

elipsoidales y en ciertos casos es común observar gránulos sudanofílicos y

metacromáticos (PHBs) (Tejera et al., 2005; Segura & Espín, 1998). Las colonias

jóvenes de estos microorganismos son generalmente lisas, opacas poco

convexas y viscosas (Figura 4A).

Figura 3. Colonias de diferentes especies de Azotobacter spp. en medio diferencial LG. A) Azotobacter vinelandii DSM2289. B) Azotobacter armeniacus DSM2284 C) Azotobacter paspali DSM2283. Fuente: Aquilanti et al., (a) (2004). Pigmentación de diferentes especies en medio Ashby con benzoato. D) Pigmentación café característica de A. armeniacus, A. chroococcum y A. nigricans. E) Pigmentación negra-café característica de A. nigricans y A. chroococcum. F) Pigmentación verde-amarillo característica de A. vinelandii y A. paspali. Fuente: Autor. Tabla 1. Colores de pigmentos solubles en agua producidos por bacterias del género Azotobacter. Fuente: Holt, 2000

Pigmento A.

vinelandii

A.

beijerinckii

A.

paspali

A.

armeniacus

A.

nigricans

A.

chroococcum

Amarillo-Verde fluorescente

+ - + - - -

Verde D - - - - - Café-Negro - - - - D D Café-Negro a Violeta-Rojo

- - - + + -

Rojos-Violetas D - + + D - D: 11% – 89% de las cepas son positivas a producir pigmento. +: 90% o más de las cepas son positivas a producir pigmento. - : 90% o más de las cepas son negativas a producir pigmento.

Figura 4. A) Colonias de Azotobacter spp. en medio libre de nitrógeno. B) Morfología de las células de Azotobacter spp. Fuente: Autor.

Bioquímicamente son catalasa y oxidasa positivo, reducen el nitrato, producen el

sulfuro de hidrógeno e hidrolizan almidón, producen promotores de crecimiento

(giberelinas, auxinas y citoquininas) (Santana et al., 2002), las bacterias de este

género fijan asimbióticamente nitrógeno y son solubizadoras de fosfato, además,

realizan procesos de biodegradación de plaguicidas como el endosulfan (Castillo

et al., 2005). Son quimioorganotróficas, utilizan para su crecimiento azúcares,

alcoholes y sales inorgánicas. Son fijadores de nitrógeno en vida libre, fijan al

menos 10 mg de N2 por gramo de carbohidrato consumido (Holt, 2000).

Requieren molibdeno para fijar nitrógeno que puede ser parcialmente

reemplazado por vanadio. Al igual que los demás fijadores de nitrógeno

Azotobacter sp. es quimioheteròtrofo, utiliza como fuente de carbono y energía

una gran variedad de ácidos orgánicos, azúcares o sus derivados alcohólicos

como el manitol que es el sustrato más empleado para aislarlos y cultivarlos,

dentro las sustancias que utilizan como fuente de carbono y energía se

encuentra la fructosa, glucosa, sucrosa, acetato, fumarato, piruvato, succinato,

acetilmetilcarbinol y α-oxoglutarato (Tabla 2) (Holt, 2000).

Tabla 2. Movilidad, formación de filamentos y pruebas bioquímicas utilizadas para la caracterización del género Azotobacter spp. Fuente: Holt, 2000 Características y

Test/Especie A.

vinelandii

A.

beijerinckii

A.

paspali

A.

armeniacus

A.

nigricans

A.

chroococcum

Movilidad + - + + - -

Filamentos en cultivos jóvenes - b - b + - b - b - b

Oxidasa + D - D D D

Peroxidasa + + + D + + Nitrato-Nitrito + + + - + + Meso-inositol + D - D - -

Fructosa + + + + + +

Glucosa + + + + + + Sucrosa + + + + + + Malonato + + - - D D Benzoato D + - - - + Caproato + - - - - + Caprilato + - - + - - Maltosa + D - + D + Rafinosa D D - D D + Glicerol + D - - - D Sorbitol + D - + D + Manitol + D - + D +

Ramnosa + - - - - - - b: Estas especies podrían producir esporádicamente filamentos de diferente longitud D: 11% - 89% de las cepas son positivas +: 90% o más de las cepas son positivas - : 90% o más de las cepas son negativas Respecto a la fuente de nitrógeno pueden utilizar nitrato, sales de amonio y

aminoácidos, pero ellos pueden además fijar el nitrógeno del ambiente (Garzón

et al., 2001), sin embargo, la adición de nitrato de potasio mejora la producción

de biomasa (Santana et al., 2002). Adicionalmente necesita fuente de magnesio,

potasio, calcio, hierro y fósforo para realizar la fijación de nitrógeno. Su

crecimiento es normal cuando se encuentra a pH de 7.0 - 7.5, requieren una

temperatura óptima de 30ºC, susceptibles a pH ácido, (Balandreau, 1986) altas

concentraciones de NaCl y temperaturas mayores a 35ºC (Saribay, 2003).

2.6.1 Azotobacter chroococcum. En medios libres de nitrógeno A. chroococcum produce un pigmento café-negro

no difusible, estos se producen en presencia de benzoato. También produce

pigmentos grises-cafés en medios adicionados con 0.2% de gluconato. Sobre

medios libres de nitrógeno esta bacteria forma colonias mucilaginosas pardas las

cuales aparecen a las 48 horas a 30ºC. A. chroococcum presenta colonias

mucosas opacas, inicialmente el color del pigmento es claro y brillante, pero a

medida que la colonia se desarrolla se torna de color café oscuro, la fuente

principal de carbono es el manitol (Santana et al., 2002). A. chroococcum

puede llegar a crecer en un pH alrededor de 5.5 (Saribay, 2003).

A. chroococcum puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico como

amonio, nitrato, nitrito o dinitrógeno, este microorganismo realiza la asimilación

de nitrógeno en tres pasos: transporte del nitrato dentro de la célula, reducción

del nitrato a nitrito (Nitrato reductasa) y la reducción de nitrito a amonio (Nitrito

reductasa), sin embargo, estos pasos requieren de dos condiciones

nutricionales, la ausencia de amonio (represor) y la presencia de nitrato o nitrito

(inductores). Se ha reportado la presencia de dos polipéptidos con masas

moleculares de 22kDa (P22) y 35kDa (P35), la expresión de estos genes es

regulada por las fuentes de nitrógeno. La P22 esta asociada a la membrana

citoplasmática y es fosforilada en respuesta al nitrato, este polipéptido es una

proteína sensorial para la asimilación de nitrato en A. chroococcum (Muñoz et

al., 1996).

Además de la fijación de nitrógeno y excreción de amonio al medio, esta especie

tiene la propiedad y la capacidad de biodegradar compuestos tóxicos y

contaminantes; tener efecto antagónico con patógenos (Hongos y Nematodos),

en cultivos agrícolas, solubilizar fosfato tricalcico y producir fitohormonas. Es una

bacteria que metaboliza compuestos fenólicos como, ácidos p-hidroxibenzoico,

vanilinico, p-cumarico, ferulico y 4-hidroxifenilacetico, compuestos que se

encuentran en aguas residuales procedentes de la extracción de aceite de oliva,

estos ácidos tienen un efecto antibacterial, fitotóxico y generan coloración a las

aguas residuales, debido a esto, son compuestos con alta carga contaminante

para el ambiente (Sarybay, 2003; Juárez et al., 2004). Además de esto, tiene la

capacidad de degradar plaguicidas cloroaromáticos contaminantes como el

endosulfán por medio de enzimas deshalogenasas, dioxigenasas e hidroxilasas

(Castillo et al., 2005). Por otro lado, Sudhir et al.,(1983), reportaron que A.

chroococcum tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de Rhizoctonia solani

en cultivos de papa a temperaturas de 15°C. Bansal et al., (1999) determinaron

el efecto de bacterias rizosféricas en cultivos de maíz infestados con el

nematodo patógeno Heterodera avenae, reportando que la máxima reducción de

infección la produjo A. chroococcum con un 48% seguido por Pseudomonas con

11% y Azospirillum con 4%.

2.6.2 Azotobacter vinelandii. Azotobacter vinelandii es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de

su cromosoma, se calcula que pueden tener hasta 80 copias. El número de

copias varía dependiendo del medio y las condiciones de cultivo así como de la

fase de crecimiento. Es de tamaño muy grande de 2 a 5 µm de diámetro es decir

de 5 a10 veces el volumen de E. coli, se ha asociado el tamaño con la poliploidía

(Nagpal et al., 1989).

La capacidad metabólica y genética por las que A. vinelandii ha sido y es objeto

de estudio en biofertilización y biotecnología incluyen la fijación de nitrógeno en

presencia de oxígeno por tres sistemas diferentes de nitrogenasa; presencia de

mecanismos de protección de la nitrogenasa ; alta capacidad respiratoria que en

condiciones diazotróficas o de fijación de nitrógeno es hasta 10 veces más alta

que la de E. coli ; la formación de estructuras de resistencia frente al estrés

ambiental (quistes) y la producción de polímeros de uso industrial como el

alginato y el polihidroxibutirato (Espin, 2002). A. vinelandii fija nitrógeno en

aerobiosis gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su

nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección respiratoria,

autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que le permiten crecer

diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas (Manchal et al., 2000).

A. vinelandii posee tres tipos de nitrogenasas diferentes para la fijación de

nitrógeno; la nitrogenasa 1 codificada por el gen nifHDK, la nitrogenasa 2 es

dependiente de vanadio y los genes que codifican para las dos proteínas están

designados con el nombre de vnf y se encuentran en los operones vnfHorfFd y

vnfDGK y la nitrogenasa 3 la cual es fabricada en condiciones deficientes de

molibdeno y vanadio esta codificada por el gen anfHDK (Figura 5) (Betancourt,

2002). La comparación de las secuencias entre estos genes indican que el

porcentaje de identidad entre los genes nifH y vnfH es del 88.5%, sugiriendo que

provienen de un gen ancestral. Por otro lado, el porcentaje de similitud entre las

secuencias de los genes nifH y anfH se encuentra alrededor del 70%. Los

genes vnfDK y anfDK muestran una mayor similitud en su secuencia al

compararlos con lo genes nifDK, reportando un porcentaje de similitud de 65.8%

entre los genes vnfK y anfK y una similitud de 65.8% entre los genes vnfD y anfD

(Joerger et al., 1989; Joerger et al., 1990)

Figura 5. Esquema de la organización de los genes involucrados en la síntesis de las tres nitrogenasas utilizadas por A. vinelandii en la fijación de nitrógeno. Fuente: Betancourt, 2002

2.7 Técnicas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias diazotrófas Diversos estudios se han realizado en la caracterización, identificación y

taxonomía de la diversidad biológica de bacterias diazotrófas. Las técnicas

moleculares mas utilizadas a nivel mundial son DGGE (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphisms), ARDRA

(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) y la secuenciación. Estas técnicas permiten conocer la

diversidad genética de forma precisa en ambientes complejos como la rizosfera

en donde pueden habitar las bacterias fijadoras nitrógeno. Los genes nif y el gen

DNAr 16S han sido reportados para la caracterización de diferentes géneros

diazótrofos, ya que son muy conservados y se encuentran en todos

microorganismos fijadores de nitrógeno. Lovell et al., (2000), realizaron un

DGGE para evaluar la diversidad de bacterias diazótrofas en cultivos de Spartina

alternifora y realizaron una PCR de genes nifH, logrando identificar bacterias

diazótrofas de la subdivisión beta de las proteobacterias. Yeager et al., (2004),

realizaron un T-RFLP del gen nifH utilizando la enzima RsaI para caracterizar la

comunidad diazótrofa en un bosque australiano el cual había sufrido un incendio

forestal, reportando cepas diazótrofas del genero Clostridium y Paenibacillus

R`sch et al., (2002) utilizaron la secuenciación de los genes nifH, nosZ, nirS y

nirK para realizar un estudio de diversidad de bacterias diazótrofas y

desnitrificantes en bosques de suelos ácidos en Alemania. Igualmente Roesch et

al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas asociadas a

cultivos de maíz, amplificando el gen nifH del DNA extraído directamente del

suelo con iniciadores nifHFor y nifHRev, y realizaron un análisis RFLP con

enzimas de restricción TaqI y HaeIII, reportando bacterias del género

Herbaspirillum, Azoarcus, Burkholderia y Azospirillum. Además de esto, Soares

et al., (2003), realizaron una comparación entre RFLP, RAPD y secuenciación

parcial del gen DNAr 16S en cepas de Herbaspirillum en Curitiba (Brasil).

Muchos estudios han dado por manifiesto la importancia de las nuevas técnicas

moleculares en la caracterización de bacterias diazótrofas, sin embargo, estos

estudios son una pequeña muestra de la gran cantidad de investigaciones y de

herramientas moleculares para la caracterización e identificación de bacterias

diazótrofas.

2.7.1 Aplicaciones del DNA ribosomal 16S y su utilización en filogenia y taxonomía El DNAr 16S es un polirribunucleotido codificado por el gen rrs también

denominado RNA ribosomal 16S, apartir de cuya secuenciación genética se

puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia

de nucleótidos de cadena sencilla, el DNAr 16S se pliega en una estructura

secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena,

alternando con regiones de cadena sencilla (Neffs et al.,1990). En eucariotas el

DNAr 18S es la macromolécula equivalente. Dado que los DNAr 16S y 18S

proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo DNAr

SSU (del inglés, Small Subunit) se utiliza para ambos (Rodicio & Mendoza,

2004). Los DNAr SSU son altamente conservados, presentando regiones

comunes a todos los organismos, pero contienen variaciones que se concentran

en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los DNAr 16S de distintos

grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia práctica: La

presencia de una o más secuencias características que se denominan

oligonucleótidos firma, se trata de secuencias específicas cortas que aparecen

en todos (o en la mayor parte de) los miembros de un determinado grupo

filogenético, y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos,

incluidos los más próximos. Por ello, los oligonucleótidos firma pueden utilizarse

para ubicar a cada bacteria dentro de su propio grupo (Rodicio & Mendoza.,

2004; Heyndrickx et al., 1996).

La comparación de las secuencias del DNAr 16S es una herramienta poderosa

para deducir la filogenia, la evolución y la relación entre bacterias,

arqueobacterias y organismos eucariotas. Estas secuencias han sido derivadas

previamente de métodos como catalogación de oligonucleotidos, secuenciación

de clones, secuenciación directa de DNA usando trascriptasa reversa y

secuenciación de material amplificado por reacción de cadena de polimerasa

(PCR) (Weisburg et al., 1991). Aunque existen cronómetros moleculares

alternativos al DNAr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarlo.

