Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 107
Catabolism of Asian Elephant Cartilage Matrix Biomolecules in Explant Culture
Siriwan Tangyuenyong1, Nawarat Viriyakhasem2, Sirinda Aungsuchawan3, Siriporn Peansukmanee1, Chatchote Thitaram1, Prachya Kongtawelert2, Siriwan Ongchai2*
Abstract
Objective—To attempt to culture and study articular cartilage biomolecules in Asian elephant.
Materials and Methods—Elephant articular cartilages were dissected from knee joint. The explants were then incubated in culture medium containing antibiotics in a humidified incubator with 5% CO
2
at 37°C for 3-28 days, under condition of 10 ng/ml IL-1b-induced cartilage degradation, compare to left untreated as control. At the end of incubation, the conditioned media were collected to measure the quantity of hyaluronan (HA), sulfated glycosaminoglycan (s-GAG) and the matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) activity by competitive inhibition-based-ELISA, colorimetric dye binding assay and gelatin zymography respectively. The remaining of collagen and uronic acid content in cartilage tissue were investigated by colorimetric dye binding assays.
Results—IL-1b treated group showed 74% higher HA release than control (P<0.05) but there was no statistical difference in s-GAG release. MMP-2 activity was found to be 71% lower in IL-1b treated group than in control. The remaining of collagen and uronic acid in the explant tissues tended to be greater in the IL-1b treated group when compared to the control. The explant tissue section stained with Hematoxylin-Eosin and Safranin-O showed no significant difference in chondrocyte number and matrix profile; however, cell size in IL-1b treated group was likely to be bigger than that in the control.
Conclusion—The achievement on cartilage explants culture and monitoring the marker substance of ar-ticular cartilage degradation provides the academic significance for further investigation of osteoarthritis in elephants.
KKU Vet J. 2012;22(2):107-123. http://vmj.kku.ac.th/
Keywords: Elephant; Explant culture; Articular cartilage degradation; Osteoarthritis; IL-1b1Department of Companion Animal and Wildlife Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, Chiang Mai University, Muang, Chiang Mai, 50100 2Thailand Excellent Center for Tissue Engineering and Stem Cells, Department of Biochemistry and Center of Excellence for Innovation in Chemistry, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Muang, Chiang Mai, 50200 3Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Muang, Chiang Mai, 50200 *Corresponding author E-mail: [email protected]
RESEARCH ARTICLE
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012108
แคแทบอลซมของสารชวโมเลกลจากกระดกออนชางเอเชย ในเนอเยอเพาะเลยง
ศรวรรณ ตงยนยง1, นวรตน วรยะเขษม2, สรนดา องศชวาล3, ศรพร เพยรสขมณ1,
ฉตรโชต ทตาราม1, ปรชญา คงทวเลศ2, ศรวรรณ องคไชย2*
บทคดยอ
วตถประสงค เพอทดลองเพาะเลยงและศกษาการสลายสารชวโมเลกลของเนอกระดกออนขอตอ
ชางเอเชย
วสดอปกรณและวธการเกบกระดกออนขอตอจากขอเขาของซากชาง น�าไปเพาะเลยงในอาหารเลยง
เนอเยอทมยาปฏชวนะภายในตบมทมความชน และม 5% CO2 ณ อณหภม 37°C เปนเวลา 3-28 วน
ในภาวะมการเหนยวน�าใหเกดการเสอมของกระดกออนดวย IL-1b 10 นาโนกรม/มลลลตร เทยบกบ
กลมควบคมซงไมม IL-1b เมอครบก�าหนด เกบน�าเลยงไปตรวจวดปรมาณไฮยาลโรแนน และซลเฟต
กลยโคซามโนกลยแคน การท�างานของเอนไซมแมทรกซเมทลโลโปรตเนส-2 (MMP-2) ดวยวธ
Competitive inhibition-based-ELISA, Colorimetric dye binding assay และ Gelatin zymography
ตามล�าดบ ปรมาณคอลลาเจน และกรดยโรนคทคงเหลออยในเนอกระดกออนถกวเคราะหโดย
Colorimetric dye binding assays
ผลการศกษา กลมทให IL-1b มการสลายไฮยาลโรแนนสงกวากลมควบคมรอยละ 74 (P<0.05)
แตซลเฟตกลยโคซามโนกลยแคนไมแตกตาง และมการท�างานของเอนไซม MMP-2 ต�ากวากลม
ควบคมรอยละ 71 คอลลาเจนและกรดยโรนคทคงเหลอในกระดกออนมแนวโนมสงกวากลมควบคม
เนอเยอกระดกออนเพาะเลยงยอมดวย Hematoxylin-Eosin และ Safranin-O ไมพบความแตกตางของ
จ�านวนเซลลกระดกออนและลกษณะแมทรกซ แตขนาดเซลลในกลม IL-1b คอนขางใหญกวากลม
ควบคม
ขอสรปความส�าเรจในการเพาะเลยงเนอเยอกระดกออนและการตดตามตรวจวดสารบงชการสลาย
กระดกออนขอตอครงน มคณคาทางวชาการทส�าคญตอการศกษาการเสอมของกระดกออนขอตอชาง
ในอนาคต
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. 2555;22(2): 107-123. http://vmj.kku.ac.th/
ค�าส�าคญ: ชาง การเพาะเลยงเนอเยอ การเสอมกระดกออนขอตอ ขอเสอม IL-1b1ภาควชาคลนกสตวเลยงและสตวปา คณะสตวแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม อ. เมอง จ. เชยงใหม 501002หนวยวจยทมความเปนเลศทางดานวศวกรรมเนอเยอและเซลลตนก�าเนดแหงประเทศไทย
