CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA ATIVIDADE ... · “Sem a convicção de uma harmonia íntima do universo, não poderia haver ciência.” Albert Einstein . Caracterização

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE Erythroxylum mucronatum

Benth. (ERYTHROXYLACEAE)

GRACIELLE SILVA SANTANA

Aracaju 2018

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cavalcante Duarte

Aracaju

2018





Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Aprovada em: ___/____/_____

___________________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Marcelo Cavalcante Duarte

___________________________________________________ 1º Examinador: Profa. Dra. Cristiani Isabel Banderó Walker

____________________________________________________ 2º Examinador: Profa. Dra. Tamires Cardoso Lima

PARECER

----------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------- -----------------------------------------------------------------------------------------------------

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por permitir que eu concluísse o trabalho, me

dando força diante de cada obstáculo encontrado (que não foram poucos). Por cada

―anjo humano‖ que colocou no meu caminho, eles foram essenciais para guiar cada

passo dado.

Meu orientador, prof. Marcelo Cavalcante, no nosso primeiro contato tive a

certeza que eu estava diante de uma pessoa de coração maravilhoso, e isso foi de

extrema importância pra mim. Obrigada por cada palavra de incentivo e principalmente

por acreditar em mim. Á Allan John, meu colega de laboratório desde o primeiro dia, por

quantas vezes parou um tempinho pra tirar minhas dúvidas.

Á professora Anamara, não tenho nem palavras para agradecer toda a ajuda que

me deu na parte de antioxidantes. Sempre muito paciente e prestativa na hora de me

explicar. Além de tudo, disponibilizando o laboratório para que eu pudesse realizar as

análises, e que sorte eu tive, por coincidência a técnica do laboratório era minha amiga

Suzanne, cada método realizado eu aprendi a fazer com ela.

Ao pessoal do Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA) da

UFPB. Quanta dedicação e companheirismo tiveram comigo, vocês foram essenciais na

conclusão do meu trabalho, momento em que eu mais precisei.

A todos os amigos do LCP/DQI, lugar que foi meu refúgio durante todo o

mestrado, onde sempre fui muito bem acolhida e jamais deixarei de fazer parte.

Ao pessoal do laboratório de Flavor da UFS, por toda assistência dada nos dias

em que estive lá.

À FAPITEC/CAPES pela bolsa concedida.

Aos meus colegas da turma 2016.1 do PPGCF, com os quais convivi momentos

fantásticos de descontração e estudos nos dois primeiros semestres de aula.

À minha família, que sempre me deu força nos estudos, em especial a minha

mãe, Givalda, que mesmo não entendendo nada sobre meu trabalho (rsrs...) estava

sempre a par de cada situação boa ou ruim que vivi durante esse tempo. E ao meu

namorado Antony, por tantas vezes ter que aguentar as crises de ansiedade que o

mestrado me causou, kkkk.

Por fim, e não menos importantes, aos meus amigos da graduação (e da vida),

que estão sempre ao meu lado, torcendo por mim. Obrigada a todos.

“Sem a convicção de uma harmonia íntima do

universo, não poderia haver ciência.”

Albert Einstein

Caracterização química bioguiada pela atividade antioxidante de Erytrhoxylum mucronatum Benth. (Erythroxylaceae) [dissertação]. Gracielle Silva Santana, Universidade Federal de Sergipe, 2018.

RESUMO

A busca pela cura e alívio de doenças através da ingestão de ervas e folhas pode ter

sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. Os cientistas e a

indústria farmacêutica têm demonstrado intenso interesse em desenvolver pesquisas

com a finalidade de descobrir novos princípios ativos de substâncias oriundas de

plantas. Algumas espécies encontradas na flora de Sergipe ainda são

desconhecidas ou pouco conhecidas cientificamente, a exemplo da espécie

Erythroxylum mucronatum que não possui relatos na literatura de seu uso na

medicina popular, bem como estudos químicos e farmacológicos ainda não foram

registrados. O presente estudo teve como objetivo realizar a caracterização química

bioguiada pela atividade antioxidante dessa espécie. Foi feita a investigação da

capacidade antioxidante para o extrato etanólico bruto (EEB) e as fases acetato de

etila (FAE), clorofórmica (FC) e hexânica (FH), todos apresentaram atividade

antioxidante, com destaque para a FAE que mostrou-se a mais ativa, através dos

métodos de eliminação dos radicais DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazila) (IC50= 37,9

µg/mL), ABTS (2,2'-azinobis (ácido 3 etilbenztiazolino-6- sulfônico)) (IC50= 452,8

µg/mL), NO (Óxido Nítrico) (IC50= 122,81 µg/mL) e ensaio de potencial reducional de

ferro (FRAP), onde demonstrou atividade superior ao padrão Trolox®. O conteúdo

de compostos fenólicos totais para a FAE foi de 348,85 ± 8,47 mg de equivalente de

ácido gálico/g da amostra. A análise em cromatógrafo líquido de alta eficiência

acoplado a espectrômetro de massas (HPLC-MS) identificou 20 compostos fenólicos

presentes na FAE. Entre os compostos identificados, FAE20 foi isolado e elucidado

por ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, denominado como

quercetina-3-O-α-L-ramnosídeo. Conjuntamente, estes resultados evidenciam que a

espécie estudada é bioprodutora de compostos fenólicos e que além de ser

antioxidante esta possui potencial para a realização de novos estudos

farmacológicos.

PALAVRAS-CHAVE: antioxidante, compostos fenólicos, Erythroxylum.

Chemical characterization bioguided by the antioxidant activity of Erytrhoxylum mucronatum Benth (Erythroxylaceae) [dissertation]. Gracielle Silva Santana, Universidade Federal de Sergipe, 2018.

ABSTRACT

The search for healing and the service of diseases through the ingestion of herbs

and leaves may have been one of the first ways of using natural products. Scientists

and the pharmaceutical industry have demonstrated intense in ventures researched

for the purpose of discovery. Other species found in the flora of Sergipe are still

unknown or little known scientifically, such as the Erythroxylum mucronatum species

that has no reports in the literature of its use in folk medicine, as well as chemical and

pharmacological studies have not yet been recorded. The objective of the present

study was to carry out a chemical characterization bioguided by the antioxidant

activity of this species. The antioxidant measurement for the crude ethanolic extract

(EEB) and ethyl acetate (FAE), chloroform (FC) and hexane (FH) phases were

tested, all of which presented antioxidant activity, with emphasis on FAE which

showed to be the most active, through the methods of elimination of DPPH radicals

(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazila (IC50 = 37.9 μg / mL), ABTS (2,2'-azinobis (3-

ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)) (IC50 = 452.8 μg / mL), NO (Nitric Oxide) (IC50 =

122.81 μg / mL) and reductive potential (FRAP), where it demonstrated activity

superior to the Trolox® standard. The content of total phenolic compounds for AED

was 348.85 ± 8.47 mg of gallic acid equivalent / g of the sample. A high-efficiency

liquid chromatograph coupled to mass spectrometer (HPLC-MS) analysis identified

20 sets of phenolic present in FAE. Among the compounds identified, FAE20 was

isolated and isolated by 1H and 13C nuclear magnetic resonance (RMN), termed

quercetin-3-O-α-L-rhamnoside. Together, these results show that it is a studied and

bioproductive species of phenolic compounds and that besides being an antioxidant,

it has the potential to carry out new pharmacological studies.

KEYWORDS: antioxidant, phenolic compounds, Erythroxylum.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mapa de distribuição da família Erythroxylaceae no mundo......................17

Figura 2. Estrutura da cocaína..................................................................................18

Figura 3. Espécie E. mucronatum.............................................................................20

Figura 4. Estrutura básica dos flavonoides................................................................21

Figura 5. Exemplos de estruturas das classes de flavonoides..................................22

Figura 6. Esquema Simplificado da Biossíntese dos flavonoides.............................23

Figura 7. Estruturas dos flavonoides isolados por OLIVEIRA (2012)........................24

Figura 8. Estruturas isoladas por RIBEIRO (2013) ...................................................25

Figura 9. Estruturas isoladas por ALBUQUERQUE (2014).......................................25

Figura 10. Exsicata E. mucronatum...........................................................................29

Figura 11. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH no sequestro do radical

DPPH..........................................................................................................................36

Figura 12. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na captura do radical

ABTS..........................................................................................................................38

Figura 13. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na inibição do NO...........40

Figura 14. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH pelo potencial reducional

do Ferro......................................................................................................................42

Figura 15. Curva padrão de ácido gálico para a determinação do teor de fenólicos

totais..........................................................................................................................44

Figura 16. Cromatograma de íons totais da FAE obtido a partir da análise por HPLC-

MS no modo de ionização negativo.............................................................................45

Figura 17. Estrutura química das procianidinas diméricas do tipo B.........................47

Figura 18. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo B...................................48

Figura 19. Proposta de fragmentação do Ácido Clorogênico....................................49

Figura 20. Estrutura do Ácido clorogênico e seu isômero Ácido Criptoclorogênico..50

Figura 21. Procianidina trimérica. epicatequina-(4β-8)-epicatequina-(4β-8)-

epicatequina...............................................................................................................50

Figura 22. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo C...................................51

Figura 23. Proposta de fragmentação da Catequina e Epicatequina........................52

Figura 24. Fragmentação da perda da unidade osídica da isoquercitrina................53

Figura 25. Fragmentação da perda da unidade rutinosídeo para o composto

Rutina.........................................................................................................................53

Figura 26. Fragmentação da perda da unidade osídica da quercetin-3-o-

pentosídeo..................................................................................................................54

Figura 27. Fragmentação da perda da ramnose da quercetin-3-o-ramnosídeo........55

Figura 28. Cromatograma HPLC-UV da FAE comprimento de onda de 280nm.......56

Figura 29. Espectro de RMN-1H (DMSO-d6; 500 MHz) do pico majoritário da FAE.57

Figura 30. Espectro de RMN-13C (DMSO-d6; 125 MHz) do pico majoritário da

FAE.............................................................................................................................58

LISTA DE TABELAS E QUADROS

Quadro 1. Espécies do gênero Erythroxylum estudadas quanto às atividades

farmacológicas...........................................................................................................19

Tabela 1. Compostos fenólicos identificados na FAE com correspondentes T.R. e

dados de espectrometria de massas (modo negativo) obtido por HPLC-MS............46

Tabela 2. Deslocamentos químicos RMN 13C 125 MHz............................................58

LISTA DE SIGLAS

ABTS 2,2'-azinobis (ácido 3 etilbenztiazolino-6- sulfônico)

APT Attached próton test

DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado

DPPH 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

EEB Extrato etanólico bruto

EPM Erro padrão médio

ER Espécies reativas

ERN Espécies reativas de nitrogênio

ERO Espécies reativas de oxigênio

ESI Ionização por eletrospray

FAE Fase acetato de etila

FC Fase clorofórmica

FH Fase hexânica

FRAP Ferric reducing antioxidante power

HPLC High performance liquid chromatography

LC Liquid chromatography

MS Mass spectrometry

NO Óxido nítrico

RMN Ressonância magnética nuclear

SNC Sistema nervoso central

SNP Nitroprussiato de sódio

TPTZ Tripiridiltriazina

TR Tempo de retenção

UV Ultravioleta

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 15

2. REFERENCIAL TEÓRICO ............................................................................ 17

2.1. FAMÍLIA ERYTHROXYLACEAE ............................................................................... 17

2.2. GÊNERO ERYTHROXYLUM .................................................................................. 18

2.3. CONSIDERAÇÕES SOBRE A ESPÉCIE ERYTHROXYLUM MUCRONATUM (BENTH.) ........ 20

2.4. COMPOSTOS FENÓLICOS .................................................................................... 20

2.4.1. Flavonóides .............................................................................................. 21

2.4.2. Flavonoides no gênero Erythroxylum ........................................................ 24

2.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ................................................................................... 26

3. OBJETIVOS ................................................................................................... 28

3.1. OBJETIVO GERAL ............................................................................................... 28

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................... 28

4. METODOLOGIA ............................................................................................ 29

4.1. COLETA ............................................................................................................ 29

4.2. PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL ........................................................... 29

4.3. OBTENÇÃO DO EXTRATO ETANÓLICO BRUTO (EEB) ............................................. 29

4.4. PARTICIONAMENTO DO EEB ............................................................................... 30

4.5. AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .............................................................. 31

4.5.1. Capacidade antioxidante por eliminação do radical DPPH• (2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo) ...................................................................................................... 31

4.5.2. Capacidade antioxidante por eliminação do radical ABTS•+(2,2'-azinobis

(ácido 3-etilbenztiazolino-6-sulfônico))................................................................ 31

4.5.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO) ............... 32

4.5.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)....... 32

4.6. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FAE .................................................................... 33

4.6.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais ................................ 33

4.6.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos ...................................... 33

4.6.2.1. Análise Cromatográfica ...................................................................... 33

4.6.2.2. Isolamento do composto majoritário ................................................... 34

4.6.2.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C ................................................................................................................... 35

4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 35

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 36

5.1. AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ANTIOXIDANTE ............................................................. 36

5.1.1. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais DPPH• .................... 36

5.1.2. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais ABTS•+ ................... 38

5.1.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO) ............... 39

5.1.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)....... 41

5.2. CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DA FAE .................................................................... 43

5.2.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais ................................ 43

5.2.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos ...................................... 45

5.2.2.1. Análise Cromatográfica ...................................................................... 45

5.2.2.2. Elucidação estrutural por Espectroscopia de Ressonância Magnética

Nuclear (RMN) de 1H e 13C ............................................................................. 56

6. CONCLUSÃO ................................................................................................ 59

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 60

APÊNDICES ............................................................................................................. 70

15

1. INTRODUÇÃO

A humanidade faz uso dos produtos naturais desde tempos imemoriais. A

busca pela cura e alívio de doenças através da ingestão de ervas e folhas pode ter

sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. Os povos

primitivos e indígenas tinham profundo conhecimento do arsenal químico da

natureza, o que foi considerado fator fundamental para o descobrimento de

substâncias tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A convivência e o

aprendizado com os mais variados grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições

para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais, do conhecimento da

relação próxima entre a química de um determinado composto e suas propriedades

biológicas (JUNIOR, 2006).

