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概念
生物进化的理论使各种生物间以亲缘关系为纽带联系起来，它是生物信息学中一些重要问题，如序列比对、基因组分析、蛋白质结构分析等的理论基础。分子系统发育分析是利用生物大分子有关性质去研究生物进化或生物间亲缘关系的方法，在生物信息学中的地位越来越重要。
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生命之树：Tree of Life 重建所有生物的进化历史并以系统树的形式加以描述
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Darwin, Charles (1809-1882)
《The Origin of Species》 （1859） 共同祖先
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生物进化理论 达尔文进化论： 进化：变异的遗传 自然选择：解释为何演变发生的机制
种群中个体变异的遗传学基础：孟德尔遗传 孟德尔豌豆实验：杂交的表现特征是基因表达的结果，而不是基因杂交遗传
中性进化论：并非所有种群中保留下来的突变都由自然选择所形成；大多数突变是中性或接近中性，不妨碍种群的生存与繁衍。
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研究生物进化历史的途径 最确凿证据是：生物化石！—— 零散、不完整 比较形态学、比较解剖学和生理学等：确定大致的进化框架 —— 细节存在很多争议
6
分子进化
1964年，Linus Pauling提出分子进化理论； 从物种的一些分子特性出发，从而了解物种之间的生物系统发生的关系。 发生在分子层面的进化过程：DNA, RNA和蛋白质分子 基本假设：核苷酸和氨基酸序列中含有生物进化历史的全部信息。
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8
分子进化的模式
核苷酸替代 DNA突变 基因复制：多基因家族以及伪基因的产生
核苷酸替代：转换 & 颠换
转换（transition） 嘌呤被嘌呤替代，或嘧啶被嘧啶替代
颠换（transversion）嘌呤被嘧啶替代，或嘧啶被嘌呤替代 在进化过程中，转换发生的频率远比颠换高。
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DNA突变的模式
替代 插入
缺失 倒位
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基因复制：（1）单个基因复制
重组
逆转录
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基因复制：（2）基因组复制
酿酒酵母
克鲁雄酵母
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同源物定义
同源：序列同源，来自共同祖先。 Ortholog (直系同源物)：通过物种形成的事件而产生，存在于不同物种的基因/蛋白质，通常有相同或相似的功能。
Paralog (旁系同源物)：在同一物种中，通过至少一次基因复制事件产生。常常具有不同功能。
Xenolog (异系同源物)：由某一个基因水平转移事件而得到的同源序列。水平转移的基因功能主要根据在前后宿主中变化而确定，然而功能却常常相似。
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paralogs
orthologs
直系同源物 vs. 旁系同源物
14
异源基因或水平转移基因 xenologous or horizontally transferred genes
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同源性与相似性 相似性 (Similarity) 序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相似DNA碱基或氨基酸残基序列所占比例； 定量描述；
同源性 (Homology) 两个基因或蛋白质序列具有共同祖先的结论； 定性判断；
相似不一定同源，同源不一定相似。 氨基酸序列相似性超过30%，很可能同源。
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序列同源性模型中的进化假设 所有的生物都起源于同一个祖先； 序列不是随机产生，而是在进化上，不断发生着演变； 基本假设： 序列保守性 结构保守性
注意：反之未必 序列保守性 结构保守性
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物种分类及关系：从物种的一些分子特性出发，构建系统发育树，进而了解物种之间的生物系统发生的关系 —— tree of life
大分子功能与结构的分析：同一家族的大分子，具有相似的三级结构及生化功能，通过序列或结构同源性分析，构建系统发育树，进行相关分析；功能预测
进化速率分析：例如，HIV的高突变性；哪些位点易发生突变？
分子进化研究的目的
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Tree of Life: 16S rRNA