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 109
ภาควชาชวเคม คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม อ. เมอง จ. เชยงใหม 502003ภาควชากายวภาคศาสตร คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม อ. เมอง จ. เชยงใหม 50100*ผเขยนทใหการตดตอ E-mail: [email protected]
บทน�า
โรคขอเสอม (Osteoarthritis, OA หรอ Degenerative Joint Disease, DJD) เปนโรคขอตอทม
ความส�าคญ เนองจากมอบตการณการเกดของโรคสงมากทงในมนษยและสตว ซงกอใหเกดปญหา
ทางดานสขภาพ เปนสาเหตใหมผปวยหลายลานคนทวโลก รวมถงในสตวหลายชนด เชน สนข มา
และชาง ตองประสบกบความเจบปวดบรเวณขอตอ ท�าใหการเคลอนไหวในหลายสวนของรางกาย
และการด�ารงชพเปนไปอยางยากล�าบาก ประสทธภาพในการท�างานและคณภาพชวตต�าลง อนสงผล
ใหโอกาสการมชวตอยสนลงกวาทควรจะเปน นอกจากน ยงสงผลเสยตอสภาพเศรษฐกจของเจาของ
สตว รวมทงการสญเสยงบประมาณจ�านวนมหาศาลไปในการตรวจวนจฉยและการรกษาทงทางยา
และการผาตด โดยเฉพาะอยางยงในชาง ซงเปนสตวบกขนาดใหญทสดในโลกและเสยงตอการสญ
พนธอยางยง ส�าหรบประเทศไทย ชางถอเปนสตวสญลกษณประจ�าชาตททรงคณคาทงทางดานจตใจ
และความเปนมาของชาตไทยตงแตอดตจนถงปจจบน ในชางเลยง (captive elephant) พบวา โรคขอ
เสอมเปนโรคระบบโครงรางและกลามเนอทพบไดบอยมากทสดโรคหนง [1-9] และยงเปนสาเหต
ส�าคญของอาการขากะเผลก (lameness) ดวย [6] ชางทถกน�ามาเลยงมกถกจ�ากดพนทรวมทงการ
เคลอนไหว โดยการลามโซทขาและใหยนอยบนพนคอนกรตแขงในสภาพทเยน ชน และเปยกแฉะ
เกอบตลอดเวลา รวมไปถงการถกใชงานโดยมนษย อาท แสดงในสวนสตว ละครสตว ธรกจการทอง
เทยว และอตสาหกรรมปาไม ประกอบกบการทชางมน�าหนกตวมาก จากหลายปจจยขางตนท�าใหม
แรงกดจ�านวนมากกระท�าตอขอตออยางตอเนองซ� าๆ เปนระยะเวลานาน อนกอใหเกดการบาดเจบ
ของขอตอและเนอเยอบรเวณใกลเคยง สงผลใหภายในขอตอมกระบวนการอกเสบเกดขน โดยเซลล
เยอบขอตอจะหลงสารสออกเสบ ไซโตคายน เชน อนเตอรลวคน และพรอสตาแกลนดน เปนตน ซง
จะไปกระตนเอนไซมตางๆ หลงออกสน�าไขขอ อนเปนผลใหกระดกออนขอตอ (articular cartilage)
ทหมบรเวณผวหนาของขอตอนนถกท�าลายจนเกดภาวะขอเสอมในทสด [10]
โดยทวไปการตรวจวนจฉยโรคขอตอในชางจะอาศยการซกประวต การตรวจรางกายทาง
กายภาพรวมกบการถายภาพทางรงส ส�าหรบประเทศไทย การตรวจวนจฉยโรคขอตออยางม
ประสทธภาพและการรกษาทประสบความส�าเรจสามารถท�าไดคอนขางยาก เนองจากขอจ�ากดของ
อปกรณทใชประกอบกบความหนาของขอตอและขาชางโตเตมวย ท�าใหภาพรงสทไดอาจไมชดเจน
เพยงพอทจะยนยนการวนจฉยโรคไดดเมอเปรยบเทยบกบในตางประเทศ ซงนอกจากมอปกรณใน
การถายภาพทางรงสทมประสทธภาพสงกวา ยงมการใชเทคนคอนในการวนจฉยโรคระบบโครงราง
และกลามเนอของชางดวย ไดแก computed tomography (CT) nuclear scintigraphy [11] และ mag-
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012110
netic resonance imaging (MRI) [9] ส�าหรบวธการรกษาในชางมกจะใชการรกษาทางกายภาพ เชน
การหยดหรอพกการท�างาน การแชหรอประคบเยน [12] และการใหยาเพอลดการอกเสบบรรเทาความ
เจบปวด เชน ยาแกอกเสบชนดทไมใชสารสเตยรอยด [13-14] ในบางกรณอาจมการใชยากลมคอรต
โคสเตยรอยดหรอใหสารอน เชน ไฮยาลโรนค แอซด (hyaluronic acid; HA) โพลซลเฟตกลยโคซา
มโนกลยแคน (polysulfated glycosaminoglycan; s-GAG) เพอเสรมความแขงแรงของขอตอ รวมทง
ใชการออกก�าลงกายหลงจากไมมการอกเสบของขอตอแลว เชน การวายน�า รวมในแผนการรกษาดวย
ปจจบน ประเทศในทวปยโรปและอเมรกา มการศกษาเกยวกบเมตาบอลซมของกระดกออน
หมผวขอตอทงในตวสตวและในหลอดทดลองอยางกวางขวาง โดยเฉพาะวธการเพาะเลยงเนอเยอ
กระดกออนจากขอตอ (cartilage explant culture) นน ในตางประเทศมการศกษามาเปนเวลานานและ
ไดพฒนาอยางตอเนองจนมรปแบบวธการเพาะเลยงทเปนมาตรฐาน ส�าหรบประเทศไทย หนวยงาน
ทมความเปนเลศทางดานวศวกรรมเนอเยอและเซลลตนก�าเนดแหงประเทศไทย (Thailand Excellent
Center for Tissue Engineering and Stem Cells) ภาควชาชวเคม คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลย
เชยงใหม เปนหนวยงานแรกทประสบความส�าเรจในการศกษาเกยวกบการเพาะเลยงเนอเยอกระดก
ออนจากขอตอของสกร [15-18] และมา [19] รวมทง แคแทบอลซมของกระดกออนขอตอทถกเหนยว
น�าใหเกดขอเสอมดวยสารอนเตอลวคน-1 เบตา (interleukin-1β) และฤทธของสมนไพรชนดตางๆ
เชน ขา [15-16] ไพล [18] งาด�า [16-17] และฟาทะลายโจร [19] ตอการสรางและเสอมสลายของ
กระดกออนผวขอในสกรและมา
ส�าหรบการเพาะเลยงเนอเยอและการศกษาเกยวกบแคแทบอลซมกระดกออนขอตอในชาง
ยงไมเคยมรายงานการศกษามากอน การศกษาครงน จงมวตถประสงคเพอทดลองเพาะเลยงและศกษา
กระบวนการสลายของสารชวโมเลกลของเนอกระดกออนขอตอในชางเอเชย โดยใชวธการเพาะเลยง
เนอเยอกระดกออน (cartilage explant culture) รวมกบการใชสารกระตนเพอเหนยวน�าใหเกดการ
เสอมสลายของเนอเยอกระดกออนขอตอ และใชการตรวจวเคราะหหาสารชวโมเลกลซงเปนองค
ประกอบของเนอเยอกระดกออน การทดลองครงน แมจะเปนเพยงการศกษาเบองตนของการเพาะ
เลยงเนอเยอกระดกออนของชาง แตถอวามคณคาทางวชาการอยางยง เพราะนอกจากจะเปนการศกษา
ตนแบบครงแรกในประเทศไทยแลว แมในระดบโลก กยงมขอมลการศกษาเกยวกบเมแทบอลซมของ
กระดกออนและภาวะขอเสอมในชางนอยมาก
วสดอปกรณและวธการ
วสด อปกรณ
ตวอยางกระดกออนหมผวขอในการศกษาครงน ท�าการเกบจากขอเขา (femerotibial หรอ
knee joint) ของชางเอเชย (Elephas maximus) เพศเมย อาย 29 ป ไมมประวตการเจบปวยอนและโรค
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 111