Atualmente os cientistas, bem como a indústria farmacêutica, têm

demonstrado um intenso interesse em desenvolver pesquisas com o objetivo de

descobrir novos princípios ativos e também aprimorar as descobertas de

ferramentas ou de novas atividades farmacológicas de substâncias já conhecidas e

oriundas de plantas (FIRMO et al., 2011).

Os estudos comprovam que os vegetais sintetizam compostos que são

agrupados da seguinte forma: os metabólitos primários, tais como carboidratos,

aminoácidos, lipídeos; e os metabólitos secundários que são compostos elaborados

a partir da síntese dos metabólitos primários, tais como compostos fenólicos,

terpenóides, alcalóides, entre outros. Esses compostos que resultam do

metabolismo secundário são os responsáveis pelos efeitos farmacológicos ou

tóxicos das plantas, e eles apresentam grande importância ecológica (SANTOS,

2011).

O Brasil detém a maior biodiversidade do mundo, despertando o interesse da

comunidade científica para estudo, conservação e utilização racional desses

recursos (SANTOS, 2011). Outro aspecto a ser ressaltado é que grande parte das

plantas existentes ainda não foram estudadas fitoquímica e biologicamente, sendo

promissoras fontes de compostos bioativos (DUARTE, 2009).

O estado de Sergipe é caracterizado por uma vegetação típica de caatinga,

bem como por remanescentes de mata atlântica (incluindo os mangues e as

16

restingas), com muitos elementos do cerrado e vegetação de campos rupestres.

Nestes ambientes, encontram-se plantas com reconhecida atividade terapêuticas

pela população local, bem como espécies de ocorrência endêmica. Algumas

espécies ainda são desconhecidas ou pouco conhecidas cientificamente, tanto do

ponto de vista botânico, químico, farmacológico e econômico (SAMPAIO, 2008).

Entre as espécies presentes na flora do estado de Sergipe têm-se aquelas

pertencentes à família Erythroxylaceae, com destaque para o gênero Erythroxylum

P. Browne. No estado, foram registradas 18 das 128 espécies de Erythroxylum

presentes no Brasil (FLORA DO BRASIL, 2018), ocorrendo 14 delas nas formações

vegetais da Mata Atlântica (restingas, tabuleiros litorâneos, florestas estacionais e

florestas ombrófilas) (PRATA et. al., 2013). Estudos fitoquímicos realizados

previamente com diferentes espécies do gênero levaram ao isolamento de muitos

metabólitos secundários, principalmente da classe dos alcaloides e flavonoides, com

efeitos farmacológicos (PAULA, 2012).

Diante de tais fatores, reconhecendo a importância química e biológica do

gênero Erythroxylum e levando em conta que a espécie Erythroxylum mucronatum

não possui relatos na literatura sobre seu uso na medicina popular, bem como

estudos químicos e farmacológicos ainda não foram registrados, considera-se assim

relevante a investigação do potencial químico e biológico de folhas da espécie no

estado de Sergipe, direcionando para a identificação de possíveis substâncias

naturais bioativas, assim contribuindo para a taxonomia da espécie.

17

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. Família Erythroxylaceae

A família Erythroxylaceae compreende quatro gêneros e cerca de 240

espécies com distribuição pantropical (figura 1), tendo seus principais centros de

diversidade e endemismo na Venezuela, Brasil e Madagascar. No Brasil, são

encontradas 128 espécies (FLORA DO BRASIL, 2018) das 187 registradas para a

América tropical (ALBUQUERQUE et al., 2014).

Fonte: www.tropicos.org, 2018.

A maioria das espécies pertence ao gênero Erythroxylum, que apresenta

ampla distribuição na América, África, Ásia e Oceania, principalmente, na região

tropical do continente americano. Aneulophus Benth, Nectaropetalum Engl. e

Pinacopodium Excell & Mendonca, são os outros três gêneros pertencentes a família

Erythroxylaceae. Estes gêneros compreendem poucas espécies e apresentam

distribuição exclusiva na África. No Brasil, ocorre apenas o gênero Erythroxylum

(PAULA, 2012). A espécie Erythroxylum coca Lam. e as suas variedades, são as

plantas mais conhecidas dessa família, sendo amplamente cultivada para a

obtenção da cocaína (MENDONÇA,1998).

Figura 1. Mapa de Distribuição da Família Erythroxylaceae no Mundo.

18

2.2. Gênero Erythroxylum

O gênero Erythroxylum está presente nas regiões tropicais e subtropicais do

planeta (PAULA, 2012). Esse gênero possui grande versatilidade ecológica, com

espécies encontradas em ambientes úmidos como a Floresta Amazônica e a

Floresta Atlântica, e em regiões semiáridas, ocorrendo em diferentes níveis de

elevações (desde o nível do mar até hábitats montanhosos) (LOIOLA et. al.,2007).

As únicas espécies de interesse econômico são as espécies E. coca e E.

novogranatense, cultivadas devido ao seu teor de cocaína ( pode chegar a até 2%

da massa seca de folhas). A cocaína (figura 2) é encontrada em abundância nestas

duas espécies e ocorre em traços em algumas outras espécies (BROCK, et al.,

2005).

O interesse pelo gênero Erythroxylum intensificou-se no século XIX, após a

descoberta das atividades farmacológicas apresentadas pelas folhas de E. coca

Lam., amplamente empregada pelos indígenas da região andina da América do Sul

(LOIOLA et. al., 2007).Estudos fitoquímicos realizados com diferentes espécies do

gênero Erythroxylum levaram ao isolamento de muitos metabólitos secundários.

Várias espécies já apresentaram a ocorrência de metabólitos importantes como

flavonóides e alcalóides, também foram encontrados compostos como taninos,

terpenos e fenilpropanóides, que em resultados obtidos em trabalhos anteriores

mostraram que apresentam atividade antioxidante, antimicrobiana, antinociceptiva

dentre outras (PAULA, 2012). Destaca-se a presença da cocaína, um alcalóide

natural do grupo tropano, produzido por E. coca, que foi empregado como

anestésico local em pequenas cirurgias. Entretanto, a cocaína ganhou notoriedade

por sua atividade psicoativa no Sistema Nervoso Central (SNC) (LOIOLA et

al.,2007).

Figura 2. Estrutura da cocaína

19

Estudos farmacológicos com espécies dessa família demostraram excelentes

resultados frente ao sistema biológico (quadro 1) como vasorelaxamento em células

do musculo liso de ratos (OLIVEIRA et. al., 2012) atividade psicoativa (TAMAGNAN

et. al., 2004), antimicrobiana (ALBUQUERQUE et al.,2014) e antitumoral (AGUIAR

et. al., 2011).

Quadro 1. Espécies do gênero Erytrhoxylum estudadas quanto às atividades farmacológicas

Espécie (s) Atividade Biológica Órgão Vegetal Referência

E. sideroxyloides Atividade

antioxidante

folhas (SOOBRATTEE et

al.,2008)

E. caatingae Efeito vasodilatador caule (REIS et al., 2012)

E. pungens Efeito

cardiovascular

raízes (OLIVEIRA et al.

2012)

E. monogynum Efeito

hepatoprotetor

folhas (SYED; NAMDEO,

2013)

E. caatingae, E.

subrotundum e E.

revolutum

Efeito relaxante

folhas (SANTOS et al.,

2013)

E. caatingae Atividade

espasmogênica

folhas (RIBEIRO, 2013)

E. caatingae Atividade

antinociceptiva

tronco (MAIA et al., 2014)

E. pulchrum

Atividade

antibacteriana

folhas

(ALBUQUERQUE

et al. 2014)

20

2.3. Considerações sobre a espécie Erythroxylum mucronatum (Benth.)

E. mucronatum é uma árvore de 2,5 - 4 metros de altura, amplamente

distribuída na América do Sul. No Brasil ocorre em matas úmidas da Mata Atlântica e

Amazônia, nas regiões norte, centro-oeste e nordeste. No estado de Sergipe essa

espécie ocorre em florestas ombrófilas, estacionais e na restinga arbórea.

Assemelha-se morfologicamente a E. citrifolium, com quem divide o mesmo hábitat.

Em E. citrifolium as estípulas são menores que 6,5 mm compr., caducas e

permanecem íntegras quando maduras, desprendendo-se dos ramos na base e os

fascículos estão localizados na axila das folhas e dos catafilos. Já em E.

mucronatum, as estípulas são maiores que 8 mm comprimento, persistentes e se

rompem longitudinalmente quando maduras e os fascículos são encontrados na

axila dos catafilos. Espécie que floresce e frutifica ao longo de todo o ano. No estado

do Sergipe foi registrada com flores nos meses de janeiro e fevereiro (PRATA et al.,

2013).

Figura 3. Espécie E. mucronatum

Fonte: www.floradobrasil.jbrj.gov.br

2.4. Compostos Fenólicos

Os compostos fenólicos constituem uma das classes de metabólitos

secundários mais importantes, numerosas e onipresentes no reino vegetal (NACZK;

SHAHIDI, 2004). Apresentam uma enorme diversidade estrutural e executam

diversas funções, desde proteção contra radiação UV até funções de sustentação e

suporte do vegetal (SOUSA, 2015), além de contribuir para as características

sensoriais de frutas e verduras.

21

Os compostos fenólicos têm como estrutura básica um anel aromático

podendo ter uma ou mais hidroxilas como substituintes, e variam de moléculas

fenólicas simples a compostos altamente polimerizados (BALASUNDRAM;

SUNDRAM; SAMMAN, 2006). São classificados principalmente de acordo com o tipo

de esqueleto principal. Dentre as principais classes de compostos fenólicos estão: os

ácidos hidroxibenzóicos, ácidos hidroxicinâmicos, flavonoides, as ligninas e os

taninos condensados (SIMÕES, 2008). Cada classe de compostos apresenta ampla

variação estrutural, e de acordo com o número e posição de seus grupos hidroxilas e

de outros grupos substituintes que existem na molécula são divididos em subclasses

(MELO et al., 2009).

2.4.1. Flavonóides

Os flavonóides constituem uma importante classe de polifenóis presentes em

abundância entre os metabólitos secundários vegetais (SIMÕES, 2017). Seu núcleo

fundamental é composto por 15 átomos de carbono, arranjados em três anéis (C6 –

C3 – C6), sendo eles: dois anéis aromáticos (A e B), unidos por três carbonos que

formam um anel heterocíclico (C). O anel A se encontra acoplado ao C, e o anel B

se encontra ligado ao C, nas posições 2, 3 ou 4 (Figura 4).

Os flavonoides podem ocorrer em grande número conjugado com açúcares.

Essa forma, chamada de conjugada, também é conhecida como heterosídeo. São

O-heterosídeos quando a ligação ocorre por intermédio de uma hidroxila e C-

heterosídeos quando a ligação ocorre por intermédio de um carbono. Quando se

encontra sem o açúcar, é chamado de aglicona ou genina, sendo também

Figura 4. Estrutura básica dos Flavonóides

22

denominada de forma livre (SIMÕES, 2017). Os açúcares conjugados com

flavonoides identificados até o momento são: as pentoses D-apiose, L-arabinose, e

D-xilose; as hexoses L-ramnose, D-alose, D-galactose, e D-glicose; e os ácidos D-

galacturônico e D-glicurônico. Os flavonoides também podem estar associados a

dissacarídeos e trissacarídeos.

