第十章 微生物的分类和鉴定

分类学（Taxonomy）

• 源自希腊语的

taxis (“arrangement”排列) and nomos (“law”法规)

Classification (分类）: 由具体到抽象，收集大量描述有关个体的文献资料，整理成科学的分类系统

Identification（鉴定） : 将未识别的生物归类为某一确定

分类单元的行为和结果 （从抽象到具体）

Nomenclature（命名）: 对每个新的类型微生物进行命名的过程

• Taxonomy （分类学） is an agreement among people

分类相关数据库1）NCBI数据库：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy

优点：对自己的序列进行比较分析

缺点：有很多错误的分类信息

2）RDP数据库： http://rdp.cme.msu.edu（适用于群落结构分析）

优点：从NCBI取出16S rRNA基因序列后，通过分析确认其分类信息

优点：对很多序列确定分类信息

3）LPSN数据库： http://www.bacterio.cict.fr/

优点：严格按照分类规则建立，能了解不同层次分类

缺点：对测序结果，不能进行分类鉴定

4） EzTaxon： http://eztaxon-e.ezbiocloud.net

优点：对测序结果，可以进行分类鉴定

5）Bergey氏原核生物分类系统

第一节 通用分类单元

• Category （taxon, 分类单位）– Domain （域）

- Phylum，Division（门）

- Class （纲）

- Order （目）

- Family (科）

- Genus (属）

- species (种）

（

各级分类单元

Fungi

Eukarya

Ascomycota

Hemiascomycetes

Saccharomycetales

Saccharomycetaceae

Saccharomyces

S. cerevisiae

Baker’s yeast

Species

Genus

Family

Order

Class

Phylum

Kingdom

Domain

All organisms

M. okinawensis

Methanothermococcus

Methanococcaceae

Methanococcales

Methanococci

Euryarcheota

None assigned for archaea

Archaea

Methanococcus E. coli

E. coli

Escherichia

Enterobacteriaceae

Enterobacteriales

Gammaproteobacteria

Proteobacteria

None assigned for bacteria

Bacteria

门

域

纲

目

科

属

种

界

种（species）的概念

微生物的种（species，简写sp.，又译

物种）是一个基本分类单元，它是一大群

表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与

同属内其他物种有明显差异的菌株的总称。

菌株又称品系（在非细胞型的病毒中则称毒株或株），表示任何由

一个独立分离的单细胞（或单个病毒粒子）繁殖而成的纯遗传型群体及

其一切后代。

菌株（strain）

菌株 (strain) = 纯培养物 (pure culture)

= 克隆 (clone)

典型菌株（type strain）

一个种内的一个典型菌株作为这个种的具体代表。

注意：典型菌株一般由两个以上国家的菌种保藏 机构保藏，以便备

查考、索取和购买。

• sp. vs spp.

– Bacillus sp. （一种芽孢杆菌）

– Bacillus spp. (若干种芽孢杆菌）

• Strain (菌株)

– Escherichia coli K12

• Type strain (典型菌株）

Rhizobium daejeanense L61T

双名法（binominal nomenclature）

双名法

属名（generic name）

种名加词（specific epithet）

微生物命名 （拉丁文）

例: Escherichia coli, E. coli, Escherichia sp. K12，Escherichia sp.，Escherichia spp., and “the genus Escherichia”

属名可用缩写，但种名不能缩写

属名可以单独用，但种名必须与属名一起用

属名和种名必须要用斜体，当手写时需用下划线

文章中第一次用学名时需要用全称，第二次开始属名可以用缩写（但必须与种名一起用）。

如果用缩写后可能与其它属引起混淆，就不能用缩写。

Escherichia coli K12

属名 种名 菌株名

俗名（common name）

指普通的、通俗的、地区性的名字，具有

大众化和简明的优点，但往往涵义不够确切，

易于重复，使用范围局限。

例如，“结核杆菌” 是Mycobacterium tuberculosis

（结核分枝杆菌）的俗名;

“红色面包霉”是Neurospora crassa（粗糙脉孢菌）

的俗名。

学名和俗名比较

命名法（Nomenclature）

• Approved List of Bacterial Name

(International Journal of Systematic Bacteriology 1980 30:255-429)