原核生物起初分为两大类:真细菌（Eubacteria）和古细菌（Archaebacteria） 生物三域分类： • 细菌域
（Bacteria） • 古菌域
（Archaea） • 真核域
（Eukarya）
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真细菌 古细菌
真核 在真核生物中的同源物是18S rRNA
分子进化研究——物种分类
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分子进化研究——人类起源（Out of Africa）
线粒体基因组(16,587bp)
人类迁移的路线
当前人类线粒体基因组最大的差异存在于非洲和非非洲人之间。
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本章内容提要
第一节，密码子偏好及分析 第二节，氨基酸序列的进化演变 第三节，分子系统发育分析 第四节，分子系统发育分析软件介绍
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第一节，密码子偏好及分析
密码子(codon): 在随机或者无自然选择的
情况下，各个密码子出现频率将大致相等; 密码子偏好：各个物种中，编码同一氨基酸
的不同同义密码子的频率非常不一致; 可能的原因：密码子对应的同功tRNA丰度
的不同 - Anticodon
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tRNA & Anticodon
每一个密码子，对应一
个tRNA； tRNA通过Anticodon来识别codon，联系
mRNA和氨基酸序列的
合成； 密码子的使用偏好：受
到密码子对应的tRNA的
进化及丰度影响。
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标准密码子表
25
大肠杆菌密码子偏好
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大肠杆菌密码子偏好
密码子偏好非常明显；例如 同为编码Leu的同义密码子CUA和CUG，二者出现的次数显著不等，CUA(1次)， CUG(141次)； 再如：编码Arg的四个密码子CGU, CGC,
CGA, CGG, 出现次数分别为：89，46，1，0. 提示：0表示对应CGG的同功tRNA可能不存在！
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碱基出现的频率
假如：每个核苷酸位点上的替代是随机发生的，则A,T,C,G出现的频率应该大致相等。
实际情况：DNA受到自然选择的压力，各个位点的碱基出现频率并不相等。
需要解决的问题： A. 每个位点上受到什么样的选择压力？ B. 各个位点的碱基频率反映了什么样的规律？
表征/统计的方法：计算G+C的含量，并进行比较
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分子进化的理论
自然选择理论： 阳性选择：促进有益突变； 定向选择：固定有益的等位基因； 平衡选择：保持多态性；
阴性选择（净化选择）：清除有害突变；
中性理论： 阳性选择：少有； 阴性选择：普遍存在； 中性进化：普遍存在；
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基因的编码区和非编码区 基因的DNA由编码区（Coding region）和非编码区（Non-coding region）构成； 编码区可以转录信使RNA，进而调控蛋白质的合成； 非编码区不能转录成信使RNA，但是它可以调控遗传信息的表达； 原核基因：编码区全部编码蛋白质； 真核基因：编码区分为外显子和内含子,只有外显子能编码蛋白质；
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同义替代 vs. 非同义替代 64个密码子，编码20个氨基酸
GTT GTC GTA GTG
CGT CGC
脯氨酸P 组氨酸H
四倍简并 二倍简并
TGG
TGC
色氨酸W
半胱氨酸C
同义替代 非同义替代 31
分子进化选择压力
进化选择压力： A. 编码区：阳性选择 ~1%；阴性选择~19%；
中性进化~80%；
B. 非编码区：~100%的中性进化
中性进化： 同义突变； 非编码区DNA序列的突变对蛋白质的合成很少有影响。
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编码区：密码子
对于同义的密码子，第一位少部分可以允许不同，例如，编码Ser的六个密码子：TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC
第二位少部分可以允许不同 第三位绝大多数可以不同 近似随机； 因此： A. 第一位：阴性进化占大部分，中性进化占小部分 B. 第二位：阴性进化占大部分，中性进化占小部分 C. 第三位：阴性进化占小部分，中性进化占大部分
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密码子偏好的应用及计算
基本假设：在高表达的基因中，密码子的选择，更倾向于使用“优化”的同义密码子