ขอมากอน มอาชพเปนชางโดยสารส�าหรบพานกทองเทยวชมปา ซงเสยชวตมาประมาณ 6-7 ชวโมง
ดวยสาเหตทคาดวาลมแลวลกไมขนเนองจากตดโซทลามไว
วธการเกบตวอยางและการเพาะเลยงเนอเยอกระดกออนขอตอ
กอนการเกบตวอยางท�าการลางท�าความสะอาดภายนอกและเลาะชนผวหนงออก แลวจง
ท�าการเกบตวอยางกระดกออนขอตอ โดยผาเปดขอตอและท�าการตดเลาะกระดกออนขอตอบรเวณ
หนาตดทใชรบน�าหนกออกเปนชน (cartilage disc) ใหมขนาด 3 x 3 มลลเมตรโดยประมาณ ท�าการ
ลางชนกระดกออนขอตอดวยอาหารเพาะเลยงเนอเยอ Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (serum-
free-DMEM) ทมยาเพนนซลน 200 ยนตตอมลลลตร และ สเตรปโตมยซน 200 ไมโครกรมตอมลลลตร
ซ� า 3 ครง แลวน�าไปเลยงภายในตบมทมความชน และคารบอนไดออกไซด 5% ณ อณหภม 37°C เปน
เวลา 24 ชวโมง จากนนน�ามาตรวจหาการปนเปอนของเชอจลนทรย ท�าการชงน� าหนก และน�าชน
กระดกออนไปเพาะเลยงตอเปนเวลา 1 คน แลวจงเกบน�าเลยงเนอเยอกระดกออนขอตอ (day 0) ไว
จากนนเพาะเลยงเนอเยอภายในตบมทมความชนและคารบอนไดออกไซด 5% ทอณหภม 37°C ตอ
ไปเปนเวลา 3-28 วน ทงในสภาวะทไมมสารกระตนใหเกดการเสอมสลายของเนอเยอกระดกออน
(Untreated control) และสภาวะทมสารกระตน (IL-1b group) โดยการใชรคอมบแนนทฮวแมนอน
เตอลวคน-1 เบตา ปรมาณ 10 นาโนกรมตอมลลลตร แลวเกบน�าเลยงและเนอเยอไวทอณหภม -20°C
เพอวเคราะหสารบงชการเสอมของเนอเยอกระดกออนและเอนไซมทเกยวของ รวมทงการตรวจทาง
จลกายวภาคศาสตรตอไป
การตรวจวเคราะหตวอยาง
ตรวจวเคราะหสารบงชการเสอมของเนอเยอกระดกออน โดยการวดปรมาณสารชวโมเลกล
ซงเปนองคประกอบของเนอเยอกระดกออนทถกสลายออกมาในน�าเลยงเนอเยอ เชน ไฮยาลโรแนน
(HA) ดวยวธ Competitive inhibition-based-ELISA ตามวธของ Pothacharoen et al. [15] และซลเฟต
กลยโคซามโนกลยแคน (s-GAG) ดวยวธ Colorimetric dye binding assay ตามวธของ Farndale et al.
[20] นอกจากนน ตรวจวดการท�างานของเอนไซมทเกยวของกบการเสอมของเนอเยอกระดกออน
กลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส (MMP, Gelatinase activity) ดวยวธ Gelatin zymography ซงดดแปลง
มาจากวธของ Ito et al. [21] และค�านวณหาความหนา (density) ของแถบเจลทเกดขน และตรวจวด
ปรมาณสารส�าคญทคงเหลออยในชนเนอเยอกระดกออน คอ กรดยโรนค ตามวธของ Pothacharoen
et al. [15] และคอลลาเจน ดวยวธ Hydroxyproline assay ตามวธของ Hoemann et al. [22] พรอม
ทดสอบความเปนพษของรคอมบแนนทฮวแมนอนเตอลวคน-1 เบตา ตอเนอเยอกระดกออนดวยวธ
Lactate dehydrogenase (LDH) assay ตามวธของ Chotjumlong et al. [23] รวมทงตรวจดลกษณะ
โครงสรางทางจลกายวภาคศาสตรของเนอเยอกระดกออนดวยวธ Hematoxylin-Eosin staining และ
safranin-O staining
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012112
การวเคราะหผลทางสถต
วเคราะหขอมลโดยใชโปรแกรม SPSSâ version 16 และเลอกระดบความเชอมนท 95%
(p<0.05) หาคาความเขมขนเฉลยของ HA s-GAG ปรมาณกรดยโรนค ปรมาณคอลลาเจน MMP และ
LDH activity จากผลการตรวจวเคราะหตวอยางทงสน 3 ครง โดยในแตละครงท�าการตรวจซ� าเปน
จ�านวน 3 ครง จากนนเปรยบเทยบคาความเขมขนเฉลยดงกลาว ระหวางกลมควบคมกบกลมทใหสาร
กระตนการเสอมสลายของกระดกออน ดวยวธ Student’s t-test และ ANOVA
ผลการศกษา
จากการเลยงเนอเยอกระดกออนชางเปนเวลา 3 วน พบวา ปรมาณ HA และ s-GAG ในน�า
เลยงเนอเยอกระดกออนของกลมทให IL-1b มการสลายของ HA ออกมาสน� าเลยงเนอเยอมากขน
อยางมนยส�าคญ (P<0.05) เมอเทยบกบกลมควบคมโดยเพมขนถง 1.8 เทา (คดเปนรอยละ 74.3) แต
ปรมาณการสลายของ s-GAG ไมพบความแตกตางทางสถต (P>0.05) เมอเปรยบเทยบกบกลมควบคม
ส�าหรบผลการวดปรมาณกรดยโรนคทเหลออยในเนอเยอกระดกออนในกลมทถกกระตนดวย IL-1b
ไมพบความแตกตางจากกลมควบคมอยางมนยส�าคญ (P>0.05) แมมแนวโนมสงกวา (Figure 1) และ
ผลการศกษาการท�างานของเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส พบวา กลมทให IL-1b ม
การท�างานของเอนไซม MMP-2 ในระดบต�ากวากลมควบคม โดยการท�างานทลดลงนนคดเปนรอย
ละ 71.8 (Figure 2) สวนการทดสอบความเปนพษของสารรคอมบแนนทฮวแมนอนเตอลวคน-1 เบตา
ตอเนอเยอกระดกออนนน ผลปรากฏวา IL-1b ทระดบความเขมขน 10 นาโนกรมตอมลลลตร ม
ปรมาณ Lactate dehydeogenase ปลดปลอยออกสน� าเลยงเนอเยอเปนปรมาณนอย และไมแตกตาง
จากกลมควบคม แตต�ากวามากเมอเปรยบเทยบกบกลมทให hydrogen peroxide (10 mM) ซงเปนสาร
ทใชเปน positive control (Figure 3) ในการตดตามตรวจวเคราะหปรมาณการสลาย HA และ s-GAG
เปนระยะเวลา 28 วน ผลปรากฏวา ณ สปดาหท 1 มการสลายของ HA และ s-GAG ออกมาในน�าเลยง
เนอเยอเพมสงขนจากสปดาหท 0 และการสลายยงเพมสงขนตอไปจนถงสปดาหท 2 ถง 4 (Figure 4
& Figure 5) หลงจากนนอตราการสลายลดลงและอยในระดบคงทตอไป (ไมแสดงขอมล) ส�าหรบ
ผลการวดปรมาณกรดยโรนคและคอลลาเจนทเหลออยในเนอเยอกระดกออน แมไมพบความแตกตาง
กนอยางมนยส�าคญ (P>0.05) แตมแนวโนมของปรมาณกรดยโรนคและคอลลาเจนในกลมทถกกระตน
ดวย IL-1b สงกวากลมควบคม (Figure 6)
ผลการตรวจดลกษณะโครงสรางทางจลกายวภาคศาสตรของเนอเยอกระดกออนดวยการยอม
ส Hematoxylin-Eosin พบวา กระดกออนหมผวขอของชางเปนชนด hyaline cartilage ลกษณะของ
เนอเยอกระดกออนสดทไมไดผานการเพาะเลยง (fresh cartilage) พบเซลลกระดกออน (chondrocyte)
จ�านวนมากอยในแอง lacunae มรปรางทรงกลม (round) หรอร (ovoid) ในบาง lacunae อาจพบเซลล