– 在 Approved List之前，没有固定的规律来描述新的种

e.g., 链霉菌（Streptomyces ）属曾同时包含超过3,000 种

• 统一的系统

• 理事会：International committee on systematic bacteriology (ICSB)

（系统细菌学国际委员会）

• 规则：细菌命名法的国际法规

• 官方杂志

– International Journal of Systematic Bacteriology （IJSB）

– International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology

（IJSEM） (From 2000)

微生物命名（Nomenclature）流程

分类学的提议(新的分类单位，新的组合)

IJSEM中发表 其它杂志发表

Notification List

in IJSEM

Validation List

in IJSEM

作者委托 IJSEM

Candidatus（候选的）

• 没有纯培养

• 通过有限的信息描述

– 16S rDNA

– Morphology（形态学） (TEM, SEM)

– Ecology（生态学）

– 其它信息

第二节 微生物在生物界的地位

一、生物的界级分类学说

三域

二、三域学说及其发展

三域学说是70年代末由C.R. Woese对大量微

生物和其他生物进行16S和18S rRNA的寡核苷

酸检测，并比较其同源性水平后提出的。

域：一个比界更高的界级分类单元。

细菌域

古生菌域

真核生物域

BacteriaEukaryaArchaea

Prokaryotes Eukaryotes

Macroorganisms

三域学说

三域学说及其生物进化谱系树

Nature, 2013,Dec. 12

产液菌/产氢菌

绿色非硫化细菌

异常球菌

螺旋体

绿色硫细菌

类杆菌－黄杆菌

浮霉状菌

衣原体

格兰氏阳性菌

蓝细菌

栖热孢菌

硝化螺旋菌

变形菌

古生菌的主要类群

甲烷球菌

甲烷栖热菌

甲烷杆菌

古生球菌

嗜盐甲烷菌

甲烷八叠球菌

热原体

甲烷螺菌

盐杆菌

盐球菌

甲烷嗜热菌

热网菌

热变型菌

热球菌 硫化叶菌

硫还原球菌

Korarchaeota

Crenarchaeota

Euryarchaeota广古生菌

泉古生菌

古古生菌

古古生菌门

泉古生菌门

广古生菌门嗜盐

嗜酸

厌氧产甲烷

奇古菌

Bergey氏原核生物分类系统纲要

1. 《伯杰氏鉴定细菌学手册》1923年

2. 《伯杰氏系统细菌学手册》1984年

细菌分类鉴定的两本权威手册

第三节 各大类微生物的分类系统刚要

1923年第1版

1925年第2版

1930年第3版

1934年第4版

1939年第5版

1948年第6版

1957年第7版

1974年第8版

1994年第9版

《伯杰氏鉴定细菌学手册》

第9版的伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群，

将古生菌部改编为5个群，全书描写约500个属。

划分为四大类：

第一类具细胞壁的革兰氏阴性细菌

第二类具细胞壁的革兰氏阳性细菌

第三类无细胞壁的细菌

第四类古生菌

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology

9th Edition

《伯杰氏鉴定细菌学手册》

1994年第9版，撰稿人多达300

多位，涉及20个国家。

鉴定手册包括35个群细菌。

《伯杰氏系统细菌学手册》第1版（1984年）是在《伯杰氏鉴定

细菌学手册》第8版（1974年）的基础上，根据10多年来细菌分

类所取得的进展编写的。

《系统手册》的新内容：

核酸杂交、16 S rRNA寡核苷酸序列等系统发育方面的资料，特

别是许多新的分类单元的划分，都是经过核苷酸序列比较

后提出的。

《伯杰氏系统细菌学手册》

1984－1989年第1 版

2000－2007年第2 版

第一卷：

一般医学和工业方面重要的革兰氏阴性细菌。

第二卷：

放线菌以外的革兰氏阳性细菌。

第三卷：

古细菌、蓝细菌及其他革兰氏阴性细菌。

第四卷：

放线菌。

《伯杰氏系统细菌学手册》(第1版)