推论1：给定一个物种的一些高表达的基因，我们可以估算优化的同义密码子的分布
推论2：接着，我们可以对给定的一个未知基因的序列进行密码子分布的分析，预测该基因的表达量！
推论3：对于一个表达量很低的基因，我们是否能够通过将少量的密码子改变成优化密码子，从而显著提高基因的表达量？
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RSCU
相对同义密码子使用度(relative synonymous codon usage, RSCU)
定义：观测到的某一同义密码子的使用次数，除以“期望”的该密码子出现次数
∑=
=in
jij
i
ijij
Xn
XRSCU
1
1
编码第i个氨基酸的第j个密码子的出现次数
编码第i个氨基酸的同义密码子的数目
编码第i个氨基酸的第j个密码子的RSCU值
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例如，编码PHE的同义密码子UUU和UUC，表中显示分别出现15、44次
51.02/)4415(
15
1
1
=+
==
∑=
−in
jij
i
ijuuuphe
Xn
XRSCU
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大肠杆菌密码子偏好
表1 37
密码子相对适应度 The relative adaptiveness of a codon
maxmax i
ij
i
ijij X
XRSCURSCU
w ==
编码第i个氨基酸的第j个同义密码子的“相对适应性”:
即该同义密码子的观察值，除以编码该氨基酸的同义密码子的最大值
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大肠杆菌 & 酵母
与表1参考数据集不同 39
CAI：密码子适应指数 Codon Adaptation Index
LL
kkwCAI ∏
=
=1
L为基因中所使用的密码子数
CAI值介于0~1之间, 该值越小表示偏性越强; CAI值一般用来预测种内基因的表达水平，以及预测外源基因的表达水平。 不同物种CAI的计算依赖于各自的参考数据集。
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大肠杆菌和酵母：部分基因的CAI
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异源基因：在其他物种中的CAI
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不同物种密码子使用频率可由 Codon Usage Database 查询
www.kazusa.or.jp/codon Codon W： 密码子使用频率偏好性分析，多变量分析
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第二节，氨基酸序列的进化演变
分子进化的分析：基于氨基酸序列的分析早于DNA序列 优势：氨基酸序列更为保守，对年代跨度大的进化分析有帮助；数学模型较DNA更简单 p距离：p-distance 泊松校正，d距离
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P-distance 两条蛋白质序列之间的氨基酸差异数为nd, 序列的氨基酸数目均为n，则P距离：
nnp d=
∧
所有的插入/缺失均删除
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氨基酸序列替换率估计
不同物种间血红蛋白α链氨基酸差异数及比例
不同物种血红蛋白α链氨基酸序列的对齐(140个aa的前60个)
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进化时间
氨基酸序列替换率
期望值 (实际值)
观测值
P不是很严格地与时间成比例
进化时间较短时，两者大致成线性关系；当进化时间较长时，多个氨基酸替代可能出现在同一位点（极端情况为回复突变），二者成非线性关系。
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TIYAPPPWS
TIYTPPPWS
TIYGPPPWS
TIYAPPPWS
例如 该位点的丙氨酸虽然发生了3次变化，但我们并没有观察到这些变化
由于多个氨基酸替代可能出现在同一位点，大多数替换估计会显著低估真正替换率。
基本假设：令r为某一位点每年的氨基酸替代率，并假设所有位点的r都相同
在时间t年之后，每个位点替代的平均数为：rt 给定一个位点，氨基酸替代数k(k=0,1,2,3,…)的可能性遵循泊松分布，即
因此，某一位点氨基酸不变的概率为
!)();(
krtetkP
krt−
=
rtetP −=);0(
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泊松校正（Poisson Correction）
泊松距离 祖先序列未知：不知道当前的序列从何演化而来 解决方案：对两条已经有t年分化的序列，一条序列某位点无替代的概率为： ，两条序列同源位点均无替代概率为：
此概率可用1-p估计：q≈1-p; 两个序列间每个位点氨基酸替代总数设为d（d=2rt）：
d=-ln(1-p)，即泊松距离
rte−
rtrt eeq 22)( −− ==