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 113
กระดกออนอยมากกวาหนงเซลล และพบอยรวมกนเปนกลม (isogeneous groups) ลกษณะของ ma-
trix จะเปนเนอเดยว (homogenous) และพบลกษณะของ territorial matrix (capsular matrix) อยรอบๆ
lacunae ซงตดส basophilic เขมกวา ใน interterritorial matrix (Figure 7a) ส�าหรบเนอเยอกระดก
ออนทเลยงใน medium (normal culture explants) พบวา จ�านวนของเซลลกระดกออนลดลงเมอเปรยบ
เทยบกบในเนอเยอกระดกออนสดทไมไดผานการเพาะเลยง สวนของ nucleus มขนาดเลกลง ตดส
เขม และแทบจะไมพบ territorial matrix เลย (Figure 7b) สวนของเนอเยอกระดกออนทเลยงใน
medium ทไดรบการกระตนดวย IL-1b (IL-1b induced culture) พบวา จ�านวนของเซลลกระดกออน
และลกษณะของ matrix ไมแตกตางจากกลม normal culture แตขนาดเซลลคอนขางใหญกวากลม
normal culture เลกนอย ดงแสดงในรปท 7c นอกจากน การยอมดวย Safranin-O ของกลมเนอเยอ
กระดกออนสดทไมไดผานการเพาะเลยง มการตดสเขมกวาใน culture explants ทงสองกลม และเมอ
เปรยบเทยบลกษณะทพบในกลม normal culture กบกลม IL-1b induced culture ปรากฏวาไมมความ
แตกตางกน ดงแสดงใน Figure7d,7eและ7f ตามล�าดบ
Figure 1. IL-1b induced degradation of cartilage matrix biomolecules of the Asian elephant
articula cartilage explants
Elephant articular cartilage explants were treated with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. After 3 days of incubation, the explants culture were harvested for analysis the release of cartilage matrix biomolecules into the culture media such as HA and s-GAG. The cartilage tissues were analyzed for uronic acid content. The results are expressed as a percentage relative to the control. *Denoted value that was significant different (P<0.05) from the control.
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012114
Figure 2. Zymographic analysis of MMP-2 activity from the culture medium of Asian elephant
articular cartilage explants induced by IL-1b (a) and optical density values of MMP-2 activity
relative to the control group (b).
66 kDa a
b
Elephant articular cartilage explants were treated with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. After 3 days of incubation, the culture media were analyzed for the gelatinolytic activity of MMP-2. Density of the clear bands which represented the gelatinase activity is expressed in the bar graph as relative to the control.
Figure 3 . Cytotoxicity effect of IL-1b on Asian elephant articular cartilage explants measuring
by LDH assay
Elephant articular cartilage explants were treated with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. After 3 days of incubation, the culture media were analyzed for the release of LDH. The positive control treated with 10 mM of H2O2 showed significant difference from the control (** = P <0.01).
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 115
Figure 5. Effect of IL-1b on the release accumulation of s-GAG to culture medium from Asian
elephant articular cartilage explants
Elephant articular cartilage explants were cultured for 28 days under treatment with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. The culture media were changed at day 4, 7, 14, 21 and 28 to analyze for s-GAG accumulative concentration.
Figure 4 . Effect of IL-1b on the release accumulation of HA to culture medium from Asian
elephant articular cartilage explants
Elephant articular cartilage explants were cultured for 28 days under treatment with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. The culture media were changed at day 4, 7, 14, 21 and 28 to analyze for HA accumulative concentration.
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012116
Figure 7. Histological staining of articular cartilage of the Asian elephant (Elephas maximus)
Fresh elephant articular cartilage tissues, the 28 days explants treated with IL-1b treated (+/IL-1b) and the untreated control (-/IL-1b) were proceeded sections and stained with Hematoxylin Eosin (a-c) and Safranin-O, the staining used for the contents of acidic glycosaminoglycans (d-f). All sections were examined under a light microscope. Bar = 100 µm.
Figure 6. Effect of IL-1b on the remaining of uronic acid and collagen contents in Asian
elephant articular cartilage explants
Elephant articular cartilage explants were treated with IL-1b at concentration 10 ng/ml or left untreated as control. The cartilage tissues were harvested at day 28 to analyze for uronic acid and collagen contents. The results are expressed as a percentage relative to the control. There was no significant different between the IL-1b treated and control (P<0.05).