Este marcador molecular presenta una serie de ventajas: 1) está presente en

todos los organismos y tiene la misma función en todos ellos; 2) debido a

restricciones estructurales, diferentes regiones de la molécula presentan distinto

grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con

diferente nivel de resolución; 3) su transmisión es principalmente vertical ya que

se considera que no está sujeto a transferencia génica horizontal entre

microorganismos; 4) la longitud de su secuencia tiene un tamaño adecuado

como para proporcionar suficiente información, con un coste asumible, y 5) el

análisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenéticas de los

microorganismos. (Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005). La identificación basada en la secuenciación del gen que codifica el DNAr 16S

en los laboratorios microbiológicos se centra en cepas cuya identificación por

métodos fenotípicos resulta imposible, es el caso de bacterias no cultivables,

hecho que en ocasiones ha conducido al descubrimiento de nuevos

microorganismos; bacterias cuyas características bioquímicas no se adaptan a

las de ningún género o especie reconocido, esta situación puede presentarse

cuando se trata de nuevas especies; cepas de especies comunes que exhiben

un perfil bioquímico ambiguo; bacterias para las cuales la caracterización

fenotípica sea sustancialmente deficiente; bacterias fastidiosas, a consecuencia

de sus requerimientos nutricionales complejos y bacterias de crecimiento lento,

que retrasa considerablemente la identificación convencional. (Rodicio &

Mendoza, 2004)

2.7.2 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA) Una alternativa para buscar la información filogenética y taxonómica que

encierra el DNAr 16S es el análisis del patrón electroforético obtenido después

de la digestión del gen con enzimas de restricción. La relación matemática entre

el número de los sitios compartidos por la enzima de restricción o de los

fragmentos compartidos del DNA es lo que entra en discusión para identificar la

divergencia genética. Los modelos matemáticos para hallar la similaridad de los

patrones de corte se basan en el uso de matrices binarias utilizando coeficientes

de similitud como el de Dice, Jaccard, Nei & Li, entre otros. Estos coeficientes

permiten agrupar a los morfotipos en clústers que identifican la distancia

genética mediante el uso de métodos de análisis de agrupamiento tales como el

Neigboring-Joing y UPGMA. En los últimos años, la amplificación del DNAr 16S

y el análisis de restricción se ha realizado en diferentes géneros como:

Clostridium, Streptocooccus, Mycobacteria, Moraxella, Leptospira Rhizobia,

Brevibacterium, Acinetobacter, entre otros (Heyndrickx et al., 1996).

2.7.3 Caracterización, identificación y filogenia del género Azotobacter y otras bacterias diazótrofas mediante ARDRA El análisis de restricción de DNAr 16S ha sido reportado por muchos autores

para realizar caracterización filogenética de baterías diazótrofas, sin embargo, un

punto critico de este análisis es la correcta identificación de las enzimas para una

caracterización adecuada. Debido a que las endonucleasas reconocen solo

ciertas secuencias de nucleótidos, el uso de estas debe generar una

diferenciación clara, es decir, deben reconocer sitios de corte en el gen DNAr

16S de diazótrofas y generar morfotipos diferentes para obtener porcentajes de

polimorfismo altos, con el fin de diferenciar las secuencias amplificadas. Las

herramientas de bioinformáticas han sido fundamentales para los análisis de

restricción ya que permiten simular los cortes de una enzima en determinada

secuencia, y de esta forma distinguir las enzimas que pueden proporcionar una

mayor información. Existen diferentes programas en internet para realizar

restricciones virtuales, entre los que se encuentran el FastPCR, CLC Gen

Worbech 2.2.4 y el Webcutter 2.0, además, existen diferentes enzimas de

restricción reportadas para la caracterización de diazótrofas. Aquilanti et al., (a)

(2004), compararon diferentes métodos de aislamiento preliminar y tomaron

muestras de suelo en el centro de Italia para realizar un análisis ARDRA,

utilizando los iniciadores universales 27f y1495r, que amplificaban el DNAr 16S

completo (1500 bp) para posteriormente realizar una digestión con las enzimas

de restricción RsaI y HhaI, identificando miembros de la familia

Azotobactereaceae, además especies del género Azomonas, Beijerinckia,

Azospirillum y Agrobacterium, reportando que la enzima Rsa I genera un patrón

de 5 bandas en la electroforesis para las especies del género Azotobacter.

De la misma forma, Magalãhes et al., (2001), realizaron una caracterización de

diazótrofas mediante ARDRA en aislamientos de muestras de suelo obtenidas

en cultivos de piña y banano utilizando los iniciadores universales Y1 y Y3 que

amplifican aproximadamente 1500 pb, utilizando enzimas de restricción AluI,

HaeII, HinfI y RsaI identificando bacterias diazotróficas: Herbaspirillum

seropedicae, Herbaspirillum rubrisubalbicans, Burkholderia brasilensis, y

Burkholderia tropicalis. Tejera et al., (2005), amplificaron el DNAr 16S utilizando

los iniciadores universales 41f y 1488r para especies de Azotobacter y utilizaron

las enzimas TaqI, NdeII y MspI para el análisis de restricción, reportando la

presencia de A. chroococcum y Azospirillum brasilense en cultivos de caña de

azúcar.

Perin et al., (2006), realizaron una caracterización de bacterias diazótrofas del

género Burkholderia aisladas de cultivos de maíz y caña de azúcar en México y

Brasil amplificando el DNAr 16S con los iniciadores universales para el dominio

bacteria fD1 y rD1 utilizando las enzimas AluI, DdeI, HaeIII, HhaI, HinfI, MspI, y

RsaI. Junior et al., (2004), realizaron una identificación de cepas de Azospirillum

asociados a Brachiaria spp. utilizando los iniciadores Y1 y Y3 para amplificar el

gen DNAr 16S y utilizaron las enzimas HaeIII, AluI, RsaI y CfoI, los patrones de

restricción fueron comparados utilizando el coeficiente de Jaccard (Rohlf, 2000) y

los aislados fueron agrupados por el método de medias distancias y

representados gráficamente por un dendrograma con el software NTSYS 2.0.

Aquilanti et al., (b) (2004), realizaron un análisis de restricción del DNAr 16S para

la caracterización de la familia Azotobactereaceae, utilizando iniciadores

universales 27f y 1495r amplificando 1500 bp y posteriormente utilizando unos

iniciadores internos Y1 y Y2 amplificando 300 bp en el extremo 5', para después

realizar la secuenciación del gen, utilizaron las enzimas RsaI, HhaI, HpaII,

FnuDII y AluI e identificaron las diferentes especies del genero Azotobacter,

seleccionaron las enzimas con ayuda de una restricción virtual del gen DNAr 16S

de secuencias de Azotobacter sp. y Azomonas sp. tomadas del Genbank,

utilizaron el programa Genetool software (Version 2.0) (Wishart et al., 2000), los

datos los organizaron en una matriz binaria de presencia (0) ausencia (1) de

bandas en los patrones de corte. Los diferentes patrones de corte de cada cepa

caracterizada con cada enzima fueron diferenciando y definiendo los haplotipos

y la combinación de los haplotipos obtenidos con las 5 enzimas fueron

agrupados generando los filotipos (Tiedje et al., 1999).

Asi mismo, Aquilanti et al., (b) (2004), hallaron la diversidad de los haplotipos, la

cual fue estimada usando el coeficiente de Shannon–Weaver: H= - £pi lnpi,

donde pi es la frecuencia de cada haplotipo (Shannon & Weaver, 1949). La

distancia genética entre los filotipos fue calculada utilizando el coeficiente de Nei

y Li (Nei & Li, 1979), y el resultado de la distancia en la matriz fue usado para el

análisis UPGMA y el análisis Neighbor-joining mid-point. La secuencia del gen

16S en todos los aislamientos estudiados fue comparada empleando el

programa Basic BLAST y los alineamientos usando el programa CLUSTALW

(Higgins et al., 1992) disponible en http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Los autores

reportaron el porcentaje de polimorfismo de cada enzima (RsaI 16%, HhaII 24%,

AluI 23%, HpaII 22%, FnuDII 15%) y concluyeron que la enzima RsaI posee un

bajo porcentaje diversidad 1.79, comparado con las enzimas HpaII y AluI

El análisis de restricción del DNA ribosomal 16S se ha utilizado para filogenia de

bacterias fototróficas de Rhizobium (Young et al., 1991), identificación de

especies de Micobacterias (Kurabachew et al., 2003), identificación de especies

de Actinomyces en aislados de muestras clínicas (Hall et al., 2001), identificación

para delinear las especies del bacterioplancton marino (Hagstrom et al., 2002) y

la identificación de diferentes bacterias importantes en biotecnología. Esto

demuestra que las técnicas moleculares como el ARDRA son muy útiles en la

identificación y caracterización de diferentes grupos de microorganismos y que

genera una identificación precisa de bacterias diazótrofas en suelos. Así mismo,

se constituye en una herramienta importante en estudios de filogenia,

taxonomía y ecología microbiana.

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

Los procedimientos convencionales para la caracterización e identificación de

microorganismos diazótrofos empleando características fenotípicas, (forma

bacteriana, presencia de flagelos y test de Gram) bioquímicas (asimilación de

azucares, crecimiento en medios libres de nitrógeno, pruebas de oxidasa y

catalasa) y fisiológicas (crecimiento a diferentes temperaturas, condiciones

atmosféricas, concentración de sal y valores de pH) son métodos que permiten

identificar solamente algunos géneros de bacterias cultivables presentes en un

agroecosistema, además, son métodos que manifiestan un mayor grado de

ambigüedad entre especies y por esto la identificación y caracterización se hace

mas difícil.

Los microorganismos diazótrofos, descritos desde el siglo pasado, han sido

objeto no solo de estudio en microbiología de suelos, sino también en el

desarrollo de productos biológicos comerciales, especialmente en Cuba, México

y Estados Unidos. En este momento en Colombia, donde se han aislado

numerosas cepas asociadas a cultivos de importancia agrícola (arroz, caña,

maíz, hortalizas, algodón, banano, flores, etc.,), se cuenta con productos

comerciales registrados que contienen bacterias fijadoras de nitrógeno de vida

libre o simbiótica, con miras a ser utilizados para reducir o complementar la

fertilización química nitrogenada. Sin embargo, el control de calidad de estos

productos y la caracterización de los aislamientos se dificultan por la similitud

macro y microscópica de los mismos, haciendo que los análisis moleculares

sean la única herramienta realmente precisa.

El análisis del DNA ribosomal 16S suministra información importante sobre la

identidad de bacterias diazótrofas del género Azotobacter, y permite establer las

relaciones filogenéticas entre individuos del mismo agroecosistema. El análisis

de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado a partir de muestras de suelo

de un agroecosistema proporciona un panorama claro de la diversidad presente

y lo convierte en una herramienta útil para la caracterización de microorganismos

no cultivables, de crecimiento lento o de aquellos con necesidades nutricionales

complejas.

La ejecución de esta propuesta pretende caracterizar cepas nativas colombianas

de la familia Azotobacteraceae, de la cual muchas especies se utilizan en la

industria agrícola como biofertilizantes. Además se procura establecer

protocolos de extracción y amplificación de ADN con el fin de validar esta

metodología para el control de calidad de bioproductos que contengan bacterias

diazótrofas e incluirla en el portafolio de servicios del Laboratorio de

Microbiología Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana.

4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general.

Caracterizar molecularmente cepas nativas Colombianas de Azotobacter

spp. aisladas de cultivos de hortalizas mediante el Análisis de Restricción

del DNA Ribosomal 16S Amplificado (ARDRA)

4.2 Objetivos específicos.

Aislar cepas nativas colombianas de Azotobacter spp. en suelos de

cultivos de hortalizas ubicados en el departamento de Boyacá

Identificar fenotípica y bioquímicamente cepas de Azotobacter spp.

aisladas de suelos de cultivos de hortalizas ubicados en el departamento

de Boyacá.

Estandarizar un protocolo para extraer DNA total y amplificar el DNA

ribosomal 16S de cepas nativas de Azotobacter spp.

Analizar y comparar los patrones de corte generados por las enzimas de

restricción (AluI, HpaII y RsaI) sobre el DNA ribosomal 16S amplificado a

partir de cada uno de aislamientos.

Realizar un análisis filogenético de las diferentes cepas nativas aisladas.

5. METODOLOGIA 5.1 Lugar de muestreo El muestreo de suelo se realizó en los municipios de Sogamoso y Tibasosa en el

departamento de Boyacá. Se muestrearon 6 cultivos de hortalizas (brócoli,

calabacín, coliflor, espinaca, tomate y zanahoria).

Se obtuvieron muestras de suelos de cultivos de calabacín (Cucurbita pepo),

espinaca (Spinacia oleracea) y tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en la

granja agroindustrial de Cementos Paz del Rio en el municipio de Sogamoso

ubicado a 170 Km de la ciudad de Bogotá, la cual cuenta con una ubicación

geográfica de 5°43’41’’de latitud norte y 72°55’13’’ longitud oeste, con una

temperatura promedio de 17°C y una altura de 2500 msnm. Las muestras de

suelos de los cultivos de brócoli (Brassica oleracea itálica); coliflor (B. oleracea

botrytis) y zanahoria (Daucus carota var. Sativus) fueron colectadas en una finca

particular productora de hortalizas del municipio de Tibasosa, ubicado

geográficamente a 5°44’00’’ latitud norte y 73°00’04’’ longitud oeste, cuenta con

una temperatura promedio de 15°C y una altura de 2748 msnm. (Figura 6)

Figura 6. Lugar de muestreo en el departamento de Boyacá.

5.2 Muestreo del suelo De cada cultivo de hortalizas se tomaron cinco muestras de 500g (Figura 7A) a

una profundidad de 10 a 15 cm (Martyniuk & Martyniuk 2003; Tejera et al.,

2005), el muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo (Torres et

al., 2000). Las muestra se empacaron en bolsas de papel que se colocaron

dentro de bolsas de plástico herméticas y posteriormente fueron trasportadas en

neveras de icopor a temperatura ambiente al laboratorio de Microbiología

Ambiental y Suelos de la Pontificia Universidad Javeriana (Figura 7B).

