Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatt · per queste proteine inattivatrici. I geni di resistenza più conosciuti e studiati sono bla TEM, bla OXA, bla SHV e

Caratterizzazione molecolare del

fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico

Francisco Miguel Fernandez Parra TAB3

Scuola Specializzata Superiore Medico Tecnica Anno 2007/2008

Istituto Cantonale di Microbiologia

Bellinzona

Responsabili: Antonella Demarta

Annapaola Caminada

Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico 2

Francisco Miguel Fernandez Parra TAB 3 – SSMT

Indice 1. Riassunto / Abstract 4 2. Introduzione 5 2.1 Le Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico 5 2.2 I β-lattamici 6 2.2.1 Resistenze ai β-lattamici 7 2.3 Le β-lattamasi 7 2.3.1 ESBL 7 2.3.2 Meccanismo di resistenza 8 2.3.3 TEM, SHV, OXA e AmpC 9 2.4 Obiettivi 10 3. Materiali e Metodi 11 3.1 Ceppi batterici 11 3.2 Estrazione del DNA batterico 12 3.3 Reazione polimerasica a catena (PCR) 13 3.3.1 PCR Multiplex per i geni blaTEM, blaSHV e blaOXA 13 3.3.2 PCR per blaAmpC 13 3.4 Sequenziamento 14 3.4.1 Purificazione NucleoSpin Extract II 14 3.4.2 Reazione di sequenza 14 3.4.3 Purificazione mediante filtri 15 3.4.4 Sequenziamento 15 3.5 Banca dati 15 4. Risultati 16 4.1 Campioni 16 4.2 Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL 17 4.2.1 TEM, OXA e SHV 17 4.2.2 AmpC 19 4.3 Sequenziamento 19 5. Discussione 20 6. Conclusione 21 7. Ringraziamenti 228. Bibliografia 23



9. Allegati 25 9.1 Estrazione del DNA batterico 25 9.2 Skim Milk 26 9.3 Agar Sangue 26 9.4 TE pH 8 26 9.5 Tampone TBE (soluzione stock 10x) 26 9.6 CTAB 10% in 0.7 M di NaCl 26 9.7 Proteinasi K (8.3 mg/ml) 27 9.8 NaCl 5M 27 9.9 SDS 10% 27 9.10 Cloroformio-alcool isoamilico (24:1) 27 9.11 Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1) 27 9.12 Alcool 70% 27 9.13 Loading Buffer 6x 28 9.14 Bromuro d’Etidio (10mg/ml) 28



1.Riassunto Oggi giorno la produzione di enzimi capaci di idrolizzare ed inattivare i β-lattamici rappresenta uno dei meccanismi più importanti nella famiglia delle Enterobatteriacee e nei bacilli gram negativi di interesse clinico. Questa resistenza è dovuta alla presenza di uno o più geni di resistenza i quali codificano per queste proteine inattivatrici. I geni di resistenza più conosciuti e studiati sono blaTEM, blaOXA, blaSHV e blaAmpC; ma negli ultimi tempi sta insorgendo un nuovo gene di resistenza, il blaCTX-M. La codificazione da parte di questi geni comporta una multiresistenza del ceppo batterico, ma nel caso di una mutazione, il batterio sarà abile di produrre delle β-lattamasi a spettro esteso (ESBL). Questi patogeni con spettro di resistenza esteso si riscontrano soprattutto in luoghi di cura, quali ospedali acuti o case per anziani e si stima che l’acquisizione varia dai 10 ai 17 giorni dal ricovero, quindi un’ulteriore problema per il paziente già malato. Si è deciso quindi di approfondire questi geni di resistenza caratterizzando 60 ceppi con fenotipo ESBL isolati dai due nosocomi acuti del Canton Ticino, l’Ospedale Regionale di Lugano e l’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli. Utilizzando la reazione polimerasica a catena (PCR) si è cercato di determinare la presenza a livello gnomico di questi geni di resistenza e secondariamente di evidenziare una possibile prevalenza sia regionale che nosocomiale. La reazione di PCR Multiplex ha permesso di amplificare una regione dei geni blaTEM, blaOXA e blaSHV; mentre in una reazione seconda reazione di PCR si è cercato di evidenziare la presenza del gene blaCMY-2, descritto come il gene più frequente appartenente al gruppo eterogeneo AmpC. Si può notare che un’importante numero di ceppi ESBL sono appartenenti alla specie E. coli e si evidenzia la presenza importante di ceppi batterici presentanti i geni di resistenza blaTEM e blaOXA sia a livello territoriale che a livello ospedaliero, risultato che differisce parecchio da studi precedenti. Evidenziata la presenza di combinazioni geniche blaTEM e blaOXA, le quali possono conferire al batterio uno spettro di resistenza ancora maggiore.

Abstract Today the production of enzymes that can hydrolyze and inactivate β-lactams is the most important mechanism of resistance in the family of Enterobacteriaceae and gram negative bacilli with clinical interest. The resistance is due by a few mutated genes of resistance that codify one or more β-lactamases with an extended spectrum of resistance (ESBL). The most know and studied genes of resistance are blaTEM, blaOXA, blaSHV and blaAmpC; but now there is a new gene of resistance, blaCTX-M. The codification of these genes produce a multiresistance in the bacteria, and when begin a bacterial infection it can cause difficult on the prescription of an antibiotics therapy. These multiresistance pathogens are found in Hospital or in nursing homes and the patient can contract it in a few days, more or less 10-17 days after the admission to hospital. We decide to study these genes with a characterisation of 60 strains with a ESBL phenotype, isolated from two acute Hospital of our region, Ospedale Regionale di Lugano and Ospedale Regionale Berllinzona e Valli. Using the polymerase chain reaction (PCR), we will found one or more genes of resistance and we will highlight a regional or nosocomial prevalence. The PCR Multiplex has permit to amplify a region in the genes blaTEM, blaOXA and blaSHV; and a second PCR reaction highlight the presence of blaCMY-2, the most described gene belong in the group of genes AmpC. We can see the Escherichia coli is the most isolated strain with ESBL phenotype (66,6%) from the ICM since 2005. The genes blaTEM and blaOXA are more highlighted than blaSHV in the strains isolated from the two acute Hospital tested. But from the literature we can read the results of the study are different from another study published in other countries; for example in Spain were find more blaSHV and blaTEM than blaOXA. We have found a presence of genic combination blaTEM and blaOXA, that can produce an higher extended spectrum of resistance to bacteria.



2.Introduzione 2.1 Le Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico Insieme alle Pastorellacee, alle Vibrionacee ed alle Aeromonadacee, le Enterobatteriacee appartengono al grande gruppo dei bastoncini gram negativi anaerobi facoltativi. Le Enterobatteriacee raggruppano molti generi di batteri normalmente presenti a livello dell’apparato intestinale nell’uomo e negli animali. Alcuni di questi germi sono in grado di provocare infezioni a diversi organi con manifestazioni cliniche variabili tra lievi a molto gravi. Le patologie più frequenti causate da un’infezione da parte delle Enterobatteriacee sono le enteriti non infiammatorie, le enteriti infiammatorie e le manifestazioni sistemiche delle infezioni intestinali [1]. Questi batteri si presentano come bacilli gram negativi con un diametro che varia tra 0.5 e 1.5 µm ed una lunghezza compresa tra 2 e 4 µm, mobili grazie alla presenza di flagelli o immobili, nel caso di Shigella e Klebsiella. Possono essere capsulati o acapsulati e solitamente crescono in anaerobiosi. Questi batteri reagiscono positivamente alla reazione della catalasi, ma in modo negativo alla reazione dell’ossidasi. Sono in grado di ridurre i nitriti in nitrati e di fermentare il glucosio con o senza produzione di gas. La struttura antigenica di questa famiglia presenta gli antigeni O, H, K e F. La loro patogenicità e virulenza è data da fattori quali fimbrie adesive che conferiscono al batterio la possibilità di aderire alle mucose, invasine ed enterotossine che portano ad una perdita massiccia di liquidi da parte della mucosa colonizzata e ad un interferenza nella funzione di quest’ultima [1]. I generi maggiormente isolati nella pratica clinica sono Escherichia coli e Klebsiella. Tra i bacilli gram negativi di interesse clinico troviamo oltre alla famiglia delle Enterobatteriacee i generi Pseudomonas e Acinetobacter. Appartenente alla famiglia delle Peudomonadacee, Pseudomonas generalmente si presenta come un bastoncino gram negativo mobile grazie ad uno o più flagelli polari, batteri strettamente aerobici e in grado di ridurre i nitriti in nitrati. Il sierotipo più importante di questa specie è lo Pseudomonas aeruginosa. Questi batteri sono normalmente presenti nell’ambiente, quindi vengono ritrovati nel suolo, nelle acque, sulle piante e come patogeni commensali nella flora intestinale dell’uomo e degli animali. La loro patogenicità è data dalla presenza del glicocalice e la presenza di pili. Reagiscono positivamente a reazioni biochimiche quali ossidasi e catalasi. [1,2] Il genere Acinetobacter appartiene alla famiglia delle Moraxellacee. Questi batteri si presentano come bacilli gram negativi, immobili probabilmente per la presenza di fimbrie. La temperatura ottimale di crescita di questo genere batterico varia tra 33-35°C. Al momento dell’identificazione attraverso metodi biochimici si osserva la positività alla catalasi mentre una reazione negativa all’ossidasi. Un’infezione da parte di questo genere batterico può comportare complicazioni quali setticemie, meningiti, polmoniti, ascessi cerebrali, ed altre manifestazioni cliniche più deboli [3].



2.2 I β-lattamici I β-lattamici sono farmaci che impediscono la sintesi della parete cellulare dei batteri, interferendo nella formazione dei legami peptidici tra le molecole di peptidoglicano (presente in particolare nella parete dei batteri gram positivi). Il primo β-lattamico, molto conosciuto per il suo grande utilizzo nella seconda guerra mondiale, è la Penicillina, scoperta negli anni 30. Questo antibiotico aveva le capacità di inibire i batteri resistenti ai sulfonamidi inducendo febbre per aumentare l’effetto terapeutico [4]. Nel corso degli anni, nuovi β-lattamici sono stati sviluppati in risposta all’insorgere di resistenze nei batteri. La resistenza ai β-lattamici da parte dei batteri patogeni risulta essere un grosso problema a livello mondiale. La principale causa del grande incremento di batteri resistenti é la forte pressione selettiva esercitata dall’uso massiccio degli antibiotici. I β-lattamici sono suddivisi in gruppi e sotto-gruppi secondo la loro struttura molecolare (Tabella1) [5].

Classe Sottoclasse

Penicilline • Penicilline • Aminopenicilline • Ureidopenicilline • Carbossipenicilline • Peniccillasi • Amidinopenicilline

Cefemici • Cefalosporine di prima generazione

• Cefalosporine di

seconda generazione • Cefalosporine di terza

generazione • Cefalosporine di quarta

generazione • Cefamicine • Oxacefemici

Cefemici (orali) • Cefalosporine • Carbapenemici

Monobattamici Non presenta sottoclassi Penemici • Carbapenemici

• Penemici

Tabella 1: Suddivisione dei β-lattamici [17].

Figura 1: Struttura dell’anello β-lattamico, bersaglio delle β-lattamasi per l’inattivazione [8].



I β-lattamici possono penetrare all’interno della cellula batterica grazie all’affinità con alcune proteine di scambio della membrana batterica che permettono il collegamento tra lo spazio extracellulare e quello intracellulare. Alcuni β-lattamici presentano un’affinità particolare per enzimi specifici chiamati penicillin-binding proteins (PBPs). Oltre ad avere una funzione di sintesi della parete cellulare questi enzimi risultano essere un punto di legame con alcuni β-lattamici [6].

2.2.1 Resistenza ai β-lattamici I meccanismi di resistenza ai β-lattamici sono molteplici ed a seconda delle caratteristiche del batterio e del bersaglio del β-lattamico si avranno degli effetti dell’antibiotico differenti. Durante il corso degli anni sono stati scoperti i vari meccanismi di resistenza ai β-lattamici che sono [4]:

- la diminuzione dell’assorbimento dell’antibiotico a livello citoplasmatico dato dalla mutazione delle proteine di membrana che riducono il grado di penetrazione del beta-lattamico all’interno della cellula;

- l’alterazione del bersaglio dell’antibiotico causato dalle alterazioni delle proteine

quali le PBPs che portano ad una minore affinità tra il recettore e l’antibiotico;

- la produzione di enzimi capaci di degradare o alterare il β-lattamico, le beta-lattamasi che rappresentano la causa principale della resistenza batterica agli antibiotici β-lattamici.

2.3 Le β-lattamasi La produzione di enzimi capaci di idrolizzare i β-lattamici rappresenta oggi uno dei meccanismi più importanti di resistenza a questi antibiotici nei bacilli gram negativi, soprattutto nelle Enterobatteriacee.

2.3.1 ESBL Un batterio viene designato come produttore di ESBL al momento in cui l’enzima prodotto conferisca una resistenza la quale possa idrolizzare oximino-cefalosporine di seconda e terza generazione. Tra le β-lattamasi, il termine ESBL (Extended spectrum β-lattamase) si riferisce a [7,8]:

- geni d’origine che hanno subito mutazioni che conferiscono all’enzima la capacità di idrolizzare le oximino-cefalosporine. I geni si trovano su plasmidi e sono designati dalle sigle blaTEM, blaSHV, blaOXA;

- β-lattamasi simili alle precedenti ma derivanti da altri geni. Designati blaCTX-M e

blaVEB, possono anch’essi trovarsi su plasmidi che spesso trasportano geni di resistenza anche per altri antibiotici;



- enzimi AmpC plasmidici. Questi enzimi sono derivati da geni presenti sul cromosoma di molti batteri. Conferiscono una resistenza ai β-lattamici molto estesa.

Il termine ESBL si riferisce quindi il momento in cui nel gene di origine avviene una mutazione che porta quindi ad uno spettro di resistenza più ampio rispetto al gene d’origine. Da sottolineare però il fatto che non tutte le β-lattamasi possono essere designate come ESBL visto che molte di queste non presentano mutazione nel gene d’origine, come ad esempio il blaTEM-1. Le ESBL più diffuse e studiate in questo lavoro sono TEM, OXA, SHV e AmpC. Questi enzimi conferiscono al ceppo batterico una multiresistenza che causa difficoltà al medico nel prescrivere una terapia antibiotica adeguata. Oltre alla produzione di ESBL esistono altri meccanismi che sono in grado di conferire ai batteri un fenotipo di resistenza ai β-lattamici simile a quello ESBL. Questi meccanismi sono: [7,8]

- l’iperproduzione delle β-lattamasi cromosomiche AmpC (Enterobacter spp.) - l’iperproduzione delle β-lattamasi di tipo K1 cromosomiche (Klebsiella oxytoca)

- la resistenza dovuta alle pompe ad eflusso (P. aeruginosa)

- la resistenza dovuta a vari meccanismi (Acinetobacter spp.)

Alcune ESBL, come ad esempio le CTX-M, oltre a conferire la multiresistenza ai beta-lattamici, sono anche in grado di indurre una resistenza ad antibiotici quali chinoloni, aminoglicosidi e trimethoprim che non appartengono alla famiglia dei β-lattamici [7]. I batteri con fenotipo ESBL positivo sono isolati in modo preponderante in luoghi quali ospedali acuti o in strutture di soggiorno a lungo termine. Si stima che nel paziente il tempo di acquisizione di batteri producenti ESBL varia dai 10 ai 17 giorni dal ricovero ed è molto simile al tempo di esposizione di batteri quali MRSA (Stafilococco aureo meticillino resistente). E proprio per questo motivo che si studiano i comportamenti di questi batteri, affinché si riduca il rischio di infezione in luoghi di cura, adottando misure preventive appropriate [9]. Attraverso parecchi studi, si è scoperta una prevalenza degli ESBL localizzata in regioni specifiche del globo. Alcuni esempi possono essere la scoperta di una prevalenza in Francia dell’enzima TEM-3, oppure la presenza negli Stati Uniti dell’enzima TEM-10 [10]. Nel corso degli anni la classificazione delle β-lattamasi è stata cambiata svariate volte. Attualmente si è deciso di utilizzare un metodo di classificazione basato sulla sequenza aminoacidica in quattro semplici gruppi designati dalla A alla D [11].

2.3.2 Meccanismo di resistenza In presenza di β-lattamasi, i β-lattamici vengono idrolizzati a livello del sito attivo dell’enzima grazie alla presenza di un gruppo ossidrile presente nella serina terminale della catena laterale della β-lattamasi. Dopo un legame non covalente tra i due, l’anello β-lattamico (Figura 1) viene attaccato da un gruppo ossidrile libero creando un legame covalente con l’enzima. A questo punto, mediante una molecola di acqua, avviene l’idrolisi dell’anello del medicamento liberando l’enzima e inattivando il β-lattamico.



Questo processo mediante serina terminale avviene solo con le β-lattamasi di classe A, C e D; per le β-lattamasi di classe B l’enzima presenta nel sito attivo uno ione di zinco ma il principio è simile [7,11,12,13].

2.3.3 TEM, SHV, OXA e AmpC TEM La prima β-lattamasi plasmatica fu scoperta negli anni sessanta e fu riscontrata in un batterio presente nell’organismo di un paziente di nome Temoniera, da cui il nome TEM. Questo gene codifica per una β-lattamasi di classe A [10]. Le β-lattamasi TEM, numerate da TEM-1 a TEM-161, si incontrano maggiormente in batteri gram negativi e sono responsabili della resistenza all’ampicillina, alle penicilline nonché alle cefalosporine. Le varianti del gene blaTEM sono la conseguenza di mutazioni puntiformi a livello nucleotidico che causano la sostituzione di singoli aminoacidi e quindi la mutazione dell’enzima [14,15]. SHV Un’altra β-lattamasi importante è SHV ossia Sulphydryl variable. L’enzima codificato dal gene blaSHV appartiene alla classe A delle β-lattamasi. Il gene codificante questa β-lattamasi può essere presente sia su plasmidi che sul cromosoma del batterio ed è spesso riscontrato in ceppi di K. pneumoniae. La maggior parte di questi enzimi presentano una sostituzione di un aminoacido in posizione 240 (da una Lisina ad un Glutamato). Questa sostituzione conferisce al batterio il fenotipo ESBL. Altre variazioni di aminoacidi sono necessarie per conferire le resistenze ad antibiotici quali ceftazidime o cefotaxime [10].

Figura 2: Azione delle beta-lattamasi [5]



OXA Un altro gene che conferisce resistenza ai β-lattamici appartiene al tipo OXA. A differenza dei geni blaTEM e blaSHV, questo gene (blaOXA) conferisce al batterio una resistenza all’ampicillina e alle cefalotine, e grazie alla sua forte attività idrolitica è capace di idrolizzare pure l’oxacillina e la cloxacillina. Questa beta-lattamasi è riscontrata in ceppi di E. coli e K. pneumoniae ma la maggior parte di questi enzimi è stata trovata in Acinetobacter baumanni e P. aeruginosa. Le β-lattamasi del tipo OXA appartengono al gruppo D. È però anche in questo caso necessaria una mutazione del gene per conferire al ceppo batterico un fenotipo ESBL [10]. AmpC Un altro tipo di β-lattamasi è rappresentata da AmpC, che si presenta come un gruppo eterogeneo di geni che possono essere localizzati sul cromosoma o sul plasmidio. Molti ceppi appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriacee presentano uno di o più geni AmpC, i quali però vengono espressi soprattutto in ceppi di K. pneumoniae. Appartenente alla classe C, l’enzima codificato può causare resistenza alle cefalosporine ed alle penicilline. La particolarità, che rende poi così difficile identificare la presenza di una di queste β-lattamasi e quindi del gene, é che non viene inibita dall’acido clavulanico, a differenza di altre β-lattamasi a spettro esteso, dando così risultati falsamente negativi [6].

2.4 Obiettivi La produzione di β-lattamasi a largo spettro rappresenta il meccanismo di resistenza ai β-lattamici più importante nelle Enterobatteriacee; batteri enterici produttori di ESBL sono sempre più diffusi. Il fenotipo ESBL è messo in evidenza all’ICM tramite un sistema automatizzato (Phoenix, BD) e/o l’analisi delle reazioni di sensibilità/resistenza (antibiogramma) a specifici antibiotici. Seguendo le linee direttive del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute™), il fenotipo ESBL viene confermato grazie alla valutazione dell’effetto sinergico della combinazione antibiotico+inibitore di β-lattamasi. Questa procedura non permette però di individuare l’enzima e rispettivamente il gene responsabile del fenotipo osservato. Lo scopo del lavoro era la caratterizzazione a livello molecolare del fenotipo ESBL, in batteri identificati all’ICM come produttori di enzimi ESBL. Inoltre era nostra intenzione rilevare la prevalenza dei diversi geni di resistenza a livello regionale (Canton Ticino) ed eventualmente a livello di struttura ospedaliera.



3. Materiali e Metodi 3.1 Ceppi batterici Per questo studio sono stati utilizzati 60 ceppi con fenotipo ESBL positivo provenienti dai due nosocomi più importanti della regione, Ospedale Regionale Bellinzona e Valli (30 ceppi) e Ospedale Regionale di Lugano (30 ceppi) (Tabella 2).

Ceppo Batterio Provenienza ESBL 04/07 K. pneumoniae ORL ESBL 05/07 E. coli ORL ESBL 10/07 E. coli ORL ESBL 12/07 E. coli ORL ESBL 13/07 E. coli ORL ESBL 14/07 E. coli ORL ESBL 16/07 E. coli ORL ESBL 21/07 A. baumanni ORL ESBL 22/07 E. coli ORL ESBL 23/07 E. coli ORL ESBL 32/07 E. coli ORL ESBL 40/07 E. coli ORL ESBL 48/07 A. baumanni ORL ESBL 51/07 E. coli ORL ESBL 55/07 K. oxytoca ORL ESBL 58/07 E. coli ORL ESBL 74/07 Salmonella spp ORL ESBL 88/07 E. coli ORL ESBL 90/07 E. coli ORL ESBL 91/07 E. coli ORL ESBL 93/07 E. coli ORL ESBL 94/07 E. coli ORL ESBL 132/06 A. baumanni ORL ESBL 156/06 P. mirabilis ORL ESBL 162/06 E. coli ORL ESBL 164/06 A. spp ORL ESBL 165/06 A. baumanni ORL ESBL 168/06 E. coli ORL ESBL 170/06 E. coli ORL ESBL 179/06 E. coli ORL ESBL 100/07 E. coli ORBV ESBL 11/07 E. coli ORBV ESBL 27/07 E. coli ORBV ESBL 33/07 E. coli ORBV ESBL 35/07 K. oxytoca ORBV ESBL 43/07 P. aeuroginosa ORBV ESBL 47/07 E. coli ORBV ESBL 50/07 Bacc. Gram - NE ORBV ESBL 56/07 K. oxytoca ORBV ESBL 71/07 E. coli ORBV ESBL 73/07 K. pneumoniae ORBV ESBL 84/07 E. coli ORBV ESBL 87/07 K. pneumoniae ORBV ESBL 89/07 E. coli ORBV

Tabella 2: Numero d’identificazione, specie e provenienza dei ceppi batterici testati.



Ceppo Batterio Provenienza ESBL 06/06 E. coli ORBV ESBL 105/05 E. coli ORBV ESBL 125/05 K. oxytoca ORBV ESBL 140/05 E. coli ORBV ESBL 149/06 A. baumanni ORBV ESBL 162/05 E. coli ORBV ESBL 176/06 E. coli ORBV ESBL 194/06 E. coli ORBV ESBL 198/06 E. coli ORBV ESBL 202/06 E. coli ORBV ESBL 21/05 A. baumanni ORBV ESBL 33/05 E. coli ORBV ESBL 72/06 E. sakazakii ORBV ESBL 93/05 E. clocae ORBV ESBL 95/06 E. coli ORBV ESBL 99/05 E. coli ORBV I ceppi sono stati selezionati unicamente seguendo un ordine temporale e di provenienza, senza tenere conto di altri criteri come specie batterica, etc. I ceppi batterici testati determinati dal laboratorio di routine dell’istituto come produttori di ESBL sono stati congelati a -80°C nel terreno di conservazione Skim Milk (BBL, Allegato 9.2). I ceppi sono poi stati scongelati e coltivati su piastre non selettive Agar Sangue di produzione propria dell’Istituto (Oxoid, Allegato 9.3) ed incubate a 37°C per 24 ore per permetterne la crescita. Il processo di coltura è stato ripetuto due volte per avere una coltura sicuramente pura proveniente da un'unica colonia.

3.2 Estrazione del DNA batterico Il metodo utilizzato per l’estrazione del DNA batterico totale è stato quello basato sull’estrazione classica Fenolo-Cloroformio (Allegato 9.1). In breve, dopo lisi batterica grazie ad un detergente, le proteine vengono (in parte) degradate dalla proteinasi K. I detriti di parete, i polisaccaridi e le proteine rimanenti precipitano con la centrifugazione insieme alla soluzione CTAB. Il DNA viene poi purificato e fatto precipitare grazie all’isopropanolo. Si è controllato lo stato del DNA caricando gli estratti su di un gel Agarosio 0,8%. La visualizzazione delle bande è permessa grazie alla presenza di Bromuro d’Etidio (Allegato 9.14) aggiunto direttamente al gel e l’aggiunta al campione del Loading Buffer 6X (Allegato 9.13). La visualizzazione su gel ha permesso anche di stimare la concentrazione del DNA, necessarie per stabilire il volume da utilizzare nelle reazioni di PCR.



3.3 Reazione polimerasica a catena (PCR) 3.3.1 PCR Multiplex per i geni blaTEM, blaSHV e blaOXA Per la messa in evidenza dei geni codificanti per TEM, SHV e OXA si è usata una PCR Multiplex che permette l’amplificazione di diversi frammenti di DNA batterico allo stesso tempo. Nella reazione sono state utilizzate 3 coppie di primers per amplificare i geni blaTEM (516 bp), blaOXA (619 bp) e blaSHV (392 bp) (Tabella 3). Per la PCR Multiplex è stato utilizzato un kit PCR Multiplex (Qiagen) seguendo le indicazioni forntite. A 25 µl di QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, sono stati aggiunti 5 µl di 10x Primers Mix (ottenuti pipettando 10 µl di ogni primer con una concentrazione iniziale di 100 µM ad un volume di 470 µl di TE), 15 µl di acqua RNase Free ed infine 5 µl di DNA estratto, raggiungendo un volume totale di 50 µl. A differenza delle condizioni del termociclatore presenti nell’articolo di riferimento [14], nella nostra reazione è stata applicata una denaturazione iniziale di 15 minuti a 95°C, per permettere l’attivazione della HotStar Taq Polimerasi. Successivamente sono stati applicati 32 cicli comprendenti la denaturazione a 94°C per 30 secondi, l’ibridazione dei primers ad una temperatura di 54°C per 30 secondi, l’elongazione da parte della Taq Polimerasi a 72°C per 1 minuto ed infine un’elongazione finale di 10 minuti a 72°C [14]. Sul gel sono stati caricati 10 µl di amplificato e 3 µl di Loading Buffer 6X . Per l’interpretazione dei risultati è stato caricato in parallelo un marcatore di taglia da 50 bp (DNA molecular weight marker XIII, Roche molecular biochemicals). I prodotti della PCR Multiplex sono stati fatti migrare in un gel d’agarosio all’1,5% (AgarosioLE, Roche) contenente Bromuro d’Etidio, ad un voltaggio di 100 V per approssimativamente 1 ora e 30 minuti e visualizzati grazie ad il transilluminatore BioDoc-It System (UVP, BioImaging Systems). 3.3.2 PCR per il gene blaAmpC In questa reazione di PCR é stata usata la coppia di primers AmpF e AmpR (Tabella 3), in grado di amplificare una regione specifica del gene blaCMY-2 di grandezza pari a 630 bp [16]. Per un volume totale di 50 µl di reazione sono stati aggiunti 25 µl di PCR Master Mix (Qiagen), 1,5 µl di primer AmpF (10 µM), 1,5 µl di AmpR (10 µM), 21 µl di acqua RNAse Free e 5 µl di DNA estratto. Le condizioni del termociclatore utilizzate sono state 35 cicli comprendenti 1 minuto di denaturazione a 94°C, 1 minuto di ibridazione a 60°C, 1 minuto di elongazione a 72°C ed infine un elongazione finale di 10 minuti a 72°C [16]. I risultati sono stati visualizzati caricando 10 µl di amplificato e 3 µl di Loading Buffer 6X su gel agarosio 1,5% e interpretati grazie al marcatore di taglia da 100 bp (DNA molecular weight XIV, Roche molecular biochemicals). Il gel è stato fatto migrare per circa 1 ora e mezza ad un voltaggio di 100 V.



3.4 Sequenziamento Terminata la PCR Multiplex, frammenti con lunghezza non conforme con i risultati attesi nella visualizzazione su gel d’agarosio sono stati sequenziali, allo scopo di confermare la presenza del gene di resistenza.

3.4.1 Purificazione NucleoSpin Extract II Prima di procedere al sequenziamento gli amplicon sono stati purificati con il kit NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) per togliere primers, dNTP e Taq Polimerasi in eccesso.

3.4.2 Reazione di sequenza Con gli amplificati purificati si è poi continuato con la reazione di sequenza, che ha permesso di amplificare unicamente un braccio del DNA per poi determinarne la sequenza. Si sono pipettati 3 µl di BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems), 1.5 µl di Buffer 5X BigDye, 2.4 µl di primers specifico ad una concentrazione finale di 1 µM, 7.1 µl di acqua sterile ed infine 1 µl di amplificato purificato per arrivare ad un volume complessivo di 15 µl di reazione. Al termociclatore sono stati applicati una denaturazione iniziale a 96°C per 1 minuto, 25 cicli che comprendono una denaturazione a 96°C per 10 secondi, l’ibridazione a 50°C per 5 secondi ed infine un elongazione a 60°C per 4 minuti. Finita la reazione di sequenza il campione è stato portato a 4°C per la conservazione.

Tabella 3: Sequenze primers utilizzati nelle reazioni di PCR [7,6].



3.4.3 Purificazione mediante filtri Terminata la reazione di sequenza, campioni sono stati purificati con un processo osmotico, caricando i 15 µl di reazione di sequenza su filtri in Nitrocellulosa con spessore pari a 0.025 µm (Millipore) poggiati in TE a pH 8 in una scatola di petri per complessivamente 2 ore.

3.4.4 Sequenziamento Terminato il tempo della seconda purificazione i campioni sono stati recuperati dal filtro (8 µl) ed aggiunti infine nelle provette di reazione insieme a 12 µl di HI-DI Formamide (Applied Biosystems). Infine per determinare la sequenza è stato utilizzato l’apparecchio ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

3.5 Banca dati Le sequenze ottenute sono state corrette e processate grazie a due software: EditSeq (DNASTAR) per la correzione e Mega 3.1 per l’allineamento con sequenze conosciute [17]. L’appartenenza ad uno dei tipi di beta-lattamasi è stata determinata con l’inserimento delle sequenze nel sistema di ricerca BLAST (Basic Local Alignement Search Tool), che comprende banche dati quali GenBank, EMBL e DDBJ+PDB. Le sequenze sono state messe a confronto con quelle già presenti nelle diverse banche dati del sistema di ricerca, e l’appartenenza è stata data in base alla percentuale di omologia riscontrata dal sistema di ricerca confrontando entrambe le sequenze.



4. Risultati

4.1 Campioni Per questo studio sono stati utilizzati 36 ceppi isolati nel 2007, 16 isolati nel 2006 e 8 nel 2005 provenienti dai due nosocomi: l’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli e l’Ospedale Regionale di Lugano. Tutti i ceppi facevano parte della collezione dell’ICM e sono stati identificati come produttori di β-lattamasi a largo spettro tramite metodi fenotipici. Come mostra la figura 3 i ceppi testati appartengono in gran parte alla specie E. coli, che raggrupa il 66,6% dei ceppi analizzati (Figura 3 e Tabella 4). L’86,6% degli stipiti a fenotipo ESBL analizzati appartenevano alla famiglia delle Enterobatteriacee. Il restante 13,3% è suddiviso tra Acinetobacter spp. (7 ceppi), P. aeruginosa ed un bacillo gram negativo non appartenente alle Enterobatteriacee.

Batterio ORL ORBV

0 5 10 15 20 25

Acinetobacter baumanni

Acinetobacter spp

Bac. gram negativi non Enterobatteriacee

Escherichia coli

Enterobacter cloacae

Enterobacter sakazakii

Klebsiella oxytoca

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeuroginosa

Proteus mirabilis

Salmonella spp

Numero di ceppi

ORBVORL

Figura 3: Ripartizione delle specie dei ceppi testati secondo provenienza.



4.2 Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL

4.2.1 TEM, OXA e SHV Tramite la PCR Multiplex tutti i ceppi sono stati testati per determinare la presenza e il tipo di gene di resistenza. Infatti 48 ceppi batterici (pari all’80%) selezionati sui 60 analizzati nello studio presentavano almeno uno di questi geni di resistenza (Tabella 4). Il risultato è stato dedotto dalla lunghezza del frammento amplificato dopo corsa elettroforetica su gel d’agarosio all’1,5% (Figura 4).

Acinetobacter baumanni 13,33% 6,67% Acinetobacter spp 3,33% 0% Bacillo Gram negativi non Enterobatteriacee 0% 3,33% E. coli 70% 63,30% Enterobacter cloacae 0% 3,33% Enterobacter sakazakii 0% 3,33% Klebsiella oxytoca 3,33% 10% Klebsiella pneumoniae 3,33% 6,67% Pseudomonas aeuroginosa 0% 3,33% Proteus mirabilis 3,33% 0% Salmonella spp 3,33% 0%

Figura 4: Gel d’agarosio all’1,5% degli amplicon ottenuti con PCR Multiplex. Linee: DNA molecular weight marker XIII (Roche molecular biochemicals); ESBL 95/06, E. coli positivo per blaOXA proveniente dall’ORBV; ESBL 156/06, P. mirabilis positivo per blaTEM proveniente dall’ORL; K+ TEM, E. coli (D9) controllo positivo blaTEM; K+ OXA, S. typhimurium (D8) controllo positivo per blaOXA; K+ SHV, K. pneumoniae controllo positivo per blaSHV.

Tabella 4: Ripartizione delle specie dei ceppi testati secondo provenienza in percentuale.



In alcuni casi, per frammenti poco visibili e/o di lunghezza non conforme, si è proceduto ad una verifica tramite sequenziamento. La presenza ed il tipo di gene di resistenza sono stati confermato per 19 amplificati. Solo in 12 ceppi con fenotipo ESBL dei 60 analizzati (ossia il 20 %) non è stato possibile mettere in evidenza nessuno dei geni di resistenza testati. La ricerca dei geni di resistenza blaTEM, blaSHV e blaOXA è infatti risutata negativa in 4 Acinetobacter spp, 3 K. oxytoca, 2 E. coli, 1 P. aeruginosa, 1 K. pneumoniae e 1 bacillo gram negativo non appartenente alla famiglia delle Enterobatteriacee. La distribuzione dei tre geni di resistenza secondo luogo d’origine, che è rappresentata nella Figure 5, mostra anche la prevalenza regionale; essendo in relazione i due nosocomi. La Figura 6 invece mostra invece la frequenza delle combinazioni geniche riscontrate nei due ospedali acuti.

0 2 4 6 8

10

1214

1618

20

blaTEM blaOXA blaSHV

ORL ORBV

0

5

10

15

20

25

30

blaTEM-blaOXA blaTEM-blaSHV blaTEM-blaOXA-blaSHV

ORL ORBV

Figura 6: Combinazioni geniche

Figura 5: Prevalenza genica secondo l’origine dei ceppi batterici.



4.2.2 AmpC I primers selezionati all’inizio del lavoro permettevano di determinare la presenza di una variante genica del gruppo eterogeneo di geni producenti β-lattamasi AmpC, ossia blaCMY-

2, che risulta essere più frequente per la produzione di questa beta-lattamasi [13]. Tutti i ceppi batterici analizzati non presentavano la forma genica blaCMY-2.

4.3 Sequenziamento Nessuno degli amplificati ottenuti con la PCR per la detezione del gene di resistenza blaCMY-2 sottoposti a sequenziamento ha permesso di evidenziare omologie con le sequenze presenti nelle banche dati.

Ceppo Batterio TEM OXA SHV Provenienza ESBL 04/07 K. pneumoniae + n + ORL ESBL 05/07 E. coli n + n ORL ESBL 10/07 E. coli + n n ORL ESBL 12/07 E. coli + n n ORL ESBL 13/07 E. coli + n n ORL ESBL 14/07 E. coli + n n ORL ESBL 16/07 E. coli + + n ORL ESBL 21/07 A. baumanni n n n ORL ESBL 22/07 E. coli n + n ORL ESBL 23/07 E. coli + + + ORL ESBL 32/07 E. coli n + n ORL ESBL 40/07 E. coli + + n ORL ESBL 48/07 A. baumanni n n n ORL ESBL 51/07 E. coli n + n ORL ESBL 55/07 K. oxytoca n n n ORL ESBL 58/07 E. coli n + n ORL ESBL 74/07 Salmonella spp + n n ORL ESBL 88/07 E. coli n + n ORL ESBL 90/07 E. coli + n n ORL ESBL 91/07 E. coli + + n ORL ESBL 93/07 E. coli + + n ORL ESBL 94/07 E. coli + + n ORL ESBL 132/06 A. baumanni + n n ORL ESBL 156/06 P. mirabilis + n n ORL ESBL 162/06 E. coli n + n ORL ESBL 164/06 A. spp n n n ORL ESBL 165/06 A. baumanni + + n ORL ESBL 168/06 E. coli + + n ORL ESBL 170/06 E. coli + + n ORL ESBL 179/06 E. coli + + n ORL ESBL 100/07 E. coli + + n ORBV ESBL 11/07 E. coli + n n ORBV ESBL 27/07 E. coli n + n ORBV ESBL 33/07 E. coli + n n ORBV ESBL 35/07 K. oxytoca n n n ORBV ESBL 43/07 P. aeuroginosa n n n ORBV ESBL 47/07 E. coli + + n ORBV ESBL 50/07 Bacc. Gram - NE n n n ORBV ESBL 56/07 K. oxytoca n n n ORBV ESBL 71/07 E. coli n + n ORBV ESBL 73/07 K. pneumoniae n n n ORBV ESBL 84/07 E. coli + n n ORBV ESBL 87/07 K. pneumoniae + n n ORBV

Tabella 4: Tabella risultati ottenuti grazie alla PCR Multiplex e provenienza dei ceppi batterici analizzati.



Ceppo Batterio TEM OXA SHV Provenienza ESBL 89/07 E. coli + + n ORBV ESBL 06/06 E. coli n n n ORBV ESBL 105/05 E. coli n n n ORBV ESBL 125/05 K. oxytoca + n n ORBV ESBL 140/05 E. coli n n + ORBV ESBL 149/06 A. baumanni + n n ORBV ESBL 162/05 E. coli + n n ORBV ESBL 176/06 E. coli + + n ORBV ESBL 194/06 E. coli + + n ORBV ESBL 198/06 E. coli + + n ORBV ESBL 202/06 E. coli n + n ORBV ESBL 21/05 A. baumanni n n n ORBV ESBL 33/05 E. coli n n + ORBV ESBL 72/06 E. sakazakii + + + ORBV ESBL 93/05 E. clocae + n n ORBV ESBL 95/06 E. coli n + n ORBV ESBL 99/05 E. coli n + n ORBV

5. Discussione Innanzitutto il fenotipo ESBL è espresso in modo preponderante nelle Enterobatteriacee ed in particolare negli E. coli. Tale fenotipo ha potuto essere associato ad almeno un gene di resistenza nell’80% dei ceppi analizzati. Il metodo applicato all’ICM per la diagnosi fenotipica dei batteri produttori di ESBL [18] ha dato risultati conformi all’analisi molecolare nella maggior parte dei ceppi appartenenti alle Enterobatteriacee. Infatti solo in 6 ceppi (corrispondenti all’11,7%) appartenenti a questa famiglia non è stato possibile evidenziare la presenza dei geni di resistenza ricercati. In particolare, sono risultati negativi 3 stipiti della specie K. oxytoca e uno della specie K. pneumoniae. Dalla letteratura [7] è noto che le Klebsielle (in particolare la K. oxytoca) possono presentare un fenotipo ESBL a causa della produzione di una β-lattamasi di tipo K1 o per una iperproduzione di un enzima AmpC, probabilmente una variante non evidenziabile con la nostra procedura. L’iperproduzione di AmpC potrebbe essere una spiegazione anche nel caso di 2 E. coli ESBL positivi nei quali non sono stati evidenziati geni blaTEM, blaSHV o blaOXA. Tra i ceppi analizzati, 7 sono stati identificati come Acinetobacter spp ed uno come P. aeruginosa, quindi non appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriacee. Il fenotipo ESBL evidenziato in tutti gli 8 ceppi sopracitati (corrispondenti al 13,3% dei ceppi totali) è però stato confermato con il reperimento di almeno un gene di resistenza solo in 2 Acinetobacter baumannii. Anche per queste specie il fenotipo ESBL può essere dovuto ad altri meccanismi quali la presenza di pompe a eflusso e/o una diminuita permeabilità della membrana. È comunque da sottolineare che la metodologia indicata dal CLSI eseguita all’ICM è poco affidabile nel caso di batteri non appartenenti alle Enterobatteriacee come indicato da molti lavori scientifici e dal CLSI stesso [19]. Il gene blaAmpC non è stato individuato in nessuno degli stipiti analizzati. Bisogna però ricordare che AmpC può essere sintetizzato a partire da un gruppo eterogeneo di geni. Nel nostro studio ci siamo limitati alla ricerca di quello più frequentemente descritto, CMY-2. È quindi ipotizzabile che l’uso di altri primers con un gene target diverso appartenente al gruppo eterogeneo AmpC avrebbe potuto dare risultati diversi.



Nella collezione di ceppi analizzati non è stato possibile individuare una prevalenza dei geni reperiti dipendente dall’origine dei ceppi. Il gene blaTEM è stato evidenziato con maggior frequenza sia negli stipiti provenienti dall’ORL che da quelli dell’ORBV. Anche gli stipiti con più di un gene di resistenza erano presenti nei due sottogruppi. A livello regionale è stato possibile osservare una maggior frequenza dei geni del tipo blaTEM, seguita da quelli del tipo blaOXA mentre i geni blaSHV risultano essere molto meno frequenti. Invece secondo la letteratura, fino al 1990 i geni maggiormente isolati in ceppi batterici sono stati blaTEM e blaSHV[15,19]; a scapito dei geni blaOXA [14], cosa che dimostrata da tale studio non corrisponde alla situazione nel territorio ticinese. La combinazione genica evidenziata con maggior frequenza è stata blaTEM-blaOXA; la quale può influire maggiormente sulla scelta della terapia antibiotica da parte del medico, vista la produzione di due β-lattamasi con spettro di resistenza esteso. In un ceppo è pure stato possibile evidenziare la presenza simultanea di 3 geni indicati sopra. Si tratta di un Enterobacter sakazakii isolato da un campione clinico proveniente dall’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli. Il riscontro del gene blaOXA risulta aumentato in ceppi di E. coli. Questo risultato differisce parecchio dal resto del mondo, visto che in altri paesi questi geni sono stati isolati maggiormente in ceppi come P. aeruginosa o A. baumannii [15].

6. Conclusione In conclusione questo studio ha dimostrato come la maggior parte dei bacilli gram negativi di interesse clinico con fenotipo ESBL dei due ospedali acuti testati siano E. coli. Inoltre si è evidenziata una diverza tendenza in Ticino riguardo la prevalenza dei geni di resistenza testati. Un ulteriore gene di resistenza da testare per la continuazione dello studio sarebbe il blaCTX-M visto il suo grande incremento nel corso degli ultimi anni. [19] Un’altra possibile continuazione del lavoro di diploma sarebbe la ricerca di nuovi primers che permettano l’amplificazione completa dei geni blaTEM, blaSHV e blaOXA; questo per determinare non una prevalenza genica, bensì una possibile prevalenza delle varianti dei 3 geni testati con la PCR Multiplex.



7. Ringraziamenti Innanzitutto ringrazio il dottor Orlando Petrini, direttore dell’Istituto Cantonale di Microbiologia, per avermi permesso di effettuare il lavoro di diploma presso l’istituto. I miei ringraziamenti vanno anche alla dottoressa Antonella Demarta, microbiologa, che mi ha seguito durante tutto lo studio dandomi consigli di ogni genere; come pure alla dottoressa Cinzia Benagli per il suo aiuto durante la redazione della parte scritta. Un ringraziamento particolare è rivolto verso il Tecnico in Analisi Biomediche AnnaPaola Caminada che mi ha aiutato durante lo svolgimento della parte pratica e non, sopportandomi con tanta pazienza e dandomi anche un supporto morale durante i momenti bui del lavoro. Altri ringraziamenti vanno al direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica Andrea Boffini, alle docenti Sonja Marci e Daniela Marcacci, al docente Giovanni Togni per il supporto metodologico riguardante il lavoro di diploma. Ringrazio infine, non per meno importanza, la docente Michaela Zenger per avermi seguito durante tutta la durata del lavoro come tutor scolastico e Andrea Carluccio, mio compagno di classe.



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Genus II. Acinetobacter), in: D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley, G. M. Garrity. 2005. Bergey’s manual of sistematic bacteriology. 2nd edition, Springer, Volume 2:425-437.

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9. Allegati 9.1 Estrazione del DNA batterico Materiale:

TE pH 8 (allegato 9.4) Proteinasi K (allegato 9.7) SDS 10% (allegato 9.9) NaCl 5 M (allegato 9.8) CTAB 10 % (allegato 9.6) Cloroformio-alcool isoamilico (allegato 9.10) Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (allegato 9.11) Alcool 70% (allegato 9.12)

Procedimento: • Prelevare da piastra Agar Sangue un’ansa di colonie e risospendere in 558 µl di TE. • Aggiungere 30 µl di SDS 10% e 12 µl di Proteinasi K e miscelare sul vortex. • Incubare ad una temperatura di 37°C fino al raggiungimento di una soluzione limpida,

complessivamente 1 ora. • Aggiungere 100 µl di NaCl 5 M e miscelare nuovamente. • Aggiungere 80 µl di CTAB 10% e mescolare manualmente. Procedere quindi

un’incubazione a 65°C per 10 minuti. • Aggiungere 700 µl di Cloroformio-alcool isoamilico, e mescolare molto bene fino ad

avere una soluzione uniforme e centrifugare 10 minuti a 13'000 rpm. • Trasferire 500 µl di sopranatante in un nuovo contenitore ed aggiungere 500 µl di

Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico. Mescolare molto bene e centrifugare 10 minuti a 13'000 rpm.

• Trasferire 200 µl di sopranatante in un nuovo contenitore e aggiungere 120 µl di Isopropanolo freddo. Centrifugare per 13 minuti a 13'000 rpm a 4°C.

• Togliere il sopranatante evitando di perdere il pellet e aggiungere 300 µl di Alcool 70% ed effettuare un movimento oscillatorio. Centrifugare per 5 minuti a 13'000 rpm.

• Lasciar asciugare il pellet presente all’interno degli Eppendorf, utilizzando lo SpeedVac Concentrator (Savant) oppure tenendo il contenitore aperto e capovolto per all’incirca 1 ora.

• Infine risospendere il pellet in 80 µl di TE pH 8.



9.2 Skim Milk Materiale:

10 g di Skim milk, BBL; Sterilizzare a 121°C per 15 minuti; 10 ml di Calf serum, Sigma; 20 ml di Glicerolo, Fluka; 70 ml di acqua demineralizzata.

9.3 Agar Sangue Materiale:

312 g di Columbia Agar Base, Oxoid; 7600 ml di acqua demineralizzata; Sterilizzare a 121°C per 15 minuti; 400 ml di sangue di montone, Mischler.

9.4 TE pH 8 Materiale:

1,211 g di TRIS Base, Fluka; 0,372 g di EDTA; Portare a volume 1000 ml di acqua demineralizzata; Aggiustare pH con NaOH o rispettivamente HCl; Sterilizzare a 121°C per 15 minuti.

9.5 Tampone TBE (soluzione stock 10x) Materiale: In un 1000 ml di acqua demineralizzata:

108 g di Tris Base, Fluka; 55 g di Acido Borico, Fluka; 40 ml di EDTA 0,5 M a pH 8

9.6 CTAB 10% in 0,7 M di NaCl Materiale:

10 g di CTAB, Merck; 100 ml di NaCl 0,7 M; Sterilizzare a 121°C per 15 minuti.



9.7 Proteinasi K (8,3 mg/ml) Materiale:

25 mg di proteinasi K, Sigma; 3 ml di acqua demineralizzata e sterilizzata.

9.8 NaCl 5 M Materiale:

29,22 g di NaCl, Fluka; Portare a volume di 100 ml con acqua demineralizzata.

9.9 SDS 10% Materiale:

10 g di SDS, Fluka, Sigma; Portare a volume di 100 ml con acqua demineralizzata, HCl concentrato per portare la soluzione a pH 7,2; Filtrare con un filtro a 0,2 µm.

9.10 Cloroformio-alcool isoamilico (24:1) Materiale:

96 ml di Cloroformio, Merck; 4 ml di alcool isoamilico, Fluka.

9.11 Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1) Materiale:

50 ml di Fenolo, Fluka; 48 ml di Cloroformio, Merck; 2 ml di alcool isoamilico, Fluka.

9.12 Alcool 70% Materiale:

70 ml di Etanolo assoluto; 30 ml di acqua demineralizzata.



9.13 Loading Buffer 6x Materiale:

0.25% mg di Blu di Bromotimolo, Merck; 0.25% di xylene cyanol; 30% di Glicerolo in acqua, Fluka;

9.14 Bromuro d’Etidio (10 mg/ml) Materiale:

2 g di EtBr, Sigma; 200 ml di acqua demineralizzata.

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Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatt · per queste proteine inattivatrici. I geni di resistenza più conosciuti e studiati sono bla TEM, bla OXA, bla SHV e