1 ln(1 )ln(1 )
dp e d pd p
−− ≈ ⇔ − = −⇔ = − −
50
51
泊松校正
0.129 0.129 0.206 0.573 0.666 0.129 0.232 0.637 0.652
0.197 0.598 0.624 0.573 0.707
0.753
泊松校正距离
P距离
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P-距离与泊松距离比较
进化时间
氨基酸序列替换率
期望值 (实际值)
P距离（观测值）
泊松距离
第三节，分子系统发育分析
系统发育树：分子进化树/分子进化分析 通过进化树的构建，分析分子之间的起源
关系，预测分子的功能。 建树方法： A. 最大简约法 (Maximum Parsimony) B. 距离法 (distance-based methods) C. 最大似然性法 (Maximum Likelihood) D. 贝叶斯（Bayesian）推断
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祖先节点/树根
内部节点/分歧点，该分支可能的祖先结点
分支/世系 末端节点
A
B
C
D
E
代表最终分类，可以是物种，群体，或者蛋白质、DNA、RNA分子等
系统发育树: 术语
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Taxon A
Taxon B
Taxon C
Taxon D
1
1
6
遗传变化
Taxon A
Taxon B
Taxon C
Taxon D
时间
Taxon A
Taxon B
Taxon C
Taxon D
无意义
分支图 进化树 时间度量树
以上三种类型的系统发育树表示相同的分支状况，相同的进化关系
系统发育树：三种类型
遗传变化 无意义 时间 遗传变化 无意义
以上三种类型的系统发育树表示相同的分支状况，相同的进化关系
时间 遗传变化 无意义
以上三种类型的系统发育树从不同方面描述同一组分支状况和进化关系。
时间 遗传变化 无意义
分支图 进化树 时间度量树
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树只代表分支的拓扑结构
A B C D E
F G F G C D E
A B
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57 无根树
基本概念
树可分为有根树和无根树两类
——有根树是具有方向的树，包含唯一的节点，作为树中所有物种的最近共同祖先。
——无根树是没有方向的树，在无其他信息（外群）或假设时不能确定树的根。不能确定其演化方向。
有根树
通过外类群来确定树根
根
bacteria outgroup
eukaryote eukaryote
eukaryote eukaryote
archaea archaea archaea
有根树
外类群
无根树，有根树，外类群
通过外类群来确定树根
有根树
外类群 通过外类群来确定树根
有根树
外类群 通过外类群来确定树根
有根树
eukaryote
eukaryote
eukaryote
eukaryote
archaea
archaea
archaea
无根树
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选择一个或多个已知与分析序列关系较远
的序列作为外类群; 外类群可以辅助定位树根; 外类群序列与分析序列间的差异必须比分
析序列之间的差异更显著。
外类群(Outgroup)
bacteria outgroup
eukaryote eukaryote
eukaryote eukaryote
archaea archaea archaea
外类群
59
60
a b
c a b c
不同数目的分类群可能的有根树和无根树
考虑3个分类群时，共有3种可能的有根树，1种无根树
a c b c b a
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a b c d
a b c d
a b c d a d b c
b a c d
c a b d
d a b c
a c b d
b c a d
c b a d
d b a c
a d b c
b a a c
c d a b
d c a b 考虑4个分类群时，共有15种可能的有根树
62
a
b
c
d
a
c
b
d
a
d
b
c
考虑4个分类群时，共有3种可能的无根树
无根树和有根树：潜在的数目
分类单元 无根树 有根树 3 1 3 4 3 15 5 15 105 6 105 945 7 945 10,395 … 30 ~3.58X1036 ~2.04X1038
分类单元数增多，计算量急剧增加。
因此，目前算法都为优化算法，不能保证最优解 63
多序列比对（自动比对，手工校正）
选择建树方法以及替代模型
建立进化树
进化树评估
系统发育树重建分析步骤
64
1. 最大简约法 (maximum parsimony, MP) 适用序列有很高相似性时
2. 距离法 (distance) 适用序列有较高相似性时
3. 最大似然法 (maximum likelihood, ML) 可用于任何相关序列集合
计算速度： 距离法 >最大简约法 >最大似然法
系统发育树重建的基本方法