Figura 7. Recolección de las muestras de suelo. A) Muestras de 500 gramos; B) Trasporte de las muestras en bolsas herméticas y neveras de icopor. Fuente: Autor. 5.3 Procesamiento de muestras Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo fueron tamizadas en un tamiz

estándar de 4.75 mm (Aquilanti et al., 2004 (a)), con el fin de obtener gránulos

uniformes, para realizar el aislamiento primario. 5.3.1 Medición de pH de las muestras de suelo La medición del pH se realizó siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop,

1981; se colocó en un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en

proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión se dejó precipitar durante 5

min y se tomó el valor de pH del sobrenadante con un potenciómetro OAKTON®.

Los valores de pH fueron promediados a partir de cuatro mediciones en cada

cultivo.

5.3.2 Aislamiento primario A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realizó

el aislamiento primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo;

que consiste en colocar 20 gránulos en cajas de Agar Ashby-Sacarosa a una

distancia aproximada de 1 cm (Figura 8A) (Anexo 1) (Aquilanti et al., 2004 (a);

Pochon, 1975). Las cajas se incubaron a 28°C por 7 días hasta observar

alrededor de los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas (Figura 8B). Se

realizó el recuento de gránulos con colonias, con el fin de obtener el porcentaje

de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas para cada cultivo

(% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de

gránulos sembrados X 100) y se realizó coloración de Gram.

Figura 8. Aislamiento primario. A) Siembra de gránulos en agar Ashby-Manitol; B) gránulos mucilaginosos después de la incubación. Fuente: Autor. 5.4 Aislamiento secundario El aislamiento secundario se realizó mediante siembra por agotamiento en cajas

con Agar Ashby-Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento

primario. Las cajas fueron incubadas por 7 días a 28°C, posteriormente se

observó el crecimiento en el medio selectivo Ashby-Sacarosa, la morfología de la

colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. (Tejera et al., 2005).

Las cepas aisladas que presentaron crecimiento en el segundo aislamiento se

codificaron de acuerdo al cultivo de donde fueron aisladas.

5.4.1 Conservación de los aislamientos mediante la técnica de criopreservación en glicerol al 50% (v/v) A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizaron cultivos en erlenmeyer

de 100ml con 50ml de caldo nutritivo (Anexo 2), el cual se incubó a 28°C por 24

horas con agitación de 150 rpm. El cultivo fue depositado en 10 viales eppendorf

de 1.5ml con 50% v/v de glicerol puro y estéril. Los tubos eppendorf se

almacenaron en bolsas ziploc a - 80°C (Aquilanti et al., 2004 (a) Poutou et al.,

1994).

5.4.2 Pigmentación de los aislamientos Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada

aislamiento se realizó una siembra en agar diferencial Ashby con 5g/l de

Benzoato (Anexo 1) (Torres et al., 2000) remplazando la fuente de carbono

(Sacarosa) en cajas de petri pequeñas para observar la pigmentación en las

colonias. La siembra se realizó tomando una colonia de cada aislamiento y

realizando una estría en toda la caja, se incubo a 28°C por 7 días y se observó

pigmentación (Figura 9). (Martyniuk & Martyniuk 2002)

.

Figura 9. Siembra en estria en agar Ashby con benzoato. Fuente: Autor.

5.4.3 Identificación Bioquímica A cada aislamiento se le realizó una caracterización con base en el

comportamiento bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol

y ramnosa (Anexo 3) también se realizó una prueba de asimilación y crecimiento

en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación

en caldo nitrato (Holt, 2000; Tejera et al., 2005). La batería de azúcares fue

sembrada con una colonia de cada cepa, se llevó a incubar a 28°C por 24

horas. Posteriormente se verificó la acidificación del medio como indicativo de la

fermentación de azúcares y benzoato (Figura 10). Finalmente se realizó la

prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa

y oxidasa a partir de las colonias. (Anexo 4). Todas las pruebas bioquímicas se

realizaron por triplicado.

Figura 10. Baterías bioquímicas de azucares sin sembrar. A) Baterías bioquímicas servidas en placas de 24 pozos; B) Baterías bioquímicas servidas en tubos de 13X100. Fuente: Autor.

5.4.4 Cepa control Para la identificación bioquímica y la caracterización molecular se utilizó una

cepa A. vinelandii ATCC No. 12518 como control positivo, además se realizó la

caracterización a una cepa de Azotobacter aislada por Toro, (2006) en un cultivo

de papa (Solanum tuberosum L.) en el municipio de Tierra Negra (Boyacá).

5.5 Extracción de DNA Inicialmente la extracción de DNA se realizó siguiendo el protocolo descrito por

Aquilanti et al., (a) (2004) Para esto, se tomaron tres colonias y se suspendieron

en 500µl de agua destilada estéril. Se llevaron a centrifugar a 5000 rpm por 5

min, el “pellet” obtenido se resuspendió en 100µl de agua estéril más 100µl de

Tris-HCL 10mM a pH 8.2. Finalmente se adicionó 0.65µl de proteinasa K

(20mg/ml), se llevó a incubar a 55°C por 2 horas, posteriormente se centrifugó a

5000 rpm por 5 min y se tomó 2µl del sobrenadante para la reacción de

amplificación (PCR).

Considerando que la extracción a partir de colonias no fue exitosa se procedió a

realizar la extracción de DNA a partir de medio de cultivo liquido, siguiendo el

protocolo propuesto por Maloy (1989) (http://www.research.umbc.edu), que

utiliza solventes orgánicos como Fenol Cloroformo alcohol Isoamílico (FCI) y

Cloroformo alcohol Isoamílico (CI) para la remoción de proteína. Este protocolo

ha sido utilizado con éxito por investigadores del Instituto Amazónico de

Investigaciones Científicas (SINCHI) para la extracción de DNA de bacterias

diazótrofas. El procedimiento consistió en realizar una suspensión a partir de una

colonia de Azotobacter en 5ml de caldo nutritivo en tubo falcón de 15ml la cual

se llevó a incubar de forma inclinada 48 horas a temperatura ambiente a 150

rpm. Posteriormente el cultivo se colocó en 2 tubos eppendorf de 1.5ml (c/u con

1.5ml del cultivo); se centrifugaron a 13000 rpm por 2 min y se desechó el

sobrenadante.

Las células se resuspendieron en 50µl de TE 1X (Anexo 5) y se reunieron las

fracciones en un solo tubo eppendorf de 1.5ml; se agregó 1ml TE de 1X y se

lavó suavemente, agitando los tubos; se centrifugó a 13000 rpm/2 min y se

descartó el sobrenadante; se resuspendieron las células en 350µl de TE 1X y se

adicionó 5µl lisozima (50mg/ml) y 2µl RNAsa A (10mg/ml), se llevó a incubar 10

min a 37ºC; posteriormente se adicionó 3µl proteinasa K (20mg/ml) y 30 µl SDS

10% y se volvió a incubar a 15 min a 65ºC hasta observar una suspensión

translúcida que indicará la lisis bacteriana. Una vez lisadas las células, se

adicionó 350µl de la mezcla fenol cloroformo alcohol isoamílico (FCI) 25:24:1

(Anexo 6) y se mezcló por inversión 5 veces; se centrifugó el tubo 13000 rpm por

7 min; posteriormente, el sobrenadante se recuperó en un tubo eppendorf de

1.5ml, teniendo cuidado de no tomar la interface ni la fase orgánica (fenol); se

adicionó 350µl de una mezcla de cloroformo alcohol isoamílico (CI) 24:1 y se

mezcló por inversión 5 veces para volver a centrifugar a 13000 rpm por 7 min;

El sobrenadante obtenido fue transferido a un tubo de vidrio de 13X100 que

contenía 1ml de etanol absoluto (98%); se mezcló suavemente hasta observar el

DNA suspendido; posteriormente, con ayuda de una pipeta pasteur estéril se

tomó el DNA y se colocó en un tubo eppendorf que contenía 500µl de etanol al

70%, posteriormente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min. El pellet de DNA

obtenido se dejó secar durante 20 minutos a temperatura ambiente y finalmente

fue resuspendido en 50µl de agua destilada estéril para ser utilizado en la

reacción de amplificación (PCR).

5.6. Amplificación de DNA ribosomal 16S con iniciadores Y1 y Y3 Para lograr la amplificación del gen DNAr 16S se utilizaron los iniciadores

universales Y1 y Y3 que amplifican una región del DNAr 16S de la posición 20 a

la 1507 (1487 pb) de bacterias diazótrofas. (Magalãhes et al., 2001) (Tabla 3). La

amplificación se llevó a cabo en un volumen de 100µl que contiene: Buffer 1X;

2mM de MgCl2; 50µM de dNTPs; 0.2µM de iniciador Y1 y 0.2µM de iniciador Y3; 4U de Taq DNA polimerasa recombinante marca Biolase®; en un ensayo

preliminar de amplificación con cuatro volúmenes de DNA (1, 2, 3 y 4µl) se

determinó que el volumen del molde adecuado para una amplificación exitosa

era de 3µl (50ng aproximadamente) (Junior et al., 2004).

La reacción de amplificación (PCR) se llevó a cabó en un termociclador (My

cycler de Biorad® con un paso inicial de denaturación de 93ºC por 2 min; 35

ciclos con un programa de temperatura que consiste en: denaturación a 93ºC por

45 seg; anillamiento a 62ºC por 45 seg y elongación a 72ºC por 2 min; y un

paso final de extensión de 72ºC por 5 min (Junior et al., 2004). Tabla 3. Secuencia y número de pares de bases de los iniciadores utilizados para la amplificación del DNAr 16S de bacterias diazótrofas.

INICIADORES SECUENCIA PARES DE BASES (pb)

Y1 Forward 5'-TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC-3' 24

Y3 Reverse 5'-TACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC-3' 26

Para observar los productos de la amplificación del DNAr 16S se corrió una

electroforesis en gel de agarosa al 1.0 % (p/v) en TBE 1X (Anexo 7), con

0.5µg/ml de bromuro de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara

Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm por 1 hora. Se colocaron en cada

pozo 15µl del producto de amplificación con 3µl de buffer de carga 6X; se utilizó

el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). La visualización de las

bandas se realizó en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron

fotografiados en el equipo Gel Documentation de Biorad®

5.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S amplificado (ARDRA) Los productos de PCR fueron digeridos con las enzimas de restricción: AluI,

(Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (b)) HpaII (Aquilanti et al., 2004 (b))

y RsaI (Magalãhes et al., 2001; Aquilanti et al., 2004 (a) (b)).

La digestiones se llevaron a cabo por separado con cada enzima en un volumen

final de 40µl que contenian: 2.5U de cada una de las enzimas AluI, HpaII y RsaI

(Promega®); Buffer 1X; 0.1mg/µl de albumina de suero bovina (BSA); 25µl de

producto de amplificación. Todas las digestiones fueron incubadas en baño de

agua a 37°C por 3 horas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Las enzimas utilizadas y su correspondiente sitio de corte se encuentran en la

tabla 4.

Tabla 4. Enzimas de restricción utilizadas en los ensayos de ARDRA.

ENZIMA SITIO DE RESTRICCION

AluI (5'- AG / CT - 3') (3'- TC / GA -5') HpaII (5'- C / CG G- 3') (3'- G GC / C-5') RsaI (5'- GT / AC- 3') (3'-CA / TG-5')

5.7.1 Perfil electroforético para el ARDRA Para observar y separar los productos de restricción del DNAr 16S se corrió una

electroforesis en gel de agarosa al 2.5% (p/v) en TBE 1X (0.09M de Tris-base,

0.09M de borato de sodio y 2.4 mM de EDTA, pH 8.3), con 0.5µg/ml de bromuro

de etidio. La electroforesis se llevó a cabo en una cámara de electroforesis

Thermo EC 330 Midcell® Primo a 3.2 V/cm durante 3 horas; Se colocaron en

cada pozo 25µl del producto de amplificación con 5µl de buffer de carga 6X; se

utilizó el marcador de peso molecular de 100pb (Promega®). Las bandas se

visualizaron en un transiluminador de luz U.V y los geles fueron fotografiados en

el equipo Gel Documentation de Biorad®

5.7.2 Análisis filogenético Las imágenes digitalizadas de los geles producto del ARDRA fueron analizadas

con el software Quantity One de Biorad®. Se establecieron los patrones de

bandas en cada cepa aislada mediante una matriz básica de presencia y

ausencia (1 y 0); los pesos moleculares de cada banda se determinaron

mediante un análisis de regresión lineal, teniendo como referencia los pesos

moleculares del marcador de 100 pb (Promega®). Posteriormente, se construyó

la matriz de similaridad genética utilizando el índice de Dice a partir del cual se

realizó el análisis de agrupamiento UPGMA y el correspondiente cladograma

para cada enzima. Adicionalmente utilizando el programa NTSYS versión 2.0 se

realizó un análisis de agrupamiento UPGMA con las tres enzimas empleando el

coeficiente de Dice.

5.8 Restricción virtual Con el fin de verificar el nivel de polimorfismo generado por las enzimas(AluI,

HpaII y RsaI) se realizó una restricción virtual utilizando el programa CLC Gene

Workbench 2.2.4®, Para eso se obtuvieron del Genebank, secuencias parciales

del DNAr 16S amplificadas de bacterias diazótrofas de las especies Azotobacter

vinelandii (AY336565); A. chroococcum (AY353708); A. paspali (AJ308318); A.

salinestris (AB175656); A. armeniacus (AB175655); A. beijerinckii (EF100152);

A. nigricans (AB175651); Azospirillum spp. (AF112477); Azomonas

macrocytogenes (AB175654); Beijerinckia derxi (AJ563934); Burkholderia tropica

(AF164045); Derxia gummosa (AB089482); Herbaspirillum seropedicae

(AY191275); Rhizobium leguminosarum (AY509900) y Escherichia coli

(AB305017).

Estas secuencias fueron alineadas empleando el programa CLC Gene

Workbench 2.3.4. Finalmente, con los patrones electroforéticos obtenidos se

realizó el correspondiente agrupamiento (UPGMA) como se describe en 5.7.2 y

se generó el cladograma que permitió establecer una comparación de los

morfotipos obtenidos con cada enzima en los diferentes aislamientos.

6. RESULTADOS 6.1 Medición de pH de los cultivos muestreados El valor de pH registrado en los suelos muestreados se encuentra cercano a la

neutralidad. Para el caso del cultivo de zanahoria se obtuvo un valor de 6.25,

mientras que para el cultivo de tomate se registró un valor de 7.44. Estos valores

se encuentran en el rango óptimo reportado para el crecimiento de bacterias del

género Azotobacter (Tabla 6).

Tabla 5. Valores de pH de suelo de cada cultivo. Fuente: Autor.

