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Revista Ecuatoriana de Medicina y Ciencias Biológicas - Vol. XXX Números 1 y 2: 50-56, octubre 2009

Juan Diego Santillana Ortiz y Eugenia M. del Pino

Características morfológicas de la gástrula enCeratophrys stolzmanni (Anura: Ceratophryidae).

Juan Diego Santillana Ortiz y Eugenia M. del PinoPontificia Universidad Católica del Ecuador, Escuela de Ciencias Biológicas,

Laboratorio de Biología del Desarrollo, 12 de Octubre 1076 y Roca,Quito, Ecuador

1edelpino@puce.edu.ec

RESUMEN: Se estudió la morfología de la gástrula y néurula en embriones de Cer-atophrys stolzmanni (el sapo bocón de la costa). Los huevos, cuyo diámetro al comienzode la gastrulación es de 2,2 mm, se desarrollan rápidamente. El proceso de gastrulacióndura aproximadamente cinco horas. Los embriones fueron fijados y analizados en monta-je entero, bisecciones y secciones de vibrátomo. Se encontró que los huevos tienen pig-mento oscuro al igual que en Xenopus laevis, pero tienen un tamaño mayor. La morfologíade la gástrula de C. stolzmanni es similar a la descrita para Ceratophrys ornata (el sapocornudo argentino) por otros autores. Los estadios de gástrula tardía y néurula temprana,estudiados mediante secciones con tinción fluorescente para núcleos celulares, revelanausencia de endodermo que recubra al notocordio y a los somitas en la parte dorsal poste-rior del embrión. Esta región se denomina GRP (Gastrocoel roof plate, por sus siglas eninglés) y tiene importancia en la determinación del eje izquierdo-derecho en anfibios. Eneste estudio se caracterizó el GRP de C. stolzmanni al nivel morfológico.

PALABRAS CLAVE: Ceratophrys ornata, Ceratophrys stolzmanni, Gastrulación, GRP,Xenopus laevis.

ABSTRACT: The gastrula morphology of Ceratophrys stolzmanni (the Pac-man frog)was studied. Its eggs, whose diameter at the beginning of the gastrulation process is 2.2mm in diameter, develop rapidly. The gastrulation process requires five hours approxi-mately. The embryos were fixed and analyzed in whole-mount, in bisections, andvibratome sections. The eggs of C. stolzmanni were pigmented, as in Xenopus laevis, buttheir size was bigger. The gastrula morphology of C. stolzmanni is similar to the onedescribed for Ceratophrys ornata (the argentine horned-frog) by other authors. The lategastrula and early neurula stages, studied with vibratome sections stained for cell nuclei,revealed lack of endoderm covering both the posterior notochord and the somites foundon this region. This region is called the GRP (Gastrocoel roof plate) and it plays a majorrole in the development of the left-right axis in amphibians. In this work the GRP of C.stolzmanni was characterized at the morphological level.

KEYWORDS: Ceratophrys ornata, Ceratophrys stolzmanni, Gastrulation, GRP, Xenopuslaevis.

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INTRODUCCIÓN

Las diferencias en el desarrollo tem-prano de las ranas, tales como el tamañode los embriones, el proceso de gastru-lación y la velocidad del desarrollo, sonaspectos necesarios de estudio para lacomprensión del desarrollo embrionario.En particular, el proceso de gastrulaciónen diversas especies de anfibios muestrala existencia de tres patrones distintos.Estos patrones se relacionan con la veloci-dad del desarrollo de las especies. Por unlado, las ranas de desarrollo rápido, comoXenopus laevis (Daudin, 1802), extiendenel arquenterón y alargan el notocordiodurante la gastrulación; mientras queranas de desarrollo lento, como Gas-trotheca riobambae (Fowler, 1913),posponen el alargamiento del notocordio ala post gástrula (1). Esto sugiere que elproceso de gastrulación es modular, esdecir que la expansión del arquenterón yel cierre del blastoporo son procesos regu-lados de forma independiente y a distintotiempo (1). Los estudios comparativosentre ranas que difieren en sus modos dereproducción, tales como Epipedobatesmachalilla (Coloma, 1995) y Epipedo-bates tricolor (Boulenger, 1899b) (repro-ducción terrestre), G. riobambae(incubación en una bolsa materna) y larana acuática X. laevis sugieren que lasdiferencias en el desarrollo embrionariotemprano están relacionadas con distintasestrategias reproductivas (1). Es impor-tante entonces ampliar los estudios com-parativos y describir los procesos dedesarrollo para especies con diversasestrategias reproductivas.