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1. 最大简约法 (MP) 根据信息位点提供的各序列间的替换情况，在所有可能的树中筛选含最小替换数的树的方法。
理论基础为奥卡姆剃刀 (Ockham)原则：计算所需替换数最小的那个拓扑结构，作为最优树。
在分析的序列位点上没有回复突变或平行突变，且被检验的序列位点数很大的时候，最大简约法能够推导获得一个很好的进化树。
优点：不需要在处理核苷酸或者氨基酸替代的时候引入假设 (替代模型)
缺点：分析序列上存在较多的回复突变或平行突变，而被检验的序列位点数又比较少的时候，可能会给出一个不合理的或者错误的进化树推导结果。
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信息位点：能将所有可能的树区别出来的
位点。
信息位点是指那些至少存在2个不同碱基/氨基酸且每个不同碱基/氨基酸至少出现两
次的位点。
信息位点 (Sites are informative)
67
68
69 Tree 1突变位点4 Tree 2突变位点5 Tree 3突变位点6
用最大简约法构树, 选择最小变化的拓扑树
上例 Position 5, 7, 9为信息位点;
基于position 5的三个MP树: Tree 1长度为1，Tree 2 & 3长度为2
类似Position 5, 对位点7, 9分别计算树长度
Tree 1总长：1+1+2=4
Tree 2长5；Tree 3长6
计算结果：MP tree的最优结果为tree 1
70
2. 距离法
又称距离矩阵法，首先通过各个物种之间的
比较，根据一定的假设（进化距离模型）推
导得出分类群之间的进化距离，构建一个进
化距离矩阵。再依据进化距离，分别依次将
序列合并聚类，构建进化树。
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简单的距离矩阵
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由进化距离构建进化树的方法有很多，常见
有： (1) Fitch-Margoliash Method (FM法): 对短支长
非常有效 (2) Neighbor-Joining Method (NJ法/邻接法):求最短支长，最通用的距离方法 (3) Neighbors Relaton Method(邻居关系法) (4) Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean (UPGMA，非加权组平均法)
通过距离矩阵建树的方法
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(1) Fitch-Margoliash方法 (FM法)
=> D和E最接近！ D
E
ABC
e
d
m
示例
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分成三组：D, E, 以及ABC
(1) FM法示例
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DE距离=d+e=10 (1) D到ABC间的平均距离=d+m = 32.7 (2) E到ABC间的平均距离=e+m = 34.7 (3) (2)-(3)+(1) d=4,e=6
D
E
ABC
e
d
m
76
分成三组：C, DE, 以及AB => C最接近DE！
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c+g+(e+d)/2=19 (1) c+f+(a+b)/2=40 (2) (e+d)/2+(a+b)/2+f+g=41 (3) (1)+(2)-(3) => c=9 => g=5
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由：(a+b)/2+f+g+(d+e)/2=41 得：f=20 由：a+f+c=39 得：a=10，则b=12
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d=e=10/2=5
UPGMA法 非加权组平均法
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c=19/2=9.5 g=c-d=9.5-5=4.5
81
a=b=22/2=11
A B (CDE) A - 22 39.5 B - - 41.5
(CDE) - - -
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(AB) (CDE) (AB) - 40.5
(CDE) - -
f1+a=f2+c=40.5/2=20.25 f1=9.25 , f2=11.75
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最大似然法 (ML)
最大似然法(maximum likelihood, ML): 最早应用于对基因频率数据的分析上
选取一个特定的替代模型来分析给定的一组序列数据，使得获得的每一个拓扑结构的似然率都为最大值，然后再挑出其中似然率最大的拓扑结构作为最优树；
在最大似然法的分析中，所考虑的参数并不是拓扑结构而是每个拓扑结构的枝长，并对似然率求最大值来估计枝长；