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 117
วจารณ
โรคขออกเสบและขอเสอมเปนโรคเรอรงทพบไดบอยทงในมนษยและสตวหลายชนด รวม
ถงชางซงเปนสตวเลยงลกดวยนมอาศยอยบนบกทมขนาดตวใหญทสดในโลก การมพยาธสภาพของ
โรคดงกลาวภายในขอตอ มกน�ามาซงความเจบปวด ทกขทรมาน ท�าใหประสทธภาพในการท�างาน
ลดต�าลง และยงสงผลตอการด�าเนนชวตในระยะยาวเปนผลใหคณภาพชวตของคนและสตวต �าลง อน
มสาเหตมาจากกระบวนการสรางและการสลายของกระดกออนภายในขอตอเสยภาวะสมดลไป โดย
เกดการสลายมากกวาการสราง ซงกระบวนการสลายเนอเยอกระดกออนดงกลาวจะอาศยการท�างาน
ของสารสออกเสบ (destructive inflammatory mediators) ไซโตคายน และเอนไซมตางๆ ในการท�าลาย
กระดกออนทหมผวบรเวณขอตอ เปนผลใหสารชวโมเลกลซงเปนองคประกอบของเนอกระดกออน
เชน ซลเฟตกลยโคซามโนกลยแคน ไฮยาลโรแนน คอลลาเจน และกรดยโรนค สลายออกมาอยในน�า
ไขขอและถกดดซมเขาสกระแสเลอดตอไป หลายสบปทผานมามการศกษาถงไซโตคายนทเกยวของ
กบกระบวนการสลายเนอเยอกระดกออนอยางกวางขวาง IL-1b เปน pro-inflammatory cytokine ท
ส�าคญมากชนดหนง ซงสรางจากเซลลเยอบขอตอและเซลลกระดกออน โดยมความเกยวของกบ
กระบวนการตอบสนองตอการตดเชอและการสรางเมดเลอดขาวชนดลมโฟไซต [24] ทงยงเปนตวการ
ส�าคญในกระบวนการสลายเนอเยอกระดกออน โดย IL-1b จะไปกระตนการสงเคราะหเอนไซมใน
กลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส [25-26] ออกฤทธยบย งการสรางคอลลาเจน [27-28] และโปรตโอก
ลยแคน [29-30] รวมทงลดการเพมจ�านวนเซลลกระดกออนของมนษยดวย [31]
งานวจยครงน เปนการศกษาเกยวกบกระบวนการสลายของสารชวโมเลกลของเนอกระดก
ออนขอตอในชางเอเชย ซงถอเปนครงแรกในโลกและครงแรกส�าหรบประเทศไทย โดยใชวธการเพาะ
เลยงเนอเยอ รวมกบการใช IL-1b เพอเหนยวน�าใหเกดการเสอมสลายของเนอเยอกระดกออนขอตอ
เสมอนเปนการจ�าลองภาวะการอกเสบทเกดขนภายในขอตอของโรคขออกเสบและขอเสอม ซงจาก
ผลการทดสอบระดบความเปนพษพบวา IL-1b ทระดบความเขมขน 10 นาโนกรมตอมลลลตร ไมม
ความเปนพษตอเนอเยอกระดกออน คณะผวจยจงไดเลอกใช IL-1b ทระดบความเขมขนดงกลาว ซง
มความปลอดภยตอเนอเยอกระดกออนส�าหรบการน�ามาใชในการวดปรมาณสารชวโมเลกลและ
วเคราะหการท�างานของเอนไซมตอไป
จากผลการศกษาเพาะเลยงเนอเยอกระดกออนชางเปนเวลา 3 วน พบวา กลมทให IL-1b ม
การสลายของ HA ออกมาสน�าเลยงเนอเยอมากกวากลมควบคมนน ใหผลตรงกนกบหลายงานวจยใน
การเพาะเลยงเนอเยอกระดกออนของสกร [15-18] และมา [19] ซงพบวา การกระตนดวย IL-1b ท�าให
มรอยละการสลายของ HA เพมสงขนเมอเทยบกบกลมควบคม อยางไรกตาม เมอเลยงเนอเยอเปน
เวลานาน 1 เดอนโดยประมาณ (28 วน) เพอดคาสะสมการสลาย HA ซงพบวา ทงกลมทกระตนดวย
IL-1b และกลมควบคมทไมใสสารกระตนดงกลาวไมมคาแตกตางกน แสดงใหเหนวา ความเขมขน
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012118
ของ IL-1b ทใชในการทดลองนนาจะมปรมาณนอย เพยงพอแคกระตนใหการสลาย HA สงขนได
ในระยะเวลาสน ๆ เทานน จงไมพบความแตกตางของคาสะสมการสลาย HA จากกลมควบคมในการ
เลยงแบบระยะยาว ซงผลนยนยนไดจากการวเคราะหปรมาณ s-GAG ในน�าเลยงทงแบบ 3 วนและ
การดคาสะสมการสลาย s-GAG จากการเลยงนาน 28 วน รวมทงผลการวเคราะห ปรมาณกรดยโร
นคทเหลออยในเนอเยอกระดกออนทเปรยบเทยบระหวางกลม IL-1b และกลมควบคม ซงไมพบ
ความแตกตางกนทางสถต อยางไรกตาม การทดลองครงนใหผลสวนทางกบผลการศกษากอนหนาท
พบวา IL-1b เพมการสลายของ s-GAG และลดปรมาณกรดยโรนคทคงเหลออยในชนเนอเยอกระดก
ออนของสกร [16-18] และมา [19]
ส�าหรบผลการศกษาการท�างานของเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนสทพบวา การ
ท�างานของเอนไซม MMP-2 ในกลมทให IL-1b มระดบต�ากวากลมควบคม ซงตรงขามกบผลการ
ศกษาในสกร [16-18] และมา [19] ทพบวา IL-1b กระตนใหเกดการท�างานของ MMP-2 เพมสงขน
โดยในภาวะปกต กระดกออนทหมบรเวณผวหนาของขอตอจะมการสลายและปลอยสารชวโมเลกล
ซงเปนองคประกอบของเนอเยอกระดกออนออกสน� าไขขออยแลวในปรมาณหนง โดยการท�างาน
ของเอนไซมกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส เมอเลยงกระดกออนในภาวะทม IL-1b ซงมฤทธกระตน
การแสดงออกของยนทเกยวของกบเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส [25-26] เปนผลท�าให
เกดการเสอมสลายของเนอเยอกระดกออนมากขน จงพบการสลายของซลเฟตกลยโคซามโนกลยแคน
ไฮยาลโรแนน คอลลาเจน และกรดยโรนคออกจากเนอกระดกออนสงขนคลายกบภาวะทเกดขนใน
โรคขอเสอม [32] เปนทนาสนใจวา ผลการศกษาครงนพบการท�างานของ MMP-2 ลดต�าลงภายใต
ภาวะการถกกระตนดวย IL-1b ซงขดแยงกบการศกษาในสตวชนดอนขางตน อยางไรกตาม ผลการ
ลดลงของเอนไซมนกลบมความสอดคลองกบปรมาณของ s-GAG ในน�าเลยงเนอเยอทไมสงขนเมอ
เทยบกบกลมควบคม รวมทงปรมาณกรดยโรนคทเหลอในเนอกระดกออนซงควรเหลอนอยลง แต
กลบพบวามแนวโนมเพมสงขนแมไมแตกตางจากกลมควบคมกตาม แสดงวานาจะมสาเหตจากการ
ท MMP-2 ซงเปนเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนสทท�าใหเกดการเสอมสลายของเนอเยอ