A classificação dessas substâncias é baseada na modificação do anel

heterocíclico central (Anel C) ou na sua perda (como no caso das chalconas)

(COUTINHO et al.,2009). A figura 5 apresenta exemplos de estruturas de variadas

classes dos flavonoides.

A substituição do anel heterocíclico de seis membros por um de cinco

membros origina a subclasse aurona ou pela forma acíclica a subclasse chalcona.

Os flavonóides podem existir como oligômeros de flavan-3-ol, que são as

Figura 5. Exemplos de estruturas das classes de flavonoides.

Cianidina

(Antocianina)

Luteolina

(Flavona) Canferol

(Flavonóis)

Isoliquiritigenina

(Chalcona) Aureusidina

(Aurona)

Alpinetina

(Flavanona)

Prociadinina B

(Proantocianidina)

Catequina

(Flavan-3-ol)

Amentoflavona

(Biflavonoide)

23

proantocianidinas (também consideradas taninos condensados) ou como oligômeros

de flavona e flavanona, que são os biflavonoides (SIMÕES, 2017).

Os flavonóides são biossintetizados através da combinação das rotas do

ácido chiquímico e do acetato. As estruturas fenilpropanóicas dos anéis B e C são

sintetizadas a partir do ácido p-cumárico da via chiquimato, enquanto que o anel A é

oriundo da condensação tipo Claisen de três Acetil-SCoA da via do acetato (Figura

6) (SIMÕES, 2017).

Figura 6. Esquema Simplificado da Biossíntese dos Flavonóides

Fonte: Adaptado de SIMÕES, 2017

Carboidratos

ác. Chiquímico

ác.Fenilpirúvico

fenilalanina tirosina NH3

ác. cinâmico p-cumaroilCoA

3x malonil-CoA

acetil-CoA

chalconas

flavanonas flavonas

auronas

di-hidroflavonóis flavonóis leucoantocianidinas

antocianidinas catequinas

PROANTOCIANIDINAS

24

Diversas funções são atribuídas aos flavonoides nas plantas: proteção dos

vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, proteção contra insetos,

fungos, vírus e bactérias; atração de animais com finalidade de polinização por atuar

como pigmentos coloridos de flores; controle da ação de hormônios vegetais;

agentes alelopáticos e inibidores de enzimas.

Além da sua relevância em plantas, os flavonoides são importantes para a

saúde humana, principalmente, pela sua atividade farmacológica como eliminador de

radicais. O recente interesse destas substâncias tem sido estimulado pela gama de

benefícios para a saúde, decorrentes das atividades antioxidantes destes compostos

polifenólicos. Para HAMINIUK (2012), esses fitoquímicos revelaram-se muito

eficazes como eliminadores de radicais livres e são importantes antioxidantes por

causa do seu elevado potencial redox e sua capacidade de quelar metais.

Além disso, foram relatados que muitos flavonoides possuem propriedades

antibacterianas e antifúngicas. Isto tem aumentado o interesse da indústria de

alimentos em utilizar esses compostos naturais como componentes para melhorar a

estabilidade de alimentos contra agentes de deterioração microbiológica (SANTAS;

ALMAJANO; CARBO, 2010).

2.4.2. Flavonoides no gênero Erythroxylum

Estudos fitoquímicos já realizados com espécies variadas do gênero

Erythroxylum, demonstraram uma predominância no isolamento de metabólitos

secundários das classes dos alcaloides (tropânico), flavonoide e terpenoide. Outras

classes também já foram isoladas neste gênero, porém, com menor frequência.

OLIVEIRA (2012) isolou dois flavonoides (Figura 7) das folhas de E.

subrotundum. Foram eles: 5,7,4’ – trihidroxiflavona – 3-O-α-L- ramnosídeo [1] e

quercetina – 3-O-α-L- ramnosídeo [2].

Figura 7. Estruturas dos flavonoides isolados por OLIVEIRA (2012).

[1] [2]

25

Nas partes aéreas (folhas) de E. rimosum, foram isolados e identificados dez

flavonoides (Figura 8) dentre eles: quercetina, canferol-3-O-α-L-arabinofuranosideo,

quercetina-3-O-α-arabinofuranosideo, quercetina-3-O-α-arabinopiranosideo,

quercetina-3-O-β-arabinopiranosideo, quercetina-3-β-glicopiranosideo, canferol,

quercetina-3-O-β-galactopiranosideo [3-10 respectivamente], (+)-catequina e

epicatequina [11 e 12] (RIBEIRO, 2013).

Das folhas de E. pulchrum, ALBUQUERQUE (2014), realizou o isolamento de

quatro flavonoides: Epicatequina (Figura 8, [12); Quercetina – 3-O-α-L- ramnosídeo

(Figura 7, [2], pág. 24); ombuim-3-rutinosídeo (Figura 9, [13]) e ombuin-3-

rutinosídeo-5-glicosídeo (Figura 9, [14]).

Figura 8. Estruturas isoladas por RIBEIRO (2013).

[11] [12]

Figura 9. Estruturas isoladas por ALBUQUERQUE (2014).

[3] R1 = H; R2 = OH [4] R1 = α-L-arabinofuranosil; R2 = H [5] R1 = α-L-arabinofuranosil; R2 = OH [6] R1 = α-L-arabinopiranosil; R2 = OH [7] R1 = β-L-arabinopiranosil; R2 = OH [8] R1 = β-L-glicopiranosil; R2 = OH [9] R1= H; R2 = H [10] R1 = α-L-galactopiranosil; R2 = OH

[13] R1 = Glu-Rha; R2 = R4 = MeO; R3 = R5 = OH [14] R1 = Glu-Rha; R2 = R4 = MeO; R3 = OH; R5 =

Glu

Glu = Glicose

Rha = Ramnose

26

2.5. Atividade Antioxidante

A oxidação compreende um processo metabólico que ocasiona a produção de

energia necessária para as atividades essenciais das células, produzindo radicais

livres (ROESLER et al., 2007). Os radicais livres são átomos ou moléculas capazes

de possuir existência independente, contendo um ou mais elétrons

desemparelhados na sua última camada de valência. Devido a sua configuração, os

radicais livres possuem como característica a alta reatividade, instabilidade e meia-

vida curta, tornando-os doadores ou receptores de elétrons capazes de interromper

reações em cadeia e danos oxidativos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).

Essas espécies reativas (ERs) são classificadas como: Espécies Reativas do

Oxigênio (EROs) e Espécies Reativas do Nitrogênio (ERNs). As ERs tanto incluem

radicais como o ânion superóxido (O2•-),o radical hidroxila(OH•), o óxido nítrico (NO•)

e o peroxinitrito (OONO-), como também espécies não- radicalares, que são agentes

oxidantes e/ou são facilmente convertidos em radicais, como por exemplo, o

peróxido de hidrogênio (H2O2), o oxigênio singlete e o ácido hipocloroso (HClO)

(NIKKI, 2010). Em baixo nível, os ERs são importantes em muitos processos

bioquímicos, entretanto, o seu excesso pode causar sérios problemas celulares,

como destruição de membrana celular (que é rica em lipídeos que são vulneráveis à

oxidação) e danos ao DNA (LIMA; BEZERRA, 2012). O excesso de formação e/ou

remoção insuficiente dessas espécies reativas é chamado de estresse oxidativo.

Este tem sido associado ao processo de envelhecimento e ao desenvolvimento de

doenças como o câncer, diabetes, doenças cardíacas e degenerativas como o

Alzheimer (ROESLER et al., 2007).

As ERs podem ser geradas por fontes endógenas (dentro do organismo) ou

exógenas (externa). Alguns processos biológicos que ocorrem no organismo dão

origem às ERs endógenas. Já as fontes exógenas incluem tabaco, poluição do ar,

anestésicos, pesticidas e radiações. Os sistemas biológicos controlam estes fatores

oxidativos via diversos mecanismos antioxidantes que reduz a reatividade dos

radicais livres (SANTOS, 2015). O sistema de defesas antioxidantes é formado por

linhas de defesa enzimática e não enzimática que atuam de forma colaborativa e

coordenada no organismo. Entre os antioxidantes enzimáticos estão as enzimas

superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidases (GPx) e catalase (CAT). Já os

antioxidantes não enzimáticos obtidos através da dieta, são representados pelo

27

ácido ascórbico (Vitamina C), α-tocoferol (Vitamina E), carotenoides, compostos

fenólicos (flavonoides) e outros antioxidantes (VALKO et al., 2007).

Os compostos antioxidantes podem prevenir, impedir ou reduzir o dano de

oxidação provocado pelos radicais livres. Eles fazem isso através da doação de um

de seus elétrons que acaba estabilizando o radical livre e, por serem estáveis não se

tornam radicais livres quando doa este elétron (CASAGRANDE, 2014). Do ponto de

vista estrutural, os antioxidantes são compostos aromáticos que possui pelo menos

uma hidroxila. O átomo de hidrogênio ativo do antioxidante é abstraído pelos

radicais livres e radicais peróxidos, a partir daí são formadas espécies inativas para

reagir em cadeia e também um radical inerte oriundo do antioxidante. Este radical

inerte é estabilizado por ressonância, desta forma o mecanismo de ressonância que

os antioxidantes possuem (devido ao anel aromático em sua estrutura) os impede de

vir a se tornarem radicais livres e assim potencializar a oxidação lipídica (RAMALHO;

JORGE 2006).

Diversos mecanismos podem ser utilizados para testar a atividade

antioxidante de sistemas biológicos ou produtos naturais. Sendo estes baseados na

captura do radical livre (DPPH, ABTS e NO), no poder de redução do metal (FRAP),

na quantificação de produtos formados durante a peroxidação dos lipídeos (co-

oxidação do β-caroteno, TBARS e oxidação do LDL), na captura do radical hidroxila

(método de desoxirribose), na captura do radical peroxila (TRAP, ORAC), dentre

outros (CRAFT et al., 2012).

28

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

Realizar a caracterização química bioguiada pela atividade antioxidante da

espécie Erythroxylum mucronatum.

3.2. Objetivos Específicos

Obter o extrato etanólico bruto e frações orgânicas da espécie E.

mucronatum;

Realizar os testes de captura de radicais livres (DPPH, ABTS e NO) e

capacidade redutora (FRAP) no extrato bruto e frações orgânicas de E. mucronatum;

Determinar por espectrofotometria o teor de compostos fenólicos totais na

fração acetato de etila;

Identificar, por HPLC-MS os compostos fenólicos presentes na fração de

acetato de etila;

Elucidar o componente majoritário da fração de acetato de etila por RMN de

1H e 13C;

29

4. METODOLOGIA

4.1. Coleta

As folhas de E. mucronatum foram coletadas no mês de março de 2016 na

Serra de Itabaiana, coordenadas [10°45’19’’ S, 37°20’32’’ W], município de Areia

Branca, Sergipe. O material vegetal foi identificado pela profa. Dra. Ana Paula do

Nascimento Prata, taxonomista vegetal do Departamento de Biologia da

Universidade Federal de Sergipe (UFS). Uma exsicata (Figura 10) do material em

estudo foi depositada no Herbário ASE/UFS sob o número de registro 36300.

4.2. Processamento do Material Vegetal

Depois de coletado, o material vegetal da espécie em estudo (folhas), foi seco

em estufa de ar circulante à temperatura de 40°C, durante 72 horas, em seguida

triturado em moinho mecânico, obtendo-se um pó seco (1145g).

4.3. Obtenção do Extrato Etanólico Bruto (EEB)

O material vegetal seco foi submetido à maceração exaustiva com etanol

(92,3%), com renovação de solvente em intervalo de 72 horas. A solução extrativa

obtida foi concentrada em rotaevaporador, sob pressão reduzida a uma temperatura

de 40°C, obtendo-se o extrato etanólico bruto (EEB) (23,87%).

Figura 10. Exsicata de E.mucronatum

30

4.4. Particionamento do EEB

Parte do extrato (100 g) foi suspenso em metanol-água (7:3) e, em seguida,

submetido a uma partição líquido/líquido com solventes de diferentes polaridades em

um funil de separação de 1000 mL, fornecendo as frações hexânica (2,03 %),

clorofórmica (2,53 %) e acetato de etila (17,38 %), respectivamente (Fluxograma1)

(LUCENA et al., 2013).

Extrato Etanólico Bruto

(100g)

MeOH:H2O (7:3)

Solução Hidroalcoólica

Hexano

Fase Hexânica

Fase Clorofórmica

Solução Hidroalcoólica III Fase Acetato de

Etila

Solução Hidroalcoólica II

Solução Hidroalcoólica I

Clorofórmio

Acetato de Etila

Fluxograma 1. Representação do processo de partição líquido/líquido do extrato etanólico bruto.

31

4.5. Avaliação de atividade antioxidante

Estes procedimentos foram realizados no laboratório de bromatologia do

Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Sergipe (UFS), com a

colaboração da Profa. Dra. Ana Mara de Oliveira e Silva.