Cultivo pH (Promedio) * Brócoli 7.06

Calabacín 6.82 Coliflor 7.12

Espinaca 6.79 Tomate 7.44

Zanahoria 6.25 * Promedio de cuatro mediciones 6.2 Porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas Los porcentajes de recuperación se realizaron para cada cultivo, obteniendo un

mayor porcentaje en los cultivos de espinaca, tomate y brócoli, sin embargo, en

el cultivo de zanahoria se obtuvo el porcentaje de recuperación mas bajo

(31.33%). En la tabla 7 se muestran los promedios de gránulos con colonias

mucilaginosas y el porcentaje de recuperación en cada cultivo.

Tabla 6. Recuento de gránulos con colonias mucilaginosas y porcentaje de recuperación por cultivo. Fuente: Autor.

Cultivo Promedio* gránulos con colonias mucilaginosas

Porcentaje de recuperación

Brócoli 7.26 36.33

Calabacín 7.00 35.00

Coliflor 6.73 33.66

Espinaca 9.00 45.00

Tomate 7.53 37.66

Zanahoria 6.26 31.33 *Promedio de gránulos con colonia mucilaginosas en las 5 muestras de cada cultivo realizado por triplicado

6.3 Identificación morfológica de bacterias diazótrofas aerobias asimbióticas En el aislamiento secundario en medio Ashby-Sacarosa se logró obtener un total

de 24 aislamientos de bacterias aerobias fijadoras de nitrógeno asimbióticas

(Tabla 7).

Tabla 7. Numero de cepas aisladas en agar Ashby- Sacarosa por cada cultivo

Cultivo Número de cepas aisladas

Brócoli 5

Calabacín 4

Coliflor 3

Espinaca 5

Tomate 5

Zanahoria 2

6.3.1 Morfología de las colonias En el total de aislamientos se evidenciaron dos morfologías diferentes de

colonias (Figura 11). Las colonias en la mayoría de aislamientos fueron de color

crema, medianas, irregulares y brillantes muy similares a la reportadas para el

género Azotobacter, sin embargo, se presentaron aislamientos con colonias

pequeñas traslucidas y brillantes como en el caso de algunos aislamientos del

cultivo de brócoli. En la tabla 8 se muestran los resultados de la morfología de

las colonias de todos los aislamientos.

Figura 11. Morfología de colonia encontrada en los aislamientos de bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de cultivos de hortalizas. A) Cepa C5E, colonias color crema, medianas, irregulares y brillantes; B) Cepa C3BR, colonias pequeñas traslucidas y brillantes. Fuente: Autor

6.3.2 Morfología de las células Se logró identificar tres morfologías celulares, se evidenció formación de quistes

en algunas cepas, al igual que bacilos Gram negativos, grandes y cortos, estas

dos morfologías son similares a las reportadas para el género Azotobacter. Sin

embargo, en algunas cepas se presentaron bacilos Gram negativos, cortos y

pequeños (Figura 12). En la tabla 8 se muestran los resultados obtenidos para la

morfología celular de todos los aislamientos

Figura 12. Morfología celular de los aislamientos. A) C5CA, quistes; B) CCT, bacilos Gram negativos ovalados y grandes; C) C1BR, bacilos Gram negativos pequeños. Fuente autor 6.3.3 Pigmentación La mayoría de las cepas aisladas no presentaron pigmentación, sin embargo,

algunos aislamientos pigmentaron de un color café claro, otros presentaron una

pigmentación café-negra y uno solo presento pigmentación verde (Figura 13 y

Tabla 8) esta característica de algunas bacterias de género Azotobacter ha sido

reportadas por Martyniuk & Martyniuk, 2003; Torres, 2000. Las pigmentaciones

de color café o negro son características de las especies de A. armenicus A.

nigricans y A. chroorococcum, mientras que la pigmentación amarillo verdosa es

característica de las especies de A. vinelandii y A. paspali (Holt, 2000), sin

embargo, estas se presentan dependiendo del medio diferencial donde se

encuentren o la presencia de un determinado sustrato, tal como lo han reportado

Aquilanti et al., (a) (2004); Holt, (2000).

Figura 13. Pigmentación de los aislamientos en agar Ashby-Benzoato. A) C1T, pigmentación café. B) C5T; pigmentación negra-café; C) C5CA; pigmentación amarillo-verde. Fuente: Autor

Tabla 8. Características fenotípicas de los aislamientos de cepas diazotrófas encontradas en cultivos de hortalizas en el departamento de Boyacá. Fuente: Autor

Cepa Muestra Lugar Morfología de la colonia

Morfología celular Pigmentación

ATCC 12518 - - A Y Sin pigmentación

CCT Papa Tierra negra A Y Sin pigmentación

C1BR Brócoli Tibasosa A X Sin pigmentación

C2BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación

C3BR Brócoli Tibasosa B Y Sin pigmentación

C4BR Brócoli Tibasosa B X Sin pigmentación

C5BR Brócoli Tibasosa A Y Sin pigmentación

C1CA Calabacín Sogamoso A Y Sin pigmentación

C3CA Calabacín Sogamoso A X Café-Amarillo

C4CA Calabacín Sogamoso A X Café claro

C5CA Calabacín Sogamoso A Z Amarillo-verde

C1CO Coliflor Tibasosa A Y Negra

C4CO Coliflor Tibasosa A Y Sin pigmentación

C5CO Coliflor Tibasosa B Y Sin pigmentación

C1E Espinaca Sogamoso B Y Sin pigmentación

C2E Espinaca Sogamoso A Y Sin pigmentación

C3E Espinaca Sogamoso A Y Café

C4E Espinaca Sogamoso A X Café

C5E Espinaca Sogamoso A Y Café-negro

C1T Tomate Sogamoso A Y Café claro

C2T Tomate Sogamoso A X Sin pigmentación

C3T Tomate Sogamoso B Y Café-Negro

C4T Tomate Sogamoso A Y Café

C5T Tomate Sogamoso A Y Café-Negra

C1Z Zanahoria Tibasosa A Z Sin pigmentación

C2Z Zanahoria Tibasosa B X Sin pigmentación A: Colonias color crema, medianas, irregulares y brillantes. B: Colonias pequeñas traslucidas y brillantes. X: Bacilos Gram negativos pequeños. Y: Bacilos Gram negativos grandes. Z: Quistes (Estructuras de resistencia).

6.4 Identificación Bioquímica La identificación bioquímica se realizó utilizando las técnicas convencionales

para la identificación del género Azotobacter, las pruebas empleadas se basan

en la utilización de cuatro azúcares como fuente de carbono, prueba de oxidasa,

prueba de catalasa y desnitrificación de nitratos (Figura 14). En la tabla 9 se

muestran los resultados de la caracterización bioquímica de todas las cepas

aisladas. Tabla 9. Caracterización bioquímica de los aislamientos, el control positivo (ATCC 12518) y la cepa CCT. Fuente: Autor.

+: Prueba positiva. - : Prueba negativa. D: Bioquímica dudosa.

Cepa/Test GLU MAL MAN RAM BNZ OXI CAT NITRATO

ATCC 12518 + + + + D + + NITRITO

CCT + + + + + + + NITRITO

C1BR - - - - D + + NITRITO

C2BR - + + D - - + AMONIO

C3BR + D + - - + + NITRITO

C4BR - - - - - - + AMONIO

C5BR D + + + - + + NITRITO

C1CA + + D + + + + AMONIO

C3CA - - D - D + + AMONIO

C4CA D - - - - + + AMONIO

C5CA + + + + + + + NITRITO

C1CO D + + - D D + NITRITO

C4CO D - - - D + + NITRITO

C5CO + - - D - + + AMONIO

C1E D - - - - + + AMONIO

C2E + + + + + + + NITRITO

C3E + + + + + + + NITRITO

C4E - - - - D + + AMONIO

C5E + D + - D D + AMONIO

C1T + - - - - + + AMONIO

C2T - D - - - - + NITRITO

C3T - - - - - + + AMONIO

C4T + + + + + + + NITRITO

C5T D + + - D D + AMONIO

C1Z + - - - - - + NITRITO

C2Z - - - - - + - NITRITO

Figura 14. Caracterización bioquímica de los aislamientos. A) Acidificación del medio en la asimilación de azúcares; prueba positiva. B) Prueba de oxidasa positiva; C) Prueba de catalasa positiva; D) Prueba de desnitrificación positiva. Fuente: Autor. De todas las cepas aisladas 10 fueron positivas para glucosa y 6 mostraron un

resultado dudoso para este azúcar, estas cepas fueron identificadas como

bacterias del género Azotobacter. Adicionalmente, la identidad de la cepa control

de A. vinelandii ATCC 12518 fue confirmada mediante las mismas pruebas.

Debido a que los resultados bioquímicos pueden ser ambiguos para diferentes

especies de Azotobacter y pueden ocasionar problemas en la identificación y

hacerla poco exacta, se tuvieron en cuenta las observaciones macro y

microscópicas (morfología de colonia y celular) así como la pigmentación

producida en medio Ashby-Benzoato para la identificación preliminar (Tabla 10).

Tabla 10. Identificación preliminar de los aislamientos. Fuente: Autor

Cepas Aisladas Identificación Preliminar

CCT; C5BR; C1CA; C5CA; C2E; C3E; C4T Azotobacter vinelandii

C1CO; C5E; C5T Azotobacter chroococcum/ A. nigricans

C3BR; C4CA; C4CO; C5CO; C1E; C1T; Azotobacter nigricans

C1Z Azotobacter paspali

En la identificación preliminar se evidenció que las cepas C1CO, C5E y C5T

presentaron resultados ambiguos para las especies de A. chroococcum y A.

nigricans, además de presentar pigmentación café-negra en el medio diferencial

Ashby-Benzoato.

6.5 Extracción de DNA Para la extracción de DNA se utilizaron los protocolos descritos por Aquilanti et

al., (b) (2004) y Maloy, (1989). En el primer caso la extracción se realizó a partir

de colonias crecidas en medio Ashby-Sacarosa. Sin embargo este protocolo no

resultó ser exitoso pues a pesar de obtener una cantidad adecuada de DNA, al

realizar la amplificación con los iniciadores universales (Y1–Y3) para el gen

DNAr 16S no se obtuvo ninguna banda de amplificación. Debido a esto se

decidió utilizar el protocolo propuesto por Maloy, (1989)., que utiliza solventes

orgánicos para una eficiente remoción de proteínas y polisacáridos, permitiendo

obtener un DNA con mayor pureza y alto peso molecular, lo que garantiza el

éxito de la reacción de amplificación. Una vez obtenido el DNA de alto peso

molecular (Figura 15 carril 1) se procedió ha realizar la amplificación con los

primers Y1 y Y3 y se obtuvo el fragmento de 1487 pb acorde con lo reportado

por Magalhães et al, (2001); Junior et al., (2004). Utilizando el protocolo de

extracción propuesto por Maloy, (1989) se logró obtener ADN de 14 aislamientos

así como del control positivo (cepa de A vinelandii ATCC 12518) y la cepa CCT.

Los aislamientos que presentaron extracción de DNA exitosa fueron: C1BR,

C3BR, C5BR, C1CA, C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z,

estos fueron caracterizados molecularmente por medio del análisis de

restricción. El único aislamiento que no se identificó preliminarmente como

bacteria del género Azotobacter fue C1BR.

6.6 Amplificación del DNA ribosomal 16S con los primers Y1 y Y3 Se realizó un ensayo preliminar con dos aislamientos para conocer la cantidad

adecuada de molde para la amplificación del DNAr 16S, los resultados

evidenciaron que con todos los volúmenes utilizados (1, 2, 3 y 4µl) se obtuvo una

banda de amplificación clara de aproximadamente 1490 pb (Figura 15), sin

embargo, considerando que la cantidad de DNA en todos los casos no es la

misma se decidió utilizar un volumen de 3µl en todas las reacciones. La

amplificación del DNAr 16S se realizó para los 14 aislamientos de los cuales se

obtuvo DNA, para la cepa control ATCC 12518 y para la cepa CCT.

Figura 15. Amplificación del DNAr 16S de dos cepas aisladas, variando el volumen de molde. 1 y 2) DNA de alto peso molecular de los aislamientos C3E y C5T. 3 y 7) 1µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 4 y 8) 2µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 5 y 9) 3µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 6 y 10) 4µl de DNA de los aislamientos C3E y C5T. 11) Agua destilada estéril 12) MPM (100pb). Fuente: Autor.

6.7 Análisis de restricción del DNA ribosomal 16S (ARDRA) Para el análisis de restricción con la enzimas AluI, HpaII y RsaI se utilizó el gen

DNAr 16s amplificado con los primers Y1 y Y3, la visualización de las bandas se

realizó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2.0% a 3.2V/cm por 3

horas. (Figura 16, 18 y 20).

6.7.1 Análisis con la enzima AluI Esta enzima generó 8 patrones de restricción o morfotipos diferentes, en donde

el morfotipo VIII fue el que generó mayor cantidad de bandas con un total de 12

y los morfotipos I y VI generaron el menor número de bandas con 3 bandas

cada uno (Tabla 11).

Figura 16. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%, digestión con la enzima AluI. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Agua destilada estéril. 10) MPM (100pb). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor. Tabla 11. Morfotipos obtenidos con la enzima AluI. Fuente: Autor. Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases

I ATCC 12518; CCT; C5CA; C3E 3 558-370-203 II C1BR 4 845-591-217-172 III C3BR; C5CO; C1E; C1T 6 845-591-449-370-217-172 IV C5BR 2 845-591 V C1CA; C2E; C4T 4 591-558-370-203 VI C5E 3 591-370-203

VII C5T 9 370-300-250-203-172-147-133-116-108

VIII C1Z 12 845-591-449-370-300-250-203-172-147-133-116-108

La restricción con esta enzima generó un total de 78 bandas para todas las

cepas evaluadas de las cuales 13 bandas fueron polimórficas obteniendo un

porcentaje de polimorfismo de 16.6%. A partir de los diferentes morfotipos de

restricción se construyó una matriz de presencia y ausencia (1 y 0) y se realizó el

agrupamiento respectivo con el método UPGMA utilizando el coeficiente de

similitud de DICE (Anexo 8), este agrupamiento generó un cladograma en el cual

se evidencia que todas las cepas evaluadas forman tres grupos (I, II y III). Se

observó de manera general que el coeficiente de similitud para las cepas del

grupo III (C3E, CCT, C5CA, ATCC 12518, C4T, C2E Y C1CA) fue

aproximadamente de 0.80, y presentan un coeficiente de similitud muy bajo

aproximadamente 0.30 con respecto a las cepas C1Z y C5T que hacen parte del

grupo II. (Figura 17).