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology

(2nd Edition ) Springer, New York

Volume 1 (2001) The Archaea and the deeply branching and

phototrophic Bacteria

Volume 2 (2005)The Proteobacteria （变形菌门）

Volume 3 (2009)The Firmicutes （厚壁菌门）

Volime 4 (2011) The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes

(Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres,Fusobacteria, Dictyoglomi, Ge

mmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia,Chlamydiae,

and Planctomycetes

Volume 5 (2012)The Actinobacteria （放线细菌门）

真菌界

子囊菌门

担子菌门

接合菌门

壶菌门

无性型真菌类

子囊菌纲

酵母菌纲

裂殖酵母纲

外囊菌纲

新乳霉纲

肺囊霉纲

担子菌纲

锈菌纲

黑粉菌纲

接合菌纲

毛菌纲

目前得到学术界较广泛采用的是Ainsworth的分类系统。

Ainsworth等人的菌物分类系统纲要

第九版（2001）

基于生理学特征的经典鉴定方法

• 基于少数的形态学和生理学的性质

• 基于主观的选择性的试验

• 缺少均一性 (标准化)

第四节 微生物分类鉴定方法

数值分类鉴定

• 基于借助于计算机分析大量的表型的性质

– (e.g. 300 strains x 200 tests)

• 更多的分析项目

• 同样缺乏均一性

• 费力的

• API 细菌数值鉴定系统 (API system)

• Biolog细菌数值鉴定系统

现代分类鉴定方法

• ad hoc Committee on Reconciliation of Approaches to Bacterial Systematics of

International Committee on Systematic Bacteriology

(ICSB，细菌系统学国际委员会) - Wayne et al. (1987) IJSB 37:463-464

– 细菌的物种应该反应基因组的关系

– 基于直接或间接的测量基因组核苷酸序列的比较

– 基因组测序 (直接的) – 理想的，但以前是不切实际

– DNA-DNA 杂交 (间接的)

种的定义

– 在最优化的杂交温度下，全基因组杂交，70％结合（同源性）

The phylogenetic definition of species generally would include strains

with approximately 70% or greater DNA-DNA relatedness and with 5°C

or less Tm. Both values must be considered.

DNA-DNA杂交: 方法间接的评价两个菌株的基因组的亲缘关系

缺点:

- 无法鉴别属以上的水平- 费力，昂贵- 无法产生数据库

Small subunit rRNA (rDNA)

基因测序 ： 用目标基因代表整个基因组 (rDNA, rpo, gyr)

SSU rRNA优点：

• 存在于大多数物种 (真核生物, 古细菌, 真细菌)

• 便于测序

– 基于保守区域的PCR (ca. 1,500 nt)

– 基于保守区域的测序

• 大型数据库

– > 2,000,000 small subunit rDNA sequences

DNA杂交和16S rRNA基因相似度关系

16S rDNA 序列相似度<97％时其DNA-DNA杂交值<70%。但16S rDNA 序列相似度>97％时不好估计DNA-DNA杂交值。

100

分类的方案

16S rDNA 测序

不同的分支 属水平的鉴定（小于95%)