กระดกออน เมอมการท�างานลดลง การสลาย s-GAG จากเนอกระดกออนจงเกดขนไดนอย และเปน
ผลใหมการคงเหลอของกรดยโรนคในเนอกระดกออนเพมขน เนองจาก s-GAG นนมกรดยโรนคเปน
องคประกอบทส�าคญอยในโมเลกล [32] จากผลการสลายและคงเหลอของสารชวโมเลกลทเปนองค
ประกอบของเนอเยอกระดกออนของชาง รวมทงการท�างานของเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปร
ตเนสของการศกษาครงน ชใหเหนวา IL-1b มผลเฉพาะในการสลายของ HA (ในการเลยงแบบระยะ
สน) มากกวาสารชวโมเลกลชนดอน ซงอาจเปนไปไดวา IL-1b ไปมผลตอเอนไซม hyaluronidase
ซงสามารถเรงการสลาย HA ในชวงแรกๆ ของการเลยง หรอในการเลยงภายใตภาวะถกกระตนออนๆ
ดวยปรมาณ IL-1b นอย ๆ อาจสงผลในทางตกลบ ท�าใหเซลลเกดการสงสญญาณปกปองตนเอง โดย
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 119
กดการสรางเอนไซมทสลายเนอกระดกออน เปนผลใหอตราการสลายเนอกระดกออนนอยลง
สอดคลองกบการคงเหลอของกรดยโรนคทมแนวโนมสงกวากลมควบคมทไมใส IL-1b ซงกมอตรา
การปลดปลอยเอนไซมทสลายเนอกระดกออน และมการสลายเนอกระดกออนเปนปกตอยแลวใน
ระดบหนง อยางไรกตาม เนองจากตวอยางชนเนอเยอทไดมาครงนมปรมาณคอนขางนอย ไมสามารถ
ท�าการทดลองมากซ� าได จงจ�าเปนตองมการศกษาเพมเตมเพอใหไดขอสรปทชดเจนยงขนตอไป
ในสวนของผลการตรวจวเคราะหปรมาณสารชวโมเลกลในระยะยาวเปนเวลา 28 วน ทพบ
วา ตงแตสปดาหท 0 จนถงสปดาหท 4 การสลายของ HA และ s-GAG จากเนอเยอออกสน�าเลยงม
ระดบเพมสงขน และหลงจากนนอตราการสลายลดลงจนอยในระดบคงทตอไป จะเหนไดวา การเพาะ
เลยงเพยงแค 1 สปดาห กสามารถวดและตดตามการสลายของสารชวโมเลกลทเปนองคประกอบของ
เนอเยอกระดกออนได โดยภายหลง 28 วน ยงคงมการสลายอยแตเปนในระดบคอนขางคงท และจาก
ผลทพบวา ปรมาณกรดยโรนคและคอลลาเจนทเหลออยในเนอเยอกระดกออนของกลมทถกกระตน
ดวย IL-1b สงกวากลมควบคมนน ชใหเหนถงแนวโนมของการรกษาองคประกอบของเนอกระดก
ออนใหคงเหลออยในชนเนอเยอเพมขน ผลการศกษาขางตนแสดงใหเหนวา วธการเพาะเลยงเนอเยอ
กระดกออนของการศกษาครงนสามารถใชเปนเครองมอในการตรวจวดและตดตามการสลายเนอเยอ
กระดกออนขอตอในชางได
ส�าหรบผลการเปรยบเทยบลกษณะโครงสรางทางจลกายวภาคศาสตรของเนอเยอกระดกออน
ระหวางกลมการเพาะเลยงทมและไมม IL-1b ดวยการยอมส Safranin-O ซงเปนวธทใชด glycosami-
noglycans และการยอมดวย Hematoxylin-Eosin ไมมพบความแตกตางกนทงจ�านวน เซลลกระดก
ออนและลกษณะของ matrix (สอดคลองกบผล s-GAG และปรมาณกรดยโรนค) แตพบวา เซลลใน
กลมไดรบ IL-1b มขนาดคอนขางใหญกวากลม normal culture เลกนอย จากผลการทดลองเปนทนา
สนใจวา แมไมพบการเปลยนแปลงของคาชวเคมระหวางกลมทมและไมมสาร IL-1b แตผลทางจล
กายวภาคศาสตรของชนเนอกลบพบวา ขนาดของเซลลทอยภายใตภาวะการถกกระตนดวย IL-1b ด
คลายจะโตกวาในภาวะทไมมการกระตนเลกนอย ซงตรงกบผลการศกษากอนหนานทท�าการทดลอง
ในเนอเยอกระดกออนของหน ทพบความเปนไปไดวา เซลลทมขนาดใหญขนอาจเกดจากการถก
กระตนโดย IL-1b ใหท�างานมากขนไปชวระยะเวลาหนง กอนทเซลลจะตายแบบอะพอพโทซสไป
ในทสด (ขอมลยงไมไดตพมพ) ดงนน ระดบความเขมขนของ IL-1b ทใชในการศกษาครงน จงอาจ
ไมใชความเขมขนทมากพอและเหมาะสมส�าหรบการเหนยวน�าใหเกดการเสอมสลายของเนอกระดก
ออนในชาง ประกอบชางเปนสตวใหญมน�าหนกตวมากถง 2,000–7,000 กโลกรม [33] ท�าใหกระดก
ออนขอตอมความหนาคอนขางมาก [34] สอดคลองกบการศกษาทพบวา ความหนาของกระดกออน
หมผวขอจะสมพนธกบน�าหนกตวของสตว [35-36] นอกจากนน โครงสรางภายในกระดกออนของ
ชางมเมทรกซเปนองคประกอบในปรมาณมาก เสนใยคอลลาเจนหนา แตมโปรตโอกลยแคนปรมาณ
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012120
นอย ซงท�าใหของกระดกออนขอตอชางมความเหนยว ยดหยนและแขงแรงมาก สามารถรบและทน
ตอแรงกด (compressive load) อนมหาศาลไดโดยไมกอใหเกดการผดรป [34] อาจท�าใหการเขาถง
ของ IL-1b ทจะไปกระตนใหเกดกระบวนการสลายเนอเยอกระดกออนเกดขนไดนอย ความเขมขน
ทใชครงนจงเพยงท�าใหเนอเยอเรมมการสลาย สงผลในทางกลบใหเซลลพยายามรกษาสมดลโดยเพม
การท�างานขน ขนาดเซลลจงโตขนเลกนอย แตความเขมขนทใชนนไมสงมากพอทจะท�าใหเกดการ
สลายมากกวาการสราง ท�าใหพบปรมาณสารทเปนองคประกอบของเนอเยอกระดกออนในน�าเลยงท
ม IL-1b มคาไมตางจากภาวะไมมสารกระตน คณะผวจยเชอวา หากเพมความเขมขนของ IL-1b ให
มากขน ผลทไดนาจะสอดคลองกบรายงานการทดลองทใชเนอเยอกระดกออนของสตวชนดอน
อยางไรกตาม ความจ�ากดของการไดตวอยางชนเนอเยอชาง ท�าใหการทดลองนไมสามารถทดสอบ
ในหลายความเขมขนได นอกจากน IL-1b ทใชในการศกษาครงน เปนชนด recombinant human
IL-1b จงอาจมโครงสรางตางจากของชาง สงผลท�าใหออกฤทธไดไมเตมท จ�าเปนตองใชในปรมาณ
มากซงตางจากในสกรและมาทอาจมโครงรางของสารนใกลเคยงกบของมนษยมากกวา จงออกฤทธ
ไดดแมใชในปรมาณเทากบทใชในชาง
จากผลการศกษาแคแทบอลซมของสารชวโมเลกลในเนอกระดกออนของชางเอเชย ดวยวธ
การเพาะเลยงเนอเยอในครงน ถอเปนความส�าเรจครงแรกของประเทศไทยและครงแรกในโลก ท
สามารถสรางตนแบบของการศกษาโรคขออกเสบและขอเสอมในชางได ซงวธการเพาะเลยงเนอเยอ