Una rana lejanamente relacionada conlas anteriores especies es Ceratophrysstolzmanni (Steindachner, 1882) (el sapobocón de la costa). Esta rana vive bajo elsuelo en ambientes xéricos del sur delEcuador y norte del Perú y deposita sushuevos en charcas temporales cuandocomienza la estación lluviosa. Ésta es unaespecie interesante para ser estudiadadebido a su diferente estrategia reproducti-va. Si bien el desarrollo embrionario de C.stolzmanni no se había estudiado, sí seconocen aspectos del desarrollo en unaespecie cercana a ésta: la rana cornudaargentina Ceratophrys ornata. El anuro C.ornata tiene un modo de vida terrestre perodeposita sus huevos, de 1,5 - 2,0 mm dediámetro, en el agua. Su desarrollo desde lafertilización hasta convertirse en renacuajoes sumamente rápido, entre 24-48 horas.De su desarrollo temprano se conoce quepresenta mesodermo superficial en el techodel gastrocele el mismo que ingresa a lascapas mesodermales profundas durante laneurulación (2).

Este mesodermo superficial forma unaestructura en el techo del arquenterón queestá expuesta a la cavidad del gastrocele(3). En los anfibios a esta estructura se laconoce como placa del techo del gastro-cele, GRP, gastrocoel roof plate, por sussiglas en inglés (3). El GRP es una regióncon células ciliadas que promueven unflujo de sustancias no determinadas en sen-tido izquierdo. Este flujo es el evento quepermite el establecimiento de la cascada dela señal molecular Nodal para la especifi-cación asimétrica del cuerpo. El GRP estábordeado por las crestas laterales endoder-males (4) las que gradualmente lo cubren(1). El GRP es análogo a estructuras simi-lares encontradas en otros vertebrados (3).

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En X. laevis y Xenopus tropicalis(Wagler 1827) el GRP mide aproximada-mente 260 µm y 150 µm de largo respec-tivamente. Los cilios tienen una longitudpromedio de 5 µm (5). Por el significadodel GRP en el establecimiento del ejeizquierdo-derecho es importante demos-trar su presencia en embriones de ranascon modos divergentes de gastrulacióncomo es C. stolzmanni.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los embriones con los que se realizóeste estudio fueron donados por el Labo-ratorio de Herpetología de la PontificiaUniversidad Católica del Ecuador(PUCE). Estos embriones provinieron dedos posturas: La primera de ranas colec-tadas en la provincia de El Oro, Ecuador;y la segunda de ranas criadas en cautive-rio dentro del programa de investigación“Balsa de los sapos”.

Los embriones se cultivaron en reci-pientes de plástico. La temperaturaambiente fue de 30 °C y 26 °C la delagua. Los acuarios fueron artificialmenteoxigenados.

Se estudió la morfología externa de lagástrula y néurula mediante montajesenteros de embriones fijados en el fijativode Smith. La estructura interna de losembriones fue descrita mediante bisec-ciones y secciones. Para realizar las sec-ciones los embriones fueron primeroembebidos en gelatina, luego montadosen cubos de agarosa y, mediante el usodel vibrátomo, se obtuvieron secciones de40-50 µm de grosor. Algunas de estas sec-ciones fueron también estudiadas usando

la metodología de tinción fluorescentepara núcleos celulares (tinción Hoechst33258). Se documentaron las observa-ciones mediante microfotografías usandouna cámara digital acoplada a un esté-reomicroscopio o a un microscopio defluorescencia. Todas estas técnicas seenmarcan en metodologías estándar delLaboratorio de Biología del Desarrollo dela PUCE. Los estadios de los embrionesse determinaron de acuerdo a la tabla ge-neral para el desarrollo de anuros (6) ypara C. ornata (2).