新的属

Genomic species

Yes No

新的种

70%>

70%<

物种水平的鉴定

化学的，表型的数据的支持

Yes

现有的物种单元

物种： 小于97% 16S

rDNA 相似度

DNA-DNA

hybridization with

species showing 16S

rDNA 相似度>97%

分类学研究的概述

mRNA

PROTEIN

• 总的细胞内蛋白和包膜蛋白的电泳图谱

Chemotaxonomic markers

• 胞内脂肪酸• 极性脂质• 醌类• 聚胺类• 细胞壁组分

Expressed features

• 形态学• 生理学• 酶学• 血清学

表型信息

总的DNA：

• GC含量• RFLP•DNA－DNA杂交

DNA

DNA基因型信息

DNA 片段:• 基于PCR的DNA指纹印迹• DNA探针• DNA 测序

rRNA

• 测序

• GenBank, EMBL16S

23S

5S

微生物分类鉴定的4个水平

① 细胞的形态和习性水平

② 细胞组分水平

③ 蛋白质水平

④ 核酸水平

（一）经典的鉴定指标

1. 形态学指标

2. 生理、生化指标

3. 生态特性指标

4. 生活史

5. 血清学反应

6. 对噬菌体的敏感性

7. 其他

1. 形态学特征

（1）群体形态学特征

（2）个体形态学特征

细胞大小、形态、排列及其染色特性

特殊的细胞结构

培养特征

运动性等

（1）群体形态特征（培养性状）

① 斜面菌苔特征

（1）群体形态特征（培养性状）

② 平板菌落特征

细菌在琼脂平板上的菌落表面形态

② 平板菌落特征

细菌在琼脂平板上的菌落隆起形状

细菌在琼脂平板上的菌落边缘形状

③ 培养液中的生长特征

（2）个体形态特征

① 革兰氏染色

② 芽孢染色

③ 荚膜染色

④ 鞭毛染色

⑤ 运动性观察（半固体琼脂穿刺法）

SEM，TEM 观察

2. 生理、生化指标 （API Kit）

（1）接触酶反应

（2）糖醇类发酵试验

（3）甲基红（M.R）试验

（4）甲基乙酰甲醇（V.P）试验

（5）吲哚试验

（6）硝酸盐还原

（7）亚硝酸盐还原

（8）大分子物质水解反应

（9）碳源利用试验

（10）氮源利用试验

化学分类：细胞化学成分用作鉴定指标

1. 细胞壁的化学成份

2. 全细胞水解液的糖型

3. 磷酸类脂成分的分析

4. 枝菌酸的分析

5. 醌类的分析

6. 脂肪酸分析

对于不同属的鉴定是有用的

弱点 - 微生物的化学组成取决于环境- 必须同一条件下培养

一些常用分类技术在分类学上的精确度

细胞壁结构

脂肪酸

聚氨，醌

脂肪酸FAMEs (脂肪酸甲酯) 通过 GC分析 (气相色谱法)

脂肪酸的气相色谱（GC）

相似性指数

16S rDNA 测序

GC含量

DNA-DNA 杂交

核酸水平分析中常用方法

16S rRNA在结构和功能上的作用

16S rRNA gene 在分子分类学应用

16S rRNA …

• 所有的细菌都具备的古老的分子

• 功能恒定

• 普遍分布

• 系统发生距离上中度保守

More than 2,000,000 of 16S rRNA gene sequences are currently available on RDP.

Procaryote Eukaryote

Overal size 70S 80S

Small subunit 30S 40S

Number of proteins ~21 ~30

RNA size

(number of base)16S

(~1500bp)

18S

(~2300bp)

Large subunit 50S 60S

Number of proteins ~34 ~50

RNA size

(number of base)23S (~2900bp)

5S (~120bp)

28S (~4200bp)

5.8S (~160bp)

5S (~120bp)

核糖体（Ribozome) structure

线粒体和叶绿体的核糖体跟原核生物的核糖体更相似

16S rDNA 测序的概述

基因组 DNA 或细胞裂解

16S rDNA

载体+ 16S rDNA

测序

放射自显影图系统进化树

16S rRNA基因的PCR扩增

16S rRNA gene

9F

341F

518F

536R907F

1100R

1512R

16S rRNA gene

Primer 1512R

5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

Primer 9F

5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

am

plific

atio

n

Electrophoresis1.6 Kb

测序: PCR 产物或克隆的基因

纯化 基于PCR的循环测序

341F partial sequence

9F

520F

536R

907F

1100R

1512R

full sequence

纯化的PCR产物

16S rRNA基因序列完全一致

不同16S rRNA基因之间

存在序列差异

载体+ 16S rDNAs

克隆 测序

序列分析

用ez-taxon数据库搜索相近序列

选择参考株

Alignment

构建系统发生树

16S rDNA 相似度≤ 97%: 不同的种

(Stackebrandt & Goebel, 1994)

DNA 碱基组成

DNA…

• 双螺旋

• [A] = [T], [G] = [C]

• A-double bond-T/ G-triple bond-C

基因组的进化适应性一部分取决于GC含量

GC含量作为分类学的标记

A + T + G + C

G + Cⅹ100%

• 原核生物之间GC 含量变化范围 20%

- 80%

• 相同的 GC 含量不意味着相同的碱基组成

• Minimal value in the overall

taxonomic characterization of genus

and species

Difference in mol% G+C = 0% ≠ same species

Difference in mol% G+C ≥ 5% ≈ different species

Difference in mol% G+C ≥ 10% ≈ different genus

Cell

GC含量分析 ( HPLC高效液相色谱)