Figura 17. UPGMA con la enzima AluI para los aislamientos. Fuente Autor. 6.7.2. Análisis con la enzima HpaII La restricción con la enzima HpaII generó 12 morfotipos de los cuales el que

generó el mayor número de bandas fue el morfotipo IV con 9 bandas, por otro

lado, los morfotipos I, VI, IX, X y XI presentaron 6 bandas. El mayor número de

cepas se encontró formando parte del morfotipo I que incluye las cepas ATCC

12518, CCT, C2E y C3E (Tabla 12).

Figura 18. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima HpaII. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo. 10) MPM (100 pb Promega). 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor. Tabla 12. Morfotipos obtenidos con la enzima HpaII. Fuente: Autor. Morfotipo Cepas # Bandas Pares de bases

I ATCC 12518; CCT; C2E; C3E 6 511-272-172-144-123-113 II C1BR; C5BR 4 951-636-411-220 III C3BR 8 951-638-411-334-256-239-220-113 IV C1CA 9 951-511-461-411-272-172-144-123-113 V C5CA 7 951-511-272-172-144-123-113 VI C5CO 6 951-411-334-256-239-123 VII C1E 7 951-638-461-411-334-456-239 VIII C5E 4 411-334-256-239 IX C1T 6 951-638-411-220-144-123 X C4T 6 461-272-172-144-123-113 XI C5T 6 677-411-367-272-220-123 XII C1Z 5 677-411-334-256-239

Por otro lado, la restricción con esta enzima generó un total de 92 bandas para

las 16 cepas analizadas, de todas las bandas 16 fueron polimórficas, pero

ninguna de ellas fue única, esta enzima tiene un porcentaje de polimorfismo de

17.3%. Los resultados del agrupamiento utilizando el coeficiente de Dice (Anexo

9) muestran que las cepas analizadas con esta enzima generan dos grupos

diferentes (Figura 19). Las cepas C1CA, C4T, C5CA, C3E, C2E, CCT y ATCC

12518 se agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente de 0.60

(grupo I), encontrándose el mayor coeficiente de similitud (0.95) entre la cepa

ATCC 12518 y el aislamiento CCT. De otra parte en el grupo (II), los

aislamientos C1T y C5T se agrupan con un coeficiente de similitud de 0.20 con

respecto al resto de aislamientos de este grupo.

Figura 19. UPGMA con la enzima HpaII para los aislamientos. Fuente: Autor. 6.7.3. Análisis con la enzima RsaI La enzima RsaI generó el menor número de morfotipos (solo 7) observándose el

menor número de bandas en el morfotipo IV (3 bandas). El morfotipo que incluyó

mayor cantidad de aislamientos corresponde al morfotipo I, con el que se obtuvo

un patrón de 5 bandas (Tabla 13)

Figura 20. Electroforesis en gel de agarosa al 2.0%. Digestión con la enzima RsaI. 1) ATCC 12518. 2) CCT. 3) C1BR. 4) C3BR. 5) C5BR. 6) C1CA. 7) C5CA. 8) C5CO. 9) Control Negativo. 10) MPM (100 pb Promega®), 11) C1E. 12) C2E. 13) C3E. 14) C5E. 15) C1T. 16) C4T. 17) C5T. 18) C1Z. Fuente: Autor.

Tabla 13. Morfotipos hallados con la enzima RsaI. Fuente: Autor Morfotipo Cepas # Bandas Pares de Bases

I ATCC 12518; CCT; C1CA; C5CA; C2E; C4T. 5 968-507-457-405-108

II C1BR, C5BR 4 479-405-350-139 III C3BR; C5CO; C1E 6 479-426-405-350-139-108 IV C3E; C5T 3 892-507-108 V C5E 6 640*-426-405-374-350-139 VI C1T 7 479-426-405-374-350-139-108 VII C1Z 7 892-507-426-405-350-139-108

*Banda única.

Esta enzima generó un total de 82 bandas entre los 7 morfotipos de las cuales

13 bandas fueron polimórficas y una de ellas fue única y se encuentra en el

morfotipo V generando un porcentaje de polimorfismo de 15.8% y un porcentaje

de bandas únicas de 1.2%. En forma general el agrupamiento utilizando el

coeficiente de Dice (Anexo 10) y el método UPGMA generó 2 grupos (I y II) en

donde las cepas que conforman el grupo (I) tienen un coeficiente de similitud

aproximadamente de 0.65, mientras que en el otro grupo (II) las cepas ATCC

12518, CCT, C1CA, C4T y C5CA presentaron un coeficiente de similitud de

aproximadamente 0.85 (Figura 21).

Figura 21. UPGMA con la enzima RsaI para los aislamientos. Fuente: Autor.

6.8 Cladograma generado del análisis con las tres enzimas Para reunir los datos obtenidos de los tres análisis se realizó agrupamiento

UPGMA con el coeficiente de Dice utilizando del programa NTSYS 2.0. Los

resultados obtenidos muestran que todos los aislamientos junto con la cepa

ATCC 12518 forman tres grupos (I, II y III). El grupo I se formó con un

coeficiente de similitud de aproximadamente 0.75. En este grupo la cepa ATCC

12518 y el aislamiento CCT presentaron el mayor coeficiente de similitud (1.0) y

un coeficiente de similitud de 0.97 con respecto al aislamiento C5CA. El grupo II

presentó un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.69 e incluye todos los

aislamientos de brócoli. Por otro lado, en el grupo III los aislamientos C5T y C1Z

se forma con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.65, además

mostraron los morfotipos más disímiles (Figura 22).

Figura 22. Análisis de agrupamiento UPGMA obtenido con las enzimas AluI, HpaII y RsaI para los

aislamientos. Fuente: Autor. 6.9 Restricción virtual. Para la restricción virtual se utilizaron secuencias parciales del gen DNAr 16s de

bacterias diazótrofas y de Escherichia coli como control negativo, obtenidas del

Genbank (Tabla 14). Los alineamientos, la comparación de las secuencias y el

agrupamiento (UPGMA) se realizaron en el software CLC Gen Workbench 2.2.4,

De manera general las secuencias se agruparon en cuatro grupos, en donde en

el clúster II se encuentran la mayoría de las especies del género Azotobacter

excepto A. chroococcum que se encuentra en el grupo I. Por otro lado, en el

grupo III solamente se encuentra la bacteria no fijadora de nitrógeno (E. coli), y

en el ultimo grupo se encuentra H. seropedicae, D. gummosa y B. tropica.

(Figura 22).

Tabla 14. Secuencias del DNAr 16S obtenidas en el Genbank para el análisis de restricción virtual. Microorganismo Accession Secuencia (pb) Iniciadores Publicación

A. vinelandii AY336565 1398 27f- 1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b) A. chroococcum AY353708 1383 27f-1495r Aquilanti et al., 2004 (a ; b)

A. paspali AJ308318 1384 - Hilario et al., 2004 A. salinestris AB175656 1477 - No publicado

A. armeniacus AB175655 1481 - No publicado A. beijerinckii EF100152 1372 - No publicado A. nigricans AB175651 1475 - No publicado

Azospirillum spp. AF112477 1457 - Oh et al., 1999 A. macrocytogenes AB175654 1442 - No publicado

B. derxi AJ563934 1429 28f-1481r Dedysh et al., B. tropica AF164045 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001

D. gummosa AB089482 1449 8f-1527r Xie & Yokota et al., 2004 H. seropedicae AY191275 1429 Y1-Y3 Magalhães et al, 2001

R. leguminosarum AY509900 1475 - No publicado E. coli AB305017 1464 - No publicado

Figura 23. UPGMA con las secuencias alineadas y comparadas utilizadas en el análisis de restricción virtual. Fuente: Autor.

El alineamiento y la comparación de las secuencias mostraron que el mayor

porcentaje de similitud se presentó entre las secuencias de A. salinestris y A.

armenicus con un 98.58%. Por otro lado, la similitud de las secuencias en las

especies del género Azotobacter se encuentra en un rango de 71.92% a

98.58%, siendo A. chroococcum la mas disímil de este grupo. Además, se

evidenció que las secuencias de Azospirillum spp. y A. macrocytogenes fueron

las mas similares con respecto a las del género Azotobacter. Finalmente se

observó que la similitud de las secuencias de E. coli, H. seropedicae, B. tropica y

D. gummosa, con respecto a las del género Azotobacter esta en un rango de

74.68% a 83.34%. (Anexo 11).

6.9.1 Análisis virtual con la enzima AluI La restricción virtual realizada con esta enzima mostró que cada secuencia

pertenece a un morfotipo distinto, se evidenció que las secuencias del género

Azotobacter generan 3 bandas mayores a 100pb, excepto la secuencia de A.

chroococcum que produce 6 bandas. Por otro lado las secuencias de B. derxi, B.

tropica y R. leguminosarum generaron 5 bandas (Tabla 15). Esta enzima generó

un total de 64 bandas de las cuales 30 fueron polimórficas obteniendo un

porcentaje de polimorfismo de 48.3% (Figura 24). Tabla 15. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima AluI en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente Autor.

Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 6 239-208-184-159-144-126

A. vinelandii 4 600-208*-207*-175-162 A. nigricans 4 602-241-208*-207*-162 A. paspali 4 601-370-207-117

A. armeniacus 4 601-370-225-207 A. salinestris 4 601-221-208*-207*-162 A. beijerinckii 4 601-209*-207*-162-108

A. macrocytogenes 4 572-208*-207*-192-162 Azospirillum spp. 3 600-209*-207*-162*-162*

B. derxi 5 430-382-231-200-144 D. gummosa 4 571-396-209-152

B. tropica 5 571-396-209-200-147 H. seropedicae 4 427-209-205*-202*-144

R. leguminosarum 5 402-208-207*-207*-184-144 E. coli 4 377-361-221-207

*Pesos moleculares que generan la misma banda en la electroforesis virtual

Figura 24. Restricción virtual con la enzima AluI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor. Los patrones de corte obtenidos con esta enzima fueron agrupados a por medio

del análisis UPGMA (Figura 24) y se determinó su similaridad por medio del

coeficiente de Dice (Anexo 12). Los resultados de este análisis mostraron 6

grupos ubicándose la mayoría de las especies de Azotobacter en el grupo IV, sin

embargo A. chroococcum, A. paspali y A. armeniacus se encuentran formando

parte de otros grupos. (Figura 24). Se logró observar que la similitud entre los

patrones de corte generados por las secuencias de A. negricans, A. vinelandii, A.

salinestri, Azospirillum spp. y A. beijerinckii fue de aproximadamente 0.85, por

otro lado, A. armenicus y A. paspali generaron una similitud aproximada de 0.78

entre ellos y una similitud de 0.60 frente al grupo anteriormente mencionado.

Figura. 25. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima AluI para las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

6.8.2 Análisis virtual con la enzima HpaII Con esta enzima cada secuencia formó un morfotipo diferente excepto las

secuencias de A. vinelandii y A. negricans, que mostraron un patrón de bandas

idéntico en la electroforesis virtual, sin embargo, dos de sus bandas se

diferencian por tan solo una base. Las secuencias de A. chroococcum y A.

salinestris generaron 5 y 4 bandas respectivamente, mientras que las demás

secuencias del género Azotobacter formaron 4 bandas, siendo las secuencias de

B. derxi y E. coli las que generaron el mayor número de bandas (Tabla 16). Esta

enzima generó un total de 73 bandas y un porcentaje de polimorfismo de 42.4%.

(Figura 25). Tabla 16. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima HpaII en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 3 654-271-220

A. vinelandii 4 545-406-128-108 A. nigricans 4 546-406-128-109 A. paspali 4 546-373-129*-128*-108

A. armeniacus 4 656-406-128-118 A. salinestris 5 406*-405*-139-128-118-108 A. beijerinckii 4 547-364-128*-125*-108

A. macrocytogenes 5 546-404-128-112-108 Azospirillum spp. 5 548-449-128-124-108

B. derxi 6 417-287-220-153-142-114 D. gummosa 5 487-423-128-116-108

B. tropica 4 541-277-128-108*-107* H. seropedicae 5 456-423-128-116-108

R. leguminosarum 5 494-402-220-157-121 E. coli 6 476-278-160-135-108-106*-104*


Figura 26. Restricción virtual con la enzima HpaII. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor.

Los patrones de corte fueron agrupados utilizando el análisis UPGMA (Figura

26), el cual fue determinado mediante una matriz de similitud utilizando el

coeficiente de Dice (Anexo 13). Este agrupamiento mostró de forma general que

las secuencias forman 5 grupos, las secuencias de A. vinelandi y A.

macrocytogenes tiene una similitud mayor a 0.85 en el grupo V, las secuencias

de A. salinestris y A. armeniacus forman un solo grupo (III), mientras que la

secuencia de A. chroococcum forma parte del grupo I.

Figura. 27. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

6.8.3 Análisis virtual con la enzima RsaI Con esta enzima se obtuvieron 14 morfotipos diferentes y un total de 62 bandas

que generaron un porcentaje de polimorfismo de 50% (Figura 27). Se encontró

que A. armeniacus y A. salinestris, corresponden a un mismo morfotipo con un

total de 5 bandas. En el caso de A. chroococcum se obtuvo un patrón de dos

bandas, siendo el morfotipo que menor número de bandas presentó (Tabla 17).

(Figura 28) (Anexo 14).

Tabla 17. Número de bandas y pesos moleculares mayores a 100pb generados con la enzima RsaI en las secuencias obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

Microorganismo Número de bandas Pesos moleculares (pb) A. chroococcum 2 789-505

A. vinelandii 4 585-356-233-146 A. nigricans 4 652-356-234-146 A. paspali 5 527-356-234-146-121

A. armeniacus 5 635-356-234-146-110 A. salinestris 5 631-356-235-146-110 A. beijerinckii 5 518-357-234-146-117

A. macrocytogenes 5 591-356-234-146-104 Azospirillum spp. 4 838-357-146-116

B. derxi 4 422*-414*-262-142-106 D. gummosa 4 470-404-352-146

B. tropica 4 439-404-390-108 H. seropedicae 4 439-404-348-150

R. leguminosarum 3 825-501-149 E. coli 3 502-457-407


Figura 28. Restricción virtual con la enzima RsaI. 1) MPM 100pb 2) A. chroococcum. 3) A. vinelandii. 4) A. nigricans. 5) A. paspali. 6) A. armeniacus. 7) A. salinestris. 8) A. beijerinckii. 9) Azomonas macrocytogenes. 10) Azospirillum spp. 11) Beijerinckia derxi. 12) Derxia gummosa. 13) Burkholderia tropica. 14) Herbaspirillum seropedicae. 15) Rhizobium leguminosarum. 16) Escherichia coli. Fuente: Autor. Los morfotipos obtenidos de la restricción virtual formaron 4 grupos. En el grupo

IV se encuentran la mayoría de las especies de Azotobacter excepto A.

chroococcum, que se encuentra formando parte del grupo III, junto a R.

legominosarum y E. coli. La mayoría de especies del género Azotobacter se

agrupan con un coeficiente de similitud de aproximadamente 0.70 (grupo IV) en

este grupo se incluyen las especies A. salinestris y A. armeniacus que presentan

el coeficiente máximo de similitud de 1.00.