กระดกออนทใชในการศกษาครงนพสจนไดวา สามารถใชเปนเครองมอในการวดและตดตามการ
สลายของสารชวโมเลกลทเปนองคประกอบในเนอกระดกออนในชางไดดเชนเดยวกบในมนษย [15]
และสตวชนดอน เชน สกร [16-18] มา [19] และสนข [37] รวมทงสามารถใชเปนวธพนฐานในการ
วจยพฒนายาทใชในการรกษาโรคขอของมนษย สนข และมา มาสการรกษาโรคขอในชางได ถงแมวา
ปรมาณตวอยางทน�ามาตรวจวเคราะหในงานวจยครงนมคอนขางจ�ากด อนเนองมาจากชางเลยงใน
ประเทศไทยมจ�านวนนอย โอกาสทชางจะเสยชวต การไดรบอนญาตและการบรจาคจากเจาของจงม
ไมมากนก ประกอบกบความยากล�าบากในขนตอนของการเกบตวอยางซงมกอยในภมประเทศและ
พนททเปนปาจงตองใชเวลาในการเดนทาง รวมทงโครงสรางของผวหนงชางทเหนยวและมความ
หนาถง 2 นว ท�าใหการผาเปดเขาสขอตอเพอเกบชนเนอกระดกออนท�าไดคอนขางยาก ใชเวลา และ
เสยงตอการปนเปอนเชอจลนทรยจากอปกรณและสงแวดลอมไดงาย ดงนน การไดมาซงตวอยางชน
เนอกระดกออนขอตอของชางแมเพยงปรมาณนอย แตเตมไปดวยคณคาในแงของการอนรกษชางไทย
และการใหขอมลอนเปนประโยชนตอวงการแพทย สตวแพทย และเภสชกรรม อยางไรกตาม คณะผ
วจยสามารถแยกและเกบเซลลกระดกออนจากเนอเยอกระดกออนขอตอของชางในครงนได และก�าลง
ท�าการศกษาเกยวกบ cellular response ตอตวกระตน IL-1b และ Lipopolysaccharide (LPS) ใน
กระบวนการสลาย (catabolism) และการแสดงออกของยนทเกยวของกบการเสอมของกระดกออน
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 121
ขอตอ (catabolic gene expression) เชน MMP-1 MMP-3 และ MMP-13 จงควรมการศกษาตอไปใน
วธการเพาะเลยงเนอเยอกระดกออน โดยใชตวกระตนการเสอมของกระดกออนชนดอน เชน Tumor
Necrosis Factors (TNFs) หรอ LPS เปนตน และทดสอบในหลายความเขมขน นอกจากนน ควรศกษา
เพมเตมถงกลไกในระดบยน โดยเฉพาะการสงสญญาณระดบเซลลทควบคมการแสดงออกของยนท
เกยวของกบเอนไซมในกลมเมทรกซเมทลโลโปรตเนส และความเปนพษในระดบเซลลของสาร
กระตน เพอเพมพนความร ความเขาใจเกยวกบกระบวนการสรางและการสลายของกระดกออนท
สามารถน�าไปสการพฒนาเทคนคการตรวจวนจฉยและการใชยารกษาโรคขอเสอม รวมทงชวยยก
ระดบคณภาพชวตและยดอายของชางเลยงใหยาวนานขนไดในอนาคต
จากผลการศกษาในครงน ถอเปนความส�าเรจในการเพาะเลยงเนอเยอกระดกออนและการ
ตดตามการสลายกระดกออนขอตอของชาง ซงใหขอมลเบองตนทส�าคญและมคณคาทางวชาการตอ
วงการสตวแพทยเปนอยางมาก รวมทงเปนวธพนฐานทสามารถใชศกษาตอยอดในการวจยพฒนายา
ทใชในการรกษาโรคขอของมนษย สนข และมา มาสการรกษาโรคขอเสอมในชางไดในอนาคต
กตตกรรมประกาศ
งานวจยนไดรบงบประมาณสนบสนนจากหนวยวจยทมความเปนเลศทางดานวศวกรรมเนอ
เยอและเซลลตนก�าเนดแหงประเทศไทย ภาควชาชวเคม คณะแพทยศาสตร มหาวทยาลยเชยงใหม
ศนยความเปนเลศดานนวตกรรมทางเคม (PERCH-CIC) ส�านกงานคณะกรรมการการอดมศกษา
กระทรวงศกษาธการ ศนยการศกษาและวจยชางไทยฯ ขอขอบพระคณ อ.น.สพ.ดร. วรพงศ ตงจต
เจรญ เปนอยางสงในการเกบตวอยางเนอเยอกระดกออน และการสนบสนนจากคณะสตวแพทยศาสตร
มหาวทยาลยเชยงใหม ทใหความอนเคราะหใชสถานทและอปกรณ รวมทงเจาของชางทกทานและ
ชางทกตวทท�าใหการศกษาครงนส�าเรจลลวงไดดวยด
เอกสารอางอง
1. George PO. Some common surgical conditions encountered in elephants. In: Silas EG, Nair MK, Nirmalan G, editors. The Asian Elephant: Ecology, Biology, Diseases, Conservation and Management. Proceedings of the National Symposium on the Asian Elephant organized by the Kerala Agricultural University at Trichur, India; 1989 Jan 16–18; Kerala Agricultural University, Trichur, India. p. 168.
2. Houck, R. Veterinary care of performing elephants. In: Fowler ME, editor. Zoo and Wild Animal Medicine, CurrentTherapy 3. Philadelphia: W.B. Saunders; 1993. p. 453–455.
3. Schmidt M. Elephants (Proboscidea). In: Fowler ME, editor. Zoo and Wild Animal Medicine, 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders; 1986. p. 883–923.
4. Varghese K, Abraham M, Valsala KV, Rajan A. Osteoarthritis in an Indian elephant (Elephas maximus indicus).Cheiron.1990;19(4):185–186.
5. Forstenpointner G, Weissengruber G, Kubber-Heiss A, Hittmair K, Konar M. Morphological features of
KKU Vet J Vol. 22 No. 2 July - December 2012122
the stifle joint of the African elephant (Loxodonta africana, Blumenbach 1797). J Morphol. 2001;248:230.
6. Hittmair KM, Vielgrader HD. Radiographic diagnosis of lameness in African elephants (Loxodonta africana). Vet Radiol Ultrasound. 2000;41(6):511–515.
7. Ruthe H. Fußleiden der Elefanten. Wissenschaftliche Z Humboldt-Universitat Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Reihe. 2000;10:471–516.
8. Salzert W. Elefanten. Ihre Pathologie und den Tierarzt interessierende physiologische Daten [dissertation]. Tierarztliche Hochschule Hannover; 1972.