细胞裂解 (化学的 & 物理的)

蛋白酶处理

RNA酶处理

DNA

RNA

protein

DNA 变性

核酸酶处理

碱性磷酸酶处理

P

HPLC 分析： 270 nm

GC含量的计算

C

G

T

A

基因组DNA杂交

• DNA序列间的部分相似进行杂交

•对于区分相近的生物的非常敏感的方法(“>99% 16S rDNA” 或“相同的 GC 含量”都有可能对应 “<70% 杂交值”)

Hybridization value ≥ 70% : same species

DNA-DNA 杂交概述

基因组 DNA纯化

靶 DNAs的固定

预杂交

生物素标记的探针 DNA

杂交和酶反应

检测

靶 DNAs的固定

Brevibacterium casei DSM 20657T AJ251418

Brevibacterium linens DSM 20425T X77451

Target

Brevibacterium iodinum NCDO 613T X76567

Probe: strain of interest

Brevibacterium aureum Enb15 AY299092

Brevibacterium aureum Enb17 AY299093

95

99

83

91

97

0.01

感兴趣的菌株 相关微生物完全无关的 e.g. E. coli

变性

(+) control 靶 (-) control

单链 DNAs

固定到膜上

washing

洗出未结合的 DNAs

与鲑鱼精DNA预杂交

• 鲑鱼精 DNA 是与细菌 DNA完全无关的DNA.

• 充当非特异性的配体 使靶 DNA中未结合的受体饱和

• 去除非特异性的 DNA-DNA 结合(不完全互补的结合)

鲑鱼精 DNA 使非特异位点饱和

标记的探针 DNA 可能的非特异性结合

特异位点

非特异位点靶 DNA

杂交膜

固定的靶 DNA

鲑鱼精 DNA

杂交膜

预杂交

Washing

标记的探针 DNA

探针 DNA

变性

加入光生物素

光照

生物素标记的探针 DNA

washing

交联

杂交

杂交膜

标准化的靶DNA

杂交膜

杂交

Washing

生物素标记的探针 DNA

(+) control

target

(-) control

底物与酶的反应

链霉亲和素

β-D-galactosidase

F

F

杂交膜

添加酶

Washing

酶

杂交膜

添加底物

底物

4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside

37℃酶反应

检测

检测

(+) control

target

(-) control

F F F F F F F F

8 RFU

F F F F F F

6 RFU

F F

2 RFU

DNA电子杂交

• 随着高通量测序技术的发展，微生物全基因组分析将成为微生物研究中的常用方法

多相分类（Polyphasic taxonomy)

基因型信息16S rRNA 基因测序GC含量DNA-DNA 杂交

化学分类信息脂肪酸醌

细胞表型信息形态学(显微镜，菌落)生长条件 (温度, pH, 盐度)碳源的利用 (API kit) 酶活性 (API kit)

Figure Transmission electron micrograph. of strain L61T

Example:

Rhizobium daejeonense sp. nov.

Rhizobium rubi IFO 13261T (D14503)

Rhizobium larrymoorei AF3-10T (Z30542)

Rhizobium radiobacter DSM 30147T (D01256)

Rhizobium undicola LMG 11875T (Y17047)

Rhizobium vitis NCPPB 3554T (D14502)

L61T (AY341343)

L22 (DQ089696)

Rhizobium loessens CCBAU 7190BT (AF364069)

Rhizobium huautlense S02T (AF025852)

Rhizobium galegae ATCC 43677T (D11343)

Rhizobium giardinii H152T (U863443)

Rhizobium leguminosarum DSM 30132T (U29386)

Rhizobium etli CFN 42T U28916

Rhizobium rhizogenes IFO 13257T (D01257)

Rhizobium tropici CIAT 899T (U89832)

Rhizobium hainanensis I66T (U71078)

Rhizobium sullae IS 123T (Y10170)

Rhizobium indigofera CCBAU 71042T (AY034027)

Rhizobium mongolense USDA 1844T (U89817)

Rhizobium gallicum R602spT (U86343)

Sinorhizobium medicae A 321T (L39882)