Figura. 29. UPGMA del análisis de restricción virtual con la enzima HpaII para las secuencias

obtenidas del Genbank. Fuente: Autor.

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Los cultivos de hortalizas son de gran importancia agrícola en nuestro país, ya

que son fuente de materias primas para el comercio y la alimentación. Los

suelos de estos cultivos poseen bacterias diazótrofas del género Azotobacter

que cumplen diferentes roles benéficos como, la fijación del nitrógeno molecular,

la producción de fitohormonas (Pandey & Kumar, 1990), la depuración de

compuestos tóxicos (Juárez et al., 2004) y mantienen el equilibrio ambiental y

ecológico en el agroecosistema. Estas bacterias son utilizadas como

biofertilizantes para disminuir el uso de compuestos nitrogenados sintéticos, con

el fin darle un valor agregado ecológico al producto, además generar mayor

rentabilidad desde el punto de vista económico (Torres, 2000 <on line>).

Para el aislamiento y caracterización molecular de bacterias diazótrofas del

género Azotobacter fueron muestreados suelos de diferentes cultivos de

hortalizas ubicados en dos municipios en el departamento de Boyacá (Figura 6).

Estos suelos fueron tomados en cuenta para el muestreo ya que pertenecen a

cultivos de hortalizas fertilizados con gran cantidad de materia orgánica y

fosfatos, lo que beneficia la proliferación de bacterias diazótrofas tal como lo

reporta Jensen, (1965); Gordon, (1981); Tsain et al., (1979), además de no

utilizar, en su esquema de rotación, fertilizantes nitrogenados en exceso que

puedan inhibir las bacterias diazótrofas, se evidencio un color oscuro en el suelo

lo que hace suponer gran cantidad de materia orgánica presente (Figura 8),

además se obtuvo información del manejo de fertilizantes en estos cultivos,

suministrada por el Ingeniero agrónomo a cargo de estas plantaciones.

El muestreo se realizó en forma de zig-zag a lo largo del cultivo a una

profundidad de 10 a 15cm, con el fin de obtener un buen porcentaje de

recuperación bacteriano (Torres et al., 2000; Aquilanti et al., 2004 (a)), aunque

los 5 muestreos realizados por cultivo no fueron cuantificados estadísticamente

fueron suficientes para el aislamiento. Por otro lado, los cultivos evaluados no

eran de gran extensión y las 5 muestras fueron representativas para la

recuperación de bacterias diazótrofas asimbióticas aerobias.

Se observó que los suelos de todos los cultivos poseen un pH cercano a la

neutralidad (Tabla 5), lo que favorece el aislamiento de bacterias del género

Azotobacter, siendo el suelo del cultivo de zanahoria el que presentó un menor

valor pH (6.25) lo que posiblemente afectó la recuperación y el crecimiento de

bacterias de este género. Aunque se han reportado especies que pueden crecer

desde pH alrededor de 5.5 como A. chroococcum y A. vinelandii (Sarybay,

2003), sin embargo, el rango optimo para el crecimiento cuando realizan la

fijación de nitrógeno se encuentra entre 7.0 y 7.5 (Balandreau, 1986).

El aislamiento y recuperación se realizó en medio Ashby-Sacarosa, este es un

medio diferencial libre de nitrógeno que permite el aislamiento de bacterias

fijadoras de nitrógeno. Debido a que todas las especies de Azotobacter son

capaces de utilizar la sacarosa como fuente de carbono (Holt, 2000), el medio

fue preparado con 5g/L de sacarosa. Sin embargo se ha reportado que para el

aislamiento de A. chroococcum se puede utilizar medio con manitol o benzoato,

(Torres et al., 2000), además posee microelementos importantes para la fijación

de nitrógeno como el FeSO4 y algunos utilizan Molibdeno como en el caso del

medio Jensen`s (Kumar & Narula, 1999).

Los porcentajes de recuperación se presentaron en un rango de 31.3 a 45.0%

(Tabla 6), sin embargo, el cultivo de menor porcentaje fue el de zanahoria, lo

cual se pudo presentar debido al pH bajo del suelo, así mismo, en este cultivo

solamente se logró obtener dos aislamientos (C1Z y C2Z), para los demás

cultivos el porcentaje de recuperación se presentó en un rango de 35 a 45%,

aunque fueron porcentajes relativamente bajos se lograron aislar 22 cepas

fijadoras de nitrógeno aerobias asimbióticas, en donde el mayor número de

cepas aisladas se presentó en los cultivos de tomate, espinaca y brócoli (5

aislamientos). Las colonias mucilaginosas obtenidas en los gránulos en el

aislamiento primario presentaron quistes formados, esto se debe a que las

bacterias de el género Azotobacter cuando provienen del suelo se encuentran en

un estado de resistencia a las condiciones ambientales (desecación) (Vela,

1974).

Los 24 aislamientos presentaron dos morfologías de colonias (Figura 11), una de

ellas se caracterizó por presentar colonias color crema, medianas, irregulares y

brillantes, morfología reportada para bacterias del género Azotobacter (Aquilanti

et al., (a) 2004), sin embargo, algunas presentaron colonias pequeñas

traslucidas y brillantes, las cuales pueden ser muy similares a las anteriormente

nombradas y presentarse en otros géneros fijadores de nitrógeno asimbióticos

como Beijerinckia (Holt, 2000) lo que dificulta la identificación. Los aislamientos

que presentaron este tipo de colonia fueron C2BR, C3BR, C4BR, C5CO, C1E,

C3T y C2Z; los demás aislamientos presentaron colonias similares a las

reportadas por el género Azotobacter (Tabla 8).

La identificación mediante la morfología celular generó tres diferentes formas

celulares. En los aislamientos C1Z y C5CA se observaron quistes (Figura 12),

estos pueden formarse después de la fase de crecimiento exponencial, cuando

las condiciones son adversas por falta de nutrientes o nutrientes complejos como

el β-Hidroxibutirato o bien cuando se degradan los PHBs (Hitchins & Sadoff,

1973), también por la acción de iones calcio en el medio (Hitchins & Sadoff,

1970); por otro lado, estas estructuras de resistencia no son formadas

exclusivamente por especies del género Azotobacter, sino que también son

características de especies del género Beijerinckia, aunque existen diferencias

en el número de quistes agrupados, ya que Azotobacter forma pares y

Beijerinckia no los agrupa, para el caso de estos dos aislamientos los quistes se

agruparon en pares.

Los aislamientos C1BR, C3BR, C4BR, C3CA, C4CA, C4E, C2T Y C2Z

presentaron bacilos Gram negativos pequeños, muy similares a los formados por

Azospirillum spp., Beijerinckia spp., Herbaspirillum spp. y Derxia spp., el resto de

los aislamientos presentaron bacilos Gram negativos grandes como los

reportados por Azotobacter spp. (Holt, 2000) (Tabla 8), sin embargo, los

aislamientos que presentaron esta morfología posiblemente pudieron germinar y

pasar a su forma vegetativa, proceso que ocurre cuando las bacterias crecen

con medios libres de nitrógeno y una fuente de azúcar fácil de metabolizar como

el manitol o la sacarosa (Hitchins & Sadoff, 1970). En general, esta identificación

y caracterización morfológica es muy relevante a la hora de identificar un género

bacteriano fijador de nitrógeno y al mismo tiempo ofrece una serie de ventajas

para distinguir fenotipos diferentes al manifestado por bacterias del género

Azotobacter, tal es el caso de los aislamientos C2BR, C4BR y C2Z, los cuales no

presentaron ninguna homología con las características morfológicas de

Azotobacter, pero presentaron una clara fijación de nitrógeno asimbiótica, lo cual

sugiere que pueden ser fijadoras de nitrógeno mas no ser del género

Azotobacter.

Con respecto a la caracterización fisiológica o a la producción de pigmentos, se

evidenciaron tres pigmentaciones diferentes, café claro, café-negro y amarillo

verdoso. Según se ha reportado, el género Azotobacter tiene la capacidad de

producir pigmentos solubles (Pandey et al., 1998; Holt, 2000 Saribay, 2003), lo

que puede ser útil a la hora de caracterizar diferentes especies, sin embargo, de

acuerdo con la composición del medio, otras especies como Bejerinckia derxi

tiene la capacidad de presentar pigmentaciones solubles de color verde (Holt,

2000). En este caso se observó la pigmentación en un medio Ashby con 5g/L de

benzoato, utilizado para diferenciar especies de A. chroococcum y A. negricans,

las cuales forman pigmentos oscuros (negros o cafés) (Torres et al., 2000;

Martyniuk & Martyniuk 2002).

Los resultados muestran que los aislamientos C1CO, C5E, C1T, C3T, C5T,

presentaron características fenotípicas y de pigmentación similares a las

presentadas por A. chroococcum y A. nigricans, (Tabla 8), este tipo de

pigmentación se debe a que el benzoato es tomado como fuente de carbono y

metabolizado por medio de la vía β-cetoadipato, que genera succinato que es

introducido a la cadena respiratoria mediante el sistema dependiente de flavina,

el cual esta relacionado con la pigmentación del medio. (Castillo, 2005).

Por otro lado, se observó que los aislamientos C3CA y C4E evidenciaron una

pigmentación café-amarilla, con bacilos Gram negativos pequeños, diferentes a

los de Azotobacter y una identificación bioquímica preliminar negativa para este

género; esto indica que pueden ser fijadoras de nitrógeno que pigmentan pero

que no son del género Azotobacter o que su identificación bioquímica no fue lo

suficientemente clara. Por el contrario los aislamientos C4CA y C3E también

pigmentaron café pero a diferencia del resto, el primer aislamiento presentó

bacilos Gram negativos pequeños y el segundo fue identificado bioquímicamente

como A. vinelandii. Esto demuestra la gran dificultad de caracterizar estos

microorganismos por métodos convencionales (Aquilanti et al., (a) 2004).

La identificación bioquímica preliminar se llevó a cabo con base en la utilización

de cuatro azúcares y benzoato como fuente de carbono, pruebas de oxidasa y

catalasa y desnitrificación de nitrato, estas bioquímicas se utilizaron ya que

permiten diferenciar el género Azotobacter, de otras bacteria fijadoras de

nitrógeno asimbióticas (Tejera et al., 2005) y así mismo ayuda a diferenciar cada

especie, un ejemplo claro de esto es que A. vinelandii es la única especie del

género capaz de asimilar la ramnosa y utilizarla como fuente de carbono (Holt,

2000), además todas las especies de este género tiene la capacidad de producir

oxidasas para la protección de su nitrogenasa (Thorneley & Ashby, 1989). Los

resultados de la identificación bioquímica preliminar muestran que de los 24

aislamientos 16 presentaron un resultado positivo o dudoso para la fermentación

de glucosa, sin embargo fueron considerados bacterias del género Azotobacter

(Tabla 9), los resultados dudosos se presentaron debido a que en las tres

replicas una de ellas generó un resultado diferente, esto pudo ocurrir por la

alcalinización del medio después de de la utilización y fermentación del azúcar, o

bien por factores externos de contaminación.

La identificación preliminar evaluando los aislamientos mediante la morfología

celular y de colonia, la pigmentación y las bioquímicas generó 4 grupos (Tabla

10), el primero conformado por los aislamientos C5BR, C1CA, C5CA, C2E, C3E,

C4T los cuales fueron identificados como bacterias de la especie A. vinelandii, el

segundo grupo presentó ambigüedad entre las especies de A. chroococcum y A.

nigricans, esto ocurrió ya que muchos de sus resultados de las pruebas

bioquímicas fueron dudosos pero coinciden con el perfil para estas especies En

el tercer grupo se presentaron los aislamientos C3BR, C4CA, C4CO, C5CO,

C1E, C1T los cuales se identificaron como A. negricans y en el ultimo grupo una

sola cepa del cultivo de zanahoria (C1Z) fue identificada como A. paspali. La

cepa control (ATCC12518) presentó un resultado que confirmó su ubicación

taxonómica como A. vinelandii, este resultado coincide con el obtenido para la

cepa CCT; en ambos casos se presentaron colonias con la morfología típica

reportada para el género Azotobacter (Aquilanti et al., 2004 (a)) con la diferencia

de no presentarse pigmentación en el medio Ashby-Benzoato, ya que esta

especie no es capaz de catabolizar el benzoato (Holt, 2000).

De otra parte, trabajo realizado por Mantilla, 2007 aportó información tendiente a

establecer la identidad de la cepa ATCC 12518 con base en la gran producción

de ácido indol acético (AIA) característica de las bacterias de este género.

Una vez caracterizados los aislamientos fenotípica y bioquímicamente se

procedió a realizar la caracterización molecular. En esta etapa se utilizaron dos

protocolos de extracción de DNA, el primero propuesto por Aquilanti et al., 2004

(b), el cual no fue exitoso, ya que al realizar la amplificación con los iniciadores

Y1 y Y3 no se obtuvo la banda esperada de 1487pb (Magalãhes et al., 2001), los

interferentes de esta extracción pudieron ser de tipo metodológico o externo, ya

que se ha reportado que la impureza o baja calidad del DNA puede inhibir el

proceso de amplificación (PCR) (White, 1993). Fue por esto que se utilizó el

protocolo de extracción reportado por Maloy, 1989, el cual utiliza solventes

orgánicos para la remoción de proteínas y polisacáridos, agentes que pueden

inhibir la reacción de PCR. Con los aislamientos C1BR, C3BR, C5BR, C1CA,

C5CA, C5CO, C1E, C2E, C3E, C5E, C1T, C4T, C5T, C1Z que presentaron una

extracción de DNA exitosa, se realizó la amplificación del DNAr 16S y posterior

análisis de restricción. La cepa CCT (aislada en otro trabajo y catalogada como

Azotobacter) y el control ATCC12518 también fueron evaluadas mediante este

análisis molecular.