4.5.1. Capacidade antioxidante por eliminação do radical DPPH• (2,2-difenil-1-

picrilhidrazilo)

Para a avaliação da capacidade antioxidantedo EEB e das suas respectivas

fases contra o radical DPPH•, foi utilizada a metodologia adaptada de BRAND-

WILLIANS, CUVELIER e BREST (1995). Foiadicionada em microplaca 50 µL da

solução do EEB, fase acetato de etila, fase clorofórmica e fase hexânica (1, 3, 10,

30, 100 µg/mL) a 150µL da solução metanólica DPPH (0,06 mM). Foram utilizados

como acompanhamentos para os testes um controle negativo (branco sem

antioxidante, metanol) e um padrão análogo sintético da vitamina E, denominado

Trolox® (100 µg/mL). A placa foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos

(ausência de luz) e posteriormente, foi feita a leitura das absorbâncias (leitor de

placas) a 517 nm. O teste foi realizado em triplicata e os valores das absorbâncias

foram expressos em porcentagem de inibição do radical DPPH de acordo com a

seguinte equação:

% Inibição DPPH = 100 x [(controle – amostra)/controle]

(Equação 1)

4.5.2. Capacidade antioxidante por eliminação do radical ABTS•+(2,2'-azinobis (ácido 3-

etilbenztiazolino-6-sulfônico))

Para a avaliação da capacidade antioxidante do EEB e das suas respectivas

fases contra o radical ABTS•, foi utilizada a metodologia adaptada de REet al.

(1999). Inicialmente, foi formado o radical ABTS•+ a partir da reação de 5 mL da

solução estoque de ABTS (7 mM) em 88 µL de solução de persulfato de potássio

K2S2O8(140 mM), a qual foi incubada a temperatura ambiente na ausência de luz por

16 horas. Passado este tempo, a solução de ABTS foi diluída em etanol aos poucos,

até obter uma absorbância de 0,70 ± 0,05 em 734nm. Em microplaca 3µL das

32

amostras (10, 30, 100, 300, 1000 µg/mL) foram adicionados a 300µL do radical

ABTS. Foram utilizados como acompanhamentos para os testes um controle

negativo (branco sem antioxidante, álcool etílico) e o padrão Trolox® (1000 µg/mL).A

leitura das absorbâncias foi realizada após 15 minutos em leitor de placas a 734 nm.

O teste foi realizado em triplicata e os valores das absorbâncias foram expressos em

porcentagem de inibição do radical ABTS de acordo com a seguinte equação:

% Inibição ABTS = 100 x [(controle – amostra)/controle]

(Equação 2)

4.5.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO)

A partir da decomposição espontânea do nitroprussiato de sódio (20 mM) em

tampão fosfato (pH=7,4) (29,75mg de SNP + 5mL de tampão), foi gerado o NO. A

partir daí, o NO interage com o oxigênio para produzir íons nitrito, que foram

medidos por meio da reação de Griess, de acordo com o método de BASU et al.

(2006). Em uma microplaca, foram adicionados 50 µL das amostras (1, 3, 10, 30,

100 µg/mL) em 50µL do SNP e foi incubada a 37°C durante 1 hora. Em seguida,

foram adicionados 100µL do reagente de Griess (Need 0,2% + Sulfa 2%; 1:1) recém

preparado na ausência de luz. Foram utilizados como acompanhamentos para os

testes um controle negativo (branco sem antioxidante, tampão fosfato) e o padrão

Trolox® (100 µg/mL). Aguardou-se 15 minutos e as absorbâncias foram medidas no

comprimento de onda de 540 nm. O teste foi realizado em triplicata e foi gerada uma

curva padrão de nitrito de sódio (NaNO2) (5, 10, 20, 40, 80, 100 µmol). A equação da

reta foi utilizada para calcular a capacidade antioxidante do EEB e das suas

respectivas fases.

4.5.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)

Na determinação do potencial reducional do ferro pelo EEB e suas fases, foi

utilizada a metodologia descrita por BENZIE e STRAIN (1996) com adaptações. Em

uma microplaca, foram adicionados 9 µL das amostras (1, 3, 10, 30, 100 µg/mL),

27µL de água destilada e 270 µL do reagente FRAP (15 mL de tampão acetato 0,3M

+ 1,5mL de uma solução de TPTZ 10mM e 1,5 de uma solução aquosa de cloreto

férrico 20 mM). A placa foi incubada a 37°C por 30 minutos e a leitura foi realizada a

33

um comprimento de onda de 595 nm. Foram utilizados como acompanhamentos

para os testes um controle negativo (branco sem antioxidante, tampão acetato) e o

padrão Trolox® (100 µg/mL). O teste foi realizado em triplicata e foi gerada uma

curva padrão de sulfato ferroso (FeSO4) (125, 250, 500, 1000, 1500, 2000 µmol). A

equação da reta foi utilizada para calcular o potencial redutor das amostras.

4.6. Caracterização química da FAE

4.6.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais

Os compostos fenólicos totais na FAE foram quantificados de acordo com o

método de Folin- Ciocalteau (SWAIN; HILLIS, 1959) com algumas adaptações. Foi

adicionada 12,5 µL da amostra (1 mg/mL) a 200µL de água destilada. Agitou-se e,

em seguida, adicionou-se 12,5µL de reagente Folin- Ciocalteau, a mistura foi

novamente agitada e, após 3 minutos foi adicionada 25 µL de solução saturada de

carbonato de sódio (Na2CO3). Agitou-se e deixou em repouso por 1 hora em

temperatura ambiente. Foi feito um branco (controle negativo) com metanol puro. A

leitura das absorbâncias foi realizada em leitor de placas a um comprimento de onda

de 720 nm. Foi feita uma curva padrão de ácido gálico (10 a 250 µg/mL) nas

mesmas condições da amostra e o resultado foi expresso em equivalente de ácido

gálico.

4.6.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos

A identificação estrutural dos compostos fenólicos da FAE foi realizada no

Laboratório Multiusuário de Caracterização e Análise (LMCA) da Universidade

Federal da Paraíba (UFPB), com colaboração do Prof. Dr. JoseanFechine Tavares.

4.6.2.1. Análise Cromatográfica

A análise estrutural dos compostos fenólicos da FAE foi desenvolvida

utilizando como técnica a cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à

espectrometria de massas (Sistema LC-MS). O equipamento utilizado foi um HPLC

SHIMADZU, constituído por duas bombas LC-20 AD, um desgasificador DGU-20A3,

um auto-injetor SIL-20A, um detector de matriz de fotodiodo SPDM20Avp. Este

34

HPLC estava acoplado a um espectrômetro de massas da marca BRUKER modelo

AMAZON X ION TRAP, fonte de ionização por eletrospray. Os parâmetros de

análise do Ion-Trap foram: capilar 4,5 kV, offset da placa final 500 V, nebulizador

24,5 psi, gás seco (N2) com fluxo de 4,5 L/h e temperatura de 200 ºC. O sistema foi

equipado com uma coluna analítica Kromasil C18 diâmetro interno 250 x 4,6 mm

(tamanho da partícula de 5 µm). As medidas foram feitas no modo Full Scan 100-

1000 m/z (registrados a cada 2 segundos), com aquisição de dados dependente de

MS2, no modo de íon negativo. Não foi utilizado forno na coluna.

A FAE foi diluída em metanol (grau HPLC) a uma concentração de 1 mg/mL.

Os solventes utilizados para a fase móvel foram: (A) 0,1% de ácido fórmico em água

milli-q e (B) Metanol, desgaseificados através de banho ultrassônico. Foi injetado um

volume de 10µL da amostra e a taxa de fluxo de fase foi de 0,6mL/min. O sistema de

gradiente utilizado na eluição iniciou com 15-32% de B de 0,01-47 minutos, 32-70%

de B de 47-83 minutos, 70-80% de B de 83-85 minutos, 80-100% de B de 85-87

minutos . Foi feita a análise cromatográfica no comprimento de onda de 280 nm e os

dados foram avaliados usando o software COMPASS – BRUKER.

4.6.2.2. Isolamento do composto majoritário

O isolamento do componente majoritário da FAE foi realizado em

equipamento HPLC-DAD da marca SHIMADZU, constituído por duas bombas LC-

10AD, um desgasificador DGU-14A, injetor manual, um detector UV-VIS SPD-

10AVvp, sistema de comunicação SCL-10Avp. O cromatógrafo foi equipado com

uma coluna semipreparativa VENUSIL XBP C18 (10 x 250 mm; tamanho de

partícula de 10 µm). Não foi utilizado forno na coluna.

A FAE foi diluída em metanol (grau HPLC) a uma concentração de 30 mg/mL.

Os solventes utilizados para a fase móvel foram: (A) 0,1% de ácido fórmico em água

milli-q e (B) Metanol, desgaseificados através de banho ultrassônico. Foi injetado

um volume de 100 µL da amostra e a taxa de fluxo de fase foi de 3 mL/min. O

sistema de gradiente utilizado na eluição foi o mesmo utilizado para o LC-MS (Item

4.6.3.1). O detector foi ajustado para um comprimento de onda de 280 nm. O

composto majoritário foi coletado em erlenmeyer. Foram feitas sucessivas injeções

até se obter uma quantidade significativa da amostra que foi concentrada em

rotaevaporador.

35

4.6.2.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C

O composto majoritário da FAE foi estruturalmente determinado através do

método espectroscópico de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H e 13C.

A análise de RMN foi realizada em espectrômetro VARIAN-NMR-SYSTEM

500MHz, operando a 500MHz para RMN 1H e 125MHz para RMN 13C. O solvente

utilizado no preparo da amostra foi o dimetil sufóxido deuterado (DMSO) e foi

utilizado como padrão interno o TMS (tetrametilsilano). Os deslocamentos químicos

(δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as constantes de acoplamento (J)

em Hz. As multiplicidades dos sinais em RMN 1H foram indicadas segundo a

convenção: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dupleto), dl (dupleto largo), dd (duplo

dupleto), t (tripleto), q (quarteto) e m (multipleto). O programa utilizado para o

processamento dos dados foi o MestReNova.

4.7. Análise Estatística

Todos os ensaios antioxidantes foram realizados em triplicata e pelo menos

duas vezes. Para o tratamento estatístico dos dados foi utilizada a análise de

variância (ANOVA) para múltiplas comparações, seguida de teste do Tukey,

utilizando o software Prism® 6.0 (GraphPad). Os dados foram expressos como

média e desvio padrão, adotando como significativos os valores de p<0,05. A partir

da equação da reta dos gráficos do potencial de inibição (%) versus as

concentrações das amostras nas análises, foi possível calcular os valores de IC50 do

extrato e suas respectivas frações.

36

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Avaliação de Atividade Antioxidante

5.1.1. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais DPPH•

A medida da capacidade sequestrante determinada pelo método DPPH

baseia-se no princípio de que o DPPH•, sendo um radical estável de coloração

violeta (em solução metanólica ou etanólica) é reduzido na presença de um

antioxidante e adquire coloração amarela (TIVERON, 2010). Isso se deve a

habilidade de transferência de hidrogênio do antioxidante para o radical livre estável

DPPH•. Em sua forma radical, o DPPH• tem maior absorção no comprimento de

onda a 517 nm, mas sob redução por antioxidante ou uma espécie radical, a

absorbância é reduzida (SANTOS, 2011). O grau dessa descoloração foi monitorado

espectrofotometricamente e indicou a habilidade das amostras em sequestrar o

radical livre. Os resultados de inibição do radical DPPH do extrato bruto (EEB), fase

acetato de etila (FAE), fase clorofórmica (FC) e fase hexânica (FH), nas

concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em percentual do

radical DPPH• e estão representados na Figura 11.

Figura 11. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH no sequestro do radical livre DPPH•

Os resultados expressam a média ± E.P.M. (Erro padrão da média) dos valores de inibição in vitro.

***p<0,001 ou **p<0,01 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.

+++p<0,001 entre concentrações do EEB e FAE. ANOVA de uma via seguida do teste de Tukey.

Rad

ical

DP

PH

(%)

0

25

50

75

100

125

Sistema 1 3 10 1 3 10 30 100 1 3 10 30 10030 100 1 3 10 30 100

Trolox

(g/mL)EEB

(g/mL)

FAE

(g/mL)

FC

(g/mL)

FH

(g/mL)

100

***

***

*** ***

***

***

***

***

*****

***

***

***

***

***

*

###

###

+++

+++

+++

37

Todas as amostras neutralizaram o radical DPPH a partir da concentração de

3 µg/mL, exceto a FH que começou a neutralizar o radical somente a partir de 30

µg/mL. Apenas as amostras de FC e FH apresentaram diferença estatística quando

comparados ao padrão trolox (100 µg/mL), indicando que as amostras de EEB e

FAE apresentam atividade antioxidante por inibição do radical DPPH tão eficiente

quanto a do padrão, com valores de inibição de 77,59 e 79,06% respectivamente,

enquanto o trolox inibiu 79,58% do radical. Nas concentrações de 3 a 30 µg/mL o

EEB e FAE tiveram diferença estatística significativa (p<0,001) entre eles.