Sinorhizobium meliloti LMG 6133T (X67222)

Sinorhizobium arboris HAMBI 1552T (Z78204)

Sinorhizobium adhaerens HAMBI 1631 (AJ420774)

Sinorhizobium terangae LMG 7834T (X68388)

Sinorhizobium kostiense HAMBI 1489T (Z78203)

Sinorhizobium kummerowiae CCBAU 71714T (AF364067)

Sinorhizobium saheli LMG 7837T (X68390)

Sinorhizobium fredii LMG 6217T (X67231)

Sinorhizobium xinjiangensis IAM 14142T (D12796)

Mesorhizobium loti LMG 6125T (X67229)

Phyllobacterium myrsinacearum IAM 13587 (D12790)

Azorhizobium caulinodans LMG 6465T (X67221)

5999

100

100

97

90

100

99

95

87

88

98

70

90

52

64

81

89

99

98

98

66

0.01

Fig. Phylogenetic tree constructed

from a comparative analysis of 16S

rDNA gene sequences showing the

relationships of strain L61 with

other related species.

Physiological characteristics of

strain L61 and related species

G+C contents

DNA-DNA hybridization

61.3%, in the range of Rhizobium (57%-63%)

• Lower than 10% with R. gianidii, R. galegae, R. huautlense, A. tumefaciens.

Description of novel species

Rhizobium daejeonense sp. nov. (dae.jeon.en'se N.L. neut. adj. daejeon, pertaining to Daejeon a city in Korea, where the type strain of this species was isolated).

• Cells are a gram-negative, aerobic, motile, non-spore forming rod (0.6-0.7 1.1-1.3 m) with peritrichous flagella.

• The colonies appearing on YMA within 3 days of incubation at 28 C are circular, cream colored, semi-translucent, and sized 1.5-3.0 mm in diameter.

• Catalase, oxidase, urease, -galactosidase, and -glucosidase are positive. Gelatin liquefaction, indole production, and arginine dihydrogenase are negative. No nitrate reduction to nitrite. (Enzyme activity)

• Cells grew at 41C, in 0-2% NaCl, or in a pH range of 5-10; however it could not grow at 4 C or 45C, in 2.5% NaCl, or in a pH range higher than 10 or lower than 4.5.

• Nodules were formed in Medicago sativa by this strain. A nifH encoding a nitrogenase complex was detected.

• DNA G+C content is 60.1-60.9%, as determined by means of HPLC. The cellular fatty acids are C16:0 (2.2-3.3%), C18:0 (2.1-3.2%), C19:0 cyclo ω8c (9.9-16.8%), C20:3 ω6,9,12c (2.7-3.3%), summed feature 3 (7.2-7.7%) and summed feature 7 (67.8-73.7%).

• The available carbon source is propionate, caprate, valerate, histidine, acetate, L-alanine, 3-hydroxy-benzoate, maltose, D-glucose, fucose, D-sorbitol, L-proline, rhamnose, D-ribose, inositol, D,L-lactate, arabinose, mannose, mannitol, maltose, and malate; the no available carbon source is citrate, itaconate, suberate, glycogen, phenyl-acetate, adipate, D-melibiose, 2-ketogluconate, N-acetyl-Glucosamine, malonate, 5-ketogluconate, and gluconate.

• L-Glutamic acid, L-methionate, L-phenylalanine, L-cysteine, and free- and nickel-complexed cyanides were used as nitrogen source, but D,L-tryptophan and glycine were not.

• Cells are resistant against ampicillin (20 and 100 g ml-1) and erythromycin (20 μg ml-1); however they are not resistant against tetracycline (50 μg ml-1), erythromycin (100 g ml-1), chloramphenicol (100 μg ml-1) or kanamycine (100 μg ml-1).

• The strains were isolated from a cyanide-degrading bioreactor originally inoculated by an activated sludge from a municipal sewage treatment plant (Daejeon, Korea).

• The type strain is L61T (= KCTC 12121T = IAM 15042T = CCBAU 10050T) and the reference strain is L22 (= KCTC 12120 = IAM 15041).

真菌的分类鉴定

www.fungalbarcoding.org

群落结构分析： https://unite.ut.ee/