Los iniciadores universales Y1 y Y3, han sido utilizados en la amplificación del

DNAr 16S de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001; Junior et al., 2004),

sin embargo, no son específicos para bacterias del género Azotobacter, pero ya

que en este estudio se realizó una identificación preliminar no fue necesario

utilizar iniciadores únicos para el género. La caracterización de bacterias

diazótrofas se puede realizar a partir de diversos genes presentes en estos

microorganismos que codifiquen para determinadas funciones, como los nif para

la nitrogenasa (Roesch et al., 2006), pero debido a las características del gen

DNAr 16S y a su trasmisión únicamente vertical, se ha convertido en el

cronometro molecular por excelencia. Este gen codifica para el RNAr 16S que

hace parte del la subunidad pequeña del ribosoma (SSU) (Weisburg et al., 1991;

Rodicio & Mendoza, 2004; Nogales, 2005).

El ARDRA se realizó con tres enzimas de restricción (AluI, RsaI, HpaII), los

morfotipos generados con estas enzimas en los aislamientos fueron comparados

con los morfotipos generados por las mismas enzimas en secuencias parciales

del DNAr 16S de diferentes géneros fijadores de nitrógeno obtenidas del

Genbank. De manera general, estas enzimas presentaron porcentajes de

polimorfismos altos en el análisis de restricción de los aislamientos, ya que para

la enzima AluI el porcentaje fue de 16.6%, para la HpaII fue de 17.3% y para

RsaI fue de 15.8%, estos son muy similares a los reportados por Aquilanti et al.,

(a y b) (2004), por el grado de polimorfismo que son utilizadas en caracterización

de bacterias diazótrofas (Magalãhes et al., 2001), ya que permiten una clara

diferenciación inter e intraespecífica de bacterias diazótrofas. Se evidenció una

relación directamente proporcional entre el porcentaje de polimorfismo y los

morfotipos generados, ya que en la enzima RsaI donde se presentó el menor

porcentaje de polimorfismo también se obtuvieron menos morfotipos, este

resultado es consistente con lo reportado por Aquilanti et al., (b) (2004).

El porcentaje de polimorfismo obtenido en este trabajo fue menor comparado

con el generado por la restricción virtual para las tres enzimas. Esto se debió,

posiblemente, a que para el análisis virtual, se utilizaron secuencias de

diferentes microorganismos (diazotrófos asimbióticos, simbióticos, endófitos y

una bacteria no fijadora de nitrógeno), lo que aumentó el grado de polimorfismo

y el número de morfotipos, sin embargo, se pudo evidenciar que estas enzimas

permiten obtener una clara diferenciación inter e intraespecífica.

Los resultados del análisis UPGMA conjunto para las tres enzimas formo tres

grupos (Figura 22). Se evidenció que las cepas C3E, CCT, ATCC 12518, C5CA,

C4T, C2E muestran un agrupamiento único en para las tres enzimas, grupo (I).

Por otro lado, las cepas C5BR, C1BR, C1E, C3BR, C1T, C5CO se agrupan

igualmente con las tres enzimas en otro grupo (II). Caso especial fueron las

cepas C5E, C5T y C1Z, que se agruparon en el grupo (III), esto indica que las

cepas C5E, C5T y C1Z no generaron un morfotipo similar a ninguno de los

demás aislamientos, algo evidente, ya que las cepas C5T y C1Z siempre

presentaron morfotipos irregulares para cada enzima y la cepa C5E presentó

una banda única con la enzima RsaI; estas bandas únicas son muy especiales,

ya que pueden ser útiles en el diseño de iniciadores específicos para la

amplificación mediante la reacción de la polimerasa (PCR).

Se observó que las cepas del grupo (II) incluyen aislamientos encontrados

solamente en los cultivos ubicados en el municipio de Sogamoso, mientras que

para el grupo (II) y (III) las cepas pertenecen a los cultivos muestreados en los

dos municipios. Esto indica que posiblemente los aislamientos generan grupos

filogenéticos diferentes de acuerdo a las características del suelo o al tipo cultivo.

Por otro lado, no se observó una relación entre los diferentes grupos con

respecto al pH del suelo, sin embargo en el grupo II, la mayoría de la cepas

fueron aisladas de suelos con valores de pH en un rango entre 7.06 a 7.44.

Al comparar los morfotipos generados del análisis ARDRA en este trabajo y los

generados a partir de la restricción virtual de las secuencias obtenidas del

Genebank, se observó en algunos casos una gran consistencia entre el número

de bandas y sus correspondientes pesos moleculares, sin embargo en otros

casos esta consistencia se presenta solo para una o dos de las enzimas. Esto

puede deberse a que los iniciadores utilizados (Y1-Y3) no son los mismos que

los utilizados para la amplificación de las secuencias reportadas en el Genebank

(Tabla 14) y por esto los pesos moleculares de las bandas generadas con las

enzimas pueden diferir en unos cuantos pares de bases especialmente en los

fragmentos de las regiones flanqueantes del gen, se consideraron bandas

similares en la comparación cuando diferían entre 15 a 25pb. Por otro lado, en

algunos aislamientos se observó la presencia de bandas de mayor peso

molecular después de la digestión con algunas enzimas, hecho que no se

presenta en las digestiones virtuales lo que indica que algunas copias del gen no

fueron digeridas completamente.

Con respecto al grupo (I) se logró observar que con las tres enzimas todas las

cepas mostraron similitud en las bandas generadas con respecto a los patrones

de corte de las especies del género Azotobacter utilizadas en la restricción

virtual. Sin embargo los patrones de corte no fueron suficientemente claros y se

decidió hacer un análisis minucioso de las bandas generadas en cada morfotipo

para evidenciar homología. Un ejemplo de esta similitud se generó con la cepa

C1CA, la cual presentó para la enzima AluI una similitud de dos bandas con

respecto a la secuencia de A. vinelandii y 4 bandas similares con la enzima HpaII

para el mismo microorganismo, sin embargo, con la enzima RsaI no se logró

ubicar esta cepa en ningún grupo. Con respecto a la cepa utilizada como control

(ATCC 12518) generó una similitud de 2 bandas con la enzima AluI y HpaII, pero

al igual que la anterior el morfotipo generado con la enzima RsaI no permitió

compararla con ninguna secuencia virtual. Debido a éstos resultados aunque

los morfotipos generados no sean completamente exactos el patrón de bandas

permite diferenciar de manera parcial cada aislamiento y considerarlo muy

similar a bacterias del género Azotobacter.

Con respecto al grupo (II) se logró observar que estas cepas poseen varias

bandas similares con las tres enzimas para bacterias del género Azotobacter, sin

embargo se encontró una relación muy cercana entre estas y las restricciones

virtuales de B. derxi, A. macrocytogenes y Azospirillum spp., un ejemplo claro de

esta situación se presento con la cepa C1BR, la cual presentó una similitud de

tres bandas con la enzima AluI frente a Azospirillum spp. y de tres bandas frente

a A. macrocytogenes pero con las enzimas HpaII y RsaI se presentaron dos

bandas similares a B. derxi, además con la enzima RsaI mostró similaridad de

cuatro bandas frente a D. gummosa. Posiblemente esta cepa es diferente a las

del género Azotobacter ya que su identificación preliminar fue negativa para

especies de este género, además su morfología corresponde a bacilos Gram

negativos pequeños similares a los de Azospirillum spp. y B. derxi. (Holt, 2000),

además siempre se ubicó junto con C5BR en un clúster alejado de los demás

aislamientos (Figuras 17, 19 y 21).

Por otro lado, en este mismo grupo, se evidenció que la cepa C5CO tiene una

similitud con A. negricans, ya que comparte algunas bandas en sus diferentes

morfotipos para las tres enzimas, aunque también comparte algunas bandas con

A. vinelandii. Sin embargo la caracterización bioquímica y fenotípica mostró un

perfil que se ajusta a la especie A. negricans por lo que se puede concluir que

las características bioquímicas, fenotípicas y moleculares permiten ubicarla

taxonómicamente como A. negricans.

Con respecto al grupo (III) se observó de manera especial que la cepa C5T

generó morfotipos idénticos en las tres enzimas con respecto A. chroococcum,

con diferencias en unas pocas bases, pero con el mismo perfil de corte. Lo que

significa que este aislamiento tiene una gran similaridad de secuencia con la

utilizada en la restricción virtual para A. chroococcum, se puede concluir que

genéticamente este aislamiento puede ser considerado como A. chroococcum,

además su identificación bioquímica lo respalda (Tabla 10), así como la

pigmentación producida en medio con benzoato (Figura 13 B).

Por otro lado, se logró verificar que el aislamiento C5T aunque presentó unos

morfotipos atípicos en todas las enzimas pertenece al género Azotobacter, sin

embargo, la secuencia de esta especie es diferente a las demás de este género,

esto se observó también en la restricción virtual y en la comparación de los

alineamientos de las secuencias obtenidas en el Genbank (Figura 22) ya que

formo siempre morfotipos y grupos diferentes a las demás especies de

Azotobacter, tal como lo reporta Aquilanti et al., (b) (2004). Las cepas C5E y C1Z

las cuales son muy similares a la cepa C5T, mostraron en la comparación con

las restricciones virtuales que comparten varias bandas en las tres enzimas con

el género A. chroococcum, sin embargo, la cepa C5E es la mas similar, aunque

no compartió los mismos sitios de corte con cada enzima, pero observando su

pigmentación (Tabla 9) posiblemente se trate de la misma especie. De otra parte

la cepa C1Z mostró similitud con otras especies de Azotobacter, por lo que su

identificación como A. paspali de acuerdo con las pruebas bioquímicas

preliminares, no pudo ser confirmada.

En conclusión, de los 16 aislamientos 14 presentaron similitud genética con

respecto a especies del género Azotobacter. De estos, el aislamiento C5T

presentó un morfotipo para las tres enzimas idéntico al presentado por la

secuencia de A. chroococcum, mientras que los aislamientos C1BR y C5BR

presentaron similitud con otros géneros fijadores de nitrógeno como B, derxi, A.

macrocytogenes, Azospirillum spp. y D. gummosa. Aunque el análisis molecular

es confiable, lo recomendable en estos casos es trabajar con cepas certificadas

para tener una comparación clara frente a los aislamientos.

Para finalizar es preciso anotar que las caracterizaciones moleculares mediante

ARDRA (Magalãhes et al., 2001; Tejera et al., 2005) DGGE (Lovell et al., 2000),

RFLPs (Yeager et al., 2004) y otras técnicas permiten tener una mayor certeza

en la identificación de géneros diazotrófos, sin embargo las técnicas

convencionales son de gran ayuda en estas identificaciones. El ARDRA es una

de las herramientas mas utilizadas en la caracterización molecular de

organismos, ya que permite obtener relaciones filogenéticas entre individuos,

además de conocer un poco mas de su estructura genética (Heyndrickx et al.,

1996). Las enzimas utilizadas en este tipo de análisis deben generar un alto

grado de polimorfismo, que permitan observar diferencias significativas inter o

intraespecíficas. Para esto las ayudas bioinformaticas son fundamentales ya

permiten clasificar enzimas que generen polimorfismo para grupos específicos y

así evitar altos costos en análisis inútiles además de ser indispensables en

estudios de biodiversidad, bioprospección y biotecnología.

8. CONCLUSIONES

El suelo muestreado en cultivos de hortalizas en dos municipios del

departamento de Boyacá presentó valores de pH adecuados y determinantes

para la recuperación de bacterias diazótrofas del género Azotobacter.

La caracterización fenotípica y bioquímica permitió identificar 17 aislamientos

presuntivos como especies del género Azotobacter, sin embargo, se presentaron

resultados ambiguos y dudosos.

Utilizando el protocolo de Maloy, (1989), se logró extraer DNA bacteriano con

una pureza y calidad adecuadas para amplificar el gen DNAr 16S de bacterias

diazótrofas, utilizando los iniciadores universales Y1-Y3.

El análisis de restricción del DNA ribosomal amplificado (ARDRA) con las

enzimas AluI, HpaII, y RsaI género porcentajes de polimorfismo de

aproximadamente 16%, obteniéndose el mayor valor con la enzima HpaII. Esto

permitió agrupar los aislamientos de bacterias del género Azotobacter en tres

grupos de similaridad, El grupo I el cual se formó con un coeficiente de similitud

de aproximadamente 0.8 incluye los aislamientos mas similares genéticamente a

las especies del género Azotobacter.

El aislamiento CCT proveniente de un cultivo de papa presentó el máximo valor

de similitud (1.0) con respecto a la cepa de Azotobacter vinelandii ATCC 12518,

lo que sugiere que puede tratarse de esta especie. En el caso del aislamiento

C1CA se presentó un coeficiente de similitud de 0.95 con respecto a las

anteriormente mencionadas, indicando que también puede tratarse de A.

vinelandii. Estos resultados fueron consistentes con los obtenidos para la

restricción virtual y las pruebas bioquímicas preliminares.

El análisis de restricción virtual con secuencias obtenidas del Genbank permitió

establecer comparaciones útiles para aclarar la ubicación taxonómica e

identificación de algunos aislamientos de bacterias diazótrofas provenientes de

cultivos de hortalizas. Esto demuestra la importancia de las herramientas

bioinformaticas como apoyo en estudios de diversidad.

Mediante la combinación de métodos convencionales y moleculares se logró

caracterizar de manera precisa como A. chroococcum un aislamiento

proveniente de un cultivo de tomate del municipio de Sogamoso y con una alta

similaridad como A. vinelandii los aislamientos C5CA y CCT, provenientes de

cultivos de calabacín y papa respectivamente.

9. RECOMENDACIONES

Utilizar diferentes medios y sustratos para verificar la pigmentación de otras

especies del género Azotobacter y verificar el comportamiento bioquímico frente

a una mayor cantidad de sustratos.

Realizar pruebas fisicoquímicas del suelo muestreado, con el fin de obtener

mayor información del agroecosistema y de esta forma conocer la función de las

bacterias aisladas en estos cultivos.

Realizar pruebas de AIA para identificar la producción de esta fitohormona y

pruebas de reducción de acetileno.

Con el fin de amplificar DNAr 16s de bacterias del género Azotobacter se debe

trabajar en el diseño de primers específicos y de esta forma tener mayor

exactitud en la caracterización.

Utilizar un mayor número de enzimas de restricción, con el fin de obtener más

información de las secuencias del gen DNAr 16s de bacterias del género

Azotobacter.