RESULTADOS

Morfología de la gástrula de C.stolzmanni.- El proceso de gastrulaciónduró aproximadamente 5 horas. Lagástrula temprana (estadio 10,5; 2,2 mmde diámetro) se caracterizó por la forma-ción del labio dorsal del blastoporo, enforma de hendidura, en la región sub-ecu-atorial del embrión. Se detectaron célulasen forma de botella en dicha hendidura.Se observó pigmento ocre oscuro en elpolo animal del embrión así como un pig-mento blanco claro en el polo vegetal.

La gástrula media (estadio 11) se carac-terizó por la extensión lateral y ventral dellabio del blastoporo, el mismo que tuvoforma de herradura (Fig. 1A). Internamenteel blastocele ocupó la mayor parte de laregión animal. El arquenterón inició su for-mación pero no se expandió.

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La gástrula tardía (estadio 12) exter-namente mostró una disminución gradualdel diámetro del tapón de yema. Interna-mente los movimientos de convergencia yextensión dorsales permitieron elalargamiento y expansión del arquenterón.En el estadio 12,5 se observó que el tapónde yema continuaba su gradual reducción.En una sección sagital de un embrión deeste estadio, teñido para núcleos celulares,se observaron el labio dorsal y ventral delblastoporo así como el cleft de Brachetque separa el ectodermo del endomeso-dermo.

Morfología de la néurula de C. stolz-manni.- Los embriones en el estadio 13muestran una reducción del tapón deyema. En el estadio temprano de forma-ción de pliegues neurales (estadio 14) seobservó alargamiento del embrión (2,3mm de largo) y la formación de plieguesneurales. En una sección horizontal paraeste mismo estadio, al nivel del tapón deyema y teñida para núcleos celulares, seobservó que el notocordio está expuesto en

el techo del arquenterón. En el estadio 14,5(2,4 mm de largo) los pliegues neuralesfueron más prominentes (Fig. 1B).Durante el estadio medio de pliegues neu-rales (estadio 15; 2,7 mm de largo) lospliegues neurales se acercaron pero el tuboneural permaneció abierto. En el estadiode cerramiento del tubo neural (estadio16), el tubo neural se cerró pero per-maneció abierto en la región rostral. En lamisma región se observaron los arcosbranquiales: mandibular, hioideo y bran-quial (Fig. 1C).

La eclosión ocurrió en el segundo día.Este tiempo de desarrollo es comparablecon X. laevis (7).

Morfología del techo del ar-quenterón en C. stolzmanni.- El techodel arquenterón se estudió en biseccionesde embriones de estadios 13-15 con elobjeto de determinar sus característicasmorfológicas. En la región caudal deltecho del arquenterón de un embrión deestadio 13 (Fig. 2A) se observó un áreapigmentada triangular, el GRP (Fig. 2B).

Características morfológicas de la gástrula en Ceratophrys stolzmanni

Fig. 1. Desarrollo temprano de C. stolzmanni: gástrula y néurula. (A) Gástrula media. (B) Néurulamedia. (C) Estadio de cerramiento del tubo neural. Abreviaturas: lb, labio del blastoporo; pn, pliegues neu-rales; bp, blastoporo; tb, tubo neural; ab, arco branquial; ah, arco hioideo; am, arco mandibular. Todas las bar-ras corresponden a 250 µm.

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Esta estructura se observó como unaregión con tres bandas más oscuras loca-lizadas en la región central y lateral. Lasbandas del GRP convergieron en la partemedia anterior (Fig. 2C).

En secciones transversales de estadios13 y 14, teñidas para núcleos celulares yefectuadas a diferentes niveles del ejeantero-posterior, se evidenció que el noto-cordio y los somitas estaban recubiertospor endodermo en la parte anterior y descu-biertos en la región posterior. Es decir, enestos estadios se encontró que el mesoder-mo está expuesto en la parte posterior deltecho del arquenterón correspondiente a laregión del GRP. Se encontró también que elembrión de C. stolzmanni presenta un co-llar circumblastoporal prominente inclusoen embriones que tienen tapón de yema ymuestran al GRP. En secciones del estadio15 el notocordio y somitas estuvieron recu-biertos por endodermo.