A IC50 expressa à concentração mínima da amostra necessária para reduzir

em 50% a concentração inicial de DDPH existente no sistema. Desta forma, quanto

menor o IC50 maior será a capacidade da amostra em inibir o radical. O valor

calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH foram 39,53; 37,9; 100,03; 166,9

µg/mL, respectivamente.

O método que envolve a eliminação do radical DPPH é um dos mais

utilizados devido à facilidade e rapidez de desempenho. OLIVEIRA (2015)

descreveu a atividade redutora de DPPH• em extratos etanólico e acetato de etila

preparados a partir das folhas da espécie E. suberosum. Os mesmos apresentaram

IC50 180 µg/mL e 740 µg/mL, respectivamente. O autor relatou que, a atividade

encontrada para o extrato etanólico, apresentou uma relação com os valores altos

encontrados de fenóis totais. (OLIVEIRA et al.,2015). Sendo assim, o presente

estudo demonstrou habilidade em neutralizar o radical DPPH superior ao da

literatura citada.

Em outro estudo, os extratos etanólicos das folhas de E. affine e E.

macrocalyx reagiram com o radical DPPH com IC50 de 16 e 45 µg/mL,

respectivamente (CAIRES, 2015), . Já o resultado de IC50 encontrado no extrato

metanólico das folhas de E. deciddum, em estudo da atividade antioxidante pelo

DPPH•, realizado por ROCHA (2015) foi de 10 µg/mL. Ambos os resultados

apresentaram atividade antioxidante melhor que a do presente estudo.

Estes resultados indicam que mais espécies do gênero Erythroxylum

possuem potencial antioxidante e que estes podem estar associados a diferentes

compostos fenólicos presentes em suas composições.

38

5.1.2. Capacidade antioxidante por eliminação de radicais ABTS•+

Diferentemente do DPPH•, que é um radical livre e é adquirido dessa forma,

sem a necessidade de preparo, o radical ABTS•+ deve ser gerado por reações

enzimáticas ou químicas (SOUZA, 2013). No presente estudo o ABTS•+, de

coloração azul-esverdeada, foi gerado por meio da reação do ABTS com perssulfato

de potássio, que possui máximos de absorção em 645, 734 e 815 nm, entretanto,

734 nm é o comprimento de onda mais comumente utilizado por minimizar a

influência da turbidez e de interferentes da amostra (CASTELO-BRANCO; TORRES,

2011). Em um meio contendo antioxidantes ocorre à redução do ABTS•+ a ABTS,

promovendo a perda da coloração do meio reacional, ocorrendo o decréscimo na

absorbância.

Os resultados de inibição do radical ABTS•+ do EEB, FAE, FC e FH, nas

concentrações de 10, 30, 100, 300 e 1000 µg/mL foram expressos em percentual de

radical ABTS e estão representados na Figura 12.

Figura 12. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na captura do radical livre ABTS•+


***p<0,001 ou *p<0,05 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.


Todas as amostras neutralizaram o radical ABTS a partir da concentração de

100 µg/mL. Somente a FAE não apresentou diferença estatística significativa

quando comparado ao Trolox (1000 µg/mL), indicando que a mesma apresenta

atividade antioxidante por captura do radical ABTS semelhante a do padrão, com

Rad

ical

AB

TS

(%)

0

25

50

75

100

125

Sistema 10 30 300 1000

Trolox

(g/mL)EEB

(g/mL)

FAE

(g/mL)

FC

(g/mL)

FH

(g/mL)

1000100 10 30 300 1000100 10 30 300 1000100 10 30 300 1000100

***

***

***

***

***

***

******

***

* ***

***

***

###

###

###

+++

+++

39

valor de inibição do radical de 92,05%, enquanto que o do trolox foi de 90,38%. FAE

se mostrou ainda mais ativa que EEB nas concentrações de 300 e 1000 µg/mL.

O valor calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH em relação ao ABTS•+

foram 533,18; 452,98; 1182,82; 2079,02 µg/mL, respectivamente.

A avaliação da capacidade antioxidante pelo método de eliminação do radical

ABTS•+ apresenta a vantagem de que a atividade pode ser medida em compostos de

natureza lipofílica ou hidrofílica, enquanto que o DPPH só pode ser dissolvido em

meio orgânico. Além disso, o ABTS•+ é um nitro-radical, portanto, amostras com

atividades nesse sistema podem demonstrar boa resposta contra espécies reativas

de nitrogênio (CRAFT et al., 2012).

Não foram encontrados na literatura estudos de análise de atividade

antioxidante através do ensaio anti-radicalar ABTS em outras espécies de

Erythroxylum, indicando que o presente estudo é inédito para o gênero.

5.1.3. Capacidade antioxidante por eliminação de Óxido Nítrico (NO)

Este método baseia-se na produção de NO a partir da decomposição

espontânea do nitroprussiato de sódio em solução aquosa. Este, por sua vez, reage

rapidamente com o oxigênio produzindo íons nitritos (Basu; Hazra, 2006). O

reagente de Griess é usado para determinar nitrito por espectrofotometria. Esse

reagente é composto por duas substâncias, ácido sulfanílico e N-(1-

naftalenodiamina). O ácido reage com o nitrito formando um sal diazônio, que irá

reagir rapidamente com o N-(1-naftalenodiamina) formando um composto azo

colorido que pode ser detectado espectrofotometricamente a 540 nm. A amostra

contendo antioxidante e o oxigênio competem pelo óxido nítrico, que este sendo

sequestrado pelo primeiro, leva a diminuição da produção de nitrito e

consequentemente, diminui a formação do composto azo colorido (CASTRO, 2012).

Os resultados de inibição do radical óxido nítrico do EEB, FAE, FC e FH, nas

concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em quantidades de

nitrito produzido e estão representados na Figura 13 (pág.40). A curva padrão de

nitrito de sódio gerada apresentou um R² = 0,9998.

40

Figura 13. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH na inibição do radical NO.


***p<0,001 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox. ANOVA de uma via

seguida do teste de Tukey.

Todas as amostras apresentaram capacidade de reduzir o NO produzido em

todas as suas concentrações. Somente as amostras de FC e FH apresentaram

diferença estatística quando comparados ao trolox (100 µg/mL). Para o EEB e FAE

não houve divergência em relação ao padrão, o que indica que estas amostras

apresentam atividade antioxidante frente à inibição do NO em conformidade com o

mesmo, sendo seus valores de inibição 41,19 e 45,57% respectivamente, enquanto

o padrão reduziu 44,92% do NO produzido. Também não houve diferença estatística

significativa entre as concentrações de EEB e FAE, indicando que os mesmos

apresentam atividade semelhante.

O valor calculado para a IC50 de EEB, FAE, FC e FH em relação ao NO foram

133,85; 122,81; 426,76; 7003,45 µg/mL, respectivamente.

NO• é um mediador importante da inflamação aguda e crônica por

estimulação da atividade da enzima ciclooxigenase (COX), resultando em produção

desequilibrada de prostaglandinas pró-inflamatórias. Nas doenças

neurodegenerativas, o cenário inflamatório é considerado uma característica

fundamental que contribui significativamente para o aumento do estresse oxidativo

e, portanto, a progressão da doença. Uma condição pró-inflamatória pode levar a

###

Nit

rito

pro

du

zid

o (

mo

l/L)

0

25

50

75

Sistema 1 3 10 30 100 1 3 10 30 1001 3 10 30 100 1 3 10 30 100

Trolox

(g/mL)EEB

(g/mL)

FAE

(g/mL)

FC

(g/mL)

FH

(g/mL)

100

*** *** ******

***

*** ******

***

***

***

***

*** *** *** ****** *** *** *** ***

###

41

uma sobrecarga de óxido nítrico, aumentando o dano oxidativo devido à formação

de peroxinitrito (DORIA et al., 2015)

Não foram encontrados estudos que analisassem a atividade antioxidante de

outras espécies de Erythroxylum na inibição do radical NO in vitro, indicando que o

presente estudo é inédito para o gênero. Os resultados obtidos indicam que os

compostos presentes nas amostras analisadas podem interagir com o NO formado a

partir da decomposição do SNP, e assim proteger os sistemas biológicos dos danos

causados por essas espécies reativas.

5.1.4. Capacidade antioxidante pelo potencial reducional do Ferro (FRAP)

O método FRAP estima a capacidade da amostra em reduzir o complexo de

Ferro Férrico Tripiridiltriazina (Fe3+ - TPTZ), ao complexo de Ferro Ferroso

Tripiridiltriazina (Fe2+ - TPTZ) em meio ácido. Quanto maior for à capacidade

antioxidante da amostra, maior será a produção do complexo ferroso TPTZ, que

apresenta coloração azul intensa. O monitoramento da atividade redutora da

amostra é feito através da leitura da absorbância em um comprimento de onda de

595 nm (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).

Os resultados da capacidade antioxidante pelo potencial reducional do EEB,

FAE, FC e FH, nas concentrações de 1, 3, 10, 30 e 100 µg/mL foram expressos em

forma de conversão do íon Fe3+ em íon Fe2+ (µmol de sulfato ferroso) Figura 14

(pág. 42). A curva padrão de sulfato ferroso gerada apresentou um R²=0,9957.

FAE e EEB apresentaram potencial em reduzir o ferro a partir da

concentração de 3 µg/mL, enquanto que FC e FH somente a partir de 10 µg/mL.

Todas as amostras (100 µg/mL) tiveram capacidade redutora significativamente

diferente do padrão Trolox (100 µg/mL), no entanto, enquanto os valores de FC e FH

indicaram que os mesmos têm eficiência inferior ao antioxidante padrão, EEB e FAE

demonstraram atividade superior a ele. FAE ainda demonstrou capacidade de

reduzir o ferro maior que EEB nas concentrações de 10 a 100 µg/mL.

42

Figura 14. Atividade antioxidante de EEB, FAE, FC e FH pelo potencial reducional do Ferro.


***p<0,001ou *p<0,05 vs sistema (meio reacional sem antioxidante). ###p<0,001 vs Trolox.


O teste de FRAP mede apenas o poder de redução, isso pode, em alguns

casos, servir como uma deficiência, mas quando usado em conjunto com outros

ensaios essa característica fornece oportunidades para determinar os mecanismos

dominantes de compostos antioxidantes (CRAFT et al., 2012).

A presença de metais iônicos, como ferro e cobre, em um sistema, pode

acelerar a taxa de oxidação desse sistema, produzindo radicais livres altamente

reativos. Compostos quelantes de metais podem alterar o potencial redox desses

íons, tornando-os inativos na geração desses radicais livres (CRAFT et al., 2012).

Compostos fenólicos podem agir como quelantes, possuindo a capacidade de se

ligar a íons metálicos formando um complexo incapaz de promover a oxidação.

Alguns requisitos estruturais são importantes no poder de quelação dos íons

metálicos, como por exemplo, a presença de hidroxilas fenólicas vicinais. Assim

como também a facilidade dos íons de metais de transição a serem quelados segue

uma ordem: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ (MIRA et al., 2002).

Não foram encontrados estudos que avaliaram a atividade antioxidante de

outras espécies de Erythroxylum através da capacidade redutora do ferro, indicando

este ser mais um tipo de estudo de atividade antioxidante inédito para o gênero.

Apesar das amostras do presente estudo terem apresentado capacidade redutora,

###

Po

ten

cia

l R

ed

uc

ion

al

(Fe

3+/F

e2

+)

0

200

400

600

800

1000

Sistema 1 3 30 100 1 3 30 1001 3 30 100 1 3 10 30 100

Trolox

(g/mL)FAE

(g/mL)

FC

(g/mL)

FH

(g/mL)

10010 1010

EEB

(g/mL)

****

***

***

***

***

***

***

******

***

******

*

***

###

### ###

+++

+++

+++

43

se faz necessário realizar o ensaio de quelação do Fe2+, a fim de comprovar também

a sua possível ação como quelante de metais.

5.2. Caracterização química da FAE

A partir dos resultados obtidos nas avaliações da atividade antioxidante,

dentre as frações observou-se que de forma geral a FAE apresentou os melhores

valores, em virtude disso a mesma foi submetida a análises de caracterização

química.

5.2.1. Determinação do teor de compostos fenólicos totais

Foi realizada a determinação do teor de compostos fenólicos totais na FAE,

pois, o solvente acetato de etila apresenta polaridade superior aos solventes

utilizados nas outras frações, e consequentemente, tende a extrair compostos que

apresentam alta polaridade, como por exemplo, os compostos fenólicos, que por

possuírem pelo menos uma hidroxila em sua estrutura, caracterizam-se como

compostos de capacidade antioxidante.

O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo método

espectrofotométrico de Folin- Ciocalteau, utilizando o ácido gálico como padrão de

referência. A quantificação por esse método se baseia na redução dos ácidos

fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolíbdico (H3PMo12O40), que estão presentes no

reagente de Folin – Ciocalteau, a óxido de tungstênio (W3O23) e óxido de molibdênio

(Mo3O23) em meio alcalino, pelos compostos fenólicos que estão presentes na

amostra. Esses óxidos formados apresentam coloração azulada, que foi possível ser

quantificada a absorbância da solução na região do visível a 720 nm (CRUZ, 2008).

O resultado de teor de compostos fenólicos totais para a FAE foi de 348,85

mg EAG/ g amostra (miligrama em equivalente de ácido gálico por grama da

amostra) ± 8,47 (Desvio Padrão). A curva padrão de ácido gálico gerada (figura 15,

pág. 44) apresentou um R²=0,9985.

44

Figura 15. Curva padrão de ácido gálico para a determinação

do teor de fenólicos totais.

Na literatura, apenas um estudo de determinação de teor de fenólicos totais

foi realizado com extrato de acetato de etila para o gênero Erythroxylum. OLIVEIRA

(2015), determinou 242,2 ± 9,53 mg EAG/ g amostra no extrato de acetato de etila

das folhas de E. suberosum, sendo assim, o presente estudo apresentou teor de

compostos fenólicos totais mais elevado que o da literatura citada. O autor relatou

ainda que através de triagem fitoquímica foi sugerida a provável presença de uma

única classe de compostos fenólicos nesse extrato, os flavonoides (OLIVEIRA et al.

2015).

Os compostos fenólicos têm o poder de amenizar e/ou prevenir danos

oxidativos causados no organismo pelo excesso de espécies reativas de oxigênio e

nitrogênio através da doação de um de seus elétrons tornando-os moléculas

estáveis, interrompendo assim possíveis reações em cadeia. Dessa forma, é

considerada importante a inserção de alimentos ricos nessas substâncias na dieta, a

fim de evitar o desenvolvimento de doenças associadas ao estresse oxidativo.

y = 0,0039x + 0,0744 R² = 0,9985

0

0,5

1

1,5

0 50 100 150 200 250 300A

bso

rbân

cia

Concentração de Ác. Gálico

45

5.2.2. Identificação estrutural dos compostos fenólicos

5.2.2.1. Análise Cromatográfica

A FAE foi submetida à análise de cromatografia líquida de alta eficiência

acoplada à espectrometria de massas, com o objetivo de identificar os compostos

fenólicos que contribuem para a sua bioatividade. Na figura 16 é apresentado o

cromatograma de íons totais obtido no modo de Ionização por Eletrospray Negativo

(ESI-).

Figura 16. Cromatograma de íons totais da FAE obtido a partir da análise por

HPLC-MS no modo de ionização negativo

Foram observados compostos que co-eluíram no mesmo pico do

cromatograma com tempos de retenção muito próximos. Os compostos foram

identificados através de comparação com injeções de amostras padrão ou com base

nos fragmentos obtidos comparando com aqueles de referências da literatura. Os

dados obtidos na análise estão descritos na tabela 1 (pág. 46).

18,8

20,1

20,6

24,0

25,3

26,6

28,8

33,2

34,9

39,1

41,5

42,7 45,6

59,5

61,6

63,4

70,1

71,0

72,1

74,9

46

Tabela 1. Compostos fenólicos identificados na FAE com correspondentes T.R. e dados de

espectrometria de massas (modo negativo) obtido por HPLC-MS.

Os compostos FAE1, FAE3, FAE5, FAE8, FAE12 e FAE15, de tempos de

retenção 18,8; 20,6; 25,3; 33,2; 42,7 e 61,6 minutos respectivamente, tiveram como

sugestão a Procianidina do tipo B. A procianidina B é um tanino condensado

constituído por 2 unidades de flavan-3-ois (catequina ou epicatequina). As

procianidinas diméricas do tipo B possuem apenas ligações interflavanólicas

covalentes entre o carbono 4 de uma unidade flavan-3-ol e o carbono 8 ou 6 da

N° T.R(min.) [M – H]- (m/z) Fragmentos (m/z) MS2

Composto Sugerido

FAE1 18,8 577,11 451, 425, 407, 289 Procianidina B

FAE2 20,1 353,02 191, 179, 173 Ácido Clorogênico


FAE4 24,0 865,15 695, 577 Procianidina C

FAE5 25,3 577,09 451, 425, 407, 289 Procianidina tipo B


FAE7 28,8 289,06 - Catequina



FAE10 39,1 353,21 191, 179, 173 Ácido Criptoclorogênico



FAE13 45,6 289,00 - Epicatequina




FAE17 70,1 463,15 445, 301, 273, 178 Quercetin-3-O-glicopiranosídeo

FAE18 71,2 609,11 591, 463, 343, 301 Rutina

FAE19 72,1 433,16 151, 179, 301 Quercetin-3-O-Pentosídeo

FAE20 74,9 447,08 429,301, 179,151 Quercetin-3-O-Ramnosídeo

47

outra unidade. São ainda classificadas, numericamente de acordo com a

estereoquímica do carbono 3 do anel C de cada uma das unidades (Figura 17)

(GONÇALVES, 2007).

Fonte: GONÇALVES, 2007

A estrutura sugerida para esses picos teve como base a comparação das

fragmentações observadas nos seus respectivos espectros de massa (MS2)

(Apêndice A) com as fragmentações desse mesmo composto já identificado na

literatura (SANTOS et al., 2013). Uma proposta de fragmentação da estrutura da

Procianidina do tipo B está representada na Figura 18 (pág. 48).

Figura 17. Estrutura química das procianidinas diméricas do tipo B.

Dímeros C4 – C8 Dímeros C4 – C6

48

O fragmento em m/z 425 pode ser explicado pela reação de Retro Diels-Alder

(quebra de ligação C – C) no anel C. Já o fragmento com m/z 407 é justificado a

partir de uma desidratação do fragmento em 425 e 289 é a representação da

unidade monomérica.

Para FAE2 e FAE10, de tempo de retenção 20,1 e 39,1 min. respectivamente,

ambos os compostos possuem fragmentos com m/z 191 (100 e 15,7%) atribuído à

perda da unidade cafeoil, e m/z 179 (48,5 e 32,8%) atribuído à perda do ácido

quínico, originados de cisão eletrolítica e m/z 173 (4,5 e 98,4%) pela desidratação do

ácido quínico (Figura 19, pág. 49), havendo diferenciação apenas nas intensidades

dos íons (Apêndice B), foi sugerido que se trata do ácido clorogênico e seu isômero

ácido criptoclorogênico (Figura 20, pág. 50).

Figura 18. Proposta de fragmentação da procianidina tipo B.

Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016

49

Estudo realizado por CLIFFORD (2003) afirmou que a abundância relativa

dos referidos fragmentos pode ser utilizada para a identificação dos ácidos

clorogênicos: criptoclorogênico, clorogênico e neoclorogênico. É fácil distinguir o

ácido criptoclorogênico (grupo acila ligado na posição 4 – OH) pelo seu pico base

em m/z 173, já os ácidos clorogênico e neoclorogênico (grupos acila conectados na

posição 3 – OH e 5 – OH, respectivamente) dão origem ao mesmo pico base m/z

191, a diferenciação entre eles se dá pelo íon do ácido cafeico m/z 179, que irá

aparecer mais abundante no ácido clorogênico com intensidade média de 49%

enquanto que no neoclorogênico é de 5%. Outro fato relevante que o autor

identificou, foi a presença do fragmento m/z 161, encontrado exclusivamente no

espectro de massas do ácido neoclorogênico (CLIFFORD et al., 2003).

Figura 19. Proposta de fragmentação do Ácido Clorogênico

Fonte: Adaptado de BASTOS, 2016.

50

A procianidina C, foi sugerida como composto para os picos FAE4, FAE6,

FAE9, FAE11, FAE14 e FAE16, com tempos de retenção 24,0; 26,6; 34,9; 41,5;

59,5; 63,4 min. respectivamente. As procianidinas triméricas do tipo C, são taninos

condensados constituídos por 3 unidades de flavan-3-ol (catequina ou epicatequina)

e também são classificadas de acordo com as suas ligações interflavanólicas

covalente (Figura 21).

Ácido Clorogênico (posição 3 – OH)

Ácido Criptoclorogênico (posição 4 – OH)

Figura 20. Estrutura do Ácido clorogênico e seu isômero ácido criptoclorogênico

Figura 21. Estrutura química da procianidina trimérica. Trímero C1 epicatequina-(4β-8)-epicatequina-(4β-

8)-epicatequina.

51

A estrutura sugerida para esses picos teve como base a comparação das

fragmentações observadas nos seus respectivos espectros de massa (MS2)

(Apêndice C) com as fragmentações desse mesmo composto já relatado na

literatura (RODRIGUES, et al., 2007). Uma proposta de fragmentação da estrutura

da Procianidina C está representada na Figura 22. O fragmento m/z 577 obtido a

partir de uma cisão homolítica gerando a unidade dimérica e o fragmento m/z 695

gerado a partir de uma reação de Retro Diels-Alder (quebra de ligação C – C)

seguido de desidratação.

Os compostos FAE7 e FAE13, com tempos de retenção 28,8 e 45,6 min.,

respectivamente, apresentaram mesma [M – H]- de m/z 289, porém, seus espectros

Figura 22. Proposta de fragmentação da Procianidina tipo C.


52

de massas MS2 não apresentaram fragmentações, com isso foram identificados

através de co-injeções com padrões. Por comparação com o pico do íon molecular e

com seus tempos de retenção (28,5 e 45,6 min. respectivamente), sugeriu-se os

compostos Catequina e Epicatequina (Apêndice D), respectivamente. Foi proposta a

fragmentação para esses compostos, que está representada na Figura 23, com os

fragmentos m/z 245 e m/z 205 oriundos a partir de uma fissão do anel heterocíclico e

m/z 179 originado a partir da perda de uma unidade catecol.

O composto FAE17, no tempo de retenção de 70,1 min. apresentou [M – H]-

m/z 463 e fragmentos em MS2 (Apêndice E) consistentes com a estrutura de uma

quercetina-3-O-glicopiranosídeo (isoquercitrina), quando comparado com dados da

literatura (TIBERTI et al., 2007; OSZMIANKI, et al., 2015). A perda da unidade

osídica por hidrólise, através do fragmento m/z 301, serviu para reforçar a sugestão

(Figura 24, pág. 53).

Figura 23. Proposta de fragmentação da Catequina e Epicatequina


53


O composto FAE18, com tempo de retenção 71,2 min. apresentou [M – H]-

m/z 609. A identificação desse composto foi feita por co-injeção de padrão,

comparando os seus tempos de retenção (71,0 min.) e seus espectros de massas

(MS2) (Apêndice F), observando principalmente o fragmento em m/z 301

correspondente a perda da unidade rutinosídeo por hidrólise (Figura 25), o que

sugere a identificação da substância rutina.

Figura 24. Fragmentação da perda da unidade osídica da isoquercitrina.

Figura 25. Fragmentação da perda da unidade rutinosídeo para o composto Rutina


54


m/z 433 e fragmentos em MS2 (Apêndice G) consistentes com a estrutura de uma

quercetina-3-O-pentosídeo (possivelmente apiose, arabinose ou xilose, que são as

unidades de pentose mais frequentemente encontradas em glicosídeos de flavonol),

quando comparado com dados da literatura (TIBERTI et al., 2007). A perda da

unidade osídica por hidrólise, através do fragmento m/z 301, serviu para reforçar a

sugestão (Figura 26).



m/z 447 e fragmentos em MS2 (Apêndice H) consistentes com a estrutura de uma

quercetina-3-O-ramnosídeo (quercitrina), quando comparado com dados da literatura

(TIBERTI, et al., 2007; OSZMIANKI, et al., 2015). Essa sugestão foi reforçada

principalmente devido à presença do fragmento m/z 301 que corresponde a perda

de uma L-ramnose (Figura 27, pág. 55).

Figura 26. Fragmentação da perda da unidade osídica da quercetin-3-o-pentosídeo

55


Na literatura, alguns estudos realizados com folhas de espécies de

Erythroxylum, identificaram compostos também detectados no presente trabalho. A

ocorrência desses compostos sugere que os mesmos possam ser considerados

marcadores quimiotaxonômicos nesse gênero. No recente estudo realizado por

Barros e colaboradores (2017) em E. suberosum, foi identificado rutina na

composição dos extratos etanólico e aquoso, além disso, observou-se a presença de

isoquercitrina nas frações diclorometano e hidrometanólica. Outro estudo que

também foi verificado a presença de compostos fenólicos nos seus extratos

etanólico e aquoso foi o das folhas de E. daphnites, sendo confirmados rutina e

ácido clorogênico em ambos (MARTINS, 2015).

Estudos já mencionados no item 2.4.2 (pág. 24), observou-se a identificação

dos compostos isolados: quercetina-3-O-α-L-ramnosídeo em E. subrotudum

(OLIVEIRA, 2012); catequina, epicatequina e quercetina-3-O-pentosídeo em E.

rimosum (RIBEIRO, 2013) e em E. pulchrum, epicatequina e quercetina-3-O-α-L-

ramnosídeo (ALBUQUERQUE, 2014). Todos esses foram isolados de fase acetato

de etila particionada do extrato metanólico.

Não foram encontrados na literatura identificação de procianidinas dimérica

e/ou trimérica em Erythroxylum, possivelmente, esse é o primeiro estudo que foi

observado à presença desses compostos no gênero.

Figura 27. Fragmentação da perda da ramnose da quercitrina

56

5.2.2.2. Elucidação estrutural por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

(RMN) de 1H e 13C

O composto majoritário da FAE (FAE20), observado no cromatograma UV em

280 nm (Figura 28), com tempo de retenção 74,9 min., já com identificação sugerida

através de análise por espectrometria de massas (item 5.2.3.1), foi isolado em HPLC

(equipado com coluna semipreparativa) e submetido à análise por espectroscopia de

ressonância magnética nuclear de 1H e 13C.

No espectro de RMN-1H em (DMSO-d6) a 500 MHz (Figura 29, pág. 57) do

composto majoritário isolado correspondente ao pico com 74,9 min. Foram vistos

oito sinais: um singleto em δH 12,63 (s, 1H, OH-5), (Apêndice I), característico de um

grupamento hidroxila quelatogênica no C-5; δH 7,28 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-2’), δH 7,24

(dd, 1H, J = 2,0 Hz, H-6’), δH 6,84 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5’), (Apêndice J e K); δH 6,36

(s, 1H, H-8) e δH 6,18 (s, 1H, H-6), (Apêndice K). Foi observado também um singleto

em δH 5,24 (s, 1H, H-1’’), ( Apêndice L) e um dubleto em δH 0,80 (d, 3H, J = 6,0 Hz,

H-6’’),( Apêndice M) característicos de sinais da ramnose. A ocorrência de quatro

sinais de prótons aromáticos no espectro de RMN de 1H corroboram com dados da

Figura 28. Cromatograma HPLC-UV da FAE em comprimento de

onda de 280 nm.

74,9 min.

57

literatura, (CHANG et al., 2009). Não foi possível visualizar os H metilênicos da

ramnose devido o encobrimento pelo sinal da H2O.

O espectro de RMN-13C em DMSO-d6 a 125 MHz (Figura 30, pág. 58) do

composto majoritário supracitado apresentou vinte e um sinais, sendo quinze

característicos de esqueleto flavonol. O espectro APT do composto isolado revelou a

presença de um carbono metilico δC 17,4 de ramnose, 10 carbonos de metínicos e

10 carbonos quaternários. Na região alifática de ramnose, foram atribuídas 6

carbonos para uma fração entre as quais o sinal mais caracteristico foi em δC 101.8,

atribuído para carbono anomérico C1'' de ramnose, (CHANG et al., 2009). Portanto,

de acordo com os deslocamentos químicos de cada carbono do composto isolado

no espectro de RMN 13C foi possível denominar o composto como Quercetina-3-O-α-

L-ramnosídeo através de comparação com dados do estudo realizado por CHANG

(2009), utilizando mesmo solvente e frequência (Tabela 2, pág. 58).

Figura 29. Espectro de RMN-1H (DMSO-d6; 500 MHz) do pico majoritário da FAE.

Figura 27. Espectro de RMN-13

C, em DMSO-d6.

DMSO (m)

2,49

58

C δc δC(CHANG et al., 2009)

2 158.7 158.0 3 134.1 134.9 4 177.6 178.2 5 161.2 162.0 6 99.5 99.4 7 166.8 165.0 8 93.6 94.2 9 157,3 157.2 10 104,6 104.8 1’ 120.6 121.5 2’ 115.4 116.2 3’ 145.2 145.9 4’ 149,7 149.2 5’ 115.6 116.4 6’ 121.0 121.8 1’’ 101.8 102.6 2’’ 71.1 71.3 3’’ 70,0 71.1 4’’ 70,3 71.9 5’’ 70,5 70.8 6’’ 17,4 18.2

Figura 30. Espectro de RMN-13

C (DMSO-d6; 125 MHz) do pico majoritário da FAE.

DMSO

39,49

Tabela 2. Deslocamentos químicos RMN 13

C

125 MHz.

59

6. CONCLUSÃO

A investigação da atividade antioxidante para as folhas de E. mucronatum,

através dos métodos DPPH, ABTS, NO e FRAP apresentou resultado positivo para o

EEB, FAE, FC e FH. Este foi o primeiro estudo que mostrou os diferentes

mecanismos antioxidantes in vitro para esse gênero;

A FAE se comportou de maneira igual ou superior ao padrão Trolox® em

todos os testes realizados para atividade antioxidante;

Ao se realizar a quantificação do teor de fenólicos da FAE, foi observada uma

alta concentração desses compostos, desta forma o seu potencial antioxidante pode

ser atribuído à abundância de substâncias dessa classe em sua composição;

A caracterização desta fase por HPLC/MS sugeriu a identificação de 20

compostos fenólicos, todos já conhecidos e em grande parte identificados em outras

espécies do gênero, com exceção das procianidinas do tipo B e C, pois, não foram

encontrados estudos onde estas tenham sido detectadas em Erythroxylum;

Entre os compostos identificados apenas o majoritário FAE20 foi possível ser

isolado e elucidado por RMN de 1H e 13C, sendo determinado como a quercetina-3-

O-L-ramnosídeo, corroborando com o resultado sugerido em HPLC-MS;

O presente trabalho contribuiu para quimiotaxonomia da família

Erytrhoxylaceae, evidenciando que a espécie estudada é bioprodutora de compostos

fenólicos e que além de ser um forte antioxidante pode apresentar ainda outros

efeitos farmacológicos relacionados a tais substâncias.

60

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGUIAR, S. J. et. al., Tropane alkaloids from Erythroxylum caatingae Plowman.

Chem. Biodivers. v.8, n.1, p. 155-165, 2011.

ALBUQUERQUE, C. H. et al. Flavonoides Glicolisados de Erythroxylum pulchrum a.

st.-hil. (Erythroxylaceae). Quimica Nova, v. 37, n. 4, p. 663-666, 2014.

ARGENTA, S.C., et al., Plantas Medicinais: Cultura Popular Versus Ciência.

Vivências: Revista eletrônica de Extensão da URI, v. 7, n. 12, p. 51-60, 2011.

BALASUNDRAM, N.; SUNDRAM, K.; SAMMAN, S. Phenolic compounds in plants

and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses.

Food Chemistry, v.99, n. 1, p.191-203, 2006.

BASTOS, K. X. Estudo fitoquímico de Hancorniaspeciosa: Isolamento, Atividade

Biológica e caracterização por cromatografia líquida de eficiência ultra elevada

acoplada à espectrometria de massas. 2016. 134f. Dissertação (Mestrado em

farmacoquímica de produtos naturais e sintéticos bioativos) – Universidade Federal

da Paraíba, João Pessoa – PB, 2016.

BARROS, I. M. C. et al., Chemical composition and antioxidant activity of extracts

from Erythroxylum suberosum A.St. Hil.leaves. Journal of Applied Pharmaceutical

Science, v.7 n.3, p. 088-094, 2017.

BASU, S.; HAZRA, B. Evaluation of nitric oxide scavenging activity, In Vitro and Ex

Vivo , of selected medicinal plants traditionally used in inflammatory diseases.

Phytotherapy Research, v. 20, n. 10, p. 896–900, out. 2006.

BENZIE, I. F. F. Lipid peroxidation: a review of causes, consequences,

measurements and dietary influences. Int. J. Food Sci. Nut, v. 47, p. 233–261,

1996.

61

BRAND-WILLIANS, W. .; CUVELIER, M. E. .; BREST, C. Use of Free Radical

Method Evaluate Antioxidant Activity. LWT - Food Science and Technology, v. 28,

p. 25–30, 1995.

BROCK, A.et al. Calystegines in wild and cultivated Erythroxylum species.

Phytochemistry, v. 66, n. 11 SPEC. ISS., p. 1231-1240, 2005.

CASAGRANDE, M. Avaliação do potencial antioxidante de coprodutos de indústrias

de suco de uva e de vinho visando sua aplicação em lingüiça de frango. 2014. 121f.

Dissertação (Mestrado em tecnologia de processos químicos e bioquímicos) –

Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Pato Branco – PR, 2014.

CASTELO-BRANCO, V. N.; TORRES, A. G. Capacidade antioxidante total de óleos

vegetais comestíveis: determinantes químicos e sua relação com a qualidade dos

óleos. Rev. Nutr., Campinas, 24(1):173-187, jan./fev., 2011.

CASTRO, J. F. A. Estudo da atividade antioxidante em frutas nativas e exóticas

brasileiras. 2012. 85f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Instituto de

Química, Universidade Estadual Paulista, Araraquara – SP, 2012.

CHANG et al. Phytochemical constituents of Bistorta manshuriensis. Natural

Product Sciences. v. 15(4), p. 234-240, 2009.

CLEMES, S.M., et al., Avaliação química de folhas de plantas medicinais nativas

utilizadas no entorno do Parque Nacional da Serra do Itajaí (PNSI). Rev. Bras.

Farm., v. 89, n. 1, p. 10-12, 2008.

CLIFFORD, M. N. et al., Hierarchical Scheme for LC-MSn Identification of

Chlorogenic Acids, J. Agric. Food Chem., Vol. 51, No. 10, 2003.

CORTES, D.et al. New medicines inspirated in annonaceas.Revista Brasileira de

Fruticultura, v. 36, n. SPEC. EDITION 1, p. 22-31, 2014.

62

COUTINHO, M. A. S.; MUZITANO, M. F.; COSTA, S. S. Flavonoides: Potenciais

agentes terapêuticos para o processo inflamatório. Revista Virtual de Química, v. 1,

n 3, p. 241-256, 2009.

CRAFT, B. D. et al. Phenol-Based Antioxidants and the In Vitro. Methods Used for

Their Assessment. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v.

11, p. 148-173, 2012.

CRUZ, A. P. G. Avaliação do efeito da extração e da microfiltração do açaí sobre sua

composição e atividade antioxidante. 2008. 88f. Dissertação (Mestrado em

Ciências) – Instituto de Química, Programa de pós-graduação em Bioquímica,

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro – RJ, 2008.

DÓRIA, G. A. A. et al. Redox-Active Profile Characterization of Remirea maritime

Extracts and Its Cytotoxic Effect in Mouse Fibroblasts (L929) and Melanoma

(B16F10) Cells. Molecules, v. 20, p. 11699-11718, 2015.

DUARTE, M.C., Novos diterpenos dos frutos de Xylopialangsdorffiana. 2009. 139f.

Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos) – Centro de

Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2009.

FIRMO, W.C.A, et al., Contexto Histórico, Uso Popular e Concepção Científica Sobre

Plantas Medicinais. Cad. Pesq., São Luís, v. 18, (n. especial), p. 90-95,2011.

Flora do Brasil 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

Disponível em: < http://floradobrasil.jbrj.gov.br/ >. Acesso em: 16 Jan. 2018.

FURANI, C. S.; FERRO, V. O. Análise de própolis. Ciênc. Tecnol. Aliment.,

Campinas, 26(1): 171-178, jan.-mar. 2006.

GONÇALVES, R. M. F.Estudo da inibição de tripsina por compostos fenólicos

isolados de fontes naturais. Efeito antinutricional de bebidas comuns. 2007. 128f.

http://floradobrasil.jbrj.gov.br/

63

Dissertação (Mestrado em Tecnologia, Ciência e Segurança Alimentar) -

Departamento de Química Faculdade de Ciências da Universidade do Porto , Escola

de Engenharia da Universidade do Minho, 2007.

HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free radicals in biology and medicine.

Oxford University Press, USA, 2015.

HAMINIUK, C. W. I.; MACIEL, G. M.; PLATA-OVIEDO, M. S. V.; PERALTA, R. M.

Phenolic compounds in fruits – an overview. International Journal of Food Science

and Technology, v. 47, n. 10, p. 2023-2044, 2012.