Se sugiere utilizar en estos casos cepas certificadas para obtener una

comparación realmente clara de los aislamientos en las restricciones virtuales,

además con el fin de identificarlos plenamente se debe secuenciar el gen

completa o parcialmente (Y1-Y2).

Realizar caracterización con genes nif y comparar los resultados con las

realizadas en base al DNAr 16S

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11. ANEXOS ANEXO 1. MEDIO AGAR ASHBY

COMPOSICION g/l

Sacarosa/Manitol o Benzoato 5

KH2PO4 1

MgSO4.7H2O 0.2

FeSO4. 7H2O 0.005

NaCl 0.2

CaCl2. 2H2O 0.2

Agar 15

pH 7.0 (+/- 0.2). Fuente: Martínez, 2003

ANEXO 2. CALDO NUTRITIVO Scharlau chemie®

COMPOSICION g/l

Extracto de carne 3.0

Extracto de peptona 5.0

ANEXO 3. PREPARACION DE AZUCARES Merck®

COMPOSICION g/l

Base rojo de fenol (caldo) 15

Azúcar (Maltosa; Manitol; Glucosa; Ramnosa)* 1

*Para la preparación con el benzoato se agrega igualmente un gramo por litro de

medio.

ANEXO 4. PRUEBA DE OXIDASA Y CATALASA. Fuente: Escobar, 2002.

Prueba de oxidasa: Coloque sobre una tira de papel filtro, puesta sobre una

lamina, varias gotas del reactivo recién preparado de tetrametil-p-fenilendiamina

al 1% en agua destilada estéril. Con un palillo tome una colonia del

microorganismo y frótela sobre el papel humedecido. La prueba de oxidasa

indica la presencia de enzimas oxidativas, denominadas citocromos, que son

porfirinas, que contiene hierro y se encuentran en la cadena respiratoria, pues

participan en el trasporte de electrones. Una prueba positiva de oxidasa se

determina por el cambio de color de azul a púrpura después de diez segundos

de poner al microorganismo con el reactivo

Prueba de catalasa: Esta se leva a cabo con el fin de comprobar la presencia

de la enzima catalasa. Con un asa de siembra se recogió el centro de una

colonia pura de 18 a 24 h de incubación en TSA y se extendió sobre un

portaobjetos, luego con un gotero se agrego una gota de HO2 al 3%. La

formación de burbujas indica la liberación de O2 característico de un resultado

positivo.

ANEXO 5. PREPARACION DE TE 1X

COMPOSICIÓN CANTIDAD/ 100ml

Tris 10mM 1ml

EDTA 1mM 0.08ml

Agua destilada 39.52ml

ANEXO 6. PREPARACION DE FCI (25:24:1) y FC (24:1)*


Fenol 50ml

Cloroformo 48ml

Alcohol Isoamílico 2ml

*Para la preparación del FC no se utiliza el fenol

ANEXO 7 PREPARACION DE TBE 5X*


Tris 10.8 g

Acido bórico 5.5g

EDTA 4ml

*Para la preparación del TBE 1X se diluye con agua destilada.

Fuente: Sambrook. 1989.

ANEXO 8. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA AluI

ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1ZATCC 100.0 93.9 0.0 26.5 0.0 86.6 97.3 13.7 19.5 85.7 83.4 50.0 11.3 90.7 35.2 32.6CCT 93.9 100.0 0.0 24.6 0.0 90.5 92.5 14.2 20.2 89.0 83.1 52.3 11.8 88.0 36.1 34.2C1BR 0.0 0.0 100.0 72.4 49.7 15.9 0.0 76.9 60.7 15.5 0.0 29.8 85.2 14.7 16.5 36.0C3BR 26.5 24.6 72.4 100.0 42.2 36.0 27.0 86.8 83.4 36.3 29.6 42.7 82.2 36.4 27.3 52.9C5BR 0.0 0.0 49.7 42.2 100.0 19.8 0.0 38.7 53.7 19.3 0.0 32.3 39.3 18.2 0.0 21.2C1CA 86.6 90.5 15.9 36.0 19.8 100.0 85.2 26.2 31.3 98.1 76.9 65.1 25.2 95.6 34.2 40.8C5CA 97.3 92.5 0.0 27.0 0.0 85.2 100.0 14.0 19.9 84.2 86.0 51.5 11.6 90.0 35.8 31.2C5CO 13.7 14.2 76.9 86.8 38.7 26.2 14.0 100.0 83.8 26.0 15.5 46.2 87.3 25.1 23.7 52.9C1E 19.5 20.2 60.7 83.4 53.7 31.3 19.9 83.8 100.0 31.1 21.9 46.5 72.0 30.2 21.3 49.8C2E 85.7 89.0 15.5 36.3 19.3 98.1 84.2 26.0 31.1 100.0 78.9 65.4 25.0 94.8 34.5 40.8C3E 83.4 83.1 0.0 29.6 0.0 76.9 86.0 15.5 21.9 78.9 100.0 52.5 13.0 78.2 31.2 26.8C5E 50.0 52.3 29.8 42.7 32.3 65.1 51.5 46.2 46.5 65.4 52.5 100.0 37.5 63.1 30.5 41.7C1T 11.3 11.8 85.2 82.2 39.3 25.2 11.6 87.3 72.0 25.0 13.0 37.5 100.0 24.0 22.8 43.8C4T 90.7 88.0 14.7 36.4 18.2 95.6 90.0 25.1 30.2 94.8 78.2 63.1 24.0 100.0 34.0 38.9C5T 35.2 36.1 16.5 27.3 0.0 34.2 35.8 23.7 21.3 34.5 31.2 30.5 22.8 34.0 100.0 76.5C1Z 32.6 34.2 36.0 52.9 21.2 40.8 31.2 52.9 49.8 40.8 26.8 41.7 43.8 38.9 76.5 100.0 ANEXO 9. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA HpaII

ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1ZATCC 100.0 94.0 0.0 17.4 0.0 62.7 70.8 8.4 0.0 84.0 81.3 0.0 19.1 64.3 24.4 0.0CCT 94.0 100.0 0.0 17.3 0.0 59.5 70.5 13.8 0.0 83.2 83.2 0.0 24.5 64.8 26.8 0.0C1BR 0.0 0.0 100.0 51.8 81.7 24.4 17.7 40.3 66.7 0.0 0.0 15.3 43.4 0.0 20.0 17.1C3BR 17.4 17.3 51.8 100.0 50.1 25.3 14.5 48.9 63.6 15.4 9.9 45.2 39.4 11.1 15.2 54.8C5BR 0.0 0.0 81.7 50.1 100.0 16.4 16.4 37.8 55.4 0.0 0.0 13.9 53.0 0.0 25.1 9.3C1CA 62.7 59.5 24.4 25.3 16.4 100.0 60.1 18.6 24.2 56.8 65.6 9.8 35.8 58.3 24.5 13.6C5CA 70.8 70.5 17.7 14.5 16.4 60.1 100.0 18.8 14.0 77.2 62.9 0.0 25.6 61.4 24.4 0.0C5CO 8.4 13.8 40.3 48.9 37.8 18.6 18.8 100.0 61.4 5.7 17.3 31.4 26.8 10.2 19.2 39.0C1E 0.0 0.0 66.7 63.6 55.4 24.2 14.0 61.4 100.0 0.0 0.0 49.0 29.8 4.0 9.6 46.1C2E 84.0 83.2 0.0 15.4 0.0 56.8 77.2 5.7 0.0 100.0 72.0 0.0 17.2 67.6 24.6 0.0C3E 81.3 83.2 0.0 9.9 0.0 65.6 62.9 17.3 0.0 72.0 100.0 0.0 17.1 60.5 28.4 0.0C5E 0.0 0.0 15.3 45.2 13.9 9.8 0.0 31.4 49.0 0.0 0.0 100.0 10.5 0.0 10.8 60.7C1T 19.1 24.5 43.4 39.4 53.0 35.8 25.6 26.8 29.8 17.2 17.1 10.5 100.0 19.5 48.4 15.1C4T 64.3 64.8 0.0 11.1 0.0 58.3 61.4 10.2 4.0 67.6 60.5 0.0 19.5 100.0 27.8 0.0C5T 24.4 26.8 20.0 15.2 25.1 24.5 24.4 19.2 9.6 24.6 28.4 10.8 48.4 27.8 100.0 32.3C1Z 0.0 0.0 17.1 54.8 9.3 13.6 0.0 39.0 46.1 0.0 0.0 60.7 15.1 0.0 32.3 100.0

ANEXO 10. INDICE DE DICE PARA LA ENZIMA RsaI

ATCC CCT C1BR C3BR C5BR C1CA C5CA C5CO C1E C2E C3E C5E C1T C4T C5T C1ZATCC 100.0 84.1 18.6 38.5 18.7 82.0 83.0 42.5 29.7 71.3 48.8 17.7 35.4 86.9 43.3 45.0CCT 84.1 100.0 22.6 34.0 18.8 87.4 91.8 37.3 28.8 63.1 54.0 15.8 35.2 87.9 41.6 40.5C1BR 18.6 22.6 100.0 71.8 92.8 25.6 24.4 69.1 77.6 14.2 0.0 61.2 77.7 25.5 0.0 45.8C3BR 38.5 34.0 71.8 100.0 76.3 30.4 32.4 92.8 92.6 22.4 23.7 66.0 89.1 33.6 17.7 65.6C5BR 18.7 18.8 92.8 76.3 100.0 21.4 20.3 71.5 83.1 14.3 0.0 63.1 79.3 21.2 0.0 45.8C1CA 82.0 87.4 25.6 30.4 21.4 100.0 94.2 34.0 32.1 66.5 43.5 17.9 32.0 93.2 46.2 44.8C5CA 83.0 91.8 24.4 32.4 20.3 94.2 100.0 36.0 30.8 64.1 44.6 17.1 33.8 94.3 45.6 43.4C5CO 42.5 37.3 69.1 92.8 71.5 34.0 36.0 100.0 86.8 23.1 24.5 62.7 85.9 37.3 18.3 65.4C1E 29.7 28.8 77.6 92.6 83.1 32.1 30.8 86.8 100.0 22.3 14.7 67.4 87.8 31.9 15.7 64.9C2E 71.3 63.1 14.2 22.4 14.3 66.5 64.1 23.1 22.3 100.0 31.0 13.5 21.0 68.8 34.0 35.2C3E 48.8 54.0 0.0 23.7 0.0 43.5 44.6 24.5 14.7 31.0 100.0 0.0 21.4 41.0 87.6 55.6C5E 17.7 15.8 61.2 66.0 63.1 17.9 17.1 62.7 67.4 13.5 0.0 100.0 59.1 17.8 0.0 57.9C1T 35.4 35.2 77.7 89.1 79.3 32.0 33.8 85.9 87.8 21.0 21.4 59.1 100.0 34.9 16.6 58.3C4T 86.9 87.9 25.5 33.6 21.2 93.2 94.3 37.3 31.9 68.8 41.0 17.8 34.9 100.0 41.9 44.3C5T 43.3 41.6 0.0 17.7 0.0 46.2 45.6 18.3 15.7 34.0 87.6 0.0 16.6 41.9 100.0 61.8C1Z 45.0 40.5 45.8 65.6 45.8 44.8 43.4 65.4 64.9 35.2 55.6 57.9 58.3 44.3 61.8 100.0 ANEXO 11. PORCENTAJE DE SIMILITUD DE LAS SECUENCIAS OBTENIDAS DEL GENBANK

ANEXO 12. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA AluI

A. chroococcum A. vinelandii A. nigricans A. paspali A. armeniacus A. salinestris A. beijerinckii A. macrocytogenes Azospirilllum spp. B. derxi D. gummosa B. tropica H. seropedicae R. leguminosarum E. coliA. chroococcum 100.0 22.6 36.4 20.0 20.0 22.6 23.4 22.6 24.3 18.1 19.9 17.9 36.4 25.4 20.0

A. vinelandii 22.6 100.0 78.4 47.1 47.1 78.5 75.5 57.2 84.0 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1A. nigricans 36.4 78.4 100.0 47.3 47.2 78.5 75.4 57.1 83.9 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.1A. paspali 20.0 47.1 47.3 100.0 75.0 47.2 46.3 29.4 48.6 0.0 24.9 21.9 22.0 0.0 24.9

A. armeniacus 20.0 47.1 47.2 75.0 100.0 47.1 46.2 29.4 48.5 0.0 24.8 21.9 22.0 0.0 24.9A. salinestris 22.6 78.5 78.5 47.2 47.1 100.0 75.5 57.2 84.1 0.0 29.1 25.1 25.3 0.0 29.2A. beijerinckii 23.4 75.5 75.4 46.3 46.2 75.5 100.0 56.6 85.0 0.0 30.4 26.1 26.3 0.0 30.5

A. macrocytogenes 22.6 57.2 57.1 29.4 29.4 57.2 56.6 100.0 64.0 0.0 46.9 40.7 25.3 0.0 29.2Azospirilllum spp. 24.3 84.0 83.9 48.6 48.5 84.1 85.0 64.0 100.0 0.0 31.9 27.2 27.4 0.0 32.0

B. derxi 18.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 19.9 20.2 14.6 0.0D. gummosa 19.9 29.1 29.1 24.9 24.8 29.1 30.4 46.9 31.9 0.0 100.0 44.0 22.0 0.0 24.8

B. tropica 17.9 25.1 25.1 21.9 21.9 25.1 26.1 40.7 27.2 19.9 44.0 100.0 19.8 0.0 21.9H. seropedicae 36.4 25.3 25.3 22.0 22.0 25.3 26.3 25.3 27.4 20.2 22.0 19.8 100.0 14.6 22.0

R. leguminosarum 25.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 14.6 0.0 0.0 14.6 100.0 30.2E. coli 20.0 29.1 29.1 24.9 24.9 29.2 30.5 29.2 32.0 0.0 24.8 21.9 22.0 30.2 100.0

ANEXO 13. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA HpaII





B. derxi 22.2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 18.0 0.0D. gummosa 0.0 44.4 22.5 41.3 22.4 29.6 32.9 40.1 38.5 0.0 100.0 40.9 80.0 19.9 15.1



ANEXO 14. COEFICIENTE DE DICE PARA EL ARDRA VIRTUAL UTILIZANDO LA ENZIMA RsaI





B. derxi 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0D. gummosa 0.0 24.8 24.8 22.1 22.0 22.1 22.0 22.1 24.8 0.0 100.0 25.0 25.2 0.0 28.7



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CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS NATIVAS