DISCUSIÓN

En este estudio se demostró que C.stolzmanni es una especie que tiene desar-

rollo rápido, comparable al de la ranaacuática X. laevis y diferente al de lasespecies de reproducción terrestre E.machalilla, E. tricolor (1) y G. riobambae(9). Por otro lado el tamaño del huevo esmayor que en X. laevis 1,3 mm (7) y 2,2mm de diámetro respectivamente, y escomparable al tamaño de los huevos de E.tricolor de 2 mm de diámetro (1). La pig-mentación oscura del polo animal es com-parable a X. laevis (7). El proceso de gas-trulación es similar al de C. ornata ya queen ambas especies el labio dorsal delblastoporo se forma más cerca del ecuadorque en comparación con X. laevis (2) (7).En la morfología externa de la néurula nose observaron diferencias significativascon el patrón de otros anuros (7) (8) (10).

El análisis de la morfología del techodel arquenterón de C. stolzmanni sugierela presencia del GRP. Al igual que en X.laevis esta estructura fue visible entre lagástrula tardía y néurula temprana (7),aunque de mayor tamaño y más visible.Además un estudio en progreso ha revela-do la presencia de cilios en esta estructura(Sáenz-Ponce, et al. comunicación per-sonal). La comparación del techo del

Fig. 2. Techo del arquenterón de C. stolzmanni. (A) Gástrula temprana. (B) Bisección de gástrula tem-prana. (C) GRP. Abreviaturas: ty, tapón de yema; a, arquenterón; GRP, placa del techo del gastrocele; bp,blastoporo. Todas las barras corresponden a 250 µm.

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arquenterón entre C. ornata y C. stolz-manni revela gran similitud. En ambasespecies, en embriones del estadio 13, laregión anterior-media del techo delarquenterón está recubierta por endoder-mo, mientras que la parte posterior estádescubierta. En la figura 3 se esquemati-za la ausencia de endodermo que recubraal notocordio y somitas en C. ornata (Fig.

3 A-C) y C. stolzmanni (Fig. 3 D-F). En laregión media del embrión de estadio 13de C. ornata el notocordio y los somitasse encuentran expuestos en el techo delarquenterón (Fig. 3A). En embriones deestadio 15 las crestas endodermales la-terales han recubierto los somitas, pero el

notocordio se encuentra aún expuesto(Fig. 3B). Tanto los somitas como elnotocordio han sido recubiertos total-mente por endodermo en embriones deestadio 18 (Fig. 3C) de acuerdo con (2).En embriones del estadio 13 de C. stolz-manni nuestras observacionesdemostraron que el notocordio y lossomitas se encuentran expuestos en la

región media-posterior (Fig. 3D-F). Elcolor del GRP en C. stolzmanni posible-mente se deba a que durante losmovimientos morfogenéticos de la gas-trulación el mesodermo superficial, quetiene pigmento oscuro, se ha internaliza-do y ocupa la región dorsal del techo del

Características morfológicas de la gástrula en Ceratophrys stolzmanni

Fig. 3. Esquema comparativo del techo del arquenterón entre C. ornata y C. stolzmanni. C. ornata: (A)Néurula temprana, (B) Néurula tardía, y (C) Estadio tail bud; C. stolzmanni: (St. 13, néurula temprana): (D)Región posterior, (E) Región media, y (F) Región anterior. Las flechas señalan el límite de la región mesodér-mica expuesta en el techo del arquenterón, el GRP. Abreviaturas: ec, ectodermo; me, mesodermo, en, endoder-mo; n, notocordio; pn, pliegues neurales; tn, tubo neural. Dibujos de C. ornata modificados de (2).

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arquenterón. La acumulación de pigmen-to puede ser una consecuencia de la con-stricción apical en las células del GRPcomo se observa en C. ornata (2).

Este estudio señala la importancia dedeterminar la modularidad del GRP enespecies de ranas con distintas estrate-gias reproductivas para comprendermejor el establecimiento del eje izquier-do-derecho.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a los Drs. L.A. Colomay D. Almeida-Reinoso así como a losotros miembros del Laboratorio de Her-petología de la PUCE por la donación deposturas de C. stolzmanni. La reproduc-ción de esta rana recibió apoyo económi-co del programa de investigación “Balsade los sapos”. A los colaboradores delLaboratorio de Biología del Desarrollo dela misma universidad se agradece por suscomentarios y soporte experimental. Estetrabajo recibió el apoyo de la beca deinvestigación de la PUCE-2008 al proyec-to Expresión génica en el desarrollo deranas ecuatorianas.

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