缺点：费时，每个步骤都要考虑内部节点的所有可能性
改进：启发式算法，分枝交换搜索等
84
85
根据实际情况选择合适的构树方法
选择相关 序列数据
强序列相似性？ 是
否
最大简约法
最大似然法
距离法
进化树评估
进行多 序列比对
具有可识别的 序列相似性？
是
否
1. 可靠的待分析数据 2. 准确的多序列比对 3. 选择合适的建树方法：
A. 序列相似程度高，MP首先 B. 序列相似程度中等， Distance法首先 C. 序列相似程度较低，ML首先 D. 序列相似程度太低，无意义
4. 一般采用两种及以上方法构建进化树，无
显著区别可接受
构建进化树的一般原则 (2)
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进化树的可靠性分析
单纯由预先获得的多序列比对结果数据所推导出的进化树有时并不一定可靠。 改进办法：引进一些统计分析来寻找更优的进化树，检验结果的可靠性。 最常见的就是bootstrap评估。
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从排列的多序列中随机有放回的抽取某一列，
构成相同长度的新的排列序列； 重复上面的过程，得到多组新的序列； 对这些新的序列进行建树，再观察这些树与原
始树是否有差异，以此评价建树的可靠性。 一般Bootstrap的值>70，则认为构建的进化树
较为可靠。
自展法- 进化树的可靠性分析 Bootstrap Method
88
89
原始排列 S1 AACAAC
S2 AACCCC
S3 ACCAAC
S4 CCACCA
S5 CCAAAC
Bootstrap1 S1 ACAAAC S2 ACCCCC S3 ACAAAC S4 CACCCA S5 CAAAAC Bootstrap2 S1 AAAACC S2 AACCCC S3 CCAACC S4 CCCCAA S5 CCAACC Bootstrap3 S1 ACAAAC S2 ACCCCC S3 CCAAAC S4 CACCCA S5 CAAAAC
基于全基因组的分子系统发育分析
选用哪些片段进行分析？基因的水平迁移 全基因组考虑了所有的生物特征，并可作为所有生物的共同指标 基于部分片段的进化树、全基因组进化树、真正的物种进化树 不同物种全基因组的序列比对
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第四节，系统发育分析软件介绍 软件 说明 PHYLIP 免费的、集成的进化分析工具
http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html MEGA 图形化、集成的进化分析工具，不包括ML
http://www.megasoftware.net/ PAUP 商业软件，集成的进化分析工具
http://paup.csit.fsu.edu/ PHYML 最快的ML建树工具
http://atgc.lirmm.fr/phyml/ MrBayes 基于贝叶斯方法的建树工具
http://mrbayes.csit.fsu.edu/ MAC5 基于贝叶斯方法的建树工具
http://www.agapow.net/software/mac5/ 91
相关软件
软件 说明 ClustalX 图形化的多序列比对工具;构建N-J系统树
http://bips.u-strasbg.fr/fr/Documentation/ClustalX/ GeneDoc 多序列比对结果的美化工具（可以导入fasta格式的文
件，作图可用于发表）http://www.psc.edu/biomed/genedoc/
BioEdit 序列分析的综合工具 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
TreeView 进化树显示工具 http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
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MEGA使用说明
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一、序列文本的准备
构树之前先将目标基因序列都分别保存为txt文本文件中（或者把所有序列保存在同一个txt文本中,可以用“>基因名称”作为第一行，然后重起一行 编辑基因序列），序列只包含序列字母（ATCG或氨基酸简写字母）。文件名名称可以已经您的想法随意编辑。
94
95
二、序列导入
（1）打开MEGA软件，界面如下
96
（2）导入需要构建系统发育树的目的序列
97
OK
98
选择分析序列类型（如果是DNA序列，点击DNA，如果是蛋白序列，点击Protein）
99
出现新的对话框，创建新的数据文件
100
选择序列类型
101
导入序列
102
103
导入序列成功
104
三、序列比对分析
点击工具栏中“W”工具，进行比对分析
105
比对结束后删除两端不能够完全对齐碱基
106
四、系统发育分析
107
关闭窗口，选择保存文件路径，自定义文件名称
108
五、系统发育树构建
根据不同分析目的，选择相应的分析算法
109
Bootstrap 选择1000，点击Compute，开始计算
110
111
计算完毕后，生成系统发育树；根据不同目的，导出分析结果，进行简单的修饰，保存
112