JUNIOR, C.V.; BOLZANI, V.S., Os Produtos Naturais E A Química Medicinal

Moderna, Química Nova, v.29, n. 2, p. 326-337, 2006

LIMA, F. O., BEZERRA, A. S., Flavonóides e radicais livres. Disciplinarum Scientia,

Santa Maria, v. 13, n. 1, p. 111-114, 2012.

LOIOLA, M. I. B. et. al., Flora da Paraíba, Brasil: Erythroxylaceae Kunth. Acta bot.

Bras. v.21, n.2, p.473-487. 2007.

LOPES, J.C., Diversidade e Caracterização das Annonaceae do Brasil. [s.n.], v.36,

n. (ed. especial), p. 124-131, 2014.

LUCENA, H. F. S. et al. Hypenol, a new lignan from Hypeniasalzmannii. Helvetica

ChimicaActa. v. 96, p. 1121-1125, 2013.

MAIA, A.K.H.L. et. al., Antinociceptive activity of the extract of Erythroxylum

caatingae, Boletín Latino americano y del Caribe de Plantas Medicinales y

Aromáticas13 (2): 152 – 162, 2014

MARTINS, D. H. N. Avaliação da sazonalidade de compostos fenólicos e atividade

antioxidante de folhas de Erythroxylum daphnites Mart. 2015. 102f. Dissertação

64

(Mestrado em Ciências da Saúde) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da

Saúde, Universidade de Brasília, Brasília, 2015.

MELO, E. A.; MACIEL, M. I. S.; LIMA, V. L. A. G.; SANTANA, A. P. M. Capacidade

antioxidante de hortaliças submetidas a tratamento térmico. Nutrire: Revista da

Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, v.34, n.1, p. 85-95, 2009.

MENDONÇA, J.O., O gênero Erythroxylum P. Browne (Erythroxylaceae) do Estado

do Paraná, Brasil. 1998.10f. [s.n.] – Departamento de Botânica, Universidade

Federal do Paraná, Curitiba, 1998.

MIRA, L. et al. Interactions of flavonoids with iron and copper ions: a mechanism for

their antioxidant activity. Free Rad Res, v. 36, p. 1199–208, 2002.

MONTENEGRO, C. A. et al. Gastroprotective effect of Xylopia langsdorffiana A. St.-

Hil. &Tul. (Annonaceae): Involvement of endogenous sulfhydryls compounds and

nitric oxide. Records of Natural Products, v. 8, n. 2, p. 165-183,2014.

MOREIRA, C. P. S. Produtos naturais bioativos de baccharisplatypodadc.

(asteraceae). 2014. 104f. Dissertação (Doutorado em ciências) – Programa de pós

– graduação em ciências da saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte – MG,

2014.

MOREIRA, I. C. et al. "Sesquiterpenes and hydrocarbons from Xylopia emarginata

(Annonaceae) fruits". Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 17, n. 1, p. 55-58,

2007.

NACKZ, M.; SHAHIDI, F. Extraction and analysis of phenolics in food.Journal of

Chromatography A, v.1054, n. 1-2, p. 95 – 111, 2004..

NIKKI, E. Assessment of antioxidant capacity in vitro and in vivo.Free radicals in

biology and medicine, v. 49, p. 503-515, 2010.

65

OLIVEIRA, A.C. et al., Erythroxylum pungens elicits vasorelaxation by reducing

intracellular calcium concentration in vascular smooth muscle cells of rats. Brazilian

Journal of Pharmacognosy 22 (2): 436-442, 2012.

OLIVEIRA, F. F. et al. Antioxidant Activity and Phytochemical Screening of Extracts

of Erythroxylum suberosum A.St.-Hil (Erythroxylaceae). Research Journal of

Phytochemistry, v. 9, n. 2, p. 68–78, 2015.

OLIVEIRA, S.L., Fitoquímica de espécies de Erythroxylum do semiárido: isolamento

e determinação estrutural de alcaloides tropânicos, flavonoides e diterpenos, 2012.

191f. Dissertação (Doutorado em produtos naturais e sintéticos bioativos) - Centro

de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.

OSZMIANSKI, J. Determination of phenolic compounds and antioxidant activity in

leaves from Wild Rubus L. species. Molecules, v. 20, p. 4951-4966, 2015.

PAULA, P. H. S., Estudo fitoquímico da fração hexânica das folhas de Erythroxylum

deciduum (Erythroxylaceae). 2012. 38f. Trabalho de Conclusão de Curso (Química

Industrial) – Universidade Estadual de Goiás, UnUCET, Anápolis – Goiás, 2012.

PRATA, A.P.N. et. al., Flora de Sergipe, Aracaju : Gráfica e Editora Triunfo, 2013.

v. 1. (592p.)

RAMALHO, V. C.; JORGE, N. Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e

alimentos gordurosos. Química Nova, v.29, n. 4, 2006.

RE, R. et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical

cationdecolorization assay. Free Radical Biologyand Medicine, v. 26, p. 1231–

1237, 1999.

REIS, M.R. et. al., Efeito vasodilatador do extrato metanólico de Erythroxylum

caatingae Plowman sobre anéis mesentéricos de ratos espontânea mente

hipertensos (SHR), R. Ci. med. biol., Salvador, v.11, n.2, p.123-128, mai./set. 2012

66

RIBEIRO, E.M.O. et. al., A new tropane alkaloid and other constituents of

Erythroxylum rimosum (Erythroxylaceae), Phytochemistry Letters 6 (2013) 232–

235.

RIBEIRO, F.P.R.A., Investigação Da Atividade Espasmogênica De Erythroxylum

caatingae Plowman Em Útero Isolado De Rata, 2013. 136f. Dissertação (Mestrado

em Recursos Naturais do Semiárido) - Universidade Federal do Vale do São

Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2013.

RIBEIRO, L. A. A. et al. O Ácido (8)17,12E,14-labdatrieno-18-óico (labdano302),

diterpeno tipo labdano isolado de Xylopia langsdorffiana St. Hil. &Tul. (Annonaceae)

relaxa a traquéia isolada de cobaia. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 17, n.

2, p. 197-203,2007.

ROCHA, M. M. et al. Potencial antioxidante de Erythroxylum deciduum A. St. Hil. In

vitro e in vivo. Perspectiva. v. 39, n. 147, p. 7-14. 2015.

RODRIGUES, C. M. Metabolic fingerprinting using direct flow injection eletrospray

ionization tandem mass spectrometry for the characterization of proanthocyanidins

from the barks of Harcornia speciosa. RapidCommum. Mass Spectrom, v. 21, p.

1907-1914, 2007.

ROESLER, R., et al., Atividade antioxidante de frutas do cerrado. Ciência e

Tecnologia de Alimentos, Campinas v. 27, n.1, p. 53-60, 2007.

SAMPAIO, T.S., Estudo fitoquímico de Hancorniaspeciosa Gomes: isolamento,

determinação estrutural e atividade biológica. 2008. 146f. Dissertação (Mestrado em

Química) – Departamento de Química,Centro de Ciências Exatas e Tecnologia,

Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão, 2008.

SANTAS, J.; ALMAJANO, M. P.; CARBO, R. Antimicrobial and antioxidant activity of

crude onion (Allium cepa, L.) extracts. International Journal of Food Science &

Technology, v. 45, n. 2, p. 403-409, 2010.

67

SANTOS, H.A.S. et. al., Avaliação Da Atividade Relaxante Do Extrato Etanólico

Bruto Obtido De Erythroxylum caatingae, Erythroxylum subrotundum E Erythroxylum

revolutum (ERYTHROXYLACEAE) em Traquéia Isolada De Cobaia,

EvolvereScientia, V. 1, N. 1, p. 119-133, 2013

SANTOS, P.F. Novos diterpenos isolados das raízes de XylopialangsdorffianaSt-

Hil&Tul.(Annonaceae). 2011. 94 f. Dissertação (Mestrado em Produtos Naturais e

Sintéticos Bioativos) – Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa, 2011

SANTOS, R. P. Extração, caracterização e avaliação bioativa do extrato Arrabidaea

chica. 2015. 89f. Dissertação (Mestrado em engenharia química) – Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2015.

SANTOS, S. A. O. Ultra-high perfomance liquid chromatography couplad to mass

spectrometry applied to the identification of valuable phenolic compounds from

Eucalyptus wood. Journal Of Chromatography B, v. 938, p 65-74, 2013.

SANTOS, S. N. Determinação quantitativa da atividade antioxidante de extratos

brutos de microrganismos pelo método de captura de radical livre DPPH. Embrapa.

Comunicado técnico 50, p. 1-5,2011.

SILVA, M. S.et al. Alkaloids and other constituents from Xylopia langsdorffiana

(Annonaceae). QuimicaNova, v. 32, n. 6, p. 1566-1570, 2009.

SIMÕES, C. M. O. Farmacognosia da planta ao medicamento. 6a Edição, Editora

UFSC, Brasil, 2008.

SIMÕES, C. M. O. Farmacognosia do Produto Natural ao medicamento. 1a Edição,

Editora Artmed, Brasil, 2017.

SOOBRATTEE, M.A. et. al., Assessment of the content of phenolics and antioxidant

actions of the Rubiaceae, Ebenaceae, Celastraceae, Erythroxylaceae and

68

Sterculaceae families of Mauritian endemic plants.Toxicology in Vitro 22 (2008) 45–

56.

SOUSA, R. M. F., Estudo Químico de Eugenia calycina Cambess e Avaliação das

atividades antimicrobiana, antioxidante e inibidora de alfa-amilase, 2015. 222f.

Dissertação (Doutorado em química) – Universidade Federal de Uberlândia,

Uberlândia – MG, 2015.

SWAIN, T.; HILLIS, W. E. The phenolic constituents of Prunus domestica. I.—The

quantitative analysis of phenolic constituents. Journal of the Science of Food and

Agriculture, v. 10, n. 1, p. 63–68, jan. 1959.

SYED, S.H.; NAMDEO, A.G., Hepatoprotective effect of leaves of Erythroxylum

monogynum Roxb. On paracetamol induced toxicity, AsianPac J TropBiomed 2013;

3(11): 877-881

TIBERTI et al. On-Line LC/UV/MS Analysis of Flavonols in the Three Apple Varieties

Most Widely Cultivated in Brazil. J. Braz. Chem. Soc., Vol. 18, No. 1, 100-105, 2007.

TAMAGNA, G. A.; KULA, N.S.; BALDESSARINE, R. J., Synthesis and monoamine

transporter affinity of 2-β-carbomethoxy-3-β-(4’-iodophenyl)tropane(β-CIT).

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v.14, n.9, p. 2117-2120, 2004.

TIVERON, A. P. Atividade antioxidante e composição fenólica de legumes e

verduras consumidos no Brasil. 2010. 102f. Dissertação (Mestrado em Ciências) –

Escola superior de agricultura ―Luiz de Queiroz‖, Universidade de São Paulo,

Piracicaba – SP. 2010.

VALKO, M. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and

human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 39,

n. 1, p. 44–84, jan. 2007.

69

ZHISHEN, J.; MENGCHENG, T.; JIANMING, W. The determination of flavonoid

contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals.

FoodChemistry, v. 64, p. 555–559, 1999.

70

APÊNDICES

APÊNDICE A. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE1, FAE3, FAE5,

FAE8, FAE12 e FAE15, no modo de ionização negativo.

71

APÊNDICE B. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE2 e FAE10, no modo de

ionização negativo.

72

APÊNDICE C. Espectro de massas (MS2) dos compostos FAE4, FAE6, FAE9, FAE11,

FAE14 e FAE16, no modo de ionização negativo.

73

APÊNDICE D1. Espectro de massas (MS2) do padrão catequina em

28,5 min., no modo de ionização negativo.

74

APÊNDICE D2. Espectro de massas (MS2) do padrão epicatequina em

45,6 min., no modo de ionização negativo.

75

APÊNDICE E. Espectro de massas (MS2) do composto FAE17, no modo de


76

APÊNDICE F. Espectro de massas (MS2) do composto FAE18

(acima) e do padrão Rutina (abaixo), no modo de ionização

negativo.

77

APÊNDICE G. Espectro de massas (MS2) do composto FAE19, no modo de


78

APÊNDICE H. Espectro de massas (MS2) do composto FAE20, no modo de


79

APÊNDICE I. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 13 a

12 ppm.

APÊNDICE J. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 7,13 a

7,19 ppm.

80

APÊNDICE K. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre

6,95 a 5,96 ppm.

APÊNDICE L. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 5,4 a

3,8 ppm.

81

APÊNDICE M. Expansão do espectro de RMN-1H 500 MHz, em DMSO-d6, na região entre 1,02

a 0,70 ppm.

Documents

CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA BIOGUIADA PELA ATIVIDADE ... · “Sem a convicção de uma harmonia íntima do universo, não poderia haver ciência.” Albert Einstein . Caracterização