9. Weissengruber GE, Fuss FK, Egger GF, Stanek G, Hittmair KM, Forstenpointner G. The elephant knee joint: Morphological and biomechanical considerations. J Anat 2006;208:59–72.
10. McIlwraith CW. Traumatic joint injuries and disease: Intraarticular fractures amenable to treatment and in which the horse can be returned to athletic activity. In: Stashak TS, Hendrickson DA, McIlwraith CW, Trotter GW, Baxter GM, editors. Lameness in the horse: An in – depth short course for the horseman. Proceeding of Lameness in the horse: An in – depth short course for the horseman; 1997 Nov 21-22; Equine Sciences of Colorado State University, Colorado. 1997. p. 39-42.
11. Gage L. Antemortem Diagnostics, Section II: Radiology. In: Murray EE, Susan KM, editors. Biology, Medicine, and Surgery of Elephants. Iowa: Wiley-Blackwell; 2006. p. 192-197.
12. Evans GH. Elephants and their diseases. Govt. Printing. Union of Burma. Rangoon. 1961. p. 194–197.
13. Bechert U, Christensen JM, Finnegan M. Pharmacokinetics of orally administered ibuprofen in elephants. Proc Amer Assoc Zoo Vet. 2003:84–85.0
14. Hunter RP, Isaza R, Koch DE. Oral bioavailability and pharmokinetic characteristics of ketoprofen enantiomersafter oral and intravenous administration in Asian elephants (Elephas maximus). Amer J Vet Res. 2003;64(1):109–114.
15. Pothacharoen P, Choocheep K, Pitak T, Pompimon W, Premanode B, Hardingham T, et al. Effect of Alpinia galanga extract on cartilage degradation and on gene expression in human chondrocyte and synovial fibroblast metabolism. Cent Eur J Biol. 2006;1(3):430-450.
16. Phitak T. Molecular investigation of phytochemicals having effects on human chondrocyte m e t a b o l i s m [dissertation]. The Graduate school. Chiang Mai University; 2010.
17. Phitak T, Pothacharoen P, Settakorn J, Poompimol W, Caterson B, Kongtawelert P. Chondroprotective and anti-inflammatory effects of sesamin. Phytochemistry. 2012;80:77-88.
18. Chaiwongsa R, Ong-chai S, Tangyuenyong S, Kongtawelert P, Panthong A, Reutrakul V. Chondroprotective potential of bioactive compounds of Zingiber cassumunar Roxb. against cytokine-induced cartilage degradation in explant culture. JMPR. Accepted Feb 24, 2012.
19. Ong-chai S, Chaiwongsa R, Viriyakhasem N, Pompimon W, Tangyuenyong S. Effect of Active Compounds from Andrographis paniculata (Nees) on Protection of Equine Articular Cartilage Degradation In Vitro. KKU Vet J. 2008;18(2):81-96
20. Farndale RW, Buttle DJ, Barrett AJ. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 1986;883(2):173-177.
21. Ito A, Nose T, Takahashi S, Mori Y. Cyclooxygenase inhibitors augment the production of p r o - m a t r i x metalloproteinase 9 (progelatinase B) in rabbit articular chondrocytes. FEBS Lett. 1995;360(1):75-79.
วารสารสตวแพทยศาสตร มข. ปท 22 ฉบบท 2 กรกฎาคม - ธนวาคม 2555 123
22. Hoemann CD, Sun J, Chrzanowski V, Buschmann MD. A multivalent assay to detect glycosaminoglycan, protein, collagen, RNA, and DNA content in milligram samples of cartilage or hydrogel-based repair cartilage. Anal Biochem. 2002;300(1):1-10.
23. Chotjumlong P, Khongkhunthian S, Ongchai S, Reutrakul V, Krisanaprakornkit S. Human β-defensin-3 up-regulates cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E2synthesis in human gingival fibroblasts. J Periodont Res. 2010;45:464–470.
24. Taub DD, Oppenheim JJ. Chemokines, inflammation and the immune system. Ther Immunol. 1994;1(4):229-246.
25. Mengshol JA, Vincenti MP, Coon CI, Barchowsky A, Brinckerhoff CE. Interleukin-1 induction of collagenase 3 (matrix metalloproteinase 13) gene expression in chondrocytes requires p38, c-jun N-terminal kinase, and nuclear factor B: Differential regulation of collagenase 1 and collagenase 3. Arthritis Rheum. 2000;43(4):801-811.
26. Richardson DW, Dodge GR. Effects of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α on expression of matrix-related genes by cultured equine articular chondrocytes. Am J Vet Res. 2000;61(6):624-630.
27. Tyler JA, Bird JLE, Giller T. Interleukin-1 inhibits the production of types II, IX, and XI procollagen mRNA in cartilage. Ann. NY Acad Sci. 1990;580(1):512–517.
28. Cook JL, Anderson CC, Kreeger JM, Tomlinson JL. Effects of human recombinant interleukin-1 beta on canine articular chondrocytes in three-dimensional culture. Am J Vet Res. 2000;61(7):766-770.
29. Takafuji VA, McIlwraith CW, Howard RD. Effects of equine recombinant interleukin-1alpha and interleukin-1beta on proteoglycan metabolism and prostaglandin E2 synthesis in equine articular cartilage explants. Am J Vet Res. 2002;63(4):551-558.
30. Gregg AJ, Fortier LA, Mohammed HO, Mayr KG, Miller BJ, Haupt JL. Assessment of the c a t a b o l i c effects of interleukin-1β on proteoglycan metabolism in equine cartilage cocultured with synoviocytes. Am J Vet Res. 2006;67(6):957-962.
31. Frazer A, Bunning RA, Russe RG. Effects of transforming growth factor beta and interleukin -1 beta on [3H] thymidine incorporation by human articular chondrocytes in vitro. Biochim Biophys Acta. 1994;1226(2):193-200.
32. Hardingham TE, Fosang AJ. Proteoglycans: many forms and many functions. FASEB J. 1992; 6:861–870.
33. Somgerd C. Elephant. In: Langka G, Somgerd C, Thitaram C, Sutthipat T, Boonyasart B, Pongsopawijit P, editors. Manual of elephant health care. Elephant and Wildlife Clinic, Department of Companion Animal and Wildlife Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, ChiangMai University. ChiangMai. 2545. p 7.
34. Egger GF, Witter K, Weissengruber G, Forstenpointner G. Articular Cartilage in the Knee Joint of the African Elephant, Loxodonta africana, Blumenbach 1797. J Morphol. 2008;269:118–127.
35. Kaab MJ, Gwynn IA, Notzli HP. Collagen fibre arrangement in the tibial plateau articular cartilage of man and other mammalian species. J Anat. 1998;193:23–34.
36. Stockwell RA. The interrelationship of cell density and cartilage thickness in mammalian articular cartilage. J Anat. 1971;109:411–421.
37. Macrory L, Vaughan-Thomas A, Clegg PD, Innes JF. An exploration of the ability of tepoxalin to ameliorate the degradation of articular cartilage in a canine in vitro model. BMC Vet Res. 2009